CN109897914A

CN109897914A - 一种同时检测yfv、rvfv、wnv和denv四种病毒的引物及其检测方法

Info

Publication number: CN109897914A
Application number: CN201811623775.9A
Authority: CN
Inventors: 樊学军; 高国龙; 石莹; 何纬
Original assignee: Sichuan International Travel Sanitary Health-Care Center
Current assignee: Sichuan International Travel Sanitary Health-Care Center
Priority date: 2018-12-28
Filing date: 2018-12-28
Publication date: 2019-06-18
Anticipated expiration: 2038-12-28
Also published as: CN109897914B

Abstract

本发明公开了一种同时检测YFV、RVFV、WNV和DENV四种病毒的引物及其检测方法。方法包括以下步骤：(1)设计引物，引物序列如SEQ ID NO.1～10；(2)制备与特异性引物相对应的病毒靶基因；(3)反转录制备cDNA；(4)GeXP多重PCR检测。本发明引物特异性好，灵敏度高，能够同时检测YFV、RVFV、WNV和DENV四种病毒，检测效率高。

Description

一种同时检测YFV、RVFV、WNV和DENV四种病毒的引物及其检测方法

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种同时检测YFV、RVFV、WNV和DENV四种病毒的引物及其检测方法。

背景技术

蚊媒病毒是一类重要的传染病病原，主要通过蚊虫叮咬在人群中传播，传播速度快，危害大，特别是近年来，随着气候及环境的变化，有日益蔓延的趋势。我国南方区气候炎热潮湿，传播媒介种类繁多，适合多种蚊媒病毒的繁殖与传播，其中许多蚊媒病毒的致病性、临床症状、流行季节均十分相似，并存在严重的血清学交叉反应，因此开发特异、敏感的鉴别诊断手段对该类疾病的预防、治疗与控制具有重要意义。

目前已知与人类疾病关系密切的蚊媒病毒主要有黄病毒属(Flav ivirus)、甲病毒属(Alphav irus)、布尼亚病毒属(Bunyav irus)和白蛉热病毒属(Phlebov irus),少数其他病毒属的蚊媒病毒，如巴泰病毒(Batai)、Colti病毒等也有报道。

黄热病毒(Yellow fever virus，YFV)属于黄病毒科的黄病毒属，病毒基因组为不分节段的单股正RNA，只有一个血清型。黄热病(yellow fever，YF)是由黄热病病毒引起的急性传染病，蚊是主要传播媒介。黄热病分为城市型和丛林型两种，在非洲和南美洲热带地区性流行。WHO估计全球每年YF发病20万例，约3万例死亡。其中90％以上发生在非洲。

登革热病毒(Dengue virus，DENV)是一种蚊媒传播引起的急性发热性传染病的病毒，根据病毒基因结构的特征，可分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型共四型。登革热病毒主要在亚洲、非洲和南美洲的热带、亚热带地区流行。感染登革热病毒后主要引起症状较轻的登革热，但少数病例会出现登革出血热，甚至在不及时治疗的情况下出现死亡。由于登革热是一种蚊传播疾病，一旦某一地区发生，极容易传播扩散。登革热在全球100多个国家发生过流行，25亿人具有感染的风险，每年大约有5000万人感染登革热病毒，我国南方地区也经常有血清检测阳性以及病毒分离情况的文献报道。

西尼罗病毒(West Nile virus，WNV)是近年来在全球广泛流行的一种鸟宿主虫媒病毒。因1937年在乌干达西尼罗地区的一位女性发热患者体内首次分离得到而命名。此后在以色列、法国、南非、阿尔及利亚和俄罗斯等国都有过暴发流行，但未引起广泛重视。1996年，该病毒袭击了罗马尼亚首都布加勒斯特，造成约400人发生脑炎、近40人死亡的严重后果，使其开始得到重视。1999年，美国纽约暴发了西尼罗病毒感染大流行，在随后的几年中，该病毒在美国广泛传播。截止到2012年，中国尚未发现有人但随着近年来病毒传播途径的变化，积极研制西尼罗病毒的防治药物已经迫在眉睫。

