CN112301124A - 用于结直肠癌和腺瘤辅助诊断的试剂盒及其使用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于结直肠癌和腺瘤辅助诊断的试剂盒及其使用方法，试剂盒包括引物组合物、探针组合物和封闭序列组合物，引物组合物由BS‑N4‑F、BS‑N4‑R、BS‑SDC2‑F、BS‑SDC2‑R、BS‑ACT‑F和BS‑ACT‑R组成，探针组合物由BS‑N4‑P、BS‑SDC2‑P和BS‑ACT‑P组成，封闭序列组合物由BS‑N4‑C和BS‑SDC2‑C组成。使用方法包括采样、提取、转化、检测和结果分析。本发明的试剂盒采用NDRG4基因和SDC2基因的联用检测，以ACTB基因作为内参，实现了结直肠癌和腺瘤的高检出率和高特异性，在使用过程中结果分析高效准确，具有很好的商业价值和现实意义。

Description

用于结直肠癌和腺瘤辅助诊断的试剂盒及其使用方法
技术领域
本发明属于生物技术及医学领域，涉及试剂盒及其使用方法，具体涉及用于结直肠癌辅助诊断的试剂盒及其使用方法。
背景技术
结直肠癌又称大肠癌(colorectal cancer，CRC)是临床最常见的恶性肿瘤之一，通常发展缓慢，近些年随着经济的发展，人们的生活方式尤其是饮食结构的变化，肠癌已经成为我国发病率上升最快的恶性肿瘤之一，严重威胁着国人的生命和健康。据全国肿瘤登记中心发布的最新《中国肿瘤登记年报》，在全国范围内，结直肠癌等消化道癌症的发病和死亡人数逐年攀升，新发病人数约为40万人/年，死亡人数约为19.5万人/年。尤其在长江三角洲、珠江三角洲以及港澳台等高发地区结直肠癌有进一步恶化的趋势。结直肠癌从最初的癌前发展至晚期有一个比较长的时间，但直到晚期才有明显症状显现(如腹痛，便血等)。统计数据表明，目前我国便潜血筛查率低于5％，肠镜检查率更不足3％。结直肠癌患者在诊断时60-70％已为中晚期，早期的比例仅为11.8％。由于大多数中国患者没有进行癌症早筛查的意识，发现症状后才到医院检查，至结直肠癌确诊时，癌细胞已经扩散，后期疗效不明显，且所需治疗费用高，致使中国近半数肠癌患者生存期不超过五年。如果早期发现结直肠癌，不仅治疗费用低，还可达到预防甚至治愈的目的。因此，将肠癌早期筛查技术在中国进行普及推广，是降低结直肠癌死亡率的关键，同时，发明更加准确的筛查方法也是提升早期诊断率的主要方法。
目前结直肠癌相关的临床或实验室诊断方法及产品有：1)粪便隐血检测(Fecaloccult blood test,FOBT)、粪便免疫化学测试(Fecal immunochemical test,FIT)；FOBT是简单、方便、低成本的非侵入性结直肠癌筛查方法，但是存在特异性不高、试验种类不统一(定性、定量)等问题。2)内镜检查；结肠镜检查具有最高的灵敏度和特异性，是目前最普遍的筛查方法和金标准。然而，结肠镜检查是一种侵入性检查，具有穿孔、出血风险，且需要肠道准备，导致患者依从性差，不利于其推广。不仅如此，结肠镜的检查质量与筛查效率密切相关，肠道准备不充分、退镜观察不仔细、内镜医生缺少经验等，均可能造成漏诊。3)外周血基因检测；2016年，美国FDA通过了Epi proColon的首个基于血液的结直肠癌筛选检测产品。该产品用于体外定性检测人外周血血浆中Septin9基因甲基化。目前，该产品已在美国、欧洲、中国以及其他地区上市。该产品在中国获得医疗器械注册证书之后，陆续有3款基于人外周血的Septin9基因甲基化检测产品上市。基于外周血的Septin9基因甲基化检测的特异性普遍在90％以下。公共甲基化检测数据库显示上皮来源的其他的良性病变以及其他组织来源的癌症都会释放S9基因片段到外周血，导致该方法的特异性不够高。4)粪便基因检测；2014年，美国FDA批准了首个非侵入性结直肠癌筛查试剂盒-Cologuard。该产品定性检测人类粪便样本中KRAS突变、BMP3与NDRG4基因甲基化以及血红蛋白水平。研究发现Cologuard对结直肠癌和晚期腺瘤的诊断率分别为92％和42％，高于FIT(诊断率分别为74％和24％)，但对于没有患结直肠癌或晚期腺瘤的患者Cologuard的特异性(87％)却比不上FIT(95％)，这意味着Cologuard的假阳性率更高。中国目前已经上市了两款基于粪便核酸的检测，一个是基于SDC2基因甲基化的检测，一个是基于miroRNA92表达的检测。这两款产品的特点是粪便取样，相比外周血检测，实现真正的无创，且取样地点不受限制，可实现家居取样。基于miroRNA92表达检测的产品灵敏度74％，特异性90％，两项指标均低于金标准肠镜，不过可以作为肠镜前的一个好的初筛方法。由于RNA本身的特殊性，稳定性差，这也导致了该方法的实验室流程繁琐，条件要求高，不适合大规模的低成本推广。目前国内已经上市的检测试剂盒中，基于SDC2基因甲基化检测的产品灵敏度84％，特异性92％。可以作为很好的结直肠癌初筛标志物。
