CN102477464A - 滩羊二毛弯曲数性状检测试剂盒及使用方法 - Google Patents

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李爱华
杨丽娟
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Abstract

一种滩羊二毛弯曲数性状选育检测试剂盒，试剂盒内装有KAP1.3基因PCR扩增用上下游引物混合物P1；TaqDNA连接酶；内切酶BsrsI。所述检测试剂盒的使用方法，所述方法包括下列步骤：1）PCR扩增SNP位点所在片段；2）PCR产物的酶切多态性检测。本发明提供的检测试剂盒通过分子生物学的应用研究，为滩羊品种选育提供了一种快速、标准、科学的方式，试剂盒的使用也十分简便，对地方特色资源的深入开发具有十分重要的意义。

Description

滩羊二毛弯曲数性状检测试剂盒及使用方法
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，特别涉及一种滩羊羊毛弯曲数性状选育检测试剂盒及使用方法。
背景技术
许多研究结果表明，羊毛的角蛋白组成与羊毛纤维的品质有密切的关系，并且受遗传、营养、生理和环境等因素的影响而发生变化。
滩羊是我国特有的轻裘皮(俗称二毛裘皮)绵羊品种，在世界绵羊品种中，其裘皮品质也是独一无二的，综合品质优良，遗传性能稳定，抗逆性强，对荒漠、半荒漠草原有很强的适应能力。属国家重点保护的羊种之一。滩羊之所以闻名于世，是因为二毛期的毛皮具有独特的毛股弯曲。滩羊的主要产品是二毛裘皮和滩羊肉，但自上世纪90年代中期以后，滩羊二毛裘皮市场价格持续低糜，随着市场经济的发展，曾一度成为陕甘宁边区人民摇钱树的滩羊，由于“二毛”裘皮销售受到冷遇、产区草原生态环境恶化等原因，滩羊生产经济效益出现负增长。如不采取相应的科学技术，不仅资源优势不能转变成商品和经济优势，而且滩羊原有的品种特性将随着生态环境的改变而变化，最终影响贫困山区回汉农民的经济收入及阻碍地方经济的发展，也有可能造成这一优良品种逐步退化，甚至威胁到该品种的生存。随着分子生物学技术的发展，利用分子遗传标记来辅助选育具有优良裘皮品质的优秀滩羊个体已成为现代家畜育种的发展方向。
滩羊育种中裘皮性状的选育是关键环节，而弯曲数是裘皮性状的一个非常重要的量化指标。角蛋白是毛囊和皮肤生物学功能重要的决定因子之一，其基因多样性在一定程度上调控角蛋白表达，从而调控羊毛的品质和产量。蛋白及亚家族编码基因存在多个插入/缺失和单核苷酸(SNP)突变，这些基因多样性与羊毛性状(细度、强度、弹性和弯曲度等)存在相关关系（管峰2007）。最近的研究表明，KAP1.3基因（杨丽娟等2010）是影响羊毛弯曲数的主要基因之一，可作为羊毛弯曲数性状选育的分子遗传标记。
限制性内切酶片段长度多态性分析（Restriction Fragment Length Polymorphism  RFLP）是利用限制性内切酶实现基因多态性位点的识别。将PCR扩增产物用限制性内切酶消化后，电泳分离，根据获得的限制性片段长度多态性，判断不同的等位基因特异性。该技术具有共显性遗传、无表型效应、不受年龄性别的影响等优点。目前已成功应用于结构基因分子标记的SNP检测和基因诊断试剂盒的研发。
发明内容
本发明的目的是提供一种滩羊二毛弯曲数性状选育检测试剂盒及使用方法，在于为滩羊二毛弯曲数相关基因的检测提供一种快速、简便、价格低廉的基因诊断方法，有利于筛选出二毛弯曲数最高的滩羊个体，指导滩羊羊毛弯曲数性状的分子标记选育。
本发明的目的通过以下技术方案实现： 
一种滩羊二毛弯曲数性状选育检测试剂盒，试剂盒内装有KAP1.3基因PCR扩增用上下游引物混合物P1；TaqDNA连接酶；内切酶BsrsI；
KAP1.3基因PCR扩增的上下游引物混合物P1表示的信息为：
KAP1.3上游引物序列5’-GGGTGGAACAAGCAGACCAAACTC-3’，
KAP1.3下游引物序列5’-TAGTTTGTTGGGACTGTACACTGGC-3’；
所述检测试剂盒的使用方法，包括下列步骤：
1）PCR扩增SNP位点所在片段；
2）PCR产物的酶切多态性检测；
所述的PCR扩增SNP位点所在片段的方法有以下步骤：
1）PCR扩增反应体系准备，在200ul的PCR反应管中，加入25ul PCR反应体系后充分混匀；25ulPCR反应体系由4ul50ng/ulDNA模板、2.5ul10×PCR反应缓冲液、2ul20mMdNTP、0.3ul5U/ul Taq酶、1ul10pM/ul上下游引物混合物P1、15.2ulddH2O组成；
2）、在S1000TM Thermal Cycler型PCR仪上设置如下PCR扩增反应程序：先95℃预变性3分钟；再经过35个循环，每个循环包括94℃变性30秒、58.8℃复性30s、72℃30秒；然后72℃延伸5分钟、最后4℃保存：程序设置完毕后，将PCR反应管放入PCR仪进行反应扩增；
3）、反应结束后，取4ulPCR产物点样在1.5％琼脂糖凝胶（含1‰GengreenII型染色液）中，然后在1×TBE缓冲液中电泳40分钟，检测PCR产物扩增片段大小，以KAP1.3基因扩增产物片段为598bp判定PCR扩增片段是否正确：
4）、剩余反应产物保存于-20℃。
所述的PCR产物的酶切多态性检测有以下步骤：
1）、酶切反应体系准备：在200ul的PCR反应管中，加入10ul 酶切反应体系，充分混匀：10ul酶切反应体系由4ul50ng/ul PCR产物、1ul10×酶切反应缓冲液、0.1ulBSA、2.5UBsrsI酶、4.65ulddH2O组成：
2）、在HZS-HA水浴振荡器上设置37℃，水温达到37℃后，将PCR反应管放入水浴振荡器进行酶切反应，反应时间为3小时；
3）、反应结束后，全部酶切产物点样在8%聚丙烯酰胺凝胶中，然后在1×TBE缓冲液中90V电泳1.5个小时，后用GengreenII型染色液(1:10000)泡染15～20min，检测酶切产物扩增片段大小，基因分型标准为KAP1.3基因酶切产物检测出223bp/350bp为AA基因型，223bp/305bp /350bp为AB基因型，223bp/305bp为BB基因型。
本发明提供的检测试剂盒通过分子生物学的应用研究，为滩羊品种选育提供了一种快速、标准、科学的方式，试剂盒的使用也十分简便，对地方特色资源的深入开发具有十分重要的意义。
附图说明
 图1为本发明试剂盒结构示意图；
 图2为KAP1.3基因PCR产物扩增结果图片；