裂谷热(Rift Valley Fever)是由布尼病毒科(Bunyaviridae)白岭热病毒属(Phlebovirus)中裂谷热病毒(Rift Valley Fever virus，RVFV)所引起的急性出血性人兽共患传染病，该病主要流行于非洲反刍动物，经蚊虫传播，多发于蚊虫活动季节。裂谷热病毒首次从1930年在肯尼亚爆发的猝死和流产的羊群中分离得到，在家畜中引起怀孕动物的流产和新生畜的高度死。而在人类中可通过触、处理感染性材料(如感染动物的血液或器官)或通过蚊虫媒介叮咬感染，人感染后通常无症状或症状较轻，少数会发展成严重的疾病，如出血热症状、急性肝炎、黄疸、脑炎和视网膜炎。裂谷热主要在非洲大陆流行，2000年8月向北蔓延到阿拉伯半岛(也门和沙特阿拉伯)，我国面临的防控压力日益严峻。为了防止RVFV传入我国，及时掌握该病的发生和流行情况，建立RVFV快速检测方法十分必要。

目前国内对传染病检测的方法已经逐渐从免疫学检测进入基因检测领域，基因检测技术的出现能够有效的提高传染病窗口期的检出率，降低穿让病在窗口期的传播几率。目前国内主要的传染病基因检测技术主要采用荧光定量PCR技术，且国内已经有多种传染病荧光定量PCR试剂盒取得批文上市。但普通的荧光定量PCR技术均是对单病毒进行检测，无法对多种病毒进行同时检测，在检测时间和效率上均存在一定的缺陷，对于大规模群体检测的缺陷更加明显。且同时对此四种蚊媒病毒进行检测的技术尚未见报道。

发明内容

针对现有技术中的上述不足，本发明提供一种同时检测YFV、RVFV、WNV和DENV四种病毒的引物及其检测方法，该方法引物特异性好、灵敏度高，能同时检测YFV、RVFV、WNV和DENV四种病毒，检测效率高。

为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种同时检测YFV、RVFV、WNV和DENV四种病毒的引物，其包括特异性嵌合引物以及通用引物，所述通用引物的上有引物的5’端用cy5荧光染料标记，特异性嵌合引物扩增后的互补链能与经荧光染料标记的通用引物相结合；具体引物序列如下：

特异性嵌合引物：

YFV-F:5’-AGGTGACACTATAGAATAGAAACCGGKATARAAACHACGGA T-3’；(SEQ ID NO.1)

YFV-R:5’-GTACGACTCACTATAGGGACCTCTAACCTCTRGACYCCRTCT-3’；(SEQ ID NO.2)

RVFV-F:5’-AGGTGACACTATAGAATATACAATGCTRACTCTGGCACTYC-3’；(SEQ ID NO.3)

RVFV-R:5’-GTACGACTCACTATAGGGAGCACCTCTYTCATCTCCCCTA-3’；(SEQ ID NO.4)

WNV-F:5’-AGGTGACACTATAGAATA AGAGTTGATGTKCGGCTTGA-3’；(SEQ ID NO.5)

WNV-R:5’-GTACGACTCACTATAGGGACTCCTTTGGTGAGGGAGTGTC-3’；(SEQ ID NO.6)

DENV-F:5’-AGGTGACACTATAGAATAGTTGTTAGTCTRYGTGGACCGAC-3’；(SEQ ID NO.7)

DENV-R:5’-GTACGACTCACTATAGGGAYCARHAYYCCTGCTGTTGGSG-3’；(SEQ ID NO.8)

通用引物-F:5’-AGGTGACACTATAGAATA-3’；(SEQ ID NO.9)

通用引物-R:5’-GTACGACTCACTATAGGGA-3’。(SEQ ID NO.10)

一种利用上述引物同时检测YFV、RVFV、WNV和DENV四种病毒的方法，包括以下步骤：

(1)收集待检样本基因，并将其连接至PMD19-T载体上，然后提取质粒备用；

(2)对提取得到的质粒RNA进行反转录，制备cDNA；

(3)以步骤(2)所得cDNA为模板，采用上述引物进行GeXP多重PCR检测。

进一步地，步骤(2)中反转录体系包括：5×PrimeScript Buffer(for Real Time)2μL、PrimeScript RT Enzyme Mix I 0.5μL、50μM Oligo dT Primer 0.5μL、100μM Random6mers 0.5μL、Total RNA 3μL，最后用RNase free dH₂O补足至10μL。

进一步地，步骤(2)中反转录条件为：42℃15min；85℃5s；4℃，共3个循环。

进一步地，步骤(3)中PCR反应体系包括：5×PCR Buffer 2μL、25mM MgCl₂2μL、PCRFwd Primer Plex各1μL、Taq Polymerasw 0.35μL、cDNA模板2μL，最后用双蒸水补足至10μL。

