CN113186282A - 鉴定胰腺癌状态的方法和试剂盒 - Google Patents

Abstract

本文提供了一种在受试者中鉴定胰腺癌状态的方法，包括：1)检测来自所述受试者的生物样品中生物标志物基因的甲基化水平，其中所述生物标志物基因选自如下基因的一种或多种：ADAMTS1、BNC1、CDKN2A、CDKN2B、MLH1、NPTX2、PENK、RASSF1A、SFRP1和TFPI2；以及2)将步骤1)检测的甲基化水平与群体中相应生物标志物基因的正常甲基化水平进行比较，以确定所述受试者中的胰腺癌状态。本文还提供了用于鉴定受试者中胰腺癌状态的试剂盒。本申请所提供的方法和试剂盒为胰腺癌的预测、诊断、和评估提供了一条快速、可靠、准确的新途径。

Description

鉴定胰腺癌状态的方法和试剂盒

技术领域

本发明涉及在受试者中鉴定胰腺癌状态的方法和试剂盒。

背景技术

胰腺癌是一种恶性程度很高，诊断和治疗都很困难的消化道恶性肿瘤，约90％为起源于腺管上皮的导管腺癌。胰腺癌发病率男性高于女性，男女之比为1.5～2:1，其发病率和死亡率近年来明显上升。早期胰腺癌的治疗效果较为理想，长在胰腺表面、小于2厘米且没有发生转移的胰腺癌，手术切除后五年生存率可达到80％。而中期胰腺癌的术后五年生存率骤降到不足20％，晚期胰腺癌则只能采取保守治疗来改善病人生存质量，病人平均存活时间只有几个月。临床上，胰腺癌的早期发现率国内仅为5％-7％，在所有癌症中是最低的。而患者往往病程晚、病情重，加之胰腺切除手术本身难度大，接受根治手术的患者，其疗效也不十分理想。这些因素，使胰腺癌成为常见癌症中治疗效果最差的一种，患者5年生存率不足5％。

胰腺癌主要是由内镜取出的组织学标本来确诊的，但诊断技术并没有在很大程度上降低胰腺癌患者的死亡率。实际临床当中，作为最常规的影像检查，B超往往未能及时检出胰腺肿块而延误病情使很多患者失去手术机会。CT尽管能相对较早发现，却很少作为筛查项目，当然最主要还是临床医生缺乏相关专科知识的补充。超声内镜是目前能较早发现小于2cm胰腺肿瘤的有效检查手段，但对设备及内镜医师都要求较高。CA199作为较敏感的胰腺癌筛查指标，特异性欠佳，其它消化道疾病都可以引起其不同程度的增高。目前尚缺乏特异性、敏感性都较高的肿瘤标志物。因此，如何提高胰腺癌患者的生存率，依赖于胰腺癌的早期诊断，筛选和挖掘有价值的早期胰腺癌的生物学标志物成为亟待解决的问题。

近年来胰腺癌表观遗传学研究进展较快，特别是DNA甲基化，研究发现在胰腺癌发生的早期就存在很多特有的肿瘤相关基因出现不同程度的甲基化状态改变，为胰腺癌早期诊断标志物的探索提供了新的契机。

基因组的DNA甲基化异常与肿瘤的发生一直是医学界研究的热点之一，细胞周期、DNA修复、血管生成和细胞凋亡等都涉及到相关基因的甲基化。DNA高甲基化最可能的调控作用是通过抑制关键基因的表达，从而决定该细胞的命运，如对于肿瘤细胞中DNA甲基化异常现象的研究已经在多种肿瘤中取得了许多重大的进展。哺乳动物中，甲基化仅影响DNA链上鸟嘌呤前的胞嘧啶(CpG)，正常细胞中CpG双核苷酸的甲基化分布并不均一，大约50％的基因在启动子区域有CpG集中分布的CpG岛存在，长度0.5～2kb不等，该区域与基因的转录调控有着密切关系。人体某些基因调控区域的CpG岛甲基化在相关癌细胞组织中频繁出现，显示出与某些肿瘤的发病、病程进展和预后、用药敏感性等相关。迄今为止，已在大多数人类肿瘤中发现了基因甲基化异常，研究发现在癌细胞中表观遗传编码发生紊乱，首先表现在DNA甲基化水平紊乱，又称为甲基化重排。由于抑癌基因CpG岛的局部高度甲基化早于细胞的恶性增生，因此，DNA甲基化的检测可以用于肿瘤发生的早期诊断。癌症相关基因甲基化也是胰腺癌发生的早期事件，因此相关基因甲基化状态可成为早期胰腺癌风险预测的有效指标。尽管如此，目前仍缺乏对这些癌症相关基因的甲基化状态进行有效检测并对检测结果进行处理的手段。

当前，消化科肿瘤学领域中迫切需要的是最小侵入性地用于评估和预测早期胰腺癌存在的临床测试。

发明内容

为了解决上述问题，在一方面，本文提供了一种在受试者中鉴定胰腺癌状态的方法，其包括以下步骤：1)检测来自所述受试者的生物样品中生物标志物基因的甲基化水平，其中所述生物标志物基因选自如下基因的一种或多种：ADAMTS1、BNC1、CDKN2A、CDKN2B、MLH1、NPTX2、PENK、RASSF1A、SFRP1和TFPI2；以及3)将步骤2)检测的甲基化水平与群体中相应生物标志物基因的正常甲基化水平进行比较，以确定所述受试者中的胰腺癌状态。

在一些实施方案中，所述方法还包括在所述受试者接受医疗处理后再次进行步骤1)，并且将两次获得的甲基化水平检测结果进行比较，以确定所述受试者中胰腺癌状态的变化。

在一些实施方案中，步骤1)中可包括从所述生物样品提取DNA并以亚硫酸氢盐处理，使得所述DNA中的未甲基化胞嘧啶残基脱氨基，而甲基化的胞嘧啶残基保持不变。

在一些优选的实施方案中，所述亚硫酸氢盐为亚硫酸氢钠。

在一些优选的实施方案中，步骤1)中所述生物标志物基因选自ADAMTS1、BNC1、CDKN2A、CDKN2B、MLH1、NPTX2、PENK、RASSF1A、SFRP1和TFPI2中的2种或2种以上。

在更优选的实施方案中，步骤1)中所述生物标志物基因选自ADAMTS1、BNC1、CDKN2A、CDKN2B、MLH1、NPTX2、PENK、RASSF1A、SFRP1和TFPI2中的5种或5种以上。

在一些具体实施方案中，步骤1)中所述生物标志物基因为ADAMTS1、BNC1、CDKN2A、PENK、以及SFRP1。

在一些实施方案中，所述胰腺癌状态为胰腺癌I期，所述生物标志物基因为SFRP1和/或RASSF1A；或所述胰腺癌状态为胰腺癌II期，所述生物标志物基因为ADAMTS1、BNC1、CDKN2B、NPTX2和/或SFRP1。

在一些实施方案中，所述胰腺癌状态为导管腺癌，所述生物标志物基因为ADAMTS1、CDKN2A、CDKN2B、MLH1、NPTX2、RASSF1A、SFRP1和/或TFPI2。

在一些实施方案中，所述胰腺癌状态为特殊类型的导管起源的癌，所述生物标志物基因为BNC1、CDKN2B、MLH1、PENK、RASSF1A、SFRP1和/或TFPI2。

在一些实施方案中，所述胰腺癌状态为腺泡细胞癌，所述生物标志物基因为BNC1、CDKN2A、MLH1、NPTX2、PENK、RASSF1A、SFRP1和/或TFPI2。

在一些实施方案中，所述胰腺癌状态为小细胞癌，所述生物标志物基因为ADAMTS1、BNC1、MLH1、NPTX2、PENK、SFRP1和/或TFPI2。

在一些实施方案中，步骤1)包括检测所述生物标志物基因内靶区域的甲基化水平，所述靶区域分别为所述生物标志物基因内至少15个碱基长度的核苷酸序列或其互补序列。

在一些实施方案中，步骤1)中对ADAMTS1基因的甲基化水平的检测包括使用具有SEQ ID NO：11和12所示序列的引物对或具有SEQ ID NO：15和16所示序列的引物对，以所述生物样品中经亚硫酸氢盐处理后的ADAMTS1基因或其片段为模板进行PCR扩增反应；对BNC1基因的甲基化水平的检测包括使用具有SEQ ID NO：19和20所示序列的引物对或具有SEQID NO：23和24所示序列的引物对，以所述生物样品中经亚硫酸氢盐处理后的BNC1基因或其片段为模板进行PCR扩增反应；对CDKN2A基因的甲基化水平的检测包括使用具有SEQ IDNO：27和28所示序列的引物对或具有SEQ ID NO：31和32所示序列的引物对，以所述生物样品中经亚硫酸氢盐处理后的CDKN2A基因或其片段为模板进行PCR扩增反应；对CDKN2B基因的甲基化水平的检测包括使用具有SEQ ID NO：35和36所示序列的引物对或具有SEQ IDNO：39和40所示序列的引物对，以所述生物样品中经亚硫酸氢盐处理后的CDKN2B基因或其片段为模板进行PCR扩增反应；对MLH1基因的甲基化水平的检测包括使用具有SEQ ID NO：43和44所示序列的引物对或具有SEQ ID NO：47和48所示序列的引物对，以所述生物样品中经亚硫酸氢盐处理后的MLH1基因或其片段为模板进行PCR扩增反应；对NPTX2基因的甲基化水平的检测包括使用具有SEQ ID NO：51和52所示序列的引物对、具有SEQ ID NO：55和56所示序列的引物对、或具有SEQ ID NO：59和60所示序列的引物对，以所述生物样品中经亚硫酸氢盐处理后的NPTX2基因或其片段为模板进行PCR扩增反应；对PENK基因的甲基化水平的检测包括使用具有SEQ ID NO：63和64所示序列的引物对、具有SEQ ID NO：67和68所示序列的引物对、或具有SEQ ID NO：71和72所示序列的引物对，以所述生物样品中经亚硫酸氢盐处理后的PENK基因或其片段为模板进行PCR扩增反应；对RASSF1A基因的甲基化水平的检测包括使用具有SEQ ID NO：75和76所示序列的引物对、具有SEQ ID NO：79和80所示序列的引物对、或具有SEQ ID NO：83和84所示序列的引物对，以所述生物样品中经亚硫酸氢盐处理后的RASSF1A基因或其片段为模板进行PCR扩增反应；对SFRP1基因的甲基化水平的检测包括使用具有SEQ ID NO：87和88所示序列的引物对或具有SEQ ID NO：91和92所示序列的引物对，以所述生物样品中经亚硫酸氢盐处理后的SFRP1基因或其片段为模板进行PCR扩增反应；以及对TFPI2基因的甲基化水平的检测包括使用具有SEQ ID NO：95和96所示序列的引物对或如SEQ ID NO：99和100所示序列的引物对，以所述生物样品中经亚硫酸氢盐处理后的TFPI2基因或其片段为模板进行PCR扩增反应。

在一些优选的实施方案中，步骤1)中对ADAMTS1基因的甲基化水平的检测包括使用具有SEQ ID NO：11和12所示序列的引物对和具有SEQ ID NO：13所示序列的封闭引物，或者使用具有SEQ ID NO：15和16所示序列的引物对和具有SEQ ID NO：17所示序列的封闭引物，以所述生物样品中经亚硫酸氢盐处理后的ADAMTS1基因或其片段为模板进行PCR扩增反应；对BNC1基因的甲基化水平的检测包括使用具有SEQ ID NO：19和20所示序列的引物对和具有SEQ ID NO：21所示序列的封闭引物，或者使用具有SEQ ID NO：23和24所示序列的引物对和具有SEQ ID NO：25所示序列的封闭引物，以所述生物样品中经亚硫酸氢盐处理后的BNC1基因或其片段为模板进行PCR扩增反应；对CDKN2A基因的甲基化水平的检测包括使用具有SEQ ID NO：27和28所示序列的引物对和具有SEQ ID NO：29所示序列的封闭引物，或者使用具有SEQ ID NO：31和32所示序列的引物对和具有SEQ ID NO：33所示序列的封闭引物，以所述生物样品中经亚硫酸氢盐处理后的CDKN2A基因或其片段为模板进行PCR扩增反应；对CDKN2B基因的甲基化水平的检测包括使用具有SEQ ID NO：35和36所示序列的引物对和具有SEQ ID NO：37所示序列的封闭引物，或者使用具有SEQ ID NO：39和40所示序列的引物对和具有SEQ ID NO：41所示序列的封闭引物，以所述生物样品中经亚硫酸氢盐处理后的CDKN2B基因或其片段为模板进行PCR扩增反应；对MLH1基因的甲基化水平的检测包括使用具有SEQ ID NO：43和44所示序列的引物对和具有SEQ ID NO：45所示序列的封闭引物，或者使用具有SEQ ID NO：47和48所示序列的引物对和具有SEQ ID NO：49所示序列的封闭引物，以所述生物样品中经亚硫酸氢盐处理后的MLH1基因或其片段为模板进行PCR扩增反应；对NPTX2基因的甲基化水平的检测包括使用具有SEQ ID NO：51和52所示序列的引物对和具有SEQ ID NO：53所示序列的封闭引物，使用具有SEQ ID NO：55和56所示序列的引物对和具有SEQ ID NO：57所示序列的封闭引物，或者使用具有SEQ ID NO：59和60所示序列的引物对和具有SEQ ID NO：61所示序列的封闭引物，以所述生物样品中经亚硫酸氢盐处理后的NPTX2基因或其片段为模板进行PCR扩增反应；对PENK基因的甲基化水平的检测包括使用具有SEQID NO：63和64所示序列的引物对和具有SEQ ID NO：65所示序列的封闭引物，使用具有SEQID NO：67和68所示序列的引物对和具有SEQ ID NO：69所示序列的封闭引物，或者使用具有SEQ ID NO：71和72所示序列的引物对和具有SEQ ID NO：73所示序列的封闭引物，以所述生物样品中经亚硫酸氢盐处理后的PENK基因或其片段为模板进行PCR扩增反应；对RASSF1A基因的甲基化水平的检测包括使用具有SEQ ID NO：75和76所示序列的引物对和具有SEQ IDNO：77所示序列的封闭引物，具有SEQ ID NO：79和80所示序列的引物对和具有SEQ ID NO：81所示序列的封闭引物，或者使用具有SEQ ID NO：83和84所示序列的引物对和具有SEQ IDNO：85所示序列的封闭引物，以所述生物样品中经亚硫酸氢盐处理后的RASSF1A基因或其片段为模板进行PCR扩增反应；对SFRP1基因的甲基化水平的检测包括使用具有SEQ ID NO：87和88所示序列的引物对和具有SEQ ID NO：89所示序列的封闭引物，或者使用具有SEQ IDNO：91和92所示序列的引物对和具有SEQ ID NO：93所示序列的封闭引物，以所述生物样品中经亚硫酸氢盐处理后的SFRP1基因或其片段为模板进行PCR扩增反应；以及对TFPI2基因的甲基化水平的检测包括使用具有SEQ ID NO：95和96所示序列的引物对和具有SEQ IDNO：97所示序列的封闭引物，或者使用具有SEQ ID NO：99和100所示序列的引物对和具有SEQ ID NO：101所示序列的封闭引物，以所述生物样品中经亚硫酸氢盐处理后的TFPI2基因或其片段为模板进行PCR扩增反应，其中所述封闭引物具有抗DNA聚合酶延伸扩增的3’末端修饰。

