CN113862364A - 结直肠癌诊断标志物、pap检测探针以及结直肠癌的检测试剂盒 - Google Patents

结直肠癌诊断标志物、pap检测探针以及结直肠癌的检测试剂盒 Download PDF

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CN113862364A CN202111263689.3A CN202111263689A CN113862364A CN 113862364 A CN113862364 A CN 113862364A CN 202111263689 A CN202111263689 A CN 202111263689A CN 113862364 A CN113862364 A CN 113862364A
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Abstract

本发明公开了结直肠癌诊断标志物、PAP检测探针以及结直肠癌的检测试剂盒。所述结直肠癌诊断标志物选自KRAS‑G12D、KRAS‑G12C、KRAS‑G13D、KRAS‑Q61H、NRAS‑Q61K、NRAS‑Q61R、NRAS‑G12D或BRAF‑V600E。本发明所述结直肠癌诊断标志物与结直肠癌密切相关，对于结直肠癌的表征具有较高的可靠性，采用所述结直肠癌标志物的组合，能够辅助评价结直肠癌患者的预后、对于化疗效果的预测以及选择有效靶向药物。本发明提供的检测试剂盒含有高特异性的PAP探针以及用于反应质控的阴性和阳性模板，能够高特异性地实现结直肠癌标志物的体外扩增且准确性高。

Description

结直肠癌诊断标志物、PAP检测探针以及结直肠癌的检测试 剂盒
技术领域
本发明涉及肿瘤诊断标志物，尤其涉及结直肠癌诊断标志物以及检测PAP探针，本发明进一步涉及结直肠癌的检测试剂盒，属于结直肠癌诊断或检测领域。
背景技术
人体在各种不良因素的作用下，身体内部某个或者某些部位组织中的细胞发生异常增生而形成肿瘤，发生异常增生的细胞就是肿瘤细胞。根据肿瘤细胞的特性及其对机体的危害性程度，可将肿瘤分为良性肿瘤和恶性肿瘤两大类。在医学上，癌是指起源于上皮组织的恶性肿瘤，是恶性肿瘤中最常见的一类，一般人们所说的“癌症”习惯上泛指所有恶性肿瘤。
结直肠癌是常见的恶性肿瘤，发病率高，早期没有明显症状，传统检测方法如大便隐血存在灵敏度和特异度较低，而结肠镜检查为有创检查，患者依从性差，检查花费高。在结直肠诊治过程中，缺乏简单有效的无创手段监测患者的治疗效果和复发。因此，急需一种无创、经济和高效的检测手段对结直肠癌患者进行病程管理，从而在基因分型指导下进行个体化治疗，对于指导临床用药至关重要。有研究表明，RAS通路在结直肠癌的发生和发展过程中起着重要作用，而KRAS、BRAF突变对于化疗方案的选择和预测治疗效果有着重要意义，通过检测RAS通路中KRAS、NRAS和BRAF基因的突变来诊断结直肠癌也逐渐被国内外广泛使用。目前，常通过实时定量聚合酶链锁反应(Quantitative Realtime Polymerase ChainReaction，Q-PCR)、多重引物PCR(multiplex PCR)和诊断试剂盒等方式对患者进行相关位点的基因突变检测。
CN110894530A公开了一种结肠癌相关分子标志物基因突变的crRNA、检测试剂盒与检测方法，所述crRNA包括：KRAS-exon2突变位点的crRNA、KRAS-exon3突变位点的crRNA、NRAS-exon2基因突变位点的crRNA以及BRAF基因突变位点的crRNA，能够实现多位点同时检测，但检测方法的特异性需要进一步提高。
CN102304581A公开了一种用于检测KRAS基因第2外显子密码子12和/或密码子13突变的试剂盒，包括特异性引物对，可以检测KRAS基因外显子2密码子12和密码子13上的所有突变类型，但检测方法的准确性需要进一步提高。
因此，提供一种特异性高、准确性高、步骤简便、成本较低的结肠癌相关基因检测方法指导病程管理，在结肠癌症治疗领域具有重要意义。
发明内容
本发明的目的之一是提供结直肠癌诊断标志物；
本发明的目的之二提供检测所述结直肠癌标志物的PAP探针；
本发明的目的之三将所述的结直肠癌诊断标志物及其PAP探针应用于检测结直肠癌，进而提供诊断或检测结直肠癌的试剂盒。
为实现上述之目的，本发明一方面提供了结直肠癌诊断标志物，所述结直肠癌诊断标志物选自KRAS-G12D、KRAS-G12C、KRAS-G13D、KRAS-Q61H、NRAS-Q61K、NRAS-Q61R、NRAS-G12D或BRAF-V600E中的任意一种或一种以上的任意组合。
其中，所述“KRAS-G12D”是指KRAS的第2外显子第12位由甘氨酸(G)突变为天冬氨酸(D)，作为本发明一种优选的具体实施方案，所述KRAS-G12D是包括SEQ ID NO:1所示的核酸序列。
所述“KRAS-G12C”是指KRAS第2外显子第12位由甘氨酸(G)突变为半胱氨酸(C)，作为本发明一种优选的具体实施方案，所述KRAS-G12C是包括SEQ ID NO:2所示的核酸序列。