进一步地，步骤(3)中PCR反应条件为：94℃，预变性5min；94℃，变性25s；60℃，退火45s；共35个循环。

一种同时检测YFV、RVFV、WNV和DENV四种病毒的试剂盒，包括上述引物。

本发明的有益效果为：

本发明能够同时快速的对YFV、RVFV、WNV和DENV四种病毒进行检测，且引物特异性好，灵敏度高，检测效率高。

附图说明

图1为RVFV病毒引物特异性验证结果图；

图2为DENV病毒引物特异性验证结果图；

图3为YFV病毒引物特异性验证结果图；

图4为WNV病毒引物特异性验证结果图；

图5为DENV、ZK、YFV和WNV病毒GeXP多重PCR检测结果。

具体实施方式

下面对本发明的具体实施方式进行描述，以便于本技术领域的技术人员理解本发明，但应该清楚，本发明不限于具体实施方式的范围，对本技术领域的普通技术人员来讲，只要各种变化在所附的权利要求限定和确定的本发明的精神和范围内，这些变化是显而易见的，一切利用本发明构思的发明创造均在保护之列。

实施例1引物设计

根据NCBI公布的DENV(Ⅰ-Ⅳ型)、RVFV、WNV、YFV，在充分比较同源性的基础上，选取保守区，用软件Primer5.0设计引物，引物由成都擎科梓熙生物有限公司合成。

GeXP-PCR的引物包含两组：一组为特异性嵌合引物，另一组为通用引物；通用引物的上游引物5’端用cy5荧光染料标记，4种病毒的通用引物均相同。特异性嵌合引物包括两个部分：通用标签和特异性引物，特异性嵌合引物扩增后的互补链能与经荧光染料标记的通用引物相结合，引物具体序列如下：

特异性嵌合引物：

YFV-F：AGGTGACACTATAGAATAGAAACCGGKATARAAACHACGGA T；(SEQ ID NO.1)

YFV-R：GTACGACTCACTATAGGGA CCTCTAACCTCTRGACYCCRTCT；(SEQ ID NO.2)

RVFV-F：AGGTGACACTATAGAATATACAATGCTRACTCTGGCACTYC；(SEQ ID NO.3)

RVFV-R：GTACGACTCACTATAGGGAGCACCTCTYTCATCTCCCCTA；(SEQ ID NO.4)

WNV-F：AGGTGACACTATAGAATA AGAGTTGATGTKCGGCTTGA；(SEQ ID NO.5)

WNV-R：GTACGACTCACTATAGGGA CTCCTTTGGTGAGGGAGTGTC；(SEQ ID NO.6)

DENV-F：AGGTGACACTATAGAATA GTTGTTAGTCTRYGTGGACCGAC；(SEQ ID NO.7)

DENV-R：GTACGACTCACTATAGGGA YCARHAYYCCTGCTGTTGGSG；(SEQ ID NO.8)

通用引物：AGGTGACACTATAGAATA(SEQ ID NO.9)；

通用引物-R：GTACGACTCACTATAGGGA。(SEQ IC NO.10)

实施例2病毒基因合成

由成都擎科梓熙生物有限公司合成人工合成各特异引物对应靶基因，并将对应基因连接到PMD19-T载体上，其中，SEQ ID NO.11为DENV病毒的基因序列，长度为292bp；SEQID NO.12为YFV病毒的基因序列，长度为247bp；SEQ ID NO.13为WNV病毒的基因序列，长度为210bp；SEQ ID NO.14为RVFV病毒的基因序列，长度为333bp。

病毒基因序列如下：

DENV病毒基因序列：

GTTGTTAGTCTACGTGGACCGACAGGAACAGTTTCGAATCGGAAGCTTGCTTAACGTAGTTCTAACAGTTTTTTATTAGAGAGCAGATCTCTGATGAACAACCAACGGAAAAAGACGGGTCGACCGTCTTTCAATATGCTGAAACGCGCGAGAAACCGCGTGTCAACTGTTTCACAGTTGGCGAAGAGATTCTCAAAAGGATTGCTTTCAGGCCAAGGACCCATGAAACTGGTGATGGCTTTTATAGCATTCCTAAGATTTCTAGCCATACCTCCAACAGCAGGAATTTTGG；(SEQID NO.11)