在更优选的实施方案中，步骤1)中对ADAMTS1基因的甲基化水平的检测包括使用具有SEQ ID NO：11和12所示序列的引物对、具有SEQ ID NO：13所示序列的封闭引物和具有SEQ ID NO：14所示序列的探针，或者使用具有SEQ ID NO：15和16所示序列的引物对、具有SEQ ID NO：17所示序列的封闭引物和具有SEQ ID NO：18所示序列的探针，以所述生物样品中经亚硫酸氢盐处理后的ADAMTS1基因或其片段为模板进行PCR扩增反应；对BNC1基因的甲基化水平的检测包括使用具有SEQ ID NO：19和20所示序列的引物对、具有SEQ ID NO：21所示序列的封闭引物和具有SEQ ID NO：22所示序列的探针，或者使用具有SEQ ID NO：23和24所示序列的引物对、具有SEQ ID NO：25所示序列的封闭引物和具有SEQ ID NO：26所示序列的探针，以所述生物样品中经亚硫酸氢盐处理后的BNC1基因或其片段为模板进行PCR扩增反应；对CDKN2A基因的甲基化水平的检测包括使用具有SEQ ID NO：27和28所示序列的引物对、具有SEQ ID NO：29所示序列的封闭引物和具有SEQ ID NO：30所示序列的探针，或者使用具有SEQ ID NO：31和32所示序列的引物对、具有SEQ ID NO：33所示序列的封闭引物和具有SEQ ID NO：34所示序列的探针，以所述生物样品中经亚硫酸氢盐处理后的CDKN2A基因或其片段为模板进行PCR扩增反应；对CDKN2B基因的甲基化水平的检测包括使用具有SEQ IDNO：35和36所示序列的引物对、具有SEQ ID NO：37所示序列的封闭引物和具有SEQ ID NO：38所示序列的探针，或者使用具有SEQ ID NO：39和40所示序列的引物对、具有SEQ ID NO：41所示序列的封闭引物和具有SEQ ID NO：42所示序列的探针，以所述生物样品中经亚硫酸氢盐处理后的CDKN2B基因或其片段为模板进行PCR扩增反应；对MLH1基因的甲基化水平的检测包括使用具有SEQ ID NO：43和44所示序列的引物对、具有SEQ ID NO：45所示序列的封闭引物和具有SEQ ID NO：46所示序列的探针，或者使用具有SEQ ID NO：47和48所示序列的引物对、具有SEQ ID NO：49所示序列的封闭引物和具有SEQ ID NO：50所示序列的探针，以所述生物样品中经亚硫酸氢盐处理后的MLH1基因或其片段为模板进行PCR扩增反应；对NPTX2基因的甲基化水平的检测包括使用具有SEQ ID NO：51和52所示序列的引物对、具有SEQ ID NO：53所示序列的封闭引物和具有SEQ ID NO：54所示序列的探针，使用具有SEQ IDNO：55和56所示序列的引物对、具有SEQ ID NO：57所示序列的封闭引物和具有SEQ ID NO：58所示序列的探针，或者使用具有SEQ ID NO：59和60所示序列的引物对、具有SEQ ID NO：61所示序列的封闭引物和具有SEQ ID NO：62所示序列的探针，以所述生物样品中经亚硫酸氢盐处理后的NPTX2基因或其片段为模板进行PCR扩增反应；对PENK基因的甲基化水平的检测包括使用具有SEQ ID NO：63和64所示序列的引物对、具有SEQ ID NO：65所示序列的封闭引物和具有SEQ ID NO：66所示序列的探针，使用具有SEQ ID NO：67和68所示序列的引物对、具有SEQ ID NO：69所示序列的封闭引物和具有SEQ ID NO：70所示序列的探针，或者使用具有SEQ ID NO：71和72所示序列的引物对、具有SEQ ID NO：73所示序列的封闭引物和具有SEQ ID NO：74所示序列的探针，以所述生物样品中经亚硫酸氢盐处理后的PENK基因或其片段为模板进行PCR扩增反应；对RASSF1A基因的甲基化水平的检测包括使用具有SEQ IDNO：75和76所示序列的引物对、具有SEQ ID NO：77所示序列的封闭引物和具有SEQ ID NO：78所示序列的探针，使用具有SEQ ID NO：79和80所示序列的引物对、具有SEQ ID NO：81所示序列的封闭引物和具有SEQ ID NO：82所示序列的探针，或者使用具有SEQ ID NO：83和84所示序列的引物对、具有SEQ ID NO：85所示序列的封闭引物和具有SEQ ID NO：86所示序列的探针，以所述生物样品中经亚硫酸氢盐处理后的RASSF1A基因或其片段为模板进行PCR扩增反应；对SFRP1基因的甲基化水平的检测包括使用具有SEQ ID NO：87和88所示序列的引物对、具有SEQ ID NO：89所示序列的封闭引物和具有SEQ ID NO：90所示序列的探针，或者使用具有SEQ ID NO：91和92所示序列的引物对、具有SEQ ID NO：93所示序列的封闭引物和具有SEQ ID NO：94所示序列的探针，以所述生物样品中经亚硫酸氢盐处理后的SFRP1基因或其片段为模板进行PCR扩增反应；以及对TFPI2基因的甲基化水平的检测包括使用具有SEQ ID NO：95和96所示序列的引物对、具有SEQ ID NO：97所示序列的封闭引物和具有SEQID NO：98所示序列的探针，或者使用具有SEQ ID NO：99和100所示序列的引物对、具有SEQID NO：101所示序列的封闭引物和具有SEQ ID NO：102所示序列的探针，以所述生物样品中经亚硫酸氢盐处理后的TFPI2基因或其片段为模板进行PCR扩增反应，其中所述探针在一个末端具有荧光基团，在另一末端具有荧光淬灭基团。

在一些实施方案中，步骤1)还包括使用具有SEQ ID NO：103和104所示序列的引物对和具有SEQ ID NO：105所示序列的探针，以所述生物样品中经亚硫酸氢盐处理后的作为内参基因的ACTB基因或其片段为模板进行PCR扩增反应。

在一些实施方案中，步骤2)包括根据所述生物标志物基因的甲基化水平基于逻辑回归来判断所述受试者中的胰腺癌状态。

另一方面，本文还提供了一种鉴定受试者中胰腺癌状态的试剂盒，其包括用于检测来自所述受试者的生物样品中生物标志物基因的甲基化水平的引物对，其中所述引物对用于以经亚硫酸氢盐处理的所述生物标志物基因或其片段为模板进行PCR扩增反应；所述生物标志物基因选自如下基因的一种或多种：ADAMTS1、BNC1、CDKN2A、CDKN2B、MLH1、NPTX2、PENK、RASSF1A、SFRP1和TFPI2。

在一些优选的实施方案中，所述生物标志物基因选自ADAMTS1、BNC1、CDKN2A、CDKN2B、MLH1、NPTX2、PENK、RASSF1A、SFRP1和TFPI2中的2种或2种以上。

在更优选的实施方案中，所述生物标志物基因选自ADAMTS1、BNC1、CDKN2A、CDKN2B、MLH1、NPTX2、PENK、RASSF1A、SFRP1和TFPI2中的5种或5种以上。

在一些具体实施方案中，所述生物标志物基因为ADAMTS1、BNC1、CDKN2A、PENK、以及SFRP1。

在一些实施方案中，所述胰腺癌状态为胰腺癌I期，所述生物标志物基因为SFRP1和/或RASSF1A；或所述胰腺癌状态为胰腺癌II期，所述生物标志物基因为ADAMTS1、BNC1、CDKN2B、NPTX2和/或SFRP1。

在一些实施方案中，所述胰腺癌状态为导管腺癌，所述生物标志物基因为ADAMTS1、CDKN2A、CDKN2B、MLH1、NPTX2、RASSF1A、SFRP1和/或TFPI2。

在一些实施方案中，所述胰腺癌状态为特殊类型的导管起源的癌，所述生物标志物基因为BNC1、CDKN2B、MLH1、PENK、RASSF1A、SFRP1和/或TFPI2。

在一些实施方案中，所述胰腺癌状态为腺泡细胞癌，所述生物标志物基因为BNC1、CDKN2A、MLH1、NPTX2、PENK、RASSF1A、SFRP1和/或TFPI2。

在一些实施方案中，所述胰腺癌状态为小细胞癌，所述生物标志物基因为ADAMTS1、BNC1、MLH1、NPTX2、PENK、SFRP1和/或TFPI2。

在一些实施方案中，所述试剂盒中用于ADAMTS1甲基化水平检测的引物对具有SEQID NO：11和12所示的序列或SEQ ID NO：15和16所示的序列；用于BNC1甲基化水平检测的引物对具有SEQ ID NO：19和20所示的序列或SEQ ID NO：23和24所示的序列；用于CDKN2A甲基化水平检测的引物对具有SEQ ID NO：27和28所示的序列或SEQ ID NO：31和32所示的序列；用于CDKN2B甲基化水平检测的引物对具有SEQ ID NO：35和36所示的序列或SEQ ID NO：39和40所示的序列；用于MLH1甲基化水平检测的引物对具有SEQ ID NO：43和44所示的序列、或SEQ ID NO：47和48所示的序列；用于NPTX2甲基化水平检测的引物对具有SEQ ID NO：51和52所示的序列、SEQ ID NO：55和56所示的序列或SEQ ID NO：59和60所示的序列；用于PENK甲基化水平检测的引物对具有SEQ ID NO：63和64所示的序列、SEQ ID NO：67和68所示的序列、或SEQ ID NO：71和72所示的序列；用于RASSF1A甲基化水平检测的引物对具有SEQID NO：75和76所示的序列、SEQ ID NO：79和80所示的序列或SEQ ID NO：83和84所示的序列；用于SFRP1甲基化水平检测的引物对具有SEQ ID NO：87和88所示的序列或SEQ ID NO：91和92所示的序列；以及用于TFPI2甲基化水平检测的引物对具有SEQ ID NO：95和96所示的序列或SEQ ID NO：99和100所示的序列。

在优选的实施方案中，所述试剂盒还可包括封闭引物，其中与具有SEQ ID NO：11和12所示序列的引物对联合使用的封闭引物具有SEQ ID NO：13所示的序列；与具有SEQ IDNO：15和16所示序列的引物对联合使用的封闭引物具有SEQ ID NO：17所示的序列；与具有SEQ ID NO：19和20所示序列的引物对联合使用的封闭引物具有SEQ ID NO：21所示的序列；与具有SEQ ID NO：23和24所示序列的引物对联合使用的封闭引物具有SEQ ID NO：25所示的序列；与具有SEQ ID NO：27和28所示序列的引物对联合使用的封闭引物具有SEQ ID NO：29所示的序列；与具有SEQ ID NO：31和32所示序列的引物对联合使用的封闭引物具有SEQID NO：33所示的序列；与具有SEQ ID NO：35和36所示序列的引物对联合使用的封闭引物具有SEQ ID NO：37所示的序列；与具有SEQ ID NO：39和40所示序列的引物对联合使用的封闭引物具有SEQ ID NO：41所示的序列；与具有SEQ ID NO：43和44所示序列的引物对联合使用的封闭引物具有SEQ ID NO：45所示的序列；与具有SEQ ID NO：47和48所示序列的引物对联合使用的封闭引物具有SEQ ID NO：49所示的序列；与具有SEQ ID NO：51和52所示序列的引物对联合使用的封闭引物具有SEQ ID NO：53所示的序列；与具有SEQ ID NO：55和56所示序列的引物对联合使用的封闭引物具有SEQ ID NO：57所示的序列；与具有SEQ ID NO：59和60所示序列的引物对联合使用的封闭引物具有SEQ ID NO：61所示的序列；与具有SEQ ID NO：63和64所示序列的引物对联合使用的封闭引物具有SEQ ID NO：65所示的序列；与具有SEQID NO：67和68所示序列的引物对联合使用的封闭引物具有SEQ ID NO：69所示的序列；与具有SEQ ID NO：71和72所示序列的引物对联合使用的封闭引物具有SEQ ID NO：73所示的序列；与具有SEQ ID NO：75和76所示序列的引物对联合使用的封闭引物具有SEQ ID NO：77所示的序列；与具有SEQ ID NO：79和80所示序列的引物对联合使用的封闭引物具有SEQ IDNO：81所示的序列；与具有SEQ ID NO：83和84所示序列的引物对联合使用的封闭引物具有SEQ ID NO：85所示的序列；与具有SEQ ID NO：87和88所示序列的引物对联合使用的封闭引物具有SEQ ID NO：89所示的序列；与具有SEQ ID NO：91和92所示序列的引物对联合使用的封闭引物具有SEQ ID NO：93所示的序列；与具有SEQ ID NO：95和96所示序列的引物对联合使用的封闭引物具有SEQ ID NO：97所示的序列；以及与具有SEQ ID NO：99和100所示序列的引物对联合使用的封闭引物具有SEQ ID NO：101所示的序列；其中所述封闭引物具有抗DNA聚合酶延伸扩增的3’末端修饰。

