CN104212798B - 一种与绵羊肉用性能相关的标记物 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种与绵羊肉用性能相关的miRNA，其序列如SEQ ID NO：1所示。本发明利用miRNA‑sep筛选出在多赛特羊和小尾寒羊肌内脂肪组织中表达差异的miRNA，并通过了QPCR验证。在实际生产中，可以通过抑制该表达差异的miRNA来实现改变绵羊肉用性能的目的。
Description
发明领域
本发明属于生物技术领域，本发明涉及一种与绵羊肉用性能相关的标记物，具体涉及一种与绵羊肉用性能相关的miRNA。
背景技术
miRNA是近年来研究发现的一种长20-24nt的内源性非蛋白编码RNA。miRNA基因最初转录产生具有颈环结构的pre-miRNAs。随后pre-miRNA被转运出核，在细胞质中被Dicer酶作用，加工成成熟的miRNA。通过序列互补与特定靶基因的mRNA结合，引起mRNA降解或抑制mRNA翻译从而对基因的表达起到负调节作用。
道赛特羊(Dorset)和小尾寒羊是具有不同生理特性的绵羊品种。道赛特羊体积大、肌肉多、肌内脂肪少，肉感差；小尾寒羊繁殖速度快、肌内脂肪多，肉感好。在实际生产中，人们常常需要大量培养肉感好的绵羊，因此寻找与肉感相关的基因或者调控基因表达的miRNA成为了上述目标实现的途径。
高通量转录组测序(RNA-sep)是在转录组水平上进行深度测序的一项技术，测序技术在转录组分析中的应用主要集中在基因表达谱的构建，新基因的发现、小分子非编码RNA表达谱的构建和新小分子RNA基因的发现、蛋白质编码基因注释、以及如fusiontranscript等转录组研究上。数据在最初的处理上是大体是相似的，接下来针对不同的研究目的可以选用不同的生物信息学软件进行计算。
利用大规模测序技术直接对由mRNA或小分子非编码RNA反转录成的cDNA序列进行测序，产生数以千万计的reads数量，从而使得一段特殊的基因组区域的转录水平可以直接通过比对到该基因组区域的reads数来衡量。该技术常用来构建某一特定组织或细胞的基因表达谱，通过对正常组织和异常组织进行基因表达谱的分析，得到在两种组织中差异表达的基因。
发明内容
本发明的首要目的是提供一种与绵羊肉用性能相关的miRNA，所述miRNA是经过RNA-seq筛选并使用QPCR验证获得的。
本发明的第二目的是提供一种检测与绵羊肉用性能相关的miRNA的试剂。
本发明的第三目的是提供一种检测与绵羊肉用性能相关的miRNA的试剂盒。
本发明的第四目的是提供上述miRNA在制备检测与绵羊肉用性能相关的miRNA的试剂盒中应用。
本发明的第五目的是提供上述试剂在制备检测与绵羊肉用性能相关的miRNA的试剂盒中应用。
为了实现上述目的，本发明采用的实施方案如下：
一种与绵羊肉用性能相关的miRNA，该miRNA的序列如SEQ ID NO：1所示。
一种检测与绵羊肉用性能相关的miRNA的试剂，所述试剂包括QPCR实验中使用的反转录引物和/或扩增引物，所述反转录引物是Oligo(dT)特异性的RT引物，优选购自北京信诺金达生物科技有限公司；所述扩增引物的正向引物序列如SEQ ID NO：2所示，反向引物为通用反向引物，优选购自北京信诺金达生物科技有限公司。
一种检测与绵羊肉用性能相关的miRNA的检测试剂盒，该检测试剂盒包括QPCR实验中使用的反转录引物和/或扩增引物，所述反转录引物是Oligo(dT)特异性的RT引物，优选购自北京信诺金达生物科技有限公司；所述扩增引物的正向引物序列如SEQ ID NO：2所示，反向引物为通用反向引物，优选购自北京信诺金达生物科技有限公司。
本发明还提供了绵羊肉用性能相关的miRNA在制备检测miRNA的试剂盒中的应用，该miRNA的序列如SEQ ID NO：1所示。
本发明还提供了检测与绵羊肉用性能相关的miRNA的试剂在制备检测miRNA的试剂盒中的应用，所述试剂包括QPCR实验中使用的反转录引物和/或扩增引物，所述反转录引物是Oligo(dT)特异性的RT引物，优选购自北京信诺金达生物科技有限公司；所述扩增引物的正向引物序列如SEQ ID NO：2所示，反向引物为通用反向引物，优选购自北京信诺金达生物科技有限公司。
本发明还提供了检测组织样本中miRNA表达量的方法，具体的操作步骤如下：
(1)提取样本总RNA；
(2)将步骤(1)获得的RNA逆转录成cDNA；
(3)在荧光实时定量PCR仪上将miRNA和对照基因进行扩增检测；
(4)通过融解曲线和扩增曲线分析，ΔΔCT法进行相对定量。
步骤(1)的具体实施方法为：收集样本后冻存于液氮，取出后把组织放入已预冷的研钵中进行研磨，待组织样本成粉末状后：
①加入Trizol，室温保存5min；
②加氯仿0.2ml，用力振荡离心管，充分混匀，室温下放置5min-10min；
③12000rpm高速离心15min后吸取上层水相(吸70％)到另一新离心管中，注意不要吸到两层水相之间的蛋白物质。移入新管，加入等体积的-20℃预冷异丙醇，充分颠倒混匀，置于冰上10min；