目前对于结直肠腺瘤的检测，常采用口服钡剂检查，在服钡后3～6h造影剂到达结肠后观察。该检查方法有局限性，直径1cm以下的结直肠腺瘤，普通钡灌肠检查漏诊率可达80％以上，而对直径1cm以上者，其漏诊率在20％～50％。即使采用气钡双对比造影，对直径＞1cm的腺瘤漏诊率亦在10％～30％，仅能显示70％左右的较大病灶。腺瘤在肠癌金标准肠镜下容易和结直肠癌以及遗传性肠道息肉病混淆，难以区分。而非侵入性的粪便检查普遍灵敏度不高，例如研究发现Cologuard对结直肠晚期腺瘤的诊断率为42％，FIT的诊断率为24％，国内上市产品康立明公司的人粪便SDC2基因甲基化检测试剂盒对腺瘤的检出率为38％。研究报道肿瘤M2型丙酮酸激酶的水平检测，可以一定程度检测癌症。应用于粪便中，可以检测结直肠腺瘤，灵敏度达到40.5％，特异性63.9％。
综合上述现有的实验室诊断方法优缺点可知，不同的结直肠癌检测方法、同一检测方法中不同的基因联合检测对于结直肠癌的检出率(灵敏度)和特异性是存在明显区别的，对于结直肠腺瘤的检测效果则区别更大。因此，需要研究一种用于同时对结直肠腺瘤和早期结直肠癌进行辅助诊断的产品和方法，以其较高的检测敏感性和特异性用于结直肠腺瘤和早期结直肠癌的检查。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种结直肠癌和腺瘤均检出率高、特异性好、使用中结果分析高效准确的用于结直肠癌和腺瘤辅助诊断的试剂盒及其使用方法，该试剂盒和使用方法丰富了现有早期结直肠癌和结直肠腺瘤诊断或筛查的产品和使用方法，显著提高了检测效果。
为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案。
一种用于结直肠癌和腺瘤辅助诊断的试剂盒，包括引物组合物、探针组合物和封闭序列组合物，所述引物组合物由用于检测NDRG4基因的引物对BS-N4-F和BS-N4-R、用于检测SDC2基因的引物对BS-SDC2-F和BS-SDC2-R以及用于检测作为内参的ACTB基因的引物对BS-ACT-F和BS-ACT-R组成，
所述BS-N4-F的DNA序列如SEQ ID NO.1所示，
所述BS-N4-R的DNA序列如SEQ ID NO.2所示，
所述BS-SDC2-F的DNA序列如SEQ ID NO.3所示，
所述BS-SDC2-R的DNA序列如SEQ ID NO.4所示，
所述BS-ACT-F的DNA序列如SEQ ID NO.5所示，
所述BS-ACT-R的DNA序列如SEQ ID NO.6所示，
所述探针组合物由NDRG4基因的探针BS-N4-P、SDC2基因的探针BS-SDC2-P和ACTB基因的探针BS-ACT-P组成，
所述BS-N4-P的DNA序列如SEQ ID NO.7所示，
所述BS-SDC2-P的DNA序列如SEQ ID NO.8所示，
所述BS-ACT-P的DNA序列如SEQ ID NO.9所示，
所述封闭序列组合物由NDRG4基因的封闭序列BS-N4-C和SDC2基因的封闭序列BS-SDC2-C组成，
所述BS-N4-C的DNA序列如SEQ ID NO.10所示，
所述BS-SDC2-C的DNA序列如SEQ ID NO.11所示。
上述的用于结直肠癌和腺瘤辅助诊断的试剂盒中，优选的，所述BS-N4-C和所述BS-SDC2-C的3’端均进行磷酸化修饰。
上述的用于结直肠癌和腺瘤辅助诊断的试剂盒中，优选的，所述BS-N4-P采用ROX和BHQ2标记，所述BS-SDC2-P采用CY5和BHQ2标记，所述BS-ACT-P采用HEX和BHQ1标记。
上述的用于结直肠癌和腺瘤辅助诊断的试剂盒中，优选的，所述引物组合物中各引物的浓度为0.1μM～0.2μM，所述探针组合物中各探针的浓度为0.1μM～0.2μM，所述封闭序列组合物中各封闭序列的浓度为0.1μM～0.2μM。
上述的用于结直肠癌和腺瘤辅助诊断的试剂盒中，优选的，所述试剂盒还包括Hotstart Taq酶、10×buffer、dNTPs、NH4Cl、DMSO和去离子水。
上述的用于结直肠癌和腺瘤辅助诊断的试剂盒中，优选的，所述dNTPs浓度为10mM，所述NH4Cl的浓度为250mM，所述DMSO的体积浓度为100％。
作为一个总的技术构思，本发明还提供一种上述的用于结直肠癌和腺瘤辅助诊断的试剂盒的使用方法，包括以下步骤：
(1)采样：采集粪便样本置于粪便样本保护液中；
(2)提取：采用磁珠法进行粪便DNA提取；
(3)转化：对提取的粪便DNA进行重亚硫酸盐转化及纯化；
(4)检测：将转化及纯化后的粪便DNA用试剂盒进行荧光定量PCR检测；
(5)结果分析：当ACTB基因的CT值＜37时，NDRG4基因的CT值＜37或SDC2基因的CT值＜42，判断为阳性；
当ACTB基因的CT值＜37时，NDRG4基因的CT值≥37且SDC2基因的CT值≥42，判断为阴性；
当ACTB基因的CT值≥37时，检测结果无效，需重新检测。
以上结果分析中的阳性和阴性，为了与病理结果的阳性和阴性进行区分，可称为检测阳性和检测阴性，有病理明确结论的阳性和阴性可称为病理阳性和病理阴性。