在优选的实施方案中，所述试剂盒还可包括探针，其中与具有SEQ ID NO：11和12所示序列的引物对联合使用的探针具有SEQ ID NO：14所示的序列；与具有SEQ ID NO：15和16所示序列的引物对联合使用的探针具有SEQ ID NO：18所示的序列；与具有SEQ ID NO：19和20所示序列的引物对联合使用的探针具有SEQ ID NO：22所示的序列；与具有SEQ ID NO：23和24所示序列的引物对联合使用的探针具有SEQ ID NO：26所示的序列；与具有SEQ IDNO：27和28所示序列的引物对联合使用的探针具有SEQ ID NO：30所示的序列；与具有SEQID NO：31和32所示序列的引物对联合使用的探针具有SEQ ID NO：34所示的序列；与具有SEQ ID NO：35和36所示序列的引物对联合使用的探针具有SEQ ID NO：38所示的序列；与具有SEQ ID NO：39和40所示序列的引物对联合使用的探针具有SEQ ID NO：42所示的序列；与具有SEQ ID NO：43和44所示序列的引物对联合使用的探针具有SEQ ID NO：46所示的序列；与具有SEQ ID NO：47和48所示序列的引物对联合使用的探针具有SEQ ID NO：50所示的序列；与具有SEQ ID NO：51和52所示序列的引物对联合使用的探针具有SEQ ID NO：54所示的序列；与具有SEQ ID NO：55和56所示序列的引物对联合使用的探针具有SEQ ID NO：58所示的序列；与具有SEQ ID NO：59和60所示序列的引物对联合使用的探针具有SEQ ID NO：62所示的序列；与具有SEQ ID NO：63和64所示序列的引物对联合使用的探针具有SEQ ID NO：66所示的序列；与具有SEQ ID NO：67和68所示序列的引物对联合使用的探针具有SEQ ID NO：70所示的序列；与具有SEQ ID NO：71和72所示序列的引物对联合使用的探针具有SEQ IDNO：74所示的序列；与具有SEQ ID NO：75和76所示序列的引物对联合使用的探针具有SEQID NO：78所示的序列；与具有SEQ ID NO：79和80所示序列的引物对联合使用的探针具有SEQ ID NO：82所示的序列；与具有SEQ ID NO：83和84所示序列的引物对联合使用的探针具有SEQ ID NO：86所示的序列；与具有SEQ ID NO：87和88所示序列的引物对联合使用的探针具有SEQ ID NO：90所示的序列；与具有SEQ ID NO：91和92所示序列的引物对联合使用的探针具有SEQ ID NO：94所示的序列；与具有SEQ ID NO：95和96所示序列的引物对联合使用的探针具有SEQ ID NO：98所示的序列；以及与具有SEQ ID NO：99和100所示序列的引物对联合使用的探针具有SEQ ID NO：102所示的序列，其中所述探针在一个末端具有荧光基团，在另一末端具有荧光淬灭基团。

在更优选的实施方案中，所述试剂盒中包括所述引物对以及相应的封闭引物和探针。

在一些实施方案中，所述试剂盒还包括具有SEQ ID NO：103和104所示序列的引物对和具有SEQ ID NO：105所示序列的探针，用于以所述生物样品中经亚硫酸氢盐处理后的作为内参基因的ACTB基因或其片段为模板进行PCR扩增反应。

在优选的实施方案中，所述试剂盒还包括DNA提取试剂和亚硫酸氢盐试剂。优选地，所述亚硫酸氢盐试剂包括亚硫酸氢钠。

在优选的实施方案中，所述试剂盒还包括阐述所述试剂盒使用方法以及以逻辑回归对检测结果进行处理的说明书。

所述胰腺癌状态包括胰腺癌易感性以及胰腺癌的存在、进展、亚型和/或分期。

所述生物样品选自所述受试者的血液、血清、血浆、粪便、淋巴、脑脊液、腹水、尿和组织活检。

本申请所提供的方法和试剂盒为胰腺癌的预测、诊断、和评估提供了一条快速、可靠、准确的新途径。

附图说明

图1显示10种生物标志物基因甲基化水平的受试者工作特征(ROC)曲线。

图2显示10种生物标志物基因的甲基化在不同胰腺癌分期中的水平分布(以Ct值表示)，其中图2A显示了ADAMTS1、BNC1、CDKN2A、CDKN2B、MLH1和NPTX2的甲基化水平分布，图2B显示了PENK、RASSF1A、SFRP1和TFPI2的甲基化水平分布。

图3显示10种标志物基因的甲基化在不同胰腺癌亚型中的水平分布(以Ct值表示)，其中图3A显示了ADAMTS1、BNC1、CDKN2A、CDKN2B、MLH1和NPTX2的甲基化水平分布，图3B显示了PENK、RASSF1A、SFRP1和TFPI2的甲基化水平分布。

图4显示采用10种标志物基因构建的逻辑回归模型的受试者工作特征(ROC)曲线。

图5显示采用5种最有特征性标志物基因构建的逻辑回归模型的受试者工作特征(ROC)曲线。

具体实施方式

除非另有说明，本申请中使用的技术术语具有本发明所属领域技术人员所通常理解的含义。

本申请在一方面涉及鉴定受试者中胰腺癌状态的方法，其包括以下步骤：1)从所述受试者采集生物样品；2)检测所述生物样品中生物标志物基因的甲基化水平，其中所述生物标志物基因选自如下基因的一种或多种：ADAMTS1(a disintegrin andmetalloproteinase with thrombospondin type 1motifs)、BNC1(basonuclin 1)、CDKN2A(cyclin dependent kinase inhibitor 2A)、CDKN2B(cyclin dependent kinaseinhibitor 2B)、MLH1(mutL homolog 1)、NPTX2(neuronal pentraxin 2)、PENK(proenkephalin)、RASSF1A(Ras association domain family member 1)、SFRP1(Secreted frizzled related protein 1)和TFPI2(Tissue factor pathway inhibitor2)；以及3)将步骤2)检测的甲基化水平与群体中相应生物标志物基因的正常甲基化水平进行比较，以确定所述受试者中的胰腺癌状态。

这里所用的术语“受试者”指患有或者怀疑患有某种疾病的个体(优选人)，或者，在预测易感性时“受试者”也可包括健康个体。该术语通常可以和与“患者”、“检测对象”、“治疗对象”等互换使用。

这里所用的术语“群体”一般指健康人群。在提及特定疾病(如胰腺癌)时，“群体”可以包括不患有该特定疾病但可能患有其它疾病的个体。另外，还可以根据年龄、性别、健康状况、是否吸烟等特征仅选择部分个体来作为“群体”。“群体中正常甲基化水平”可以通过对足够多的个体进行检测而得到，或者可以在已有的临床文献中找到。在一些情况下，该正常水平指无甲基化。

这里所用的术语“胰腺癌状态”包括受试者对胰腺癌的易感性以及胰腺癌的存在、进展、亚型和/或分期。在一些实施方案中，可以根据受试者中所述生物标志物基因的甲基化水平来预测该受试者对胰腺癌的易感性。在另一些实施方案中，可以根据受试者中所述生物标志物基因的甲基化水平来鉴定该受试者中是否存在胰腺癌；并且如果存在胰腺癌的话，鉴定其亚型和/或分期。胰腺癌亚型可包括导管腺癌、特殊类型的导管起源的癌、腺泡细胞癌和小细胞癌。胰腺癌分期可以包括I期(IA、IB或IC)、II期、III期和IV期。在一些实施方案中，所述胰腺癌是I期胰腺癌。在一些实施方案中，所述胰腺癌是II期胰腺癌。在一些实施方案中，所述胰腺癌是III期胰腺癌。在另一些实施方案中，所述胰腺癌是IV期胰腺癌。

在本发明的方法中，还可以基于所述胰腺癌的分期来安排对受试者的治疗，例如，包括对受试者进行更多的测试、进行外科手术、进行药物治疗以及不采取进一步的行动。在另一些实施方案中，本发明的方法还包括在受试者经治疗后，再次测量受试者中ADAMTS1、BNC1、CDKN2A、CDKN2B、MLH1、NPTX2、PENK、RASSF1A、SFRP1和TFPI2基因中的一种或更多种生物标志物基因或其片段的甲基化水平；并且使所述测量结果与胰腺癌状态相关联，以鉴定所述治疗是否导致受试者中胰腺癌状态的改变。在一些实施方案中，所述关联通过软件分类算法来进行。

步骤2)中对甲基化水平的检测包括从生物样品中提取DNA，并以亚硫酸氢盐处理，随后使用甲基化特异的引物对进行PCR扩增反应。其中亚硫酸氢盐处理造成DNA双链分子中未甲基化的胞嘧啶残基脱氨基，成为尿嘧啶；而甲基化的胞嘧啶残基保持不变。这样，在随后的PCR扩增反应中，模板上甲基化的胞嘧啶残基位点作为胞嘧啶残基与引物中的鸟嘌呤残基配对，而未甲基化的胞嘧啶残基位点作为尿嘧啶残基与引物中的腺嘌呤残基配对。发明人针对每种生物标志物基因设计了多个引物对，以检测每种生物标志物基因内靶区域的甲基化水平，其中所述靶区域分别选自SEQ ID NO：1-10所示序列(分别与ADAMTS1、BNC1、CDKN2A、CDKN2B、MLH1、NPTX2、PENK、RASSF1A、SFRP1和TFPI2基因对应)中连续的至少15个碱基长度的片段；而所述引物对的核酸序列分别等同、互补或杂交于上述靶区域。本文提供的引物对利用该甲基化差异来检测生物标志物基因内靶区域的甲基化水平。当所述生物标志物基因的靶区域未甲基化时，所用的引物对不能在PCR扩增反应中与作为模板的靶区域(经亚硫酸氢盐处理)有效地配对结合，不能(或极少)生成扩增产物；而当所述生物标志物基因的靶基因被甲基化时，所用的引物对能够在PCR扩增反应中与作为模板的靶区域(经亚硫酸氢盐处理)有效地配对结合，从而生成扩增产物。这种扩增反应的差异可以在扩增反应进行过程中实时监测，或者可以通过检测扩增产物来判断。本发明人经过多次试验，筛选出了针对所述生物标志物基因的多个引物对(见下文)，它们单独或者联合使用，可帮助鉴定所述受试者中的胰腺癌状态。

本文在提及检测甲基化水平时经常会使用术语“生物标志物基因或其片段”，是由于在PCR扩增反应中，所用的引物对在模板的选择上并不会区分是整个基因还是其片段，只要模板的长度不小于待扩增区域的长度即可(事实上，在提取DNA以及随后的亚硫酸氢盐处理过程中，通常会导致基因断裂成不同大小的片段)。

在一些优选实施方案中，本发明使用HeavyMethyl方法测量标志物基因甲基化，所以除了设计普通Taqman引物外，还设计了封闭引物。封闭引物在核苷酸序列上设计为与相应引物对所扩增区域内的一段模板序列配对结合。另外，封闭引物在3’-OH引入化学修饰，导致DNA聚合酶无法扩增，该化学修饰例如为C3间臂(C3 Spacer)、C6间臂(C6 Spacer)、反转3’末端(inverted 3’end)、3’磷酸(3’P)等。在本发明方法的实施方案中，将封闭引物的核苷酸序列设计为与未甲基化的模板(经亚硫酸盐处理)结合，而不与甲基化的模板(经亚硫酸盐处理)结合。因而，在封闭引物所对应的区域内没有发生甲基化时，其可阻止相应扩增反应进行，从而提高本发明检测方法的特异性。

在本发明方法的更优选实施方案中，还包括利用荧光探针来实时监测和/或定量PCR扩增反应。所用探针5’端报告荧光基团可以为FAM、JOE、TET、HEX、Cy3、Texas Red、Rox、或Cy5；3’端的猝灭基团为BHQ1、BHQ2、BHQ3、TAMRA、DABCYL或MGB。

本发明方法中对所述生物标志物基因的甲基化水平的检测包括检测所述生物标志物基因中是否存在甲基化、以及对该甲基化进行定量和定性检测。

所述生物样品选自提取自受试者的流体或组织，包括血液、血清、血浆、粪便、淋巴、脑脊液、腹水、尿和组织活检等，优选血浆、血清和粪便。

在本发明的方法中，还可以考虑受试者的年龄，用来预测所述受试者中的胰腺癌状态。

在一些实施方案中，本发明的方法还包括提供胰腺癌预测的书面报告或电子报告的步骤，并且任选地，所述报告包括关于受试者中胰腺癌存在与否或其可能性或者关于受试者胰腺癌的等级化风险的预测。

在一些实施方案中，本发明的方法还包括为医师建立生物标志物基因甲基化相对水平的报告和通过邮寄、传真、邮箱等传输这样的报告。在一个实施方案中，通过互联网传输包含生物标志物基因甲基化水平的报告的数据流。

在一些实施方案中，采用统计方法构建基于生物标志物基因的甲基化水平的诊断模型，所述统计方法选自以下方法：多元线性回归，查找表、决策树、支持向量机、Probit回归、逻辑回归、聚类分析、邻域分析、遗传算法、贝叶斯和非贝叶斯方法等。

在另一些实施方案中，提供了基于生物标志物基因甲基化水平的预测或诊断模型。所述模型可以是软件代码、计算机可读格式的形式或书面说明的形式，用于评价生物标志物基因的相对甲基化水平。