④12000rpm高速离15min后小心弃掉上清液，按1ml/ml Trizol的比例加入75％DEPC乙醇洗涤沉淀(4℃保存)，洗涤沉淀物，振荡混合，4℃下12000rpm高速离心5min；
⑤弃去乙醇液体，室温下放置5min以充分晾干沉淀，加入DEPC处理过的水溶解沉淀；
⑥用Nanodrop2000紫外分光光度计测量RNA纯度及浓度，冻存于-70℃。
步骤(2)的具体实施方法为：
a.体系配制
| 总RNA | 10μl |
| 5×RT Buffer | 4μl |
| miRNA接头引物 | 1μl |
| miRNA RT Enzyme Mix | 2μl |
| 无RNA酶的去离子水 | 补至20μl |
| 总体积 | 20μl |
b.混匀，离心。
c.37℃水浴60min；
d.85℃水浴10min，灭活逆转录酶。
其中，miRNA接头引物为Oligo(dT)特异性的RT引物(购自北京信诺金达生物科技有限公司)。
步骤(3)的具体实施方法为：
a.PCR体系配置(20μl体系)
| 2×SG Green qPCR Mix | 10μl |
| 正向引物(10μM) | 0.4μl |
| 反向引物(10μM) | 0.4μl |
| ROX | 0.4ul |
| cDNA | 1μl |
| 无核酸酶的水 | 7.8ul |
| 总体积 | 20ul |
b.混合均匀，离心，分到8联排管或者96孔PCR板里，每个样品每个基因3个PCR平行反应。
c.PCR反应程序设置
以SYBR Green作为荧光标记物，在Light Cycler荧光实时定量PCR仪上进行PCR反应。扩增miRNA的正向引物序列如SEQ ID NO：2所示，反向引物为通用反向引物(购自北京信诺金达生物科技有限公司)。以snRNA U6作为对照基因，其正向引物序列为SEQ ID NO：3所示；反向引物序列为SEQ ID NO：4所示。
本发明的优点和有益效果：(1)首次发现了序列如SEQ ID NO：1所示的miRNA与绵羊肉用性能相关；(2)在实际生产中，可以通过抑制miRNA的表达，从而改善绵羊的肉用性能，提高肉感，因此本发明为畜牧业生产提供了理论基础和技术启示。
附图说明
图1表示使用QPCR检测道赛特羊和小尾寒羊脂肪组织中miRNA的表达。
具体的实施方式
下面结合具体的实施例进一步说明本发明，本发明的实施例仅用于解释本发明，并不意味着限制本发明的保护范围。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1与绵羊肉用性能相关的miRNA的筛选
1.1试验材料的采集
试验材料采自2个生理性能不同的绵羊品种：小尾寒羊和道赛特羊。在同样的条件下对2个品种绵羊进行饲养管理，在12月龄时，每品种屠宰8只，公母各半。屠宰程序按中华人民共和国国家标准(GB13078 2001和GB/T172337 1998)和农业行业标准(NY514 2002和NY5151 2002)进行。屠宰后，采集羊腹部肌内脂肪组织，用铝箔包裹置于液氮中速冻，之后放入-70℃保存备用。
1.2RNA样品的制备及质量分析
1.2.1RNA样品的制备
两种绵羊的脂肪组织经过RNA抽提后经琼脂糖凝胶电泳判断RNA样品质量，合格者可以用于进一步的转录组分析，总RNA提取的步骤如下：
将组织放入已预冷的研钵中进行研磨，待组织样本成粉末状后：
①加入Trizol，室温保存5min；
②加氯仿0.2ml，用力振荡离心管，充分混匀，室温下放置5min-10min；
③12000rpm高速离心15min后吸取上层水相(吸70％)到另一新离心管中，注意不要吸到两层水相之间的蛋白物质。移入新管，加入等体积的-20℃预冷异丙醇，充分颠倒混匀，置于冰上10min；
④12000rpm高速离15min后小心弃掉上清液，按1ml/ml Trizol的比例加入75％DEPC乙醇洗涤沉淀(4℃保存)，洗涤沉淀物，振荡混合，4℃下12000rpm高速离心5min；
⑤弃去乙醇液体，室温下放置5min以充分晾干沉淀，加入DEPC处理过的水溶解沉淀；
⑥用Nanodrop2000紫外分光光度计测量RNA纯度及浓度，冻存于-70℃。
1.2.2RNA样品的质量分析(NanoDrop1000分光光度计)
NanoDrop1000分光光度计检测RNA样品，RNA-seq测序的样品要求：OD260/OD280为1.8-2.2。
1.2.3RNA样品的质量分析(Agilent Technologies 2100 Bioanalyzer)
Agilent Technologies 2100 Bioanalyzer检测RNA样品质量，观察28S rRNA和18S rRNA主带明显、无降解、RNA完整性指数合格、浓度达到要求的符合RNA-seq测序cDNA文库构建的要求，可以用于文库构建及测序。
1.3高通量转录组测序
1.3.1RNA-seq读段定位