 图3为本发明分型截图，注：223bp/350bp为AA基因型，223bp/305bp /350bp为AB基因型，223bp/305bp为BB基因型。
具体实施方式
  以下结合附图对本发明进行更细致的描述：如图1所示，本发明试剂盒包括KAP1.3基因PCR扩增的上下游引物混合物P1；TaqDNA连接酶；内切酶BsrsI。
 该试剂盒是直接以受测二毛期滩羊的血液提取的DNA基因组为模板，利用RFLP技术检测出KAP1.3的基因型，基因型共有3种—AA、AB、BB，其中BB基因型个体的二毛弯曲数最高。该试剂盒装有表1所述成分。
 表1试剂盒组成
Figure 276176DEST_PATH_IMAGE001
P1表示用于KAP1.3基因PCR扩增的上下游引物混合物，具体引物信息如下：
 KAP1.3上游引物序列5’-GGGTGGAACAAGCAGACCAAACTC-3’，
 KAP1.3下游引物序列5’-TAGTTTGTTGGGACTGTACACTGGC-3’
 扩增产物片段为598bp。
本发明试剂盒的使用方法，具体操作步骤如下：
 1.PCR扩增SNP位点所在片段：
  1）PCR扩增反应体系准备，在200ul的PCR反应管中，加入25ul PCR反应体系后充分混匀；25ulPCR反应体系由4ul50ng/ulDNA模板、2.5ul10×PCR反应缓冲液、2ul20mMdNTP、0.3ul5U/ul Taq酶、1ul10pM/ul上下游引物混合物P1、15.2ulddH2O组成；
2）、在S1000TM Thermal Cycler型PCR仪上设置如下PCR扩增反应程序：先95℃预变性3分钟；再经过35个循环，每个循环包括94℃变性30秒、58.8℃复性30s、72℃30秒；然后72℃延伸5分钟、最后4℃保存：程序设置完毕后，将PCR反应管放入PCR仪进行反应扩增；
3）、反应结束后，取4ulPCR产物点样在1.5％琼脂糖凝胶（含1‰GengreenII型染色液）中，然后在1×TBE缓冲液中电泳40分钟，检测PCR产物扩增片段大小，以KAP1.3基因扩增产物片段为598bp判定PCR扩增片段是否正确：
4）、剩余反应产物保存于-20℃。
所述的PCR产物的酶切多态性检测有以下步骤：
1）、酶切反应体系准备：在200ul的PCR反应管中，加入10ul 酶切反应体系，充分混匀：10ul酶切反应体系由4ul50ng/ul PCR产物、1ul10×酶切反应缓冲液、0.1ulBSA、2.5UBsrsI酶、4.65ulddH2O组成：
2）、在HZS-HA水浴振荡器上设置37℃，水温达到37℃后，将PCR反应管放入水浴振荡器进行酶切反应，反应时间为3小时；
3）、反应结束后，全部酶切产物点样在8%聚丙烯酰胺凝胶中，然后在1×TBE缓冲液中90V电泳1.5个小时，后用GengreenII型染色液(1:10000)泡染15～20min，检测酶切产物扩增片段大小，基因分型标准为KAP1.3基因酶切产物检测出223bp/350bp为AA基因型，223bp/305bp /350bp为AB基因型，223bp/305bp为BB基因型。
<110> 宁夏大学饲料工程技术中心
<120> 滩羊二毛弯曲数性状检测试剂盒
<160> 1
<210> 1
<211> 152
<212> DNA
<213> 滩羊（Ovis aries）
<220>
<221> VARIANT
<400> 1
Met Ala Cys Cys Ser Thr Ser Phe Cys Gly Phe Pro Ile Cys Ser Thr
1               5                   10                  15
Ala Gly Thr Cys Gly Ser Ser Cys Cys Arg Ser Thr Cys Ser Gln Thr
            20                  25                  30          
Ser Cys Cys Gln Pro Thr Ser Ile Gln Thr Ser Cys Cys Gln Pro Thr
        35                  40                  45                                   
Cys Leu Gln Thr Ser Gly Cys Glu Thr Gly Cys Gly Ile Gly Gly Ser
    50                  55                  60                      
Thr Gly Tyr Gly Gln Val Gly Ser Ser Gly Ala Val Ser Ser Arg Thr
65                  70                  75                  80                 
Arg Trp Cys Arg Pro Asp Cys Arg Val Glu Gly Thr Ser Leu Pro Pro
                85                  90                  95                   
Cys Cys Val Val Ser Cys Thr Ser Pro Ser Cys Cys Gln Leu Tyr Tyr
            100                 105                 110                         
Ala Gln Ala Ser Cys Cys Arg Pro Ser Tyr Cys Gly Gln Ser Cys Cys
        115                 120                 125                            
Arg Pro Ala Cys Cys Cys Gln Pro Thr Cys Thr Glu Pro Val Cys Glu
130                 135                 140                            
Pro Thr Cys Ser Gln Pro Ile Cys
145                 150                 
 