所述“KRAS-G13D”是指KRAS第2外显子第13位由甘氨酸(G)突变为天冬氨酸(D)，作为本发明一种优选的具体实施方案，所述KRAS-G13D是包括SEQ ID NO:3所示的核酸序列。
所述“KRAS-Q61H”指KRAS第3外显子第61位由谷氨酰胺(Q)突变为组氨酸(H)，作为本发明一种优选的具体实施方案，所述KRAS-Q61H是包括SEQ ID NO:4所示的核酸序列。
所述“NRAS-Q61K”是指NRAS第3外显子第61位由谷氨酰胺(Q)突变赖氨酸(K)，作为本发明一种优选的具体实施方案，所述NRAS-Q61K是包括SEQ ID NO:5所示的核酸序列。
所述“NRAS-Q61R”指NRAS第3外显子第61位由谷氨酰胺(Q)突变精氨酸(R)，作为本发明一种优选的具体实施方案，所述NRAS-Q61R包括SEQ ID NO:6所示的核酸序列。
所述“NRAS-G12D”指NRAS第2外显子第12位由甘氨酸(G)突变为天冬氨酸(D)，作为本发明一种优选的具体实施方案，所述NRAS-G12D是包括SEQ ID NO:7所示的核酸序列。
所述“BRAF-V600E”指BRAF的外显子15第600位氨基酸由缬氨酸(V)变为谷氨酸(E)，作为本发明一种优选的具体实施方案，所述BRAF-V600E是包括SEQ ID NO:8所示的核酸序列。
本发明的另一方面是提供检测结直肠癌标志物KRAS-G12D、KRAS-G12C、KRAS-G13D、KRAS-Q61H、NRAS-Q61K、NRAS-Q61R、NRAS-G12D或BRAF-V600E的PAP探针。
本发明一种优选的具体实施方案，所述检测结直肠癌标志物KRAS-G12D的PAP探针包括SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10所示的核酸序列；检测所述KRAS-G12C的PAP探针包括SEQID NO:11和SEQ ID NO:12所示的核酸序列；检测所述KRAS-G13D的PAP探针包括SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14所示的核酸序列；检测所述KRAS-Q61H的PAP探针包括SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16所示的核酸序列；检测所述NRAS-Q61K的PAP探针包括SEQ ID NO:17和SEQ IDNO:18所示序列的核酸序列；检测所述NRAS-Q61R的PAP探针包括SEQ ID NO:19和SEQ IDNO:20所示的核酸序列；检测所述NRAS-G12D的PAP探针包括SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:22所示的核酸序列；检测所述BRAF-V600E的PAP探针包括SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:24所示的核酸序列。
作为本发明一种更优选的实施方案，所述检测结直肠癌标志物KRAS-G12D、KRAS-G12C、KRAS-G13D、KRAS-Q61H、NRAS-Q61K、NRAS-Q61R、NRAS-G12D或BRAF-V600E的PAP探针的3’端碱基均被进行双脱氧修饰，实现了焦磷酸解激活聚合反应(Pyrophosphorolysis-activated polymerization，PAP)与甲基化PCR的结合，进一步提高了PAP检测探针的特异性。
本发明的再一方面是提供一种结直肠癌的检测试剂盒，所述检测试剂盒包括DNA聚合酶、Na4PPi、dNTPs、荧光染料、缓冲液和PAP检测探针；其中，所述的PAP检测探针是上述检测结直肠癌标志物KRAS-G12D、KRAS-G12C、KRAS-G13D、KRAS-Q61H、NRAS-Q61K、NRAS-Q61R、NRAS-G12D或BRAF-V600E的PAP检测探针中的任何一种。
作为本发明一种优选的具体实施方案，所述DNA聚合酶包括Taq DNA聚合酶，进一步优选为KlenTaq-s；所述荧光染料包括SYBRGreenⅠ。
作为本发明一种优选的具体实施方案，所述结直肠癌的检测试剂盒还包括二甲基亚砜。
作为本发明进一步优选的具体实施方案，所述结直肠癌的检测试剂盒还包括阳性模板和阴性模板；其中，所述阳性模板为含有所述结直肠癌诊断标志物的DNA的质粒。
所述阴性模板为含有所述的结直肠癌诊断标志物的野生型DNA的质粒，具体的，包括：结直肠癌诊断标志物KRAS-G12D的野生型DNA、结直肠癌诊断标志物KRAS-G12C的野生型DNA、结直肠癌诊断标志物KRAS-G13D的野生型DNA、结直肠癌诊断标志物KRAS-Q61H的野生型DNA、结直肠癌诊断标志物NRAS-Q61K的野生型DNA、结直肠癌诊断标志物NRAS-Q61R的野生型DNA、结直肠癌诊断标志物NRAS-G12D的野生型DNA和BRAF-V600E的野生型DNA。