利用本发明的方法可得到新的且重要的额外信息，其协助医师对患者患胰腺癌的风险进行分级并计划接下来将采取的诊断步骤。本文提供的方法类似地还可用于评估无症状高风险患者中的胰腺癌风险，以及对于一般群体用作筛查工具。考虑本发明的方法可被临床医师用作其它预测性和诊断性指标的全面评估的一部分。

本发明的方法可用于评估现有化学治疗剂和候选化学治疗剂以及其它类型癌症治疗手段的治疗效力。例如，可以在受试者治疗前后或者在治疗期间从所述受试者取得生物样品，并且按上文所述进行生物标志物基因甲基化水平的检测，通过检测结果鉴定所述受试者中癌症状态的变化，从而确定所述治疗效力。

本发明的方法还可用于鉴定受试者是否潜在地正在发生癌症。在随时间取自受试者的生物样品中检测生物标志物基因甲基化相对水平，从而将指向癌症特征的生物标志物甲基化水平改变解释为朝发生癌症方向进展。

所述生物标志物基因的组合提供了用于在胰腺癌进展不同分期中预测胰腺癌存在或检测胰腺癌的敏感、特异且准确的手段。对所述生物样品中甲基化水平的评价也可与患者的恶性肿瘤前或临床前病症的存在具有相关性。因此，所公开的方法可用于预测或检测样品中胰腺癌的存在、胰腺癌的阶段、胰腺癌的亚型、胰腺癌的良性或恶性、胰腺癌的转移可能性、与胰腺癌有关的赘生物的组织学类型、癌症的无痛性或攻击性，以及与预防、诊断、表征和治疗患者胰腺癌有关的其它胰腺癌特征。

本发明的方法还可用于评估候选药物抑制胰腺癌的效力，评估胰腺癌疗法的效力，监测胰腺癌的进展，选择抑制胰腺癌的药剂或疗法，监测胰腺癌患者的治疗，监测患者中胰腺癌的抑制状况，以及通过检测测试化合物暴露后测试动物内生物标志物基因的甲基化水平，来评估测试化合物的致癌潜力。

本发明还提供了用于检测胰腺癌状态的试剂盒。在一些实施方案中，该试剂盒可包括DNA提取试剂和亚硫酸氢盐试剂。DNA提取试剂可包括裂解缓冲液、结合缓冲液、清洗缓冲液和洗脱缓冲液。裂解缓冲液通常由蛋白变性剂、去垢剂、pH缓冲剂和核酸酶抑制剂组成。结合缓冲液通常由蛋白变性剂和pH缓冲剂组成。清洗缓冲液分为清洗缓冲液A和清洗缓冲液B：清洗缓冲液A由蛋白质变性剂、核酸酶抑制剂、去垢剂、pH缓冲剂和乙醇组成；清洗缓冲液B由核酸酶抑制剂、pH缓冲剂和乙醇组成。洗脱缓冲液通常由核酸酶抑制剂和pH缓冲剂组成。所述蛋白变性剂选自异硫氰酸胍、盐酸胍和尿素中的一种或多种；去垢剂选自Tween20、IGEPAL CA-630、Triton X-100、NP-40和SDS中的一种或多种；pH缓冲剂选自Tris、硼酸、磷酸盐、MES和HEPES中的一种或多种；核酸酶抑制剂选自EDTA、EGTA和DEPC中的一种或多种。亚硫酸氢盐试剂包括亚硫酸氢盐缓冲液和保护缓冲液。其中，亚硫酸氢盐选自重亚硫酸钠、亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、亚硫酸氢铵和亚硫酸铵中的一种或多种；保护缓冲液由氧自由基清除剂组成，氧自由基清除剂选自对苯二酚、维生素E、维生素E衍生物、Trolox、三羟基苯甲酸和三羟基苯甲酸衍生物中的一种或几种。

本发明的试剂盒包括用于ADAMTS1、BNC1、CDKN2A、CDKN2B、MLH1、NPTX2、PENK、RASSF1A、SFRP1和TFPI2基因中一种或多种进行甲基化特异性PCR扩增反应的引物对。这些引物对分别检测对应基因靶区域核苷酸序列中至少一段核苷酸序列的甲基化。

本发明的试剂盒还可包括与上述引物对联合使用的封闭引物和探针(上文和下文有对这些封闭引物和探针的说明)。

在某些实施方案中，所述试剂盒还可包括使用试剂盒提取生物样品DNA和以亚硫酸氢盐试剂处理DNA的说明书。在另一些实施方案中，所述试剂盒还包括使用试剂盒内试剂测量受试者中生物标志物水平的说明书。在又一些实施方案中，所述试剂盒包含使用该试剂盒以确定受试者中胰腺癌状态的说明书。

本发明还保护利用所述试剂盒检测生物标志物基因或其片段的甲基化水平的方法，包括如下步骤：采用DNA提取试剂提取生物样品内的DNA，将提取得到的DNA采用亚硫酸氢盐试剂进行处理；以及以处理后的DNA为模板，利用所提供的引物对来检测生物标志物基因甲基化水平。

所述生物标志物基因甲基化水平测量方法可选自以下方法中一种或多种：实时荧光PCR、数字PCR、重亚硫酸盐测序、甲基化特异性PCR、限制性内切酶分析法、高分辨溶解曲线技术、基因芯片技术和飞行时间质谱。

以下通过实施例来进一步描述本发明。

实施例1：DNA提取

DNA提取试剂由裂解缓冲液、结合缓冲液、清洗缓冲液和洗脱缓冲液组成。裂解缓冲液由蛋白变性剂、去垢剂、pH缓冲剂和核酸酶抑制剂组成。结合缓冲液由蛋白变性剂和pH缓冲剂组成。清洗缓冲液分为清洗缓冲液A和清洗缓冲液B，清洗缓冲液A由蛋白质变性剂、核酸酶抑制剂、去垢剂、pH缓冲剂和乙醇组成；清洗缓冲液B由核酸酶抑制剂、pH缓冲剂和乙醇组成。洗脱缓冲液由核酸酶抑制剂和pH缓冲剂组成。其中蛋白变性剂为：盐酸胍；去垢剂为：Tween20；pH缓冲剂为：Tris-HCl；核酸酶抑制剂为：EDTA。

本实施例以胰腺癌患者血浆样品为例，提取血浆DNA。提取方法包括如下步骤：

(1)取1mL血浆，加入相同体积的裂解缓冲液，再加入蛋白酶K和Carrier RNA，使其终浓度分别为100mg/L和1μg/mL，震荡混匀，55℃温育30min；

(2)加入100μL磁珠(购自Life technologies公司，货号：37002D)，振荡孵育1小时；

(3)用磁分离器吸附磁珠，丢弃上清溶液；

(4)加入1mL清洗缓冲液A重悬磁珠，震荡清洗1min；

(5)用磁分离器吸附磁珠，丢弃上清；

(6)加入1mL清洗缓冲液B重悬磁珠，震荡清洗1min；

(7)用磁分离器吸附磁珠，丢弃上清溶液；

(8)10000rpm快速离心1min，用磁分离器吸附磁珠，去除残余上清溶液；

(9)将装有磁珠的离心管开盖放置在55℃的金属浴上，晾干10min；

(10)加入100μL洗脱缓冲液重悬磁珠，放置在65℃金属浴上，震荡洗脱10min；

(11)用磁分离器吸附磁珠，取出含有目的DNA的缓冲液，定量DNA，做好标记；

(12)洗脱后的DNA存放于4℃冰箱待用，或者保存于-20℃冰箱长期保存。

实施例2：亚硫酸氢盐处理DNA

亚硫酸氢盐处理DNA是采用亚硫酸氢盐试剂进行处理，亚硫酸氢盐试剂由亚硫酸氢盐缓冲液和保护缓冲液组成；亚硫酸氢盐缓冲液为亚硫酸氢钠和水的混合液体；保护缓冲液为氧自由基清除剂对苯二酚和水的混合液体。

本实施例以实施例1提取得到的DNA为处理对象，采用亚硫酸氢盐处理DNA，具体步骤包括：

(1)配制亚硫酸氢盐缓冲液：称取1g亚硫酸氢钠粉末，加水配制成3M缓冲液；

(2)配制保护缓冲液：称取1g对苯二酚试剂，加水配置成0.5M保护缓冲液；

(3)将100μL DNA溶液、200μl亚硫酸氢盐缓冲液和50μl保护液混合，震荡混合均匀；

(4)热处理：95℃5min，80℃60min，4℃10min；

(5)将1mL DNA结合缓冲液加入到亚硫酸氢盐处理后的DNA溶液中，再加入50μL磁珠，震荡孵育1h；

(6)用磁分离器吸附磁珠，丢弃上清溶液；

(7)加入0.5mL清洗缓冲液A重悬磁珠，震荡清洗1min；

(8)用磁分离器吸附磁珠，丢弃上清；

(9)加入0.5mL清洗缓冲液B重悬磁珠，震荡清洗1min；

(10)用磁分离器吸附磁珠，丢弃上清溶液；

(11)10000rpm快速离心1min，用磁分离器吸附磁珠，去除残余上清溶液；

(12)将装有磁珠的离心管放置在55℃的金属浴上，开盖晾干10min；

(13)加入50μL洗脱缓冲液重悬磁珠，放置在65℃金属浴上，震荡洗脱10min；

(14)用磁分离器吸附磁珠，取出含有目的DNA的缓冲液，定量DNA，做好标记。

实施例3：实时荧光PCR检测DNA甲基化及引物组验证

本实施例以实时荧光PCR为例测量生物标志物基因的甲基化水平。检测基因为ADAMTS1、BNC1、CDKN2A、CDKN2B、MLH1、NPTX2、PENK、RASSF1A、SFRP1和TFPI2基因，内参基因为ACTB。本实施例采用实施例2经过亚硫酸氢盐处理后的DNA为模板进行实时荧光PCR扩增。待测DNA样品、阴性质控品、阳性质控品和无模板对照均进行3个复孔检测。该阴性质控品和阳性质控品分别按如下方式制备：取400μL浓度10ng/μL的人白细胞DNA加入到含有1％BSA的TE缓冲溶液中，混匀，将溶液定容到200mL，得到浓度为0.02ng/μL的阴性质控品；取384μL浓度10ng/μL的人白细胞DNA和16μL浓度10ng/μL的Hela细胞DNA，加入到含有1％BSA的TE缓冲溶液中，混匀，定容到200mL，得到浓度0.02ng/μL的阳性质控品，其中阳性DNA含量为4％。

对于ADAMTS1、BNC1、CDKN2A、CDKN2B、MLH1、NPTX2、PENK、RASSF1A、SFRP1和TFPI2基因，可以设计很多套引物和探针的组合，而每一套探针引物组合的性能可能存在差别，所以需要通过实验进行验证。

因此，我们针对ADAMTS1、BNC1、CDKN2A、CDKN2B、MLH1、NPTX2、PENK、RASSF1A、SFRP1和TFPI2基因设计了多种引物和探针，其分别等同于、互补于或杂交于SEQ ID NO：1-10所示序列的至少15个核苷酸或其互补序列；再用甲基化和非甲基化核酸序列作为模板验证引物和探针的有效性。我们通过实时荧光PCR扩增结果筛选出以下最佳的引物组和内参基因ACTB的引物组：

ADAMTS1引物组1

引物1：SEQ ID NO 11:5’-TTCGGGATACGGGATTACG-3’

引物2：SEQ ID NO 12:5’-CGTTCTAAAACGTAAAACCG-3’

封闭引物：SEQ ID NO 13:5’-TGGGATTATGTGTTTTTGTTTGTATGTTTTTGATT-C3-3’

探针：SEQ ID NO 14:5’-HEX-AACTACTATCGAACCGCAACTCCA-BHQ1-3’

ADAMTS1引物组2

引物1：SEQ ID NO 15:5’-GGAGGCGTATTTTATTTAGTCG-3’

引物2：SEQ ID NO 16:5’-CGACTTCTCCCCTAAAACGACG-3’

封闭引物：SEQ ID NO 17:5’-TGTATTTTATTTAGTTGTTGTTTGTTGTTAGTGAGT-C3-3’

探针：SEQ ID NO 18:5’-HEX-ACGCTCGCTAACGACGAACA-BHQ1-3’

BNC1引物组1

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RASSF1A引物组3

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SFRP1引物组1

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TFPI2引物组1

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内参基因ACTB引物组

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多组引物和探针均能区分甲基化和非甲基化模板，分别可以作为检测ADAMTS1、BNC1、CDKN2A、CDKN2B、MLH1、NPTX2、PENK、RASSF1A、SFRP1和TFPI2基因甲基化的引物和探针。虽然不同的引物和探针组合效果略有不同，但是以上引物和探针分别适用于ADAMTS1、BNC1、CDKN2A、CDKN2B、MLH1、NPTX2、PENK、RASSF1A、SFRP1和TFPI2基因的甲基化检测。下表1显示了采用各个引物和探针组合对上述基因的合成的甲基化和非甲基化模板(经亚硫酸氢盐处理)的检测结果。显然，所设计的各个引物和探针组合是对于甲基化模板是高度特异性的。

表1所设计的引物组对甲基化和非甲基化模板的检测结果(Ct，均值)

此外，我们采用不同癌症患者和健康人DNA作为模板进一步验证引物和探针组合的有效性。将5例胰腺癌、3例肝癌和5例健康人的血浆样本采用实施例1的DNA提取方法提取DNA，然后采用实施例2的方法，采用亚硫酸氢盐处理DNA模板。利用上述多个引物和探针组合，进行实时荧光PCR实验。分别测得癌症样本和健康人样本的各种标志物基因Ct值，结果见下表2。