上述的用于结直肠癌和腺瘤辅助诊断的试剂盒的使用方法中，优选的，所述步骤(4)中，所述荧光定量PCR检测的反应程序为：50℃预变性2min，95℃变性10min，然后以95℃变性15s、60℃退火30s为一个循环进行45次，最后20℃保持2min。
本发明使用方法的结果分析中，首先，所有样本ACTB基因必须小于阈值，检测结果才有效，该基因如果大于阈值，说明检测结果不可靠，需要重新取样检测。在内参基因ACTB检测值合格的情况下，另外的两个标志物任意一个小于阈值即判断为阳性，即当ACTB基因的CT值＜37，NDRG4基因的CT值＜37或SDC2基因的CT值＜42时，判断为阳性。判断为阴性的时候ACTB仍然应该小于阈值，另外两个标志物同时大于或等于阈值时判断为阴性，即当ACTB基因的CT值＜37，NDRG4基因的CT值≥37，且SDC2基因的CT值≥42时，判断为阴性。ACTB基因的CT值≥37时，本次检测结果无效，需重新检测。
本发明中，浓度单位M指mol/L。
结直肠癌以及结直肠腺瘤(包括癌前病变)患者的粪便中会混入癌症组织来源的脱落细胞与DNA，本发明通过试剂盒提取粪便中的DNA进行结直肠癌相关基因的甲基化水平检测，通过甲基化水平判断受检者体内组织基因水平的变化，从而判断其是否具有结直肠癌风险，用该方法作为肠镜之前的筛查手段，可以有效地实现将行肠镜人群的分流，提高受检者的接受度与医疗服务水平。
SDC2基因位于人类8号染色体上，该基因在大肠癌肿瘤组织中的表达显著异常，相较于正常组织，SDC2基因的表达显著上升，且其启动子区域的CpG岛同时存在高度的甲基化。NDRG4基因位于人类16号染色体上，是NDRG抑癌基因家族成员之一，该基因家族在人体多种器官正常组织中高表达，在某些肿瘤组织中不表达或低表达。在结直肠癌患者肿瘤组织中，NDRG4基因启动子区域的CpG岛呈现高度甲基化，该抑癌基因的沉默会促进肿瘤的形成和发展。本发明选取SDC2和NDRG4两个基因作为结直肠癌及腺瘤的甲基化检测靶点，定性检测粪便核酸样本的甲基化情况。用于体外定性检测人粪便样本中SDC2、NDRG4基因甲基化情况。检测结果仅作为辅助诊断供临床医生参考，为患者提供一种无创性结直肠癌辅助检查方法，阳性检测结果还需通过肠镜检测进一步确诊。
本发明的主要创新点在于：
1、联合检测选择的基因为NDRG4基因和SDC2基因，虽然现有技术中存在多基因联合检测的技术方案，特别是联合基因包含NDRG4基因和/或SDC2基因，但本发明的联合检测仅为NDRG4基因和SDC2基因的联合，以ACTB管家基因作为内参。在作为辅助诊断试剂盒的开发过程中，标志物组合越多，灵敏度确实会有加成，但是特异性会随着基因的增多而下降。例如Septin9基因，权威数据库MethHC指出Septin9基因在正常人群中也会出现一定比例的甲基化，至于炎症、息肉等良性病人，检测值阳性的比例更大，也就是说该基因的特异性很低，在60％左右，而本发明选择的SDC2基因的灵敏度较高，特异性非常高，达到98％，当加入S9基因的时候，引起特异性太低会拉低整体的检测特异性，NDRG4相对来说灵敏度和特异性比较中庸，可以弥补SDC2灵敏度不足的缺点，也能克服S9严重拉低特异性的问题。因此，并非标志物组合越多，检测效果越好。申请人发现，本发明仅采用NDRG4基因和SDC2基因组合时，其灵敏度，特异性表现更加优异，联合检测不仅对早期结直肠癌具有非常高的灵敏度和特异性，同时对结直肠腺瘤也具有显著优于现有技术的灵敏度和特异性，病理检测1cm以下的腺瘤及以上的腺瘤，都能通过本试剂盒检测进行提示。另外，本发明扩大了临床样本量，数据更加可靠。由此可知，本发明相比于现有类似联合检测技术，具有预料不到的技术效果。
2、就结果分析来看，现有技术需要通过构建一个模型来进行结果分析，以三个标志物联合检测试剂盒为例，阳性判断并非三者任意一个阳性算阳性，而是要通过构建一个模型进行综合判断，也就是说，得到了三个标志物的检测值，无法直接判断该样本是否阳性，而是需要采用一个配套的模型来进行计算得出阳性判断值。而本发明采用两个标志物，任意一个阳性即可判断样本阳性与否，即得到标志物的检测值，可以直接判断是否阳性，不需要复杂的模型进行处理，更加适合基层医生或者检验人员使用，同时，有利于该方法的推广，无需配套的模型软件，在任何机器上得到下机数据即可出具报告，无需多一个软件分析步骤，简化了流程，显著优于现有技术。
与现有技术相比，本发明的优点在于：
本发明提供了一种用于人类粪便脱落细胞DNA的提取以及检测NDRG4与SDC2基因甲基化的试剂盒和使用方法，该试剂盒采用3联检测试剂，采用NDRG4、SDC2基因联合检测，以ACTB管家基因作为内标，以此监控样本中的人源性核酸含量，单管3通道同时进行检测。试剂盒检测的样本为粪便脱落细胞的DNA，采样无禁忌症，可以多次采样，可以居家采样，常温运输，稳定性好，使用中采用的是实时荧光定量PCR技术，3个检测基因采用不同的荧光标记，检测体系中包含对非甲基化序列进行屏蔽的封闭序列，以此提升检测试剂的特异性。本发明通过ACTB基因的甲基化作为内标，判定检测的结果准确性。该试剂盒可应用于检测病理阳性的结直肠癌或结直肠腺瘤病人以及肠镜阴性的健康人粪便DNA甲基化水平，得出目标基因甲基化的内标阳性预测值，以此作为癌症阳性病人的判断标准。利用大量临床样本进行验证，计算腺瘤检出率、灵敏度与特异性。该试剂盒的腺瘤检出率、灵敏度以及特异性均超过金标准，可以应用作为临床就诊者行肠镜前的一种辅助诊断结直肠癌的产品。本试剂盒用于体外定性检测人粪便样本中SDC2、NDRG4基因甲基化情况，检测结果仅用作辅助诊断供临床医生参考，为患者提供一种无创性结直肠癌辅助检查方法，阳性检测结果还需通过肠镜检测/病理检测进一步确诊。