作为本发明一种优选的具体实施方案，所述KRAS-G12D的野生型DNA包括SEQ IDNO:25所示的核酸序列；所述KRAS-G12C的野生型DNA包括SEQ ID NO:26所示的核酸序列；所述KRAS-G13D的野生型DNA包括SEQ ID NO:27所示的核酸序列；所述KRAS-Q61H的野生型DNA包括SEQ ID NO:28所示的核酸序列；所述NRAS-Q61K的野生型DNA包括SEQ ID NO:29所示的核酸序列；所述NRAS-Q61R的野生型DNA包括SEQ ID NO:30所示的核酸序列；所述NRAS-G12D的野生型DNA包括SEQ ID NO:31所示的核酸序列；所述BRAF-V600E的野生型DNA包括SEQ IDNO:32所示的核酸序列。
作为本发明进一步优选的具体实施方案，所述质粒包括pUC19。
本发明的再一方面是提供应用所述结直肠癌的检测试剂盒诊断结直肠癌的方法，该方法包括：(1)采集待检测样品的样品DNA；(2)建立实时定量PCR的反应体系对样品DNA进行实时定量PCR扩增；(3)根据达到相同荧光域值的扩增循环数，进行反应质控和数据分析，判定检测样品是突变阳性还是阴性。
作为本发明一种优选的具体实施方案，所述样品DNA来源于石蜡包埋病理切片组织DNA、粪便DNA或外周血cfDNA；
作为本发明一种优选的具体实施方案，所述实时定量PCR的反应体系包括：结直肠癌标志物的PAP探针、KlenTaq-s、dNTPs、Na4PPi、SYBRGreenⅠ、缓冲液(10×Buffer)、二甲基亚砜(DMSO)和模板DNA。
作为本发明一种优选的实施方案，所述实时定量PCR的反应体系可按如下体系配制：2～3μL 10×Buffer、0.5～1.5μL Na4PPi、1.5～2.5μL二甲基亚砜、0.5～1.5μL dNTPs、0.5～1.5μL SYBRGreenⅠ、0.1～0.5μL KlenTaq-s、12～14μL ddH2O、结直肠癌标志物的PAP探针各0.5～1.5μL以及0.5～1.5μL模板DNA。
作为参考，本发明提供了一种实时定量PCR的条件，包括：90～95℃预变性30～35s；90～95℃变性25～30s，60～62℃退火25～30s，64～65℃25～35s，65～70℃25～30s，70～75℃25～30s，35～40个循环；2～4℃保存。
作为本发明一种优选的实施方案，所述模板DNA包括cfDNA、阳性模板或阴性模板中的任意一种。
所述反应质控的判断标准为：阳性模板的扩增循环数＜25，阴性模板的扩增循环数＞38或者无扩增，判断反应质控合格。
所述数据分析为将样品DNA的结果与阴性模板的结果进行比较，所述样品DNA的扩增循环数小于所述阴性模板的扩增循环数2个以上，判断为突变阳性。
本发明再一方面是提供一种结直肠癌标志物的检测装置，所述检测装置包括：
(1)样品制备单元：包括用于从石蜡包埋病理切片组织样本、粪便样本或外周血样本中提取DNA和/或cfDNA；
(2)实时定量PCR单元，包括体系配制模块和程序运行模块，用于配制实时定量PCR反应体系并运行PCR反应程序；
(3)数据分析单元，用于进行反应质控和数据分析。
作为本发明一种优选的实施方案，所述体系配制模块用于配制实时定量PCR反应体系，所述实时定量PCR反应体系包括2～3μL 10×Buffer、0.5～1.5μL Na4PPi、1.5～2.5μL二甲基亚砜、0.5～1.5μL dNTPs、0.5～1.5μL SYBRGreenⅠ、0.1～0.5μL KlenTaq-s、12～14μL ddH2O、结直肠癌标志物的PAP探针各0.5～1.5μL以及0.5～1.5μL cfDNA或0.5～1.5μL阳性模板或0.5～1.5μL阴性模板。
作为本发明一种优选的实施方案，所述程序运行模块用于进行实时定量PCR，所述实时定量PCR的条件为：90～95℃预变性30～35s；90～95℃变性25～30s，60～62℃退火25～30s，64～65℃25～35s，65～70℃25～30s，70～75℃25～30s，35～40个循环；2～4℃保存。
作为本发明一种优选的实施方案，所述反应质控的判断标准为：阳性模板的扩增循环数＜20，阴性模板的扩增循环数＞38或者无扩增，判断反应质控合格。
作为本发明一种优选的实施方案，所述数据分析为将样品DNA的结果与阴性模板的结果进行比较。
作为本发明一种优选的实施方案，，所述样品DNA的扩增循环数小于所述阴性模板的扩增循环数2个以上，判断为突变阳性。
本发明所述结直肠癌诊断标志物与结直肠癌密切相关，对于结直肠癌的表征具有较高的可靠性。本发明通过采用含有上述8种结直肠癌标志物的组合，其能够辅助评价结直肠癌患者的预后、对于化疗效果的预测以及选择有效靶向药物。本发明的结直肠癌标志物检测试剂盒，含有高特异性的PAP探针，能够高特异性地实现结直肠癌标志物的体外扩增，还含有用于反应质控的阴性和阳性模板，具有较高的准确性，在制备结直肠癌诊断试剂和/或结直肠癌检测设备领域中具有应用前景。
(1)本发明的结直肠癌标志物与结直肠癌密切相关，对于结直肠癌的表征具有较高的可靠性；
(2)本发明的结直肠癌标志物检测试剂盒，含有检测结直肠癌标志物的PAP探针，能够高特异性地实现结直肠癌标志物的体外扩增；
(3)本发明的试剂盒中还含有用于反应质控的阴性和阳性模板，有利于提高检测准确性，在制备结直肠癌诊断试剂和/或结直肠癌检测设备领域中具有广阔的应用前景。