YFV病毒基因序列：

GAAACCGGGATAAAAACTACGGATGGAGAACCGGACTCCACACATTGAGACAGAAGAAGTTGTCAGCCCAGAACCCCACACGAGTTTTGCCACTGCTAAGCTGTGAGGCAGTGCAGGCTGGGACAGCCGACCTCCAGGTTGCGAAA AACCTGGTTTCTGGGACCTCCCACCCCAGAGTAAAAAGAACGGAGCCTCCGCTACCACCCTCCCACGTGGTGGTAGAAAGACGGGGTCTAGAGGTTAGAGG；(SEQ ID NO.12)

WNV病毒基因序列：

AGAGTTGATGTGCGGCTTGATGATGATGGAAACTTCCAGCTCATGAATGATCCAGGAGCACCTTGGAAGATATGGATGCTCAGAATGGTCTGTCTCGCGATTAGTGCGTACACCCCCTGGGCAATCTTGCCCTCAGTAGTTGGATTTTGGATAACTCTCCAATACACAAAGAGAGGAGGCGTGTTGTGGGACACTCCCTCACCAAAGGAG(SEQ IDNO.13)

RVFVFE病毒基因序列：

TACAATGCTAACTCTGGCACTTCCAACATTTGATGTTTCCAAGATGGTAGATAGAATTACCATAGACTTCAATCTGGATGATATACAAGGAGCATCTGAAATAGGCTCAACTTTGCTACCCTCCATGTCGATAGATGTGGAAGATATGGCCAATTTTGTTCACGATTTCACCTTTGGCCACTTAGCTGACAAGACTGACAGACTGTTAATGCGTGAGTTTCCCATGATGAATGACGGGTTTGATCATTTGAGCCCTGACATGATCATTAAAACTACATCTGGCATGTACAACATCGTTGAGTTCACCACCTTTAGGGGAGATGAAAGAGGTGC；(SEQ ID NO.14)

然后将各病毒序列连接至PMD19-T载体上，再用质粒小提试剂盒提取DG-PMD19T，RVFV-PMD19T，WN-PMD19T，YF-PMD19T质粒；然后再根据表1和表2的反转录体系和反转录条件进行反转录，制备得到相应的cDNA。

表1 反转录体系

表2 反转录条件

实施例3普通PCR扩增

1、以各病毒质粒为模板，通过普通PCR验证各引物特异性，其PCR反应体系及反应条件分别见表3和表4，再结合毛细管电泳片段对引物特异性进行进一步验证。

表 23PCR反应体系

表4 PCR反应条件

根据检测结果可知，本发明设计的引物特异性好。

实施例4GeXP单重PCR

1、单重PCR反应体系建立

(1)退火温度优化

将上述引物均通过GeXP单重PCR反应和琼脂糖凝胶电泳检测其特异性。反应体系表如下表5。以四种病毒的cDNA为模板，对所涉及的每对引物进行单重PCR扩增，选择退火温度分别为55℃，56.5℃，58℃，59.5℃，61℃进行梯度筛选，确定各引物对的最适Tm值。

表5 单重PCR体系配方表

单重PCR反应体系：94℃预变性5min；94℃变性25s，分别以55℃，56.5℃，58℃，59.5℃，61℃退火25s，72℃延伸30s，共35cycles；72℃延伸5min；4℃保存。扩增产物以2.5％琼脂糖，电压为120V进行电泳后通过凝胶成像系统观察结果；根据检测结果，从55℃到61℃各病毒扩增效率及引物特异性无明显差异，因此选取60℃作为后续PCR退火温度。

(2)单重PCR引物浓度优化

通过四对引物进行梯度单重PCR体系构建，引物浓度梯度分别为：5μM，4μM，3μM，2μM，1μM，通过对不同引物浓度进行扩增通过凝胶成像系统观察结果，确定最佳引物浓度。

2、GeXP单重PCR与GeXP片段进行引物特异性检测

琼脂糖凝胶电泳的分辨率较低，需对其电泳结果显示具特异性的引物对进一步验证，确保其对目标DNA有扩增而对其干扰物无反应。根据GeXP专利试剂技术，将所筛选的引物的上下游5’端分别连接上通用标签F-Tag(AGGTGACACTATAGAATA)，3’端连接上通用标签F-Tag(GTACGACTCACTATAGGGA)形成特异性嵌合引物。根据GeXP单重PCR标准配置体系，以单引物混合模板进行单重PCR反应。扩增体系如下表6.