表2各引物组对已知胰腺癌状态个体(包括健康个体)中指定基因甲基化水平的检测结果

缩写词：PaCa：胰腺癌：HeCa：肝癌：Con：健康

从以上癌症患者和健康人样本的ADAMTS1、BNC1、CDKN2A、CDKN2B、MLH1、NPTX2、PENK、RASSF1A、SFRP1和TFPI2基因甲基化检测的Ct值可以看出，以上各个引物和探针组合对胰腺癌甲基化DNA有高度特异性扩增，其它癌症和健康人无扩增或者扩增Ct值大于40。虽然不同组的引物和探针组合对胰腺癌样本的扩增Ct值有些差异，但都明显区别于其它癌症和健康人样本，因此以上各个引物组合均适用于胰腺癌检测。

实施例四：试剂盒检测胰腺癌患者、良性病症患者血浆的灵敏度和特异性

使用来自病理学上确定胰腺癌的患者的178个样品和来自病理学上确定为良性病症的患者的233个样品(见表3)，所有样本都收集自中国人民解放军海军总医院。胰腺癌样品包括疾病的所有分期和常见亚型。胰腺癌患者都是通过影像学及病理学诊断确诊的，样本分期基于国际TNM分期标准，样本亚型依据组织活检及免疫组化方法确定。良性样品包括在整个研究群体中看到的良性病症的常见类型。在外科手术后得到完整临床病理学报告，包括患者年龄、吸烟史、人种、分期、亚型并且对每个样品编码收集地点。

表3所采集样品对象的胰腺癌分期以及其它特征

用实施例1的DNA提取方法提取DNA，然后采用实施例2的方法用亚硫酸氢盐处理DNA模板，再利用实施例3中提供的引物和探针组合(针对每个生物标志物基因都采用引物组1)进行实时荧光PCR实验，检测ADAMTS1、BNC1、CDKN2A、CDKN2B、MLH1、NPTX2、PENK、RASSF1A、SFRP1和TFPI2基因和内参基因ACTB，最后得出健康人和胰腺癌患者样本各个基因的Ct值。如上文实施例3所描述的，可以通过该Ct值反映各基因的甲基化水平。

使用可商购软件包(IBM SPSS Statistics 24和MedCalc11.4.2.0，分别购自IBM和MedCalc)进行血浆生物标志物水平的描述性统计、受试者工作特征(ROC)曲线和图形展示。使用非参数Kruskal-Wallis检验(ANOVA)，然后使用Dunn's多重比较后检验确定了统计学差异。对于所有的统计学比较，p值<0.05视为统计学显著。

使用实时荧光PCR测定，在来自病理学确定胰腺癌的178名患者和具有良性胰腺病的233名个体的血浆中，检测了上述10种标志物基因的甲基化水平。为了有助于确定这些生物标志物基因区分症状相似的癌症与良性胰腺病的能力，所有样品从相同的临床群体(基于存在胰腺囊肿进行外科手术的患者)中得到。在任何介入之前和已知疾病状态之前就收集所有的样品。随后通过离体组织的病理学检查来确定疾病状态。使用单一的样品收集方案来收集血浆，监测顺从性。这确保了样品质量并且消除了样品集合中的任何收集、加工和生物偏倚的可能性。在该研究中没有使用正常的健康样品，原因是它们通常比良性病症更容易被区分。这些样本显示，患胰腺癌的个体中的平均患者年龄(58.4岁)比患良性病症(48.3岁)的那些个体高，并且都随疾病表现的分期进展而增加(表3)。总体上，胰腺癌亚型的分布与人群中所有胰腺癌病例所见分布相类似，其中导管腺癌的比例(88.2％)比其它胰腺癌高。研究中的良性对照代表常见良性胰腺疾病，包括良性囊肿、胰腺炎等。

对于每种生物标志物的甲基化水平检测数据，使用MedCalc11.4.2.0软件，选择95％置信区间，产生ROC曲线并且计算其曲线下面积(AUC)值。相对于良性胰腺病，胰腺癌样品中10种生物标志物基因甲基化水平AUC均大于0.8(p值<0.05)，AUC在0.809-0.901之间(见图1和表4)。

表4 10种标志物基因受试者工作特征(ROC)曲线分析的曲线下面积(AUC)

为了确定某些生物标志物基因是否对癌症的不同分期(特别是早期)具有更大的区分度，比较10种生物标志物基因(图2)在I期和II期(标志物检测最重要时期)样品中的区分度。对于I期样品，SFRP1和RASSF1A具有很高的区分度(p值<0.001)，然后是ADAMTS1、BNC1、CDKN2B、MLH1、NPTX2、PENK和TFPI2(p值0.001至0.01)，然后是CDKN2A(p值0.01至0.05)。对于II期样品，ADAMTS1、BNC1、CDKN2B、NPTX2和SFRP1具有很高的区分度(p值<0.001)，然后是PENK、RASSF1A和TFPI2(p值0.001至0.01)，然后是MLH1(p值0.01至0.05)。CDKN2A没有显著性差异(p值>0.05)。

还评价了上述生物标志物基因的甲基化水平在来自良性病症与各种亚型胰腺癌的样品之间是否有统计显著性差异(图3)。对于导管腺癌，ADAMTS1、CDKN2A、CDKN2B、MLH1、NPTX2、RASSF1A、SFRP1和TFPI2具有很高的区分度(p值<0.001)，然后为BNC1(p值0.001至0.05)，PENK(p值0.01至0.05)。对于特殊类型的导管起源的癌，BNC1、CDKN2B、MLH1、PENK、RASSF1A、SFRP1和TFPI2具有很高的区分度(p值<0.001)，然后为CDKN2A和NPTX2(p值0.001至0.01)，ADAMTS1(p值0.01至0.05)。对于腺泡细胞癌，BNC1、CDKN2A、MLH1、NPTX2、PENK、RASSF1A、SFRP1和TFPI2具有很高的区分度(p值<0.001)，然后为CDKN2B(p值0.001至0.01)，ADAMTS1(p值0.01至0.05)。对于小细胞癌，ADAMTS1、BNC1、MLH1、NPTX2、PENK、SFRP1和TFPI2具有很高的区分度(p值<0.001)，然后为CDKN2A和RASSF1A(p值0.001至0.01)，CDKN2B(p值0.01至0.05)。

就操作简单和降低成本而言，检测单个生物标志物基因的甲基化水平优于检测多种生物标志物基因的甲基化水平。然而，清楚的是，单个生物标志物基因的甲基化水平可能无法提供复杂疾病的固有多样性信息，所以经常还需要构建采用多标志物的诊断模型。多标志物诊断模型需要使用统计分析方法进行，以下以逻辑回归模型为例构建甲基化基因标志物诊断模型来检测胰腺癌。

逻辑回归模型的训练通过如下方式进行：将样本分成病例和对照，然后使用IBMSPSS Statistics 24软件来优化回归系数。对于每种标志物都有一个回归系数，加上一个偏差参数，使得逻辑回归模型用于训练数据的似然性最大化。

训练后，回归系数集合就限定了逻辑回归模型。通过将生物标志物的甲基化水平放入逻辑回归方程中，本领域技术人员可容易地使用这种类型的诊断模型来预测任何新样品鉴定为病例或对照的可能性。

上述10种标志物基因甲基化水平AUC均大于0.80，接下来我们使用逻辑回归组合了10种标志物基因，产生的AUC为0.940(标准误差：0.0153；95％CI：0.898-0.969；p值<0.0001)(图4)。为了让监测分析方法更简单，再将AUC值较大的5种标志物基因(ADAMTS1、BNC1、CDKN2A、PENK、和SFRP1)组合并建立逻辑回归模型。得到的AUC值为0.922(标准误差：0.0179；95％CI：0.876-0.955；p值<0.0001)(图5)。对于该样品集合，在80％的特异性下，给出了95％的灵敏度。通过在固定特异性值下确定模型的灵敏度和在固定灵敏度值下确定模型的特异性来进一步比较两种模型(表5和表6)。例如可以选择当所述方法的灵敏度高于约95％时，其灵敏度和特异性总和大于约160％；或者当所述方法的特异性高于约95％时，其灵敏度和特异性总和大于约165％。一般来说，10种标志物比5种标志物的逻辑回归模型的灵敏度和特异性稍好些，基于操作分析程序和成本考虑，5种标志物组合也是比较好的选择。

表5 5种最有特征性的标志物基因和10种标志物基因的逻辑回归模型在重要特异性阈值时的灵敏度

表6 5种最有特征性的标志物基因和10种标志物基因的逻辑回归模型在重要灵敏度阈值时的特异性

需要指出的是，本实施例提供的甲基化水平检测结果是采用针对各个生物标志物基因的引物组1得到的(例如，对于ADAMTS1基因，采用ADAMTS1引物组1；对于BNC1基因，采用BNC1引物组1，以此类推)，但采用本文提供的另外引物组，得到类似的检测结果(数据未示出)。

本发明提供的技术方案，通过联合检测ADAMTS1、BNC1、CDKN2A、CDKN2B、MLH1、NPTX2、PENK、RASSF1A、SFRP1和TFPI2基因中一个或更多个基因或其片段的甲基化水平，使得胰腺癌检测的灵敏度和特异性得到了提高，从而保证了检测结果的正确性和可靠性。并且，采用本发明试剂盒中提供的引物，通过检测样本中的上述生物标志物基因的甲基化，利用逻辑回归方程分析，能够快速、便捷地判断样本是否呈阳性及风险值。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；本领域的普通技术人员应当理解：可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围，其均应涵盖在本发明说明书的范围中。

SEQUENCE LISTING

<110> 北京艾克伦医疗科技有限公司

<120> 鉴定胰腺癌状态的方法和试剂盒

<130> 21112CI

<160> 105

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 630

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 1

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gctgctacga gcggtgtctc ctggggctcc aatgcagcga gctgtgcccg aggggttcgg 120

aaggcgcaag ctgggcagcg acatggggaa cgcggagcgg gctccggggt ctcggagctt 180

tgggccagta cccacgctgc tgctgctcgc cgcggcgcta ctggccgtgt cggacgcact 240

cgggcgcccc tccgaggagg acgaggagct agtggtgccg gagctggagc gcgccccggg 300

acacgggacc acgcgcctcc gcctgcacgc ctttgaccag cagctggatc tggagctgcg 360

gcccgacagc agctttttgg cgcccggctt cacgctccag aacgtggggc gcaaatccgg 420

gtccgagacg ccgcttccgg aaaccgacct ggcgcactgc ttctactccg gcaccgtgaa 480

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<211> 759

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 2

cggctcccag cacggaaccg acggggcgct cccgagacgg gcgagccacg cgctcgcagg 60

tcccaaggcc aggctgggcg ggactgttaa gggagctcga agtcgggggc cgggggcttc 120

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gcagcccagg cccacttcct gtcactccag gaaaacctcg gagcggcgga cgcggctcgg 240

cccggcttcc agcccagagc ccaagcgcct tagccccgtc ccagcgcttt ctgaaagacg 300

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aaatagcgac tttcagtcgt gggttttttg ttcttgtggg tttgttttgt tttttgttgt 480

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<212> DNA

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cgcacctcct ctacccgacc ccgggccgcg gccgtggcca gccagtcagc cgaaggctcc 120

atgctgctcc ccgccgccgg ctccatgctg ctccccgccg cccgctgcct gctctccccc 180

tctccgcagc cgccgagcgc acgcggtccg ccccaccctc tggtgaccag ccagcccctc 240

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ggagggaccg cggtatcttt ccaggcaagg ggacgccgtg agcgagtgct cggaggaggt 360

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<212> DNA

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ccctcgtgac gcgtcggccc gggcctggcc tcccggcgat cacagcggac agggggcgga 300

gcctaagggg gtggggagac gccggcccct tggcccagct gaaaacggaa ttctttgccg 360

gctggctccc cactctgcca gagcgaggcg gggcagtgag gactccgcga cgcgtccgca 420

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ccgctcggcc actgcacggg gccccaagcc gcagaaggac gacgggaggg taatgaagct 600

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gtgtcgttaa gtt 673

<210> 5

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<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 5

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ggagtgaagg aggccacggg caagtcgccc tgacgcagac gctccaccag ggccgcgcgc 120

tcgccgtccg ccacataccg ctcgtagtat tcgtgctcag cctcgtagtg gcgcctgacg 180

tcgcgttcgc gggtagctac gatgaggcgg cgacagacca ggcacagggc cccatcgccc 240

tccggaggct ccaccaccaa ataacgctgg gtccactcgg gccggaaaac tagagcctcg 300

tcgacttcca tcttgcttct tttgggcgtc atccacattc tgcgggaggc cacaagagca 360

gggccaacgt tagaaaggcc gcaaggggag aggaggagcc tgagaagcgc caagcacctc 420

ctccgctctg cgccagatca cctcagcaga ggcacacaag cccggttccg gcatctctgc 480

tcctattggc tggatatttc gtattccccg agctcctaaa aacgaaccaa taggaagagc 540

ggacagcgat ctctaacgcg caagcgc 567

<210> 6

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<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 6