本发明的试剂盒以粪便样本作为检测样本，取样方便、属于无创检测，能够提升受检者的接受程度，有利于扩大结直肠癌和腺瘤筛查的覆盖人群，降低中国结直肠癌的发生率，为全民健康提供保障。本发明的高灵敏度、高特异性能够有效提升进展期腺瘤的检出率、提升结直肠癌的早期发现率，提升病人的5年生存率。
本发明的试剂盒可用于结直肠癌的早期辅助检查和腺瘤辅助检查，针对其中阳性样本再进行肠镜、病理检查确诊，起到分级诊疗的目的。本发明可为没有肠镜条件的临床单位提供很好的结直肠癌早期筛查产品，有利于结直肠癌早期筛查的普及推广，减轻医疗负担与居民经济压力。
附图说明
图1为本发明实施例1中NDRG4的ROC曲线分析结果示意图。
图2为本发明实施例1中SDC2的ROC曲线分析结果示意图。
图3为本发明实施例1中NDRG4/SDC2联合的ROC曲线分析结果示意图。
图4为本发明实施例2中样本检测内标ACTB的曲线示意图。
图5为本发明实施例2中阳性样本检测曲线示意图。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体优选的实施例对本发明作进一步描述，但并不因此而限制本发明的保护范围。
以下实施例中所采用的材料和仪器均为市售。
实施例1：
一种本发明的用于结直肠癌和腺瘤辅助诊断的试剂盒，包括引物组合物、探针组合物、封闭序列组合物、Hot start Taq酶、10×buffer、dNTPs、NH4Cl、DMSO和去离子水。其中，引物组合物的组分列于表1中，探针组合物的组分列于表2中，封闭序列组合物的组分列于表3中。
表1实施例1的引物组合物
BS-N4-F 5’-GTTTCGCGTCGCGGTTTTCGTTC-3’(SEQ ID NO.1)
BS-N4-R 5’-CGTAACTTCCGCCTTCTACGCG-3’(SEQ ID NO.2)
BS-SDC2-F 5’-AGAAATTAATAAGTGAGAGGGCGTCGC-3’(SEQ ID NO.3)
BS-SDC2-R 5’-AACGCTCGCTTCCTCCTCCTACG-3’(SEQ ID NO.4)
BS-ACT-F 5’-GAAAGGGTGTAGTTTTGGGAGGTTAG-3’(SEQ ID NO.5)
BS-ACT-R 5’-CCCAAAACCAACCACAAAAAAAT-3’(SEQ ID NO.6)
表1中，引物对BS-N4-F和BS-N4-R用于扩增NDRG4基因，引物对BS-SDC2-F和BS-SDC2-R用于扩增SDC2基因，引物对BS-ACT-F和BS-ACT-R用于扩增ACTB基因。
表2实施例1的荧光探针序列组合物
Figure BDA0002147528100000071
表2中，BS-N4-P探针用于识别NDRG4基因，BS-SDC2-P探针用于识别SDC2基因，BS-ACT-P探针用于识别ACTB基因。
表3实施例1的封闭序列组合物
Figure BDA0002147528100000072
表3中，BS-N4-C用于封闭NDRG4基因，BS-SDC2-C用于封闭SDC2基因。
一种上述本实施例1的用于结直肠癌和腺瘤辅助诊断的试剂盒的使用方法，包括以下步骤：
(1)采样：采集5-8g粪便样本置于15mL的粪便样本保护液中，粪便样本保护液优选申请人申请的公开号为CN201711107812.6的专利文献提供的粪便样本保护液，但不限于此。
(2)提取：采用磁珠法提取试剂盒进行提取，具体步骤如下：
(2.1)将收到的样本(带保护液，约20mL)充分振荡混匀，使样本溶液呈匀浆状态，3000g离心15min，转移10mL上清至另一50mL离心管中，剩余样本保存备用；
(2.2)加入10mL Lysis Buffer，颠倒混匀，55℃水浴孵育20min；
(2.3)加入30μL Acryl Carrier、240μL蛋白酶K和60μL磁珠，垂直混匀仪混匀30min；
(2.4)3000g离心3min，将上清倒入废液缸，余留约1.8mL上清；
(2.5)将剩余溶液及沉积在底部的磁珠充分混匀后，转移至另一2mL离心管中，置于磁力架上吸附至澄清，吸弃上清；
(2.6)加入800μL wash buffer 1(300μL 0.1M盐酸胍，10mmol/LTris-HCl、pH7.4，1mmol/L EDTA pH8.0)，充分振荡混匀，静置1min，置于磁力架上吸附至澄清，吸弃上清；
(2.7)加入500μL wash buffer 2(无水乙醇)，充分振荡混匀，静置1min，置于磁力架上吸附至澄清，吸弃上清；