附图说明
图1在野生型DNA中不同突变DNA所占比例的模板的PCR扩增敏感度检测结果。
图2阴性模板条件下探针的扩增效率结果。
图3探针的PAP扩增效率曲线。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。
实施例1采用结直肠癌标志物KRAS-G12D及其PAP检测探针检测结直肠癌
(1)制备cfDNA
用EDTA抗凝采血管采集病人新鲜全血5mL，将全血混匀后在4℃、3000rpm下离心10min，取白膜层上层，即为血浆；
使用Qiagen试剂盒(QIAseqcfDNAExtractionKit,Cat.180025)按照说明书提取血浆中cfDNA。
(2)制备阴性模板和阳性模板
利用索莱宝动物组织/细胞基因组DNA提取试剂盒(D1700)，提取人类正常胰腺导管上皮细胞系HPDE6-C7的基因组DNA，以基因组DNA为PCR模板，设计KRAS-G12D所在片段的PCR引物。
向200μL微型管中加入11μL ddH2O、0.5μL上游引物、0.5μL下游引物、0.5μLHPDE6-C7基因组DNA和12.5μL 2×PrimeSTAR DNA聚合酶，终反应体系为25μL；配制后混匀、离心，PCR上机，设定程序为98℃1min；60℃5s，72℃10s，72℃15s，35个循环；12℃5min；PCR反应结束后下机，将PCR产物加入琼脂糖胶中进行电泳检测(180V，20min)，将产物所在条带用全式金Easypure PCR Purification Kit(CAT.EP101-01)按照说明书切胶回收，用Nanodrop 8000检测回收PCR产物浓度。
用内切酶EcoRI和BamHI分别酶切PCR产物和pUC19质粒，反应体系为：5μg PCR产物或质粒，1.5μL EcoRI，1.5μL BamHI，6μL Buffer A，水补齐至60μL；37℃酶切过夜，然后进行琼脂糖凝胶电泳，用全式金Easypure PCR Purification Kit按说明书分别回收PCR产物的酶切产物和pUC19质粒酶切产物；配制连接体系(12μL)：2μL pUC19质粒酶切产物，1μLPCR产物的酶切产物，1μL T4连接酶，1.2μL T4连接酶buffer，6.8μL ddH2O；室温孵育3h，获得连接产物。
使用热激法进行转化，将7μL连接产物与30μL Stbl3感受态细胞混匀，先冰浴30min，然后45℃水浴90s，再冰浴3min，加入450μL SOC培养基，恒温摇床培养1h(37℃，150rpm)；取出离心(4500rpm，5min)，小心吸出上清液，再加入40μL SOC培养基与沉淀混匀，并将其均匀涂布于预先制备好的具备氨苄霉素抗性的LB琼脂平板上，37℃培养过夜；待菌落饱满，挑取单克隆菌落接入含有氨苄霉素的LB液体培养基中，恒温摇床培养过夜(37℃，200rpm)，利用Tiangen质粒小提中量试剂盒提取质粒，并送一代测序验证序列的正确性；
测序验证正确的质粒，即为阴性模板(109拷贝数)，其中，阴性模板含有SEQ IDNO:25所示的核酸序列。
对阴性模板上SEQ ID NO:25所示的核酸序列中的进行点突变，即获得阳性模板，阳性模板含有SEQ ID NO:1所示的核酸序列。
(3)实时定量PCR
cfDNA、阴性模板和阳性模板的实时定量PCR反应体系按表1配制。
表1实时定量PCR反应体系
成分 体积(μL)
10×Buffer 2.5
Na<sub>4</sub>PPi 1
DMSO 2
dNTPs 1
SYBRGreenⅠ 1
KlenTaq-s 0.3
Kras G12D-F(SEQ ID NO:9) 1
Kras G12D-R(SEQ ID NO:10) 1
cfDNA/阴性模板/阳性模板 1
ddH<sub>2</sub>O 13.2
总体积 24
使用Biorad系列实时定量PCR扩增仪进行实时定量PCR，设定程序为：95℃预变性30s；95℃变性25s，60℃退火30s，64℃30s，68℃30s，72℃30s，40个循环；4℃保存。
(4)反应质控和数据分析
cfDNA的反应、阴性模板的反应、阳性模板的反应结果分别如图1-3所示，在本例突变位点中，本发明试剂盒检测的患者血液cfDNA样本的循环数与阴性模板比较，如相差3个循环以上即定义为阳性，相差3个循环以内定义为阴性，本发明试剂盒检测结果同时与相应患者血cfDNA的二代测序结果对比，发现检测结果与二代测序结果检测到的突变一致，如表2所示。
表2本发明检测试剂盒检测结果与测序结果对比
Figure BDA0003320148210000111
实施例2采用结直肠癌标志物KRAS-G12C及其PAP检测探针检测结直肠癌
本实施例对结直肠癌标志物KRAS-G12C进行检测，与实施例1相比，区别仅在于：
步骤(2)的PCR引物为KRAS-G12C的引物；阴性模板含有SEQ ID NO:26所示的核酸序列。对阴性模板上SEQ ID NO:26所示的核酸序列中的进行点突变，即获得阳性模板，阳性模板含有SEQ ID NO:2所示的核酸序列；
