CN103911462A

CN103911462A - 黄热、乙型脑炎、基孔肯雅、西尼罗的鉴别检测方法及引物和探针

Info

Publication number: CN103911462A
Application number: CN201410131452.3A
Authority: CN
Inventors: 李云; 史玲莉; 闫冀焕; 滑娜; 沈军; 吴志茹; 兰景; 李薇; 付晓昀
Original assignee: HEBEI INTERNATIONAL TRAVAL HEALTH CENTER
Current assignee: HEBEI INTERNATIONAL TRAVAL HEALTH CENTER
Priority date: 2014-04-03
Filing date: 2014-04-03
Publication date: 2014-07-09
Anticipated expiration: 2034-04-03
Also published as: CN103911462B

Abstract

本发明公开了一种黄热、乙型脑炎、基孔肯雅、西尼罗的鉴别检测方法及引物和探针，其利用多重聚合酶链反应（PCR）结合液相芯片来快速定性和定量检测黄热、乙型脑炎，基孔肯雅和西尼罗病毒，包括四对特异性高、灵敏度高、重复性好的引物和探针。

Description

黄热、乙型脑炎、基孔肯雅、西尼罗的鉴别检测方法及引物和探针

技术领域

本发明属于生物芯片和诊断试剂技术领域，涉及一种针对黄热、乙型脑炎、基孔肯雅、西尼罗的鉴别检测方法及引物和探针，具体是一种采用基于微球的液相芯片技术用于快速检测多种蚊媒病毒的方法。

背景技术

黄热(Yellow fever virus)、流行性乙型脑炎（首先在日本从患者脑组织中分离获得，因此称为日本脑炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)）、西尼罗热(West Nile fever) 和基孔肯雅热(Chikungunya fever) 四种疾病是威胁人民健康的重要虫媒病毒性传染病，分别因黄热病毒(Yellow fever virus，YFV)、日本脑炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)、西尼罗病毒(West Nile virus，WNV) 和基孔肯雅病毒(Chikungunya virus，CHIK) 所引起。

发病初期症状极其相似，难以鉴别；并且具有传染快、易流行等特点，一旦发生，将严重威胁人们健康和社会安定。为了有效防控上述虫媒病毒性疾病的发生与传播，在疾病发生早期实行快速诊断是一个重要的环节，而对于各出入境口岸来说，在不影响入境人员和货物快速通关前提下，如能在有效时间内，实现对人员以及船舱、货物中可能携带的蚊子进行快速筛查；同时，快速检测各口岸周边环境中蚊子携带病毒情况、建立有效防控网络，以防上述病毒的传入，将具有非常重大的意义。

目前常规的检测手段包括分离培养方法、免疫学方法，以及核酸检测方法，如PCR、多重PCR、RT-PCR和基于Taqman探针技术的实时荧光PCR方法等。但这些方法或多或少存在一些缺陷：如分离培养方法在技术上比较困难，且获得病原学诊断和药敏结果常需要3～5天以上，在临床上难以及早进行病原学诊断和耐药性测定，无法满足临床救治危重感染者的需要；免疫学方法检测病毒的特异性抗体时，不仅需分别在患者感染的急性期及恢复期采集双份血清，并且还可能存在抗原抗体间的交叉反应而干扰检测，不利于疾病的早期诊断；在核酸检测方法方面，PCR、多重PCR、RT-PCR方法及基于Taqman探针技术的实时荧光PCR方法等的灵敏度高，特异性好，适合于快速检测鉴定，但这些方法大多基于单一反应或较少数重数的多重反应的检测，在对临床样本进行检测时，对每一个样本的数十种指标进行检测和排除时，需要耗费大量的劳动和成本。

对于分子实验室中大量样本的常规检测，研究者正致力于开发和建设以多重快速检测为目标的检测平台，典型的高通量多重分析技术包括生物芯片、毛细电泳和质谱等，由于其能在同一反应容器中同时检测多个核酸序列，因此在节约时间、劳动和成本方面更具有优势，是高通量、特异、可靠、快速和经济的核酸检测方法。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种黄热、乙型脑炎、基孔肯雅、西尼罗的鉴别检测方法及引物和探针，其利用多重聚合酶链反应（PCR）结合液相芯片来快速定性和定量检测黄热、乙型脑炎，基孔肯雅和西尼罗病毒，包括四对特异性高、灵敏度高、重复性好的引物和探针。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：

一种黄热、乙型脑炎、基孔肯雅、西尼罗的鉴别检测用探针，所述探针包括：黄热病毒的探针YFV-PF、基孔肯雅病毒的探针CHIKV-PF、西尼罗病毒的探针WNV-PF和乙型脑炎病毒的探针JEV-PF，上述探针的核酸序列分别依次参见SEQ ID NO：1-4，具体参见表1。

表1 黄热、乙型脑炎、基孔肯雅、西尼罗的探针

名称	序列	SEQ ID No：
			YFV-PF	CCATCGCCTCAACCAAT	1
CHIKV-PF	TCCAGGACATTTCCGCTACG	2
			WNV-PF	TACCCGGAGACGCCACA	3
JEV-PF	GAGGCGCACGCCACAAA	4