(2.8)重复步骤7，吸弃残液；
(2.9)加入800μL wash buffer 3(75％乙醇)，静置1min后吸弃上清；
(2.10)加入60μL elution buffer，55℃水浴15min；
(2.11)高速瞬时离心，置于磁力架上吸附至溶液澄清，吸取上清至新的离心管中，所得即为提取的粪便DNA。
(3)转化：对提取的粪便DNA进行重亚硫酸盐转化及纯化，优选采用ZYMO公司的转化试剂盒EZ-96DNA Methylation-Gold MagPrep(货号：D5042)，但不限于此。转化处理是使未甲基化的C转化为U，从而使得甲基化序列与未甲基化序列在转化后得以存在序列上的差异，从而进行检测，二者在未进行转化处理的时候其序列是相同的。
NDRG4甲基化基因转化前序列(SEQ ID NO.12)：
GGGCCTCGCAGCGCACCCAGCACAGTCCGCGCGGCGGAGCGGGTGAGAAGTCGGCGGGGGCGCGGATCGACCGGGGTGTCCCCCAGGCTCCGCGTCGCGGTCCCCGCTCGCCCTCCCGCCCGCCCACCGGGCACCCCAGCCGCGCAGAAGGCGGAAGCCACGCGCGAGGGACCGCGGTCCGTCCGGGACTAGCCCCAGGCCCGGCACCGCCCCGCGGGCCGAGCG。
NDRG4甲基化基因转化后序列(SEQ ID NO.13)：
GGGTTTCGTAGCGTATTTAGTATAGTTCGCGCGGCGGAGCGGGCGAGAAGTCGGCGGGGGCGCGGATCGATCGGGGTGTTTTTTAGGTTTCGCGTCGCGGTTTTCGTTCGTTTTTTCGTTCGTTTATCGGGTATTTTAGTCGCGTAGAAGGCGGAAGTTACGCGCGAGGGATCGCGGTTCGTTCGGGATTAGTTTTAGGTTCGGTATCGTTTCGCGGGTCGAGCG。
SDC2甲基化基因转化前序列(SEQ ID NO.14)：
TCCGCGGAGGAGCAAAACCACAGCAGAGCAAGAAGAGCTTCAGAGAGCAGCCTTCCCGGAGCACCAACTCCGTGTCGGGAGTGCAGAAACCAACAAGTGAGAGGGCGCCGCGTTCCCGGGGCGCAGCTGCGGGCGGCGGGAGCAGGCGCAGGAGGAGGAAGCGAGCGCCCCCGAGCCCCGAGCCCGAGTCCCCGAGCCTGAGCCGCAATCGCTGCGGTACTCTGCTCCGGATTCGTGTGCGCGGGCTGCGCCGAGCGCTGGGCAGGAGGCTTCGTTTTGCCCTGGTTGCAAGCAGCGGCTGGGAGCAGCCGGTCCCTGGGGAATATGCGGCGC。
SDC2甲基化基因转化后序列(SEQ ID NO.15)：
TTCGCGGAGGAGTAAAATTATAGTAGAGTAAGAAGAGTTTTAGAGAGTAGTTTTTTCGGAGTATTAATTTCGTGTCGGGAGTGTAGAAATTAATAAGTGAGAGGGCGTCGCGTTTTCGGGGCGTAGTTGCGGGCGGCGGGAGTAGGCGTAGGAGGAGGAAGCGAGCGTTTTCGAGTTTCGAGTTCGAGTTTTCGAGTTTGAGTCGTAATCGTTGCGGTATTTTGTTTCGGATTCGTGTGCGCGGGTTGCGTCGAGCGTTGGGTAGGAGGTTTCGTTTTGTTTTGGTTGTAAGTAGCGGTTGGGAGTAGTCGGTTTTTGGGGAATATGCGGCGT。
(4)检测：将转化后的核酸取5μL进行荧光定量PCR检测，试剂盒(检测体系)的总体积为30μL，具体如下表4所示，其中，Hot start Taq酶为热启动Taq酶，10×buffer为10×缓冲液，dNTPs为ATP、TTP、CTP和GTP的混合物，DMSO为二甲亚砜，可商业购得。
表4试剂盒组分及用量
Figure BDA0002147528100000091
Figure BDA0002147528100000101
扩增程序为：
a、50℃预变性2min；
b、95℃变性10min；
c、95℃变性15s，60℃退火30s，荧光采集，循环45次
d、20℃，2min。
(5)结果分析
收集临床样本，有肠镜明确结论的样本才进入提取流程，有病理明确结论的样本才认定为结直肠癌病理阳性样本。以肠镜检测大致正常为阴性，肠镜检出息肉并通过病理检测验证癌症为病理阳性，作为检测的金标准对照。本发明的检测实施样本来源于中南大学湘雅医院共收集有效检测结果的病理阳性以及病理阴性样本共269例，其中结直肠癌阳性样本38例，非结直肠癌样本共231例(腺瘤样本18例，息肉样本18例，炎症及内痔等150例，正常样本45例)。