步骤(3)的PAP探针为Kras G12C-F(SEQ ID NO:11)和Kras G12C-R(SEQ ID NO:12)。
其它与实施例1相同。
本发明试剂盒检测结果与二代测序检测结果进行比较分析，检测结果如表3所示。
表3本发明检测试剂盒检测结果与测序结果对比
Figure BDA0003320148210000121
实施例3采用结直肠癌标志物KRAS-G13D及其PAP检测探针检测结直肠癌
本实施例对结直肠癌标志物KRAS-G13D进行检测，与实施例1相比，区别仅在于：
步骤(2)的PCR引物为KRAS-G13D的引物；阴性模板含有SEQ ID NO:27所示的核酸序列。对阴性模板上SEQ ID NO:27所示的核酸序列中的进行点突变，即获得阳性模板，阳性模板含有SEQ ID NO:3所示的核酸序列；
步骤(3)的PAP探针为KRAS-G13D的PAP探针：Kras G13D-F(SEQ ID NO:13)和KrasG13D-R(SEQ ID NO:14)；
其它与实施例1相同。
本发明试剂盒检测结果与二代测序检测结果进行比较分析，检测结果如表4所示。
表4本发明试剂盒检测结果与二代测序检测结果对比
患者ID 本发明试剂盒检测循环数 本发明试剂盒检测结果 二代测序(NGS)检测结果
C001 39.96 - -
C002 41.23 - -
C005 30.12 + +
C006 28.24 + +
C007 42.31 - -
C021 41.12 - -
C022 39.13 - -
C025 41.43 - -
阳性模板 19.34 + /
阴性模板 44.13 - /
空白对照 - - /
实施例4采用结直肠癌标志物KRAS-Q61H及其PAP检测探针检测结直肠癌
本实施例对结直肠癌标志物KRAS-Q61H进行检测，与实施例1相比，区别仅在于：
步骤(2)的PCR引物为KRAS-Q61H的引物；阴性模板含有SEQ ID NO:28所示的核酸序列。对阴性模板上SEQ ID NO:28所示的核酸序列中的进行点突变，即获得阳性模板，阳性模板含有SEQ ID NO:4所示的核酸序列；
步骤(3)的PAP探针为KRAS-Q61H的PAP探针：Kras Q61H-F(SEQ ID NO:15)和KrasQ61H-R(SEQ ID NO:16)；
其它与实施例1相同。
本发明试剂盒检测结果与二代测序检测结果进行比较分析，检测结果如表5所示。
表5本发明试剂盒检测结果与二代测序检测结果对比
患者ID 本发明试剂盒检测循环数 本发明试剂盒检测结果 二代测序(NGS)检测结果
C001 40.32 - -
C002 42.35 - -
C005 45.33 - -
C006 - - -
C007 42.56 - -
C021 42.11 - -
C022 25.45 + +
C025 23.23 + +
阳性模板 16.34 + /
阴性模板 39.13 - /
空白对照 - - /
实施例5采用结直肠癌标志物NRAS-Q61K及其PAP检测探针检测结直肠癌
本实施例对结直肠癌标志物NRAS-Q61K进行检测，与实施例1相比，区别仅在于：
步骤(2)的PCR引物为NRAS-Q61K的引物；阴性模板含有SEQ ID NO:29所示的核酸序列。对阴性模板上SEQ ID NO:29所示的核酸序列中的进行点突变，即获得阳性模板，阳性模板含有SEQ ID NO:5所示的核酸序列；
步骤(3)的PAP探针为NRAS-Q61K的PAP探针：Nras-Q61K-F(SEQ ID NO:17)和Nras-Q61K-R(SEQ ID NO:18)；
其它与实施例1相同。
本发明试剂盒检测结果与二代测序检测结果进行比较分析，检测结果如表6所示。
表6本发明试剂盒检测结果与二代测序检测结果对比
Figure BDA0003320148210000141
Figure BDA0003320148210000151
实施例6采用结直肠癌标志物NRAS-Q61R及其PAP检测探针检测结直肠癌
本实施例对结直肠癌标志物NRAS-Q61R进行检测，与实施例1相比，区别仅在于：
步骤(2)的PCR引物为NRAS-Q61R的引物；阴性模板含有SEQ ID NO:30所示的核酸序列。对阴性模板上SEQ ID NO:30所示的核酸序列中的进行点突变，即获得阳性模板，阳性模板含有SEQ ID NO:6所示的核酸序列；
步骤(3)的PAP探针为NRAS-Q61R的PAP探针：Nras-Q61R-F(SEQ ID NO:19)和Nras-Q61R-R(SEQ ID NO:20)；
其它与实施例1相同。
本发明试剂盒检测结果与二代测序检测结果进行比较分析，检测结果如表7所示。
表7本发明试剂盒检测结果与二代测序检测结果对比
Figure BDA0003320148210000152
Figure BDA0003320148210000161
实施例7采用结直肠癌标志物NRAS-G12D及其PAP检测探针检测结直肠癌
本实施例对结直肠癌标志物NRAS-G12D进行检测，与实施例1相比，区别仅在于：
步骤(2)的PCR引物为NRAS-G12D的引物；阴性模板含有SEQ ID NO:31所示的核酸序列。对阴性模板上SEQ ID NO:31所示的核酸序列中的进行点突变，即获得阳性模板，阳性模板含有SEQ ID NO:7所示的核酸序列；