gctcgtggcg cgcgccccac acgccggccc cctccgcccc tcagcttaag aaagggcgcg 60

cggacccggc aggccagagt gccgagcagc gcggtgggtg cggctgtgag acggcaggag 120

acttctgccc cgcggtgcac gcgaccctcg agacgacagc gcggctactg ccagcagcga 180

aggcgcctcc cgcggagcgc cccgacggcg cccgctcgcc catgccgagc tgagcgcggc 240

agcggcggcg ggatgctggc gctgctggcc gccagcgtgg cgctcgccgt ggccgctggg 300

gcccaggaca gcccggcgcc cggtagccgc ttcgtgtgca cggcactgcc cccagaggcg 360

gtgcacgccg gctgcccgct gcccgcgatg cccatgcagg gcggcgcgca gagtcccgag 420

gaggagctga gggccgcggt gctgcagctg cgcgagaccg tcgtgcagca gaaggagacg 480

ctgggcgcgc agcgcgaggc catccgcgag ctcacgggca agctagcgcg ctgcgagggg 540

ctggcgggcg gcaaggcgcg cggcgcgggg gccacgggca aggacactat gggcgacctg 600

ccgcgggacc ccggccacgt cg 622

<210> 7

<211> 690

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 7

tggggacgtc tgcccgccct ctttcccttc acatttcatt gcatgggttc cccaacagcg 60

ttccctggtt cttctttgtg accccagtca atgtcctgcc tcccccggct cccgctctct 120

cgcccctggt ctgcggcgtt ctctccggaa tcttgccctg ggccgcggac gcccaggaaa 180

agagccgggt gccccaggca gcctcgcgtt gggggcgacc gcgccatccc gggaaccgcg 240

aggcgatctg agtcgcctcc acgtctacct aaaagctgtc ggccgggagg gcggggcccc 300

agaaaggagc attcctgcgg gcttttgctc gacgatcccc tgctgaggct gtcgcggcga 360

gggtcctgcc gagggacccc gttctgcgcc caggcaggct cgaagcacgc gtccctctct 420

cctcgcagtc catggcgcgg ttcctgacac tttgcacttg gctgctgttg ctcggccccg 480

ggctcctggc gaccgtgcgg gccgaatgca gccaggattg cgcgacgtgc agctaccgcc 540

tagtgcgccc ggccgacatc aacttcctgg tgagtgttgc gcgcggcgag tgttgcgcac 600

cttgtgagac agagtttccg caacagtacg cggactgcct ccggcccacc gcgcggcgcg 660

tatggcggtt cgcaccgggt cggagccgca 690

<210> 8

<211> 443

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 8

ctgcgagagc gcgcccagcc ccgccttcgg gccccacagt ccctgcaccc aggtttccat 60

tgcgcggctc tcctcagctc cttcccgccg cccagtctgg atcctggggg aggcgctgaa 120

gtcggggccc gccctgtggc cccgcccggc ccgcgcttgc tagcgcccaa agccagcgaa 180

gcacgggccc aaccgggcca tgtcggggga gcctgagctc attgagctgc gggagctggc 240

acccgctggg cgcgctggga agggccgcac ccggctggag cgtgccaacg cgctgcgcat 300

cgcgcggggc accgcgtgca accccacacg gcagctggtc cctggccgtg gccaccgctt 360

ccagcccgcg gggcccgcca cgcacacgtg gtgcgacctc tgtggcgact tcatctgggg 420

cgtcgtgcgc aaaggcctgc agt 443

<210> 9

<211> 759

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 9

gcaagccaat gcgagttaat tacagcgtcc gccctggtct ctctccaccc cacgccgtga 60

tccattcccc ttctttttct ccccttgtct ctttcctcct ccccctttta tttatgtatt 120

tttggttttg ttttttaagg ggtgttgagc cgcgtctggt tctagtaaac cgaacccgct 180

cgcgagggag gcgattggct cccgcgccgg tgacggacgt ggtaacgagt gcggctcgcc 240

ccgccgggag ctgattggct gcgcggggcg gctccgaggg ctcggccgta ggagccccgc 300

gcactccagc cctgcagcct ccggagtcag tgccgcgcgc ccgccgcccc gcgccttcct 360

gctcgccgca cctccgggag ccggggcgca cccagcccgc agcgccgcct ccccgcccgc 420

gccgcctccg accgcaggcc gagggccgcc actggccggg gggaccgggc agcagcttgc 480

ggccgcggag ccgggcaacg ctggggactg cgccttttgt ccccggaggt ccctggaagt 540

ttgcggcagg acgcgcgcgg ggaggcggcg gaggcagccc cgacgtcgcg gagaacaggg 600

cgcagagccg gcatgggcat cgggcgcagc gaggggggcc gccgcggggc agccctgggc 660

gtgctgctgg cgctgggcgc ggcgcttctg gccgtgggct cggccagcga gtacgactac 720

gtgagcttcc agtcggacat cggcccgtac cagagcggg 759

<210> 10

<211> 828

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 10

ctaatctgaa ggtccattgc aacgaatccc gctccgctct gacccaagaa ctccgcactt 60

tctctccacc agcctttcaa atacctgaac ttcatgcctt caagaggtgg attccggctt 120

ctttacagcg caatcactag caggtcattt ccgtctagct tgcagatttc ccattactga 180

cacaaacgct ccctcagggc gtccccgtct ggactacagg agaaagtttg ggaggcaggt 240

tcaacttttc aacttggcgg ggaattcctc tccctcttac acagtttgca gcgcgggggc 300

ggcggggtga cagtccccgt gcatgaatca gccacccctc aggctccgcc ccggcggggg 360

tcggccggac gctcgccccg cataaagcgg gcacccgggc cgcctggagc agaaagccgc 420

gcacctcctc ccgccaggcg ctttctcgga cgccttgccc agcgggccgc ccgaccccct 480

gcaccatgga ccccgctcgc cccctggggc tgtcgattct gctgcttttc ctgacggagg 540

ctgcactggg cgatgctgct caggagccaa caggtatctg gccgctccag gagcttctct 600

ccccaaccgg cggagagggc gcagcgggcc atggggcccc gtgtaggcgc cctccaagcc 660

tcgctttctc caggtccctg ccgcgcgctc cgctggcagg ggggactcgc tcccaagttt 720

gcactttctc tgcagaggcc cctccgctcg gaaggggaca gaactccccg ggatgttctt 780

tcctcctagg agctacgcct gaccactttc cctctctttt gctctcct 828

<210> 11

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 11

ttcgggatac gggattacg 19

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 12

cgttctaaaa cgtaaaaccg 20

<210> 13

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 封闭引物

<400> 13

tgggattatg tgtttttgtt tgtatgtttt tgatt 35

<210> 14

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 探针

<400> 14

aactactatc gaaccgcaac tcca 24

<210> 15

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 15

ggaggcgtat tttatttagt cg 22

<210> 16

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 16

cgacttctcc cctaaaacga cg 22

<210> 17

<211> 36

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 封闭引物

<400> 17

tgtattttat ttagttgttg tttgttgtta gtgagt 36

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 探针

<400> 18

acgctcgcta acgacgaaca 20

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 19

cggtttttag tacggaatcg 20

<210> 20

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 20

cgacttcgaa ctccctta 18

<210> 21

<211> 38

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 封闭引物

<400> 21

tggaattgat ggggtgtttt tgagatgggt gagttatg 38

<210> 22

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 探针

<400> 22

atcccgccca acctaacctt 20

<210> 23

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 23

cgttttagtt tcgttttagc gt 22

<210> 24

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 24

cgaacgttaa ccgtatacg 19

<210> 25

<211> 38

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 封闭引物

<400> 25

tgttttagtg ttttttgaaa gatgggttat tttgtgtg 38

<210> 26

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 探针

<400> 26

actacgaacc ctaaaatcct tatcgcg 27

<210> 27

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 27

tggagttttc ggttgattg 19

<210> 28

<211> 15

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 28

acaacgcccg cacct 15

<210> 29

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 封闭引物

<400> 29

tggttgattg gttggttatg gttgt 25

<210> 30

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 探针

<400> 30

acccgacccc gaaccgcg 18

<210> 31

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 31

tcgagtattc gtttacggc 19

<210> 32

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 32

tttcttcctc cgatactaac g 21

<210> 33

<211> 34

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 封闭引物

<400> 33

ttgtttatgg tgtttttttg tttggaaaga tatt 34

<210> 34

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 探针

<400> 34

cctccgaccc tatccctcaa atcctct 27

<210> 35

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 35

cggcgattat agcggata 18

<210> 36

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 36

tccgttttca actaaaccaa 20

<210> 37

<211> 37

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 封闭引物

<400> 37

gtggataggg ggtggagttt aagggggtgg ggagatg 37

<210> 38

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 探针

<400> 38

aaaccgacgt ctccccaccc 20

<210> 39

<211> 17

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 39

tagtgaggat ttcgcga 17

<210> 40

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 40

gcgcctaaat tacttctaaa 20

<210> 41

<211> 32

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 封闭引物

<400> 41

tgtgatgtgt ttgtattttg tggttagagt gg 32

<210> 42

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 探针

<400> 42

cgaacgcaac cgaactcaaa 20

<210> 43

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 43

tcgtgtttag tttcgtag 18

<210> 44

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 44

ccaacgttat ttaataataa aacc 24

<210> 45

<211> 32

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 封闭引物

<400> 45

gttttgtagt ggtgtttgat gttgtgtttg tg 32

<210> 46

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 探针

<400> 46

ctatacctaa tctatcgccg cctcatc 27

<210> 47

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 47

cgttcgtagt attcgtgttt a 21

<210> 48

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 48

ccaacgttat ttaataataa aacc 24

<210> 49

<211> 34

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 封闭引物

<400> 49

tgtgtttagt tttgtagtgg tgtttgatgt tgtg 34

<210> 50

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 探针

<400> 50

tatacctaat ctatcgccgc ctcatc 26

<210> 51

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 51

cgttcgttcg tttatgtc 18

<210> 52

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 52

gccgaactat cctaaacc 18

<210> 53

<211> 33

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 封闭引物

<400> 53

tgtttatgtt gagttgagtg tggtagtggt ggt 33

<210> 54

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 探针

<400> 54

ccacgctaac gaccaacaac g 21

<210> 55

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 55

tcggtaggtt agagtgtc 18

<210> 56

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 56

gtctcgaaaa tcgcgtac 18

<210> 57

<211> 41

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 封闭引物

<400> 57

gttagagtgt tgagtagtgt ggtgggtgtg gttgtgagat g 41

<210> 58

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 探针

<400> 58

taccgtctca caaccgcacc 20

<210> 59

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 59

ggttagagtg tcgagtagc 19

<210> 60

<211> 17

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 60

gaaaatcgcg tacaccg 17

<210> 61

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 封闭引物

<400> 61

agtgttgagt agtgtggtgg gtgtg 25

<210> 62

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 探针

<400> 62

aatctcctac cgtctcacaa ccgca 25

<210> 63

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 63

gttttaggta gtttcgcgt 19

<210> 64

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 64

cgaccgacaa cttttaaata aac 23

<210> 65

<211> 31

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 封闭引物

<400> 65

gttttgtgtt gggggtgatt gtgttatttt g 31

<210> 66

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 探针

<400> 66

aaacgactca aatcgcctcg c 21

<210> 67

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 67

gcgtttaggt aggttcga 18

<210> 68

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 68

ccgaacaaca acaaccaa 18

<210> 69

<211> 32

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 封闭引物

<400> 69

ggtttgaagt atgtgttttt ttttttttgt ag 32

<210> 70

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 探针

<400> 70

aaaccgcgcc ataaactacg aaa 23

<210> 71

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 71

cgggtgtttt aggtagtttc 20

<210> 72

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 72

accgacaact tttaaataaa c 21

<210> 73

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 封闭引物

<400> 73

gtagttttgt gttgggggtg attgtg 26

<210> 74

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 探针

<400> 74

aaacgactca aatcgcctcg c 21

<210> 75

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 75

gcgttgaagt cggggttcg 19

<210> 76

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 76

ccgattaaac ccgtacttc 19

<210> 77

<211> 33

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 封闭引物

<400> 77

ttggggtttg ttttgtggtt tcgtttggtt tgt 33

<210> 78

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 探针

<400> 78

cgctaacaaa cgcgaaccga 20

<210> 79

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 79

gggagtttga gtttattga 19

<210> 80

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 80

gatacgcaac gcgttaacac g 21

<210> 81

<211> 33

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 封闭引物

<400> 81

cacattaaca cactccaacc aaatacaacc ctt 33

<210> 82

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 探针

<400> 82

cgcccaacga ataccaactc c 21

<210> 83

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 83

tacgggttta atcgggtta 19

<210> 84

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 84

aaccgaatac gacccttc 18

<210> 85

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 封闭引物

<400> 85

ttgggttatg ttgggggagt ttgagttt 28

<210> 86

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 探针

<400> 86

cgcccaacga ataccaactc c 21

<210> 87

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 87

tcgggagttg attggttg 18

<210> 88

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 88

ccgaaaacta caaaactaaa ataca 25

<210> 89

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 封闭引物

<400> 89

tgggagttga ttggttgtgt gg 22

<210> 90

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 探针

<400> 90

aaactcctac gaccgaaccc tc 22

<210> 91

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 91

gtcgtatttt cgggagtc 18

<210> 92

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 92

gacctacgat cgaaaacg 18

<210> 93

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 封闭引物

<400> 93

tgggagttgg ggtgtattta gtttgta 27

<210> 94

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 探针

<400> 94

aaacgacgct acgaactaaa tacgc 25

<210> 95

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 95

tttcgtttcg gcgggggt 18

<210> 96

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 96

aaacgcctaa cgaaaaaaaa tacgc 25

<210> 97

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 封闭引物

<400> 97

ttggtggggg ttggttggat gtttg 25

<210> 98

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 探针

<400> 98

tctactccaa acgacccgaa tacccgc 27

<210> 99

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 99

tattttttag gtttcgtttc ggc 23

<210> 100

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 100

aaacgacccg aatacccg 18

<210> 101

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 封闭引物

<400> 101

taggttttgt tttggtgggg gttg 24

<210> 102

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 探针

<400> 102

tatacgaaac gaacgtccga ccg 23

<210> 103

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 103

gtgatggagg aggtttagta agt 23

<210> 104

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 104

ccaataaaac ctactcctcc ctt 23

<210> 105

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 探针

<400> 105

accaccaccc aacacacaat aacaaacaca 30

Claims (38)

1.一种在受试者中鉴定胰腺癌状态的方法，包括以下步骤：

1)检测来自所述受试者的生物样品中生物标志物基因的甲基化水平，其中所述生物标志物基因选自如下基因的一种或多种：ADAMTS1、BNC1、CDKN2A、CDKN2B、MLH1、NPTX2、PENK、RASSF1A、SFRP1和TFPI2；以及

2)将步骤1)检测的甲基化水平与群体中相应生物标志物基因的正常甲基化水平进行比较，以确定所述受试者中的胰腺癌状态。

2.如权利要求1所述的方法，其中还包括在所述受试者接受医疗处理后再次进行步骤1)和2)，并且将两次获得的甲基化水平检测结果进行比较，以确定所述受试者中胰腺癌状态的变化。