实验结果显示：样本ACTB基因的CT值在22至42(或无扩增)之间，取95％分位值，CT值<37时判定样本质量合格；ACTB基因的CT值≥37时，则判定本次检测结果无效，需重新检测。在确定样本质量合格的情况下，根据临床需要，采用ROC曲线分析，如图1至图3所示，分析显示单个标志物辅助诊断的灵敏度都较低，特异性较高，两个标志物的联合检测作为辅助诊断手段，灵敏度得到了极大的提高。当NDRG4基因的CT值＜37或SDC2基因的CT值＜42时，判断为阳性，当NDRG4基因的CT值≥37且SDC2基因的CT值≥42时，判断为阴性，此时ROC曲线面积最大，准确度最高。其中灵敏度为0.8802，特异性为0.9236，腺瘤灵敏度为0.4863。从表5可以看出，两个标志物联合，腺瘤的灵敏度也得到了很大的提高，达到了0.4863。我们的检测不仅能早发现腺瘤，而且能够很好的和正常人群进行区分，从而避免误诊带来的恐慌，很适合用于社区门诊以及大量人群的健康筛查。
表5不同标志物的结直肠癌和腺瘤检测灵敏度和特异性
灵敏度(结直肠癌) 特异性(结直肠癌) 灵敏度(腺瘤)
NDRG4 0.7589 0.8812 0.2351
SDC2 0.8264 0.9300 0.3766
SDC2/NDRG4 0.8802 0.9236 0.4863
实施例2
另收集有效检测结果的结直肠癌和腺瘤病理阳性以及病理阴性样本共455例，其中结直肠癌阳性样本57例，非结直肠癌样本共398例，息肉样本22例，炎症及内痔等298例，正常样本58例)对实施例1所建立的方法进行验证，并与实际值进行比对，结果显示：灵敏度为0.8947，特异性为0.9196，腺瘤灵敏度为0.4833，Kappa为0.9165。图4为样本检测内标ACTB的曲线示意图，图5为阳性样本检测曲线示意图。
表6样本矩阵表
Figure BDA0002147528100000111
综合上述分析，SDC2和NDRG4基因联合检测能够很好的同时检出结直肠癌和结直肠腺瘤，且明显优于单靶点检测的检测效果，与目前市面上的产品相比也具有明显优势，且更加符合临床需求。本发明相较于肠镜检查或者血液检查，实现了真正的无创检测，并且采样灵活，不局限在医院环境。本发明针对检测位点进行了针对性的大量样本的临床研究，实现了对癌前病变(腺瘤)较高的检出灵敏度。本发明的试剂盒可用作结直肠癌和腺瘤的早期辅助检查手段之一，针对其中阳性样本再进行肠镜、病理检查确诊，起到分级诊疗的目的。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制。虽然本发明已以较佳实施例揭示如上，然而并非用以限定本发明。任何熟悉本领域的技术人员，在不脱离本发明的精神实质和技术方案的情况下，都可利用上述揭示的方法和技术内容对本发明技术方案做出许多可能的变动和修饰，或修改为等同变化的等效实施例。因此，凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同替换、等效变化及修饰，均仍属于本发明技术方案保护的范围内。
序列表
<110> 人和未来生物科技（长沙）有限公司
<120> 用于结直肠癌和腺瘤辅助诊断的试剂盒及其使用方法
<160> 15
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(23)
<223> 根据实验要求而设计，以作为NDRG4基因的上游引物BS-N4-F的核苷酸序列
<400> 1
gtttcgcgtc gcggttttcg ttc 23
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(22)
<223> 根据实验要求而设计，以作为NDRG4基因的下游引物BS-N4-R的核苷酸序列
<400> 2
cgtaacttcc gccttctacg cg 22
<210> 3
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(27)
<223> 根据实验要求而设计，以作为SDC2基因的上游引物BS- SDC2-F的核苷酸序列
<400> 3
agaaattaat aagtgagagg gcgtcgc 27
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(23)
<223> 根据实验要求而设计，以作为SDC2基因的下游引物BS- SDC2-R的核苷酸序列
<400> 4
aacgctcgct tcctcctcct acg 23
<210> 5
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(26)
<223> 根据实验要求而设计，以作为ACTB基因的上游引物BS-ACT-F的核苷酸序列
<400> 5
gaaagggtgt agttttggga ggttag 26
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(23)
<223> 根据实验要求而设计，以作为ACTB基因的下游引物BS-ACT-R的核苷酸序列
<400> 6
cccaaaacca accacaaaaa aat 23
<210> 7