步骤(3)的PAP探针为NRAS-G12D的PAP探针：Nras-G12D-F(SEQ ID NO:21)和Nras-G12D-R(SEQ ID NO:22)；
其它与实施例1相同。
本发明试剂盒检测结果与二代测序检测结果进行比较分析，检测结果如表8所示。
表8本发明试剂盒检测结果与二代测序检测结果比较对比
Figure BDA0003320148210000162
Figure BDA0003320148210000171
实施例8采用结直肠癌标志物BRAF-V600E及其PAP检测探针检测结直肠癌
本实施例对结直肠癌标志物BRAF-V600E进行检测，与实施例1相比，区别仅在于：
步骤(2)的PCR引物为BRAF-V600E的引物；阴性模板含有SEQ ID NO:32所示的核酸序列。对阴性模板上SEQ ID NO:32所示的核酸序列中的进行点突变，即获得阳性模板，阳性模板含有SEQ ID NO:8所示的核酸序列；
步骤(3)的PAP探针为BRAF-V600E的PAP探针：Braf-V600E-F(SEQ ID NO:23)Braf-V600E-R(SEQ ID NO:24)；
其它与实施例1相同。
本发明试剂盒检测结果与二代测序检测结果进行比较分析，检测结果如表9所示。
表9本发明试剂盒检测结果与二代测序检测结果对比
Figure BDA0003320148210000172
Figure BDA0003320148210000181
序列表
<110> 天津市肿瘤医院（天津医科大学肿瘤医院）
<120> 结直肠癌诊断标志物、PAP检测探针以及结直肠癌的检测试剂盒
<130> 0028
<160> 32
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 55
<212> DNA
<213> Artifical sequence
<400> 1
tgactgaata taaacttgtg gtagttggag ctgatggcgt aggcaagagt gcctt 55
<210> 2
<211> 55
<212> DNA
<213> Artifical sequence
<400> 2
atgactgaat ataaacttgt ggtagttgga gcttgtggcg taggcaagag tgcct 55
<210> 3
<211> 55
<212> DNA
<213> Artifical sequence
<400> 3
ctgaatataa acttgtggta gttggagctg gtgacgtagg caagagtgcc ttgac 55
<210> 4
<211> 48
<212> DNA
<213> Artifical sequence
<400> 4
ttggatattc tcgacacagc aggtcacgag gagtacagtg caatgagg 48
<210> 5
<211> 51
<212> DNA
<213> Artifical sequence
<400> 5
ttggacatac tggatacagc tggaaaagaa gagtacagtg ccatgagaga c 51
<210> 6
<211> 51
<212> DNA
<213> Artifical sequence
<400> 6
ttggacatac tggatacagc tggacgagaa gagtacagtg ccatgagaga c 51
<210> 7
<211> 38
<212> DNA
<213> Artifical sequence
<400> 7
tggtggtggt tggagcagat ggtgttggga aaagcgca 38
<210> 8
<211> 56
<212> DNA
<213> Artifical sequence
<400> 8
agtaaaaata ggtgattttg gtctagctac agaagaaatc tcgatggagt gggtcc 56
<210> 9
<211> 36
<212> DNA
<213> Artifical sequence
<400> 9
tgactgaata taaacttgtg gtagttggag ctgdda 36
<210> 10
<211> 24
<212> DNA
<213> Artifical sequence
<400> 10
aaggcactct tgcctacgcc addt 24
<210> 11
<211> 36
<212> DNA
<213> Artifical sequence
<400> 11
atgactgaat ataaacttgt ggtagttgga gctddt 36
<210> 12
<211> 24
<212> DNA
<213> Artifical sequence
<400> 12
aggcactctt gcctacgcca cdda 24
<210> 13
<211> 36
<212> DNA
<213> Artifical sequence