用Bowtie分析。Bowtie是一个超级快速的，较为节省内存的短序列拼接至模板基因组的工具。它在拼接35碱基长度的序列时，可以达到每小时2.5亿次的拼接速度。Bowtie并不是一个简单的拼接工具，它不同于Blast等。它适合的工作是将小序列比对至大基因组上去。它最长能读取1024个碱基的片段。
1.3.2差异表达miRNA分析
对于miRNA的差异分析，首先将miRNA_All_Counts的counts数加和小于10的删除，再采用结合国际公认算法EBSeq进行差异筛选。其中logFC＞1或LogFC＜-1，FDR＜0.05。
实施例2 QPCR验证差异表达miRNA
根据上述RNA-seq结果，选择在两组中差异表达显著的miRNA作为本发明中初步筛查的对象，本实施例选择满足条件的序列如SEQ ID NO：1所示的miRNA进行QPCR验证(所选miRNA在多赛特脂肪组织中的含量高于小尾寒羊)。道赛特羊和小尾寒羊脂肪组织各自取50个样本作为试验对象。在整个过程中均实施严格的质控。每个样本连续检测三次，所有检测均采用盲法，即在不清楚样本背景的情况下完成以避免偏倚。
(1)RNA提取操作步骤如实施例1。
(2)逆转录制备cDNA：
a.体系配制：
| 总RNA | 10μl |
| 5×RT Buffer | 4μl |
| miRNA接头引物 | 1μl |
| miRNA RT Enzyme Mix | 2μl |
| 无RNA酶的去离子水 | 补至20μl |
| 总体积 | 20μl |
b.将步骤a的各组分混匀，离心。
c.37℃水浴60min；
d.85℃水浴10min，灭活逆转录酶。
其中，miRNA接头引物Oligo(dT)特异性的RT引物(购自北京信诺金达生物科技有限公司)。
(3)QPCR：
a.PCR体系配制：
| 2×SG Green qPCR Mix | 10μl |
| 正向引物(10μM) | 0.4ul |
| 反向引物(10μM) | 0.4μl |
| ROX | 0.4μl |
| cDNA | 1μl |
| 无核酸酶的水 | 7.8ul |
| 总体积 | 20μl |
b.将步骤a的各组分混合均匀，离心，分到8联排管或者96孔PCR板里，每个样品每个基因3个PCR平行反应。
c.PCR反应程序：
以SYBR Green作为荧光标记物，在Light Cycler荧光实时定量PCR仪上进行PCR反应。扩增miRNA的正向引物序列如SEQ ID NO：2所示，反向引物为通用反向引物(购自北京信诺金达生物科技有限公司)。以snRNA U6作为参照基因，其上游引物序列为SEQ ID NO：3所示；下游引物序列为SEQ ID NO：4所示。
比较Ct方法分析数据，Prizm 4统计分析软件进行数据统计分析。结果如图1所示，与小尾寒羊相比，miRNA在道赛特羊肌内脂肪组织中的含量高出2倍多，差异具有显著性(P＝0.0083)，同RNA-sep结果一致。
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。
Claims (7)
1.一种绵羊肉用性能相关的miRNA，其特征在于，所述miRNA序列如SEQ ID NO：1所示。
2.一种检测权利要求1所述的miRNA的试剂，其特征在于，所述试剂包括QPCR实验中使用的反转录引物和扩增引物；所述反转录引物为Oligo(dT)特异性的RT引物；所述扩增引物由正向引物和反向引物组成，所述正向引物序列如SEQ ID NO：2所示，所述反向引物为通用反向引物，所述通用反向引物购自北京信诺金达生物科技有限公司。
3.一种权利要求1所述的miRNA的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒包含权利要求2所述的试剂。
4.根据权利要求3所述的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒还包含PCR反应常用的试剂和酶。
5.权利要求1所述的miRNA在制备权利要求3或4所述的检测试剂盒中的应用。
6.权利要求2所述的试剂在制备权利要求3或4所述的检测试剂盒中的应用。
7.一种检测权利要求1所述的miRNA的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)提取样本总RNA；
(2)将步骤(1)获得的RNA逆转录成cDNA；
(3)在荧光实时定量PCR仪上将步骤(2)获得的cDNA和对照基因进行扩增检测；
(4)通过融解曲线和扩增曲线分析，ΔΔCT法进行相对定量；
其中，所述RNA逆转录成cDNA使用的引物序列为Oligo(dT)特异性的RT引物；
步骤(3)中扩增检测需使用扩增引物，所述扩增引物的正向引物序列如SEQ ID NO：2所示，所述扩增引物的反向引物为通用反向引物，所述通用反向引物购自北京信诺金达生物科技有限公司；
所述对照基因为snRNA U6，所述对照基因的正向引物序列如SEQ ID NO：3所示，所述对照基因的反向引物序列如SEQ ID NO：4所示。
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