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(33)
<223> 根据实验要求而设计，以作为NDRG4基因的探针BS-N4-P的核苷酸序列
<400> 7
gttttttcgt tcgtttatcg ggtattttag tcg 33
<210> 8
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(24)
<223> 根据实验要求而设计，以作为SDC2基因的探针BS-SDC2-P的核苷酸序列
<400> 8
ttttcggggc gtagttgcgg gcgg 24
<210> 9
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(33)
<223> 根据实验要求而设计，以作为ACTB基因的探针BS-ACT-P的核苷酸序列
<400> 9
cctcttctaa taaccacctc cctccttcct aac 33
<210> 10
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(23)
<223> 根据实验要求而设计，以作为NDRG4基因的封闭序列BS-N4-C的核苷酸序列
<400> 10
gttttgtgtt gtggtttttg ttc 23
<210> 11
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(27)
<223> 根据实验要求而设计，以作为SDC2基因的封闭序列BS-SDC2-C的核苷酸序列
<400> 11
agaaattaat aagtgagagg gcgtcgc 27
<210> 12
<211> 225
<212> DNA
<213> 人(human)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(225)
<223> NDRG4甲基化基因转化前序列
<400> 12
gggcctcgca gcgcacccag cacagtccgc gcggcggagc gggtgagaag tcggcggggg 60
cgcggatcga ccggggtgtc ccccaggctc cgcgtcgcgg tccccgctcg ccctcccgcc 120
cgcccaccgg gcaccccagc cgcgcagaag gcggaagcca cgcgcgaggg accgcggtcc 180
gtccgggact agccccaggc ccggcaccgc cccgcgggcc gagcg 225
<210> 13
<211> 225
<212> DNA
<213> 人(human)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(225)
<223> NDRG4甲基化基因转化后序列
<400> 13
gggtttcgta gcgtatttag tatagttcgc gcggcggagc gggcgagaag tcggcggggg 60
cgcggatcga tcggggtgtt ttttaggttt cgcgtcgcgg ttttcgttcg ttttttcgtt 120
cgtttatcgg gtattttagt cgcgtagaag gcggaagtta cgcgcgaggg atcgcggttc 180
gttcgggatt agttttaggt tcggtatcgt ttcgcgggtc gagcg 225
<210> 14
<211> 333
<212> DNA
<213> 人(human)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(333)
<223> SDC2甲基化基因转化前序列
<400> 14
tccgcggagg agcaaaacca cagcagagca agaagagctt cagagagcag ccttcccgga 60
gcaccaactc cgtgtcggga gtgcagaaac caacaagtga gagggcgccg cgttcccggg 120
gcgcagctgc gggcggcggg agcaggcgca ggaggaggaa gcgagcgccc ccgagccccg 180
agcccgagtc cccgagcctg agccgcaatc gctgcggtac tctgctccgg attcgtgtgc 240
gcgggctgcg ccgagcgctg ggcaggaggc ttcgttttgc cctggttgca agcagcggct 300
gggagcagcc ggtccctggg gaatatgcgg cgc 333
<210> 15
<211> 333
<212> DNA
<213> 人(human)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(333)