<400> 13
ctgaatataa acttgtggta gttggagctg gtgdda 36
<210> 14
<211> 24
<212> DNA
<213> Artifical sequence
<400> 14
gtcaaggcac tcttgcctac gddt 24
<210> 15
<211> 29
<212> DNA
<213> Artifical sequence
<400> 15
ttggatattc tcgacacagc aggtcaddc 29
<210> 16
<211> 24
<212> DNA
<213> Artifical sequence
<400> 16
cctcattgca ctgtactcct cddg 24
<210> 17
<211> 27
<212> DNA
<213> Artifical sequence
<400> 17
ttggacatac tggatacagc tggadda 27
<210> 18
<211> 29
<212> DNA
<213> Artifical sequence
<400> 18
gtctctcatg gcactgtact cttcttddt 29
<210> 19
<211> 28
<212> DNA
<213> Artifical sequence
<400> 19
ttggacatac tggatacagc tggacddg 28
<210> 20
<211> 28
<212> DNA
<213> Artifical sequence
<400> 20
gtctctcatg gcactgtact cttctddc 28
<210> 21
<211> 21
<212> DNA
<213> Artifical sequence
<400> 21
tggtggtggt tggagcagdd a 21
<210> 22
<211> 22
<212> DNA
<213> Artifical sequence
<400> 22
tgcgcttttc ccaacaccad dt 22
<210> 23
<211> 35
<212> DNA
<213> Artifical sequence
<400> 23
agtaaaaata ggtgattttg gtctagctac agdda 35
<210> 24
<211> 25
<212> DNA
<213> Artifical sequence
<400> 24
ggacccactc catcgagatt tcddt 25
<210> 25
<211> 55
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 25
tgactgaata taaacttgtg gtagttggag ctggtggcgt aggcaagagt gcctt 55
<210> 26
<211> 56
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 26
atgactgaat ataaacttgt ggtagttgga gctgtgtggc gtaggcaaga gtgcct 56
<210> 27
<211> 55
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 27
ctgaatataa acttgtggta gttggagctg gtggcgtagg caagagtgcc ttgac 55
<210> 28
<211> 48
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 28
ttggatattc tcgacacagc aggtcaagag gagtacagtg caatgagg 48
<210> 29
<211> 51
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 29
ttggacatac tggatacagc tggacaagaa gagtacagtg ccatgagaga c 51
<210> 30
<211> 51
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 30
ttggacatac tggatacagc tggacaagaa gagtacagtg ccatgagaga c 51
<210> 31
<211> 38
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 31
tggtggtggt tggagcaggt ggtgttggga aaagcgca 38
<210> 32
<211> 56
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 32
agtaaaaata ggtgattttg gtctagctac agtagaaatc tcgatggagt gggtcc 56

Claims (10)