3.如权利要求1或2所述的方法，其中所述胰腺癌状态包括胰腺癌易感性以及胰腺癌的存在、进展、亚型和/或分期。

4.如权利要求1或2所述的方法，其中步骤1)中包括从所述生物样品提取DNA并以亚硫酸氢盐处理，使得所述DNA中的未甲基化胞嘧啶残基脱氨基，而甲基化的胞嘧啶残基保持不变。

5.如权利要求4所述的方法，其中所述亚硫酸氢盐为亚硫酸氢钠。

6.如权利要求1或2所述的方法，其中步骤1)中所述生物标志物基因选自ADAMTS1、BNC1、CDKN2A、CDKN2B、MLH1、NPTX2、PENK、RASSF1A、SFRP1和TFPI2中的2种或2种以上。

7.如权利要求6所述的方法，其中步骤1)中所述生物标志物基因选自ADAMTS1、BNC1、CDKN2A、CDKN2B、MLH1、NPTX2、PENK、RASSF1A、SFRP1和TFPI2中的5种或5种以上。

8.如权利要求7所述的方法，其中步骤1)中所述生物标志物基因为ADAMTS1、BNC1、CDKN2A、PENK以及SFRP1。

9.如权利要求1或2所述的方法，其中所述胰腺癌状态为胰腺癌I期，所述生物标志物基因为SFRP1和/或RASSF1A；或所述胰腺癌状态为胰腺癌II期，所述生物标志物基因为ADAMTS1、BNC1、CDKN2B、NPTX2和/或SFRP1。

10.如权利要求1或2所述的方法，其中所述胰腺癌状态为导管腺癌，所述生物标志物基因为ADAMTS1、CDKN2A、CDKN2B、MLH1、NPTX2、RASSF1A、SFRP1和/或TFPI2。

11.如权利要求1或2所述的方法，其中所述胰腺癌状态为特殊类型的导管起源的癌，所述生物标志物基因为BNC1、CDKN2B、MLH1、PENK、RASSF1A、SFRP1和/或TFPI2。

12.如权利要求1或2所述的方法，其中所述胰腺癌状态为腺泡细胞癌，所述生物标志物基因为BNC1、CDKN2A、MLH1、NPTX2、PENK、RASSF1A、SFRP1和/或TFPI2。

13.如权利要求1或2所述的方法，其中所述胰腺癌状态为小细胞癌，所述生物标志物基因为ADAMTS1、BNC1、MLH1、NPTX2、PENK、SFRP1和/或TFPI2。

14.如权利要求1或2所述的方法，其中步骤1)包括检测所述生物标志物基因内靶区域的甲基化水平，所述靶区域分别为所述生物标志物基因内至少15个碱基长度的核苷酸序列或其互补序列。

15.如权利要求1或2所述的方法，其中步骤1)中

对ADAMTS1基因的甲基化水平的检测包括使用具有SEQ ID NO：11和12所示序列的引物对或具有SEQ ID NO：15和16所示序列的引物对，以所述生物样品中经亚硫酸氢盐处理后的ADAMTS1基因或其片段为模板进行PCR扩增反应；

对BNC1基因的甲基化水平的检测包括使用具有SEQ ID NO：19和20所示序列的引物对或具有SEQ ID NO：23和24所示序列的引物对，以所述生物样品中经亚硫酸氢盐处理后的BNC1基因或其片段为模板进行PCR扩增反应；

对CDKN2A基因的甲基化水平的检测包括使用具有SEQ ID NO：27和28所示序列的引物对或具有SEQ ID NO：31和32所示序列的引物对，以所述生物样品中经亚硫酸氢盐处理后的CDKN2A基因或其片段为模板进行PCR扩增反应；

对CDKN2B基因的甲基化水平的检测包括使用具有SEQ ID NO：35和36所示序列的引物对或具有SEQ ID NO：39和40所示序列的引物对，以所述生物样品中经亚硫酸氢盐处理后的CDKN2B基因或其片段为模板进行PCR扩增反应；

对MLH1基因的甲基化水平的检测包括使用具有SEQ ID NO：43和44所示序列的引物对或具有SEQ ID NO：47和48所示序列的引物对，以所述生物样品中经亚硫酸氢盐处理后的MLH1基因或其片段为模板进行PCR扩增反应；

对NPTX2基因的甲基化水平的检测包括使用具有SEQ ID NO：51和52所示序列的引物对、具有SEQ ID NO：55和56所示序列的引物对、或具有SEQ ID NO：59和60所示序列的引物对，以所述生物样品中经亚硫酸氢盐处理后的NPTX2基因或其片段为模板进行PCR扩增反应；

对PENK基因的甲基化水平的检测包括使用具有SEQ ID NO：63和64所示序列的引物对、具有SEQ ID NO：67和68所示序列的引物对、或具有SEQ ID NO：71和72所示序列的引物对，以所述生物样品中经亚硫酸氢盐处理后的PENK基因或其片段为模板进行PCR扩增反应；

对RASSF1A基因的甲基化水平的检测包括使用具有SEQ ID NO：75和76所示序列的引物对、具有SEQ ID NO：79和80所示序列的引物对、或具有SEQ ID NO：83和84所示序列的引物对，以所述生物样品中经亚硫酸氢盐处理后的RASSF1A基因或其片段为模板进行PCR扩增反应；

对SFRP1基因的甲基化水平的检测包括使用具有SEQ ID NO：87和88所示序列的引物对或具有SEQ ID NO：91和92所示序列的引物对，以所述生物样品中经亚硫酸氢盐处理后的SFRP1基因或其片段为模板进行PCR扩增反应；以及

对TFPI2基因的甲基化水平的检测包括使用具有SEQ ID NO：95和96所示序列的引物对或如SEQ ID NO：99和100所示序列的引物对，以所述生物样品中经亚硫酸氢盐处理后的TFPI2基因或其片段为模板进行PCR扩增反应。

16.如权利要求15所述的方法，其中步骤2)中

对ADAMTS1基因的甲基化水平的检测包括使用具有SEQ ID NO：11和12所示序列的引物对和具有SEQ ID NO：13所示序列的封闭引物，或者使用具有SEQ ID NO：15和16所示序列的引物对和具有SEQ ID NO：17所示序列的封闭引物，以所述生物样品中经亚硫酸氢盐处理后的ADAMTS1基因或其片段为模板进行PCR扩增反应；

对BNC1基因的甲基化水平的检测包括使用具有SEQ ID NO：19和20所示序列的引物对和具有SEQ ID NO：21所示序列的封闭引物，或者使用具有SEQ ID NO：23和24所示序列的引物对和具有SEQ ID NO：25所示序列的封闭引物，以所述生物样品中经亚硫酸氢盐处理后的BNC1基因或其片段为模板进行PCR扩增反应；

对CDKN2A基因的甲基化水平的检测包括使用具有SEQ ID NO：27和28所示序列的引物对和具有SEQ ID NO：29所示序列的封闭引物，或者使用具有SEQ ID NO：31和32所示序列的引物对和具有SEQ ID NO：33所示序列的封闭引物，以所述生物样品中经亚硫酸氢盐处理后的CDKN2A基因或其片段为模板进行PCR扩增反应；

对CDKN2B基因的甲基化水平的检测包括使用具有SEQ ID NO：35和36所示序列的引物对和具有SEQ ID NO：37所示序列的封闭引物，或者使用具有SEQ ID NO：39和40所示序列的引物对和具有SEQ ID NO：41所示序列的封闭引物，以所述生物样品中经亚硫酸氢盐处理后的CDKN2B基因或其片段为模板进行PCR扩增反应；

对MLH1基因的甲基化水平的检测包括使用具有SEQ ID NO：43和44所示序列的引物对和具有SEQ ID NO：45所示序列的封闭引物，或者使用具有SEQ ID NO：47和48所示序列的引物对和具有SEQ ID NO：49所示序列的封闭引物，以所述生物样品中经亚硫酸氢盐处理后的MLH1基因或其片段为模板进行PCR扩增反应；

对NPTX2基因的甲基化水平的检测包括使用具有SEQ ID NO：51和52所示序列的引物对和具有SEQ ID NO：53所示序列的封闭引物，使用具有SEQ ID NO：55和56所示序列的引物对和具有SEQ ID NO：57所示序列的封闭引物，或者使用具有SEQ ID NO：59和60所示序列的引物对和具有SEQ ID NO：61所示序列的封闭引物，以所述生物样品中经亚硫酸氢盐处理后的NPTX2基因或其片段为模板进行PCR扩增反应；

对PENK基因的甲基化水平的检测包括使用具有SEQ ID NO：63和64所示序列的引物对和具有SEQ ID NO：65所示序列的封闭引物，使用具有SEQ ID NO：67和68所示序列的引物对和具有SEQ ID NO：69所示序列的封闭引物，或者使用具有SEQ ID NO：71和72所示序列的引物对和具有SEQ ID NO：73所示序列的封闭引物，以所述生物样品中经亚硫酸氢盐处理后的PENK基因或其片段为模板进行PCR扩增反应；

对RASSF1A基因的甲基化水平的检测包括使用具有SEQ ID NO：75和76所示序列的引物对和具有SEQ ID NO：77所示序列的封闭引物，具有SEQ ID NO：79和80所示序列的引物对和具有SEQ ID NO：81所示序列的封闭引物，或者使用具有SEQ ID NO：83和84所示序列的引物对和具有SEQ ID NO：85所示序列的封闭引物，以所述生物样品中经亚硫酸氢盐处理后的RASSF1A基因或其片段为模板进行PCR扩增反应；

对SFRP1基因的甲基化水平的检测包括使用具有SEQ ID NO：87和88所示序列的引物对和具有SEQ ID NO：89所示序列的封闭引物，或者使用具有SEQ ID NO：91和92所示序列的引物对和具有SEQ ID NO：93所示序列的封闭引物，以所述生物样品中经亚硫酸氢盐处理后的SFRP1基因或其片段为模板进行PCR扩增反应；以及

对TFPI2基因的甲基化水平的检测包括使用具有SEQ ID NO：95和96所示序列的引物对和具有SEQ ID NO：97所示序列的封闭引物，或者使用具有SEQ ID NO：99和100所示序列的引物对和具有SEQ ID NO：101所示序列的封闭引物，以所述生物样品中经亚硫酸氢盐处理后的TFPI2基因或其片段为模板进行PCR扩增反应，

其中所述封闭引物具有抗DNA聚合酶延伸扩增的3’末端修饰。

17.如权利要求16所述的方法，其中步骤1)中

对ADAMTS1基因的甲基化水平的检测包括使用具有SEQ ID NO：11和12所示序列的引物对、具有SEQ ID NO：13所示序列的封闭引物和具有SEQ ID NO：14所示序列的探针，或者使用具有SEQ ID NO：15和16所示序列的引物对、具有SEQ ID NO：17所示序列的封闭引物和具有SEQ ID NO：18所示序列的探针，以所述生物样品中经亚硫酸氢盐处理后的ADAMTS1基因或其片段为模板进行PCR扩增反应；

对BNC1基因的甲基化水平的检测包括使用具有SEQ ID NO：19和20所示序列的引物对、具有SEQ ID NO：21所示序列的封闭引物和具有SEQ ID NO：22所示序列的探针，或者使用具有SEQ ID NO：23和24所示序列的引物对、具有SEQ ID NO：25所示序列的封闭引物和具有SEQ ID NO：26所示序列的探针，以所述生物样品中经亚硫酸氢盐处理后的BNC1基因或其片段为模板进行PCR扩增反应；

对CDKN2A基因的甲基化水平的检测包括使用具有SEQ ID NO：27和28所示序列的引物对、具有SEQ ID NO：29所示序列的封闭引物和具有SEQ ID NO：30所示序列的探针，或者使用具有SEQ ID NO：31和32所示序列的引物对、具有SEQ ID NO：33所示序列的封闭引物和具有SEQ ID NO：34所示序列的探针，以所述生物样品中经亚硫酸氢盐处理后的CDKN2A基因或其片段为模板进行PCR扩增反应；

对CDKN2B基因的甲基化水平的检测包括使用具有SEQ ID NO：35和36所示序列的引物对、具有SEQ ID NO：37所示序列的封闭引物和具有SEQ ID NO：38所示序列的探针，或者使用具有SEQ ID NO：39和40所示序列的引物对、具有SEQ ID NO：41所示序列的封闭引物和具有SEQ ID NO：42所示序列的探针，以所述生物样品中经亚硫酸氢盐处理后的CDKN2B基因或其片段为模板进行PCR扩增反应；

对MLH1基因的甲基化水平的检测包括使用具有SEQ ID NO：43和44所示序列的引物对、具有SEQ ID NO：45所示序列的封闭引物和具有SEQ ID NO：46所示序列的探针，或者使用具有SEQ ID NO：47和48所示序列的引物对、具有SEQ ID NO：49所示序列的封闭引物和具有SEQ ID NO：50所示序列的探针，以所述生物样品中经亚硫酸氢盐处理后的MLH1基因或其片段为模板进行PCR扩增反应；

对NPTX2基因的甲基化水平的检测包括使用具有SEQ ID NO：51和52所示序列的引物对、具有SEQ ID NO：53所示序列的封闭引物和具有SEQ ID NO：54所示序列的探针，使用具有SEQ ID NO：55和56所示序列的引物对、具有SEQ ID NO：57所示序列的封闭引物和具有SEQ ID NO：58所示序列的探针，或者使用具有SEQ ID NO：59和60所示序列的引物对、具有SEQ ID NO：61所示序列的封闭引物和具有SEQ ID NO：62所示序列的探针，以所述生物样品中经亚硫酸氢盐处理后的NPTX2基因或其片段为模板进行PCR扩增反应；