<223> SDC2甲基化基因转化后序列
<400> 15
ttcgcggagg agtaaaatta tagtagagta agaagagttt tagagagtag ttttttcgga 60
gtattaattt cgtgtcggga gtgtagaaat taataagtga gagggcgtcg cgttttcggg 120
gcgtagttgc gggcggcggg agtaggcgta ggaggaggaa gcgagcgttt tcgagtttcg 180
agttcgagtt ttcgagtttg agtcgtaatc gttgcggtat tttgtttcgg attcgtgtgc 240
gcgggttgcg tcgagcgttg ggtaggaggt ttcgttttgt tttggttgta agtagcggtt 300
gggagtagtc ggtttttggg gaatatgcgg cgt 333

Claims (8)

1.一种用于结直肠癌和腺瘤辅助诊断的试剂盒，其特征在于，包括引物组合物、探针组合物和封闭序列组合物，所述引物组合物由用于检测NDRG4基因的引物对BS-N4-F和BS-N4-R、用于检测SDC2基因的引物对BS-SDC2-F和BS-SDC2-R以及用于检测作为内参的ACTB基因的引物对BS-ACT-F和BS-ACT-R组成，
所述BS-N4-F的DNA序列如SEQ ID NO.1所示，
所述BS-N4-R的DNA序列如SEQ ID NO.2所示，
所述BS-SDC2-F的DNA序列如SEQ ID NO.3所示，
所述BS-SDC2-R的DNA序列如SEQ ID NO.4所示，
所述BS-ACT-F的DNA序列如SEQ ID NO.5所示，
所述BS-ACT-R的DNA序列如SEQ ID NO.6所示，
所述探针组合物由NDRG4基因的探针BS-N4-P、SDC2基因的探针BS-SDC2-P和ACTB基因的探针BS-ACT-P组成，
所述BS-N4-P的DNA序列如SEQ ID NO.7所示，
所述BS-SDC2-P的DNA序列如SEQ ID NO.8所示，
所述BS-ACT-P的DNA序列如SEQ ID NO.9所示，
所述封闭序列组合物由NDRG4基因的封闭序列BS-N4-C和SDC2基因的封闭序列BS-SDC2-C组成，
所述BS-N4-C的DNA序列如SEQ ID NO.10所示，
所述BS-SDC2-C的DNA序列如SEQ ID NO.11所示。
2.根据权利要求1所述的用于结直肠癌和腺瘤辅助诊断的试剂盒，其特征在于，所述BS-N4-C和所述BS-SDC2-C的3’端均进行磷酸化修饰。
3.根据权利要求1所述的用于结直肠癌和腺瘤辅助诊断的试剂盒，其特征在于，所述BS-N4-P采用ROX和BHQ2标记，所述BS-SDC2-P采用CY5和BHQ2标记，所述BS-ACT-P采用HEX和BHQ1标记。
4.根据权利要求1所述的用于结直肠癌和腺瘤辅助诊断的试剂盒，其特征在于，所述引物组合物中各引物的浓度为0.1μM～0.2μM，所述探针组合物中各探针的浓度为0.1μM～0.2μM，所述封闭序列组合物中各封闭序列的浓度为0.1μM～0.2μM。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的用于结直肠癌和腺瘤辅助诊断的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括Hot start Taq酶、10×buffer、dNTPs、NH4Cl、DMSO和去离子水。
6.根据权利要求5所述的用于结直肠癌和腺瘤辅助诊断的试剂盒，其特征在于，所述dNTPs浓度为10mM，所述NH4Cl的浓度为250mM，所述DMSO的体积浓度为100％。
7.一种如权利要求1～6中任一项所述的用于结直肠癌和腺瘤辅助诊断的试剂盒的使用方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)采样：采集粪便样本置于粪便样本保护液中；
(2)提取：采用磁珠法进行粪便DNA提取；
(3)转化：对提取的粪便DNA进行重亚硫酸盐转化及纯化；
(4)检测：将转化及纯化后的粪便DNA用试剂盒进行荧光定量PCR检测；
(5)结果分析：当ACTB基因的CT值＜37时，NDRG4基因的CT值＜37或SDC2基因的CT值＜42，判断为阳性；
当ACTB基因的CT值＜37时，NDRG4基因的CT值≥37且SDC2基因的CT值≥42，判断为阴性；
当ACTB基因的CT值≥37时，检测结果无效，需重新检测。
8.根据权利要求7所述的用于结直肠癌和腺瘤辅助诊断的试剂盒的使用方法，其特征在于，所述步骤(4)中，所述荧光定量PCR检测的反应程序为：50℃预变性2min，95℃变性10min，然后以95℃变性15s、60℃退火30s为一个循环进行45次，最后20℃保持2min。
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