1.结直肠癌诊断标志物，其特征在于，所述结直肠癌诊断标志物选自KRAS-G12D、KRAS-G12C、KRAS-G13D、KRAS-Q61H、NRAS-Q61K、NRAS-Q61R、NRAS-G12D或BRAF-V600E中的任意一种或一种以上的任意组合。
2.按照权利要求1所述的结直肠癌诊断标志物，其特征在于，所述KRAS-G12D是指KRAS的第2外显子第12位由甘氨酸突变为天冬氨酸；所述KRAS-G12C是指KRAS第2外显子第12位由甘氨酸突变为半胱氨酸；所述KRAS-G13D是指KRAS第2外显子第13位由甘氨酸突变为天冬氨酸；所述KRAS-Q61H指KRAS第3外显子第61位由谷氨酰胺突变为组氨酸；所述NRAS-Q61K是指NRAS第3外显子第61位由谷氨酰胺突变为赖氨酸；所述NRAS-Q61R指NRAS第3外显子第61位由谷氨酰胺突变为精氨酸；所述NRAS-G12D指NRAS第2外显子第12位由甘氨酸突变为天冬氨酸；所述BRAF-V600E指BRAF的外显子15第600位由缬氨酸突变为谷氨酸。
3.按照权利要求1或2所述的结直肠癌诊断标志物，其特征在于，所述KRAS-G12D是包括SEQ ID NO:1所示的核酸序列，所述KRAS-G12C是包括SEQ ID NO:2所示的核酸序列，所述KRAS-G13D是包括SEQ ID NO:3所示的核酸序列，所述KRAS-Q61H是包括SEQ ID NO:4所示的核酸序列，所述NRAS-Q61K是包括SEQ ID NO:5所示的核酸序列，所述NRAS-Q61R包括SEQ IDNO:6所示的核酸序列，所述NRAS-G12D是包括SEQ ID NO:7所示的核酸序列，所述BRAF-V600E是包括SEQ ID NO:8所示的核酸序列。
4.用于检测权利要求1或2所述结直肠癌诊断标志物的探针或引物；优选的，所述的检测探针是PAP探针；更优选的，检测结直肠癌标志物KRAS-G12D的PAP探针包括SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10所示的核酸序列；检测KRAS-G12C的PAP探针包括SEQ ID NO:11和SEQ IDNO:12所示的核酸序列；检测KRAS-G13D的PAP探针包括SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14所示的核酸序列；检测KRAS-Q61H的PAP探针包括SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16所示的核酸序列；检测NRAS-Q61K的PAP探针包括SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18所示序列的核酸序列；检测NRAS-Q61R的PAP探针包括SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20所示的核酸序列；检测NRAS-G12D的PAP探针包括SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:22所示的核酸序列；检测BRAF-V600E的PAP探针包括SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:24所示的核酸序列。
5.按照权利要求4所述的探针，其特征在于，所述PAP探针的3’端碱基进行双脱氧修饰。
6.权利要求1或2所述的结直肠癌诊断标志物或在制备检测或诊断结直肠癌试剂中的用途。
7.权利要求4所述的探针或引物在制备检测或诊断结直肠癌试剂中的用途。
8.一种结直肠癌的检测试剂盒，包括DNA聚合酶、Na4PPi、dNTPs、荧光染料、缓冲液和PAP检测探针；其中，所述的PAP检测探针是权利要求4所述的探针中的任何一种。
9.按照权利要求8所述的检测试剂盒，其特征在于，还含有荧光染料、二甲基亚砜、阳性模板以及阴性模板；其中，所述阳性模板为含有权利要求1所述结直肠癌诊断标志物的DNA的质粒，所述阴性模板为含有权利要求1所述结直肠癌诊断标志物的野生型DNA的质粒。
10.按照权利要求9所述的检测试剂盒，其特征在于，结直肠癌诊断标志物KRAS-G12D的野生型DNA包括SEQ ID NO:25所示的核酸序列；结直肠癌诊断标志物KRAS-G12C的野生型DNA包括SEQ ID NO:26所示的核酸序列；结直肠癌诊断标志物KRAS-G13D的野生型DNA包括SEQ ID NO:27所示的核酸序列；结直肠癌诊断标志物KRAS-Q61H的野生型DNA包括SEQ IDNO:28所示的核酸序列；结直肠癌诊断标志物NRAS-Q61K的野生型DNA包括SEQ ID NO:29所示的核酸序列；结直肠癌诊断标志物NRAS-Q61R的野生型DNA包括SEQ ID NO:30所示的核酸序列；结直肠癌诊断标志物NRAS-G12D的野生型DNA包括SEQ ID NO:31所示的核酸序列；结直肠癌诊断标志物BRAF-V600E的野生型DNA包括SEQ ID NO:32所示的核酸序列。
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