Claims (5)

1.一种滩羊二毛弯曲数性状选育检测试剂盒，试剂盒内装有KAP1.3基因PCR扩增用上下游引物混合物P1；TaqDNA连接酶；内切酶BsrsI。
2.根据权利1要求所述的滩羊羊毛弯曲数性状选育检测试剂盒，其特征是KAP1.3基因PCR扩增的上下游引物混合物P1表示的信息为：
KAP1.3上游引物序列5’-GGGTGGAACAAGCAGACCAAACTC-3’，
KAP1.3下游引物序列5’-TAGTTTGTTGGGACTGTACACTGGC-3’。
3.一种权利要求1所述检测试剂盒的使用方法，其特征是，所述方法包括下列步骤：
1）PCR扩增SNP位点所在片段；
2）PCR产物的酶切多态性检测。
4.根据权利要求3所述检测试剂盒的使用方法，其特征是所述的PCR扩增SNP位点所在片段的方法有以下步骤：
1）PCR扩增反应体系准备，在200ul的PCR反应管中，加入25ul PCR反应体系后充分混匀；25ulPCR反应体系由4ul50ng/ulDNA模板、2.5ul10×PCR反应缓冲液、2ul20mMdNTP、0.3ul5U/ul Taq酶、1ul10pM/ul上下游引物混合物P1、15.2ul ddH2O组成；
2）、在S1000TM Thermal Cycler型PCR仪上设置如下PCR扩增反应程序：先95℃预变性3分钟；再经过35个循环，每个循环包括94℃变性30秒、58.8℃复性30s、72℃30秒；然后72℃延伸5分钟、最后4℃保存：程序设置完毕后，将PCR反应管放入PCR仪进行反应扩增；
3）、反应结束后，取4ulPCR产物点样在1.5％琼脂糖凝胶（含1‰GengreenII型染色液）中，然后在1×TBE缓冲液中电泳40分钟，检测PCR产物扩增片段大小，以KAP1.3基因扩增产物片段为598bp判定PCR扩增片段是否正确：
4）、剩余反应产物保存于-20℃。
5.根据权利要求3所述检测试剂盒的使用方法，其特征是，所述的PCR产物的酶切多态性检测有以下步骤：
1）、酶切反应体系准备：在200ul的PCR反应管中，加入10ul 酶切反应体系，充分混匀：10ul酶切反应体系由4ul50ng/ul PCR产物、1ul10×酶切反应缓冲液、0.1ulBSA、2.5UBsrsI酶、4.65ulddH2O组成：
2）、在HZS-HA水浴振荡器上设置37℃，水温达到37℃后，将PCR反应管放入水浴振荡器进行酶切反应，反应时间为3小时；
3）、反应结束后，全部酶切产物点样在8%聚丙烯酰胺凝胶中，然后在1×TBE缓冲液中90V电泳1.5个小时，后用GengreenII型染色液(1:10000)泡染15～20min，检测酶切产物扩增片段大小，基因分型标准为KAP1.3基因酶切产物检测出223bp/350bp为AA基因型，223bp/305bp /350bp为AB基因型，223bp/305bp为BB基因型。
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