对PENK基因的甲基化水平的检测包括使用具有SEQ ID NO：63和64所示序列的引物对、具有SEQ ID NO：65所示序列的封闭引物和具有SEQ ID NO：66所示序列的探针，使用具有SEQ ID NO：67和68所示序列的引物对、具有SEQ ID NO：69所示序列的封闭引物和具有SEQID NO：70所示序列的探针，或者使用具有SEQ ID NO：71和72所示序列的引物对、具有SEQID NO：73所示序列的封闭引物和具有SEQ ID NO：74所示序列的探针，以所述生物样品中经亚硫酸氢盐处理后的PENK基因或其片段为模板进行PCR扩增反应；

对RASSF1A基因的甲基化水平的检测包括使用具有SEQ ID NO：75和76所示序列的引物对、具有SEQ ID NO：77所示序列的封闭引物和具有SEQ ID NO：78所示序列的探针，使用具有SEQ ID NO：79和80所示序列的引物对、具有SEQ ID NO：81所示序列的封闭引物和具有SEQ ID NO：82所示序列的探针，或者使用具有SEQ ID NO：83和84所示序列的引物对、具有SEQ ID NO：85所示序列的封闭引物和具有SEQ ID NO：86所示序列的探针，以所述生物样品中经亚硫酸氢盐处理后的RASSF1A基因或其片段为模板进行PCR扩增反应；

对SFRP1基因的甲基化水平的检测包括使用具有SEQ ID NO：87和88所示序列的引物对、具有SEQ ID NO：89所示序列的封闭引物和具有SEQ ID NO：90所示序列的探针，或者使用具有SEQ ID NO：91和92所示序列的引物对、具有SEQ ID NO：93所示序列的封闭引物和具有SEQ ID NO：94所示序列的探针，以所述生物样品中经亚硫酸氢盐处理后的SFRP1基因或其片段为模板进行PCR扩增反应；以及

对TFPI2基因的甲基化水平的检测包括使用具有SEQ ID NO：95和96所示序列的引物对、具有SEQ ID NO：97所示序列的封闭引物和具有SEQ ID NO：98所示序列的探针，或者使用具有SEQ ID NO：99和100所示序列的引物对、具有SEQ ID NO：101所示序列的封闭引物和具有SEQ ID NO：102所示序列的探针，以所述生物样品中经亚硫酸氢盐处理后的TFPI2基因或其片段为模板进行PCR扩增反应，

其中所述探针在一个末端具有荧光基团，在另一末端具有荧光淬灭基团。

18.如权利要求1或2所述的方法，其中步骤1)还包括使用具有SEQ ID NO：103和104所示序列的引物对和具有SEQ ID NO：105所示序列的探针，以所述生物样品中经亚硫酸氢盐处理后的作为内参基因的ACTB基因或其片段为模板进行PCR扩增反应。

19.如权利要求1或2所述的方法，其中步骤2)包括根据所述生物标志物基因的甲基化水平基于逻辑回归来判断所述受试者中的胰腺癌状态。

20.如权利要求1或2所述的方法，其中所述生物样品选自所述受试者的血液、血清、血浆、粪便、淋巴、脑脊液、腹水、尿和组织活检。

21.一种鉴定受试者中胰腺癌状态的试剂盒，包括用于检测来自所述受试者的生物样品中生物标志物基因的甲基化水平的引物对，其中所述引物对用于以经亚硫酸氢盐处理的所述生物标志物基因或其片段为模板进行PCR扩增反应；所述生物标志物基因选自如下基因的一种或多种：ADAMTS1、BNC1、CDKN2A、CDKN2B、MLH1、NPTX2、PENK、RASSF1A、SFRP1和TFPI2。

22.如权利要求21所述的试剂盒，其中所述生物标志物基因选自ADAMTS1、BNC1、CDKN2A、CDKN2B、MLH1、NPTX2、PENK、RASSF1A、SFRP1和TFPI2中的2种或2种以上。

23.如权利要求22所述的试剂盒，其中所述生物标志物基因选自ADAMTS1、BNC1、CDKN2A、CDKN2B、MLH1、NPTX2、PENK、RASSF1A、SFRP1和TFPI2中的5种或5种以上。

24.如权利要求23所述的试剂盒，其中所述生物标志物基因为ADAMTS1、BNC1、CDKN2A、PENK以及SFRP1。

25.如权利要求21所述的试剂盒，其中所述胰腺癌状态为胰腺癌I期，所述生物标志物基因为SFRP1和/或RASSF1A；或所述胰腺癌状态为胰腺癌II期，所述生物标志物基因为ADAMTS1、BNC1、CDKN2B、NPTX2和/或SFRP1。

26.如权利要求21所述的试剂盒，其中所述胰腺癌状态为导管腺癌，所述生物标志物基因为ADAMTS1、CDKN2A、CDKN2B、MLH1、NPTX2、RASSF1A、SFRP1和/或TFPI2。

27.如权利要求21所述的试剂盒，其中所述胰腺癌状态为特殊类型的导管起源的癌，所述生物标志物基因为BNC1、CDKN2B、MLH1、PENK、RASSF1A、SFRP1和/或TFPI2。

28.如权利要求21所述的试剂盒，其中所述胰腺癌状态为腺泡细胞癌，所述生物标志物基因为BNC1、CDKN2A、MLH1、NPTX2、PENK、RASSF1A、SFRP1和/或TFPI2。

29.如权利要求21所述的试剂盒，其中所述胰腺癌状态为小细胞癌，所述生物标志物基因为ADAMTS1、BNC1、MLH1、NPTX2、PENK、SFRP1和/或TFPI2。

30.如权利要求21所述的试剂盒，其中

用于ADAMTS1甲基化水平检测的引物对具有SEQ ID NO：11和12所示的序列或SEQ IDNO：15和16所示的序列；

用于BNC1甲基化水平检测的引物对具有SEQ ID NO：19和20所示的序列或SEQ ID NO：23和24所示的序列；

用于CDKN2A甲基化水平检测的引物对具有SEQ ID NO：27和28所示的序列或SEQ IDNO：31和32所示的序列；

用于CDKN2B甲基化水平检测的引物对具有SEQ ID NO：35和36所示的序列或SEQ IDNO：39和40所示的序列；

用于MLH1甲基化水平检测的引物对具有SEQ ID NO：43和44所示的序列、或SEQ ID NO：47和48所示的序列；

用于NPTX2甲基化水平检测的引物对具有SEQ ID NO：51和52所示的序列、SEQ ID NO：55和56所示的序列或SEQ ID NO：59和60所示的序列；

用于PENK甲基化水平检测的引物对具有SEQ ID NO：63和64所示的序列、SEQ ID NO：67和68所示的序列、或SEQ ID NO：71和72所示的序列；

用于RASSF1A甲基化水平检测的引物对具有SEQ ID NO：75和76所示的序列、SEQ IDNO：79和80所示的序列或SEQ ID NO：83和84所示的序列；

用于SFRP1甲基化水平检测的引物对具有SEQ ID NO：87和88所示的序列或SEQ ID NO：91和92所示的序列；以及

用于TFPI2甲基化水平检测的引物对具有SEQ ID NO：95和96所示的序列或SEQ ID NO：99和100所示的序列。

31.如权利要求30所述的试剂盒，还包括封闭引物，其中

与具有SEQ ID NO：11和12所示序列的引物对联合使用的封闭引物具有SEQ ID NO：13所示的序列；

与具有SEQ ID NO：15和16所示序列的引物对联合使用的封闭引物具有SEQ ID NO：17所示的序列；

与具有SEQ ID NO：19和20所示序列的引物对联合使用的封闭引物具有SEQ ID NO：21所示的序列；

与具有SEQ ID NO：23和24所示序列的引物对联合使用的封闭引物具有SEQ ID NO：25所示的序列；

与具有SEQ ID NO：27和28所示序列的引物对联合使用的封闭引物具有SEQ ID NO：29所示的序列；

与具有SEQ ID NO：31和32所示序列的引物对联合使用的封闭引物具有SEQ ID NO：33所示的序列；

与具有SEQ ID NO：35和36所示序列的引物对联合使用的封闭引物具有SEQ ID NO：37所示的序列；

与具有SEQ ID NO：39和40所示序列的引物对联合使用的封闭引物具有SEQ ID NO：41所示的序列；

与具有SEQ ID NO：43和44所示序列的引物对联合使用的封闭引物具有SEQ ID NO：45所示的序列；

与具有SEQ ID NO：47和48所示序列的引物对联合使用的封闭引物具有SEQ ID NO：49所示的序列；

与具有SEQ ID NO：51和52所示序列的引物对联合使用的封闭引物具有SEQ ID NO：53所示的序列；

与具有SEQ ID NO：55和56所示序列的引物对联合使用的封闭引物具有SEQ ID NO：57所示的序列；

与具有SEQ ID NO：59和60所示序列的引物对联合使用的封闭引物具有SEQ ID NO：61所示的序列；

与具有SEQ ID NO：63和64所示序列的引物对联合使用的封闭引物具有SEQ ID NO：65所示的序列；

与具有SEQ ID NO：67和68所示序列的引物对联合使用的封闭引物具有SEQ ID NO：69所示的序列；

与具有SEQ ID NO：71和72所示序列的引物对联合使用的封闭引物具有SEQ ID NO：73所示的序列；

与具有SEQ ID NO：75和76所示序列的引物对联合使用的封闭引物具有SEQ ID NO：77所示的序列；

与具有SEQ ID NO：79和80所示序列的引物对联合使用的封闭引物具有SEQ ID NO：81所示的序列；

与具有SEQ ID NO：83和84所示序列的引物对联合使用的封闭引物具有SEQ ID NO：85所示的序列；

与具有SEQ ID NO：87和88所示序列的引物对联合使用的封闭引物具有SEQ ID NO：89所示的序列；

与具有SEQ ID NO：91和92所示序列的引物对联合使用的封闭引物具有SEQ ID NO：93所示的序列；

与具有SEQ ID NO：95和96所示序列的引物对联合使用的封闭引物具有SEQ ID NO：97所示的序列；以及

与具有SEQ ID NO：99和100所示序列的引物对联合使用的封闭引物具有SEQ ID NO：101所示的序列；

其中所述封闭引物具有抗DNA聚合酶延伸扩增的3’末端修饰。

32.如权利要求30或31所述的试剂盒，还包括探针，其中

与具有SEQ ID NO：11和12所示序列的引物对联合使用的探针具有SEQ ID NO：14所示的序列；

与具有SEQ ID NO：15和16所示序列的引物对联合使用的探针具有SEQ ID NO：18所示的序列；

与具有SEQ ID NO：19和20所示序列的引物对联合使用的探针具有SEQ ID NO：22所示的序列；

与具有SEQ ID NO：23和24所示序列的引物对联合使用的探针具有SEQ ID NO：26所示的序列；

与具有SEQ ID NO：27和28所示序列的引物对联合使用的探针具有SEQ ID NO：30所示的序列；

与具有SEQ ID NO：31和32所示序列的引物对联合使用的探针具有SEQ ID NO：34所示的序列；

与具有SEQ ID NO：35和36所示序列的引物对联合使用的探针具有SEQ ID NO：38所示的序列；

与具有SEQ ID NO：39和40所示序列的引物对联合使用的探针具有SEQ ID NO：42所示的序列；

与具有SEQ ID NO：43和44所示序列的引物对联合使用的探针具有SEQ ID NO：46所示的序列；

与具有SEQ ID NO：47和48所示序列的引物对联合使用的探针具有SEQ ID NO：50所示的序列；

与具有SEQ ID NO：51和52所示序列的引物对联合使用的探针具有SEQ ID NO：54所示的序列；

与具有SEQ ID NO：55和56所示序列的引物对联合使用的探针具有SEQ ID NO：58所示的序列；

与具有SEQ ID NO：59和60所示序列的引物对联合使用的探针具有SEQ ID NO：62所示的序列；

与具有SEQ ID NO：63和64所示序列的引物对联合使用的探针具有SEQ ID NO：66所示的序列；

与具有SEQ ID NO：67和68所示序列的引物对联合使用的探针具有SEQ ID NO：70所示的序列；

与具有SEQ ID NO：71和72所示序列的引物对联合使用的探针具有SEQ ID NO：74所示的序列；

与具有SEQ ID NO：75和76所示序列的引物对联合使用的探针具有SEQ ID NO：78所示的序列；

与具有SEQ ID NO：79和80所示序列的引物对联合使用的探针具有SEQ ID NO：82所示的序列；

与具有SEQ ID NO：83和84所示序列的引物对联合使用的探针具有SEQ ID NO：86所示的序列；

与具有SEQ ID NO：87和88所示序列的引物对联合使用的探针具有SEQ ID NO：90所示的序列；

与具有SEQ ID NO：91和92所示序列的引物对联合使用的探针具有SEQ ID NO：94所示的序列；

与具有SEQ ID NO：95和96所示序列的引物对联合使用的探针具有SEQ ID NO：98所示的序列；以及

与具有SEQ ID NO：99和100所示序列的引物对联合使用的探针具有SEQ ID NO：102所示的序列，

其中所述探针在一个末端具有荧光基团，在另一末端具有荧光淬灭基团。

33.如权利要求21所述的试剂盒，其中还包括具有SEQ ID NO：103和104所示序列的引物对和具有SEQ ID NO：105所示序列的探针，用于以所述生物样品中经亚硫酸氢盐处理后的作为内参基因的ACTB基因或其片段为模板进行PCR扩增反应。

34.如权利要求21所述的试剂盒，其中还包括DNA提取试剂和亚硫酸氢盐试剂。

35.如权利要求34所述的试剂盒，其中所述亚硫酸氢盐试剂包括亚硫酸氢钠。

36.如权利要求21所述的试剂盒，其中所述胰腺癌状态包括胰腺癌易感性以及胰腺癌的存在、进展、亚型和/或分期。

37.如权利要求21所述的试剂盒，其中所述生物样品选自所述受试者的血液、血清、血浆、粪便、淋巴、脑脊液、腹水、尿和组织活检。

38.如权利要求21所述的试剂盒，其中还包括阐述所述试剂盒使用方法以及以逻辑回归对检测结果进行处理的说明书。

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