表6 GeXP单重PCR体系表

反应条件：94℃预变性5min，94℃变性25s，60℃退火45s，共35cycles，4℃保存。扩增产物上机GeXP多重分析表达仪进行片段分析。

具体操作方法为：取出-20℃存放的甲酰胺(Sample Loading Solution，SLS)于室温下充分融化，去除PCR产物，以甲酰胺进行稀释制备成备用样品，稀释倍数依实际出峰信号强弱进行调整，避光保存待用。

以GeXP多重基因表达分析仪专用96孔样品板进行试验，按照说明书配置片段分析上机样品，每孔总体系40μL，包含38.5μL甲酰胺和0.5μL的Size Standard 400(分子量内标400)，以及1μL上述PCR产物稀释液。

用封膜封住样品板，置于96孔板在涡旋震荡仪上进行充分混匀，排除气泡后于台式冷冻高速离心1min，每孔悬空滴加1滴矿物油防止样品在分析过程中受热挥发。

取GeXP多重基因表达分析仪专用缓冲液板，在与上样板对应排孔内加入约6-8滴分离缓冲液，保证每孔液面相对平齐。

打开GeXP仪器预热数分钟，在Set Up模块设置样品名称和分离方法，各参数默认值，开始运行。

待片段分析结束后进入GeXP体系的Fragment程序，选择Size Standard 400分析程序，分析并记录结果，其检测结果见图1～4。

图1为RVFV病毒引物特异性验证结果图；图2为DENV病毒引物特异性验证结果图；图3为YFV病毒引物特异性验证结果图；图4为WNV病毒引物特异性验证结果图；根据图1～4的结果可知，本发明设计的引物特异性好。

实施例5GeXP多重PCR体系建立与优化

参照上述GeXP单重PCR的反应体系及条件，摸索建立DENV、ZK、WNV、YFV病毒的DNA为模板(以上DNA浓度均在20-50ug/μL)，4对特异性嵌合引物混合的四重PCR体系，GeXP多重PCR反应体系见表7。

表7 GeXP多重PCR体系表

反应条件为：94℃预变性5min，94℃变性25s，60℃退火45s，共35cycles，4℃保存。

且本发明设计的引物具有优良的灵敏度和特异性。

实施例6GeXP多重PCR检测

收集10份阴性血清样本进行RNA提取，以核酸蛋白仪测定含量和纯度，然后通过参照实施例2的反转录过程进行反转录，再用实施例1设计的引物和实施例5建立的GeXP多重PCR体系进行检测，其结果见图5。

如图5所示，本发明设计的引物和检测体系，能够同时检测到DENV、ZK、YFV和WNV四种病毒，且引物特异性好，灵敏度高，检测效率高。

实施例7干扰物检测

1、将人源DNA和RNA份三组加入至逆转录体系中，其结果见表8。

I组中，在20μL逆转录体系中，加入5×10³copies/μL四种病毒混合DNA和10ng人源DNA；

II组中，在20μL逆转录体系中，加入5×10³copies/μL四种病毒混合DNA和100ng人源DNA；

III组中，在20μL逆转录体系中，加入5×10³copies/μL四种病毒混合DNA和1000ng人源DNA；

表8 干扰检验结果

由表8结果可知，人源DNA和RNA的干扰不会影响此四种病毒DNA的检测结果。

序列表

<110> 四川国际旅行卫生保健中心

<120> 一种同时检测YFV、RVFV、WNV和DENV四种病毒的引物及其检测方法

<160> 14

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

aggtgacact atagaataga aaccggkata raaachacgg at 42

<210> 2

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gtacgactca ctatagggac ctctaacctc trgacyccrt ct 42

<210> 3

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

aggtgacact atagaatata caatgctrac tctggcacty c 41

<210> 4

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gtacgactca ctatagggag cacctctytc atctccccta 40

<210> 5

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

aggtgacact atagaataag agttgatgtk cggcttga 38

<210> 6

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gtacgactca ctatagggac tcctttggtg agggagtgtc 40

<210> 7

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

aggtgacact atagaatagt tgttagtctr ygtggaccga c 41

<210> 8

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gtacgactca ctatagggay carhayycct gctgttggsg 40

<210> 9

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

aggtgacact atagaata 18

<210> 10

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gtacgactca ctataggga 19

<210> 11

<211> 292

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

gttgttagtc tacgtggacc gacaggaaca gtttcgaatc ggaagcttgc ttaacgtagt 60

tctaacagtt ttttattaga gagcagatct ctgatgaaca accaacggaa aaagacgggt 120

cgaccgtctt tcaatatgct gaaacgcgcg agaaaccgcg tgtcaactgt ttcacagttg 180

gcgaagagat tctcaaaagg attgctttca ggccaaggac ccatgaaact ggtgatggct 240

tttatagcat tcctaagatt tctagccata cctccaacag caggaatttt gg 292

<210> 12

<211> 247

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

gaaaccggga taaaaactac ggatggagaa ccggactcca cacattgaga cagaagaagt 60

tgtcagccca gaaccccaca cgagttttgc cactgctaag ctgtgaggca gtgcaggctg 120

ggacagccga cctccaggtt gcgaaaaacc tggtttctgg gacctcccac cccagagtaa 180

aaagaacgga gcctccgcta ccaccctccc acgtggtggt agaaagacgg ggtctagagg 240

ttagagg 247

<210> 13

<211> 210

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

agagttgatg tgcggcttga tgatgatgga aacttccagc tcatgaatga tccaggagca 60

ccttggaaga tatggatgct cagaatggtc tgtctcgcga ttagtgcgta caccccctgg 120

gcaatcttgc cctcagtagt tggattttgg ataactctcc aatacacaaa gagaggaggc 180

gtgttgtggg acactccctc accaaaggag 210

<210> 14

<211> 333

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

tacaatgcta actctggcac ttccaacatt tgatgtttcc aagatggtag atagaattac 60

catagacttc aatctggatg atatacaagg agcatctgaa ataggctcaa ctttgctacc 120

ctccatgtcg atagatgtgg aagatatggc caattttgtt cacgatttca cctttggcca 180

cttagctgac aagactgaca gactgttaat gcgtgagttt cccatgatga atgacgggtt 240

tgatcatttg agccctgaca tgatcattaa aactacatct ggcatgtaca acatcgttga 300

gttcaccacc tttaggggag atgaaagagg tgc 333

Claims

1.一种同时检测YFV、RVFV、WNV和DENV四种病毒的引物，其特征在于，其包括特异性嵌合引物以及通用引物，所述通用引物的上游引物的5’端用荧光染料标记，特异性嵌合引物扩增后的互补链能与经荧光染料标记的通用引物相结合，引物具体序列如下：

特异性嵌合引物：

YFV-F:5’-AGGTGACACTATAGAATAGAAACCGGKATARAAACHACGGAT-3’；

YFV-R:5’-GTACGACTCACTATAGGGACCTCTAACCTCTRGACYCCRTCT-3’；

RVFV-F:5’-AGGTGACACTATAGAATATACAATGCTRACTCTGGCACTYC-3’；

RVFV-R:5’-GTACGACTCACTATAGGGAGCACCTCTYTCATCTCCCCTA-3’；

WNV-F:5’-AGGTGACACTATAGAATAAGAGTTGATGTKCGGCTTGA-3’；

WNV-R:5’-GTACGACTCACTATAGGGACTCCTTTGGTGAGGGAGTGTC-3’；

DENV-F:5’-AGGTGACACTATAGAATAGTTGTTAGTCTRYGTGGACCGAC-3’；

DENV-R:5’-GTACGACTCACTATAGGGAYCARHAYYCCTGCTGTTGGSG-3’；

通用引物-F:5’-AGGTGACACTATAGAATA-3’；

通用引物-R:5’-GTACGACTCACTATAGGGA-3’。

2.一种利用权利要求1所述引物同时检测YFV、RVFV、WNV和DENV四种病毒的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)收集待检样本，并将其连接至载体上，然后提取质粒RNA备用；

(2)对提取得到的质粒RNA进行反转录，制备cDNA；

(3)以步骤(2)所得cDNA为模板，采用权利要求1中所述引物进行GeXP多重PCR检测。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述反转录体系包括：5×PrimeScript Buffer 2μL、PrimeScript RT Enzyme Mix I 0.5μL、50μM Oligo dT Primer0.5μL、100μM Random 6mers 0.5μL、Total RNA 3μL，最后用RNase free dH₂O补足至10μL。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述反转录条件为：42℃15min；85℃5s；4℃，共3个循环。

5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(3)中所述PCR反应体系包括：5×PCRBuffer 2μL、25mM MgCl₂ 2μL、PCR Fwd Primer Plex各1μL、Taq Polymerasw 0.35μL、cDNA模板2μL，最后用双蒸水补足至10μL。

6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(3)中所述PCR反应条件为：94℃，预变性5min；94℃，变性25s；60℃，退火45s；共35个循环。

7.一种同时检测YFV、RVFV、WNV和DENV四种病毒的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的引物。