一种黄热、乙型脑炎、基孔肯雅、西尼罗的鉴别检测用引物，所述引物包括下述PCR扩增引物对：黄热病毒的引物对YFV-F和YFV-R，其序列分别参见SEQ ID NO：5-6；基孔肯雅病毒的引物对CHIKV-F和CHIKV-R，其序列分别参见SEQ ID NO：7-8；西尼罗病毒的引物对WNV-F和WNV-R，其序列分别参见SEQ ID NO：9-10；乙型脑炎病毒的引物对JEV-F和JEV-R，其序列分别参见SEQ ID NO：11-12，具体参见表2。

表2 黄热、乙型脑炎、基孔肯雅、西尼罗的引物对

每对引物对中下游引物的5’端修饰有生物素标记，每个探针5’端均带有胺基化修饰且连有C12邻接臂序列、并分别与相应荧光标记的微球偶联。

所述引物还包括下述反转录引物：YFV-RT、CHIKV-RT、WNV-RT和JEV-RT，其核酸序列分别参见SEQ ID NO：13-16。

表3 黄热、乙型脑炎、基孔肯雅、西尼罗的反转录引物

本发明还提供了一种黄热、乙型脑炎、基孔肯雅、西尼罗的鉴别检测方法，基于微球的液相芯片技术，具体包括以下步骤：

①合成权利要求1和2所述的引物对和探针，将每对引物中的下游引物5’端进行生物素标记；将每个探针5’端进行胺基化修饰且连有C12邻接臂序列；

②将所述探针分别与相应荧光编码的微球偶联、然后等数目混合，制得偶联有特异性核酸探针的微球组；

③抽提待测样本的RNA，并采用多重反转录反应的方法对RNA病毒的特定基因序列反转录成cDNA；

④以cDNA为模板、采用步骤①中的引物对进行PCR扩增，制得PCR扩增产物；

⑤将PCR扩增产物与微球组温育杂交，然后加入链霉亲和素－藻红蛋白与微球上捕获的PCR扩增产物上的生物素结合，形成微球-探针-PCR产物-生物素-SA-PE的复合物，利用液相芯片系统对待测样品进行定性和定量分析。

采用上述技术方案产生的有益效果在于：（1）本发明对RNA病毒特异基因进行多重特异性反转录，增加了病毒检测的特异性，减少了后期PCR扩增中非特异序列对扩增的影响，提高扩增效率，具有较高的灵敏度；（2）本发明选用的引物对各自扩增的病毒特异序列都有很高的灵敏度，在进一步改进的方案中，采用不对称PCR的方法，增加生物标记单链的产量，提高后期PCR产物与偶联有特异性核酸探针的微球杂交结合的效率，提高了检测的灵敏度；（3）本发明探针碱基成分合理，具有比较均一的Tm值，探针与PCR产物的杂交温度条件基本一致，有利于同一温度下杂交的同步性，提高检测的准确性；（4）本发明利用多重PCR反应结合液相芯片，在一次试验中可以鉴别括黄热病毒（YFV）、流行性乙型脑炎（日本脑炎）病毒（JEV）、西尼罗病毒（WNV）及基孔肯雅病毒（CHIKV），具有通量大，特异性及灵敏度高，结果稳定，重复性好，操作简单，检测速度快的优点。

具体实施方式

一、按照表1中的核酸序列合成所需的引物对和探针，将每对引物中的下游引物5’端进行生物素标记；并将将每个探针5’端进行胺基化修饰且连有C12邻接臂序列。

二、将所述探针分别与相应荧光编码的微球偶联、然后等数目混合，制得偶联有特异性核酸探针的微球组。

选取编号为22、39、15、12共4种微球（BioRad公司），按照如下方法进行核酸探针的偶联：

1．将储存于2-10℃的编号为22、39、15、12的4种微球及储存于-20℃的2瓶未开封EDC粉末（10mg/瓶）置于室温平衡30分钟-60分钟。

2．将YFV-PF、CHIKV-PF、WNV-PF、JEV-PF核酸探针分别用ddH₂O溶解，浓度分别为0.1 nmol/μL；

3．将4种微球分别高速漩涡振荡30秒，再超声振荡30秒；

4．各取100μL（1.25×10⁶个）微球分别加入4个1.5mL Eppendorf管中；

5． 14000g离心4分钟沉淀微球；

6．小心弃上清液，加入8.5μL 0.1M MES（pH4.5）重悬微球，并振荡混匀；

7．每种核酸探针各取1μL（0.1 nmol/μL）分别加入上述对应编码的Eppendorf管中，并振荡混匀；

8．新鲜制备10mg/ml浓度的EDC溶液，向上述Eppendorf管中每管加入0.5μl EDC溶液，并立即振荡混匀；

9．避光，室温孵育30分钟；

10．重复步骤8-9一次；

11．每管Eppendorf管中加入1ml 0.02% Tween 20，并短暂振荡混匀；

12． 14000g离心4分钟沉淀微球；

13．弃上清液，加入1ml 0.1% SDS重悬微球，并振荡混匀40秒；

14． 16000g离心4分钟沉淀微球；

15．弃上清液，加入20μ1 TE（pH8.0）重悬微球，并高速振荡混匀30秒；

16．微球计数：

(1) 将偶联好的微球振荡混匀40秒；

(2) 用ddH₂O将微球悬液稀释100倍，充分振荡混匀；

(3) 取10μL微球稀释液加入到血球计数板上；

(4) 对四个角上的计数室内的微球计数；

(5) 计算微球悬液的浓度；

4种微球悬液的计数结果都约为：4×10⁴个/μl。

将偶联好的核酸探针微球等体积进行混合，以1.5×TMAC缓冲液稀释到每种微球的终浓度为150个/μl，2-10℃避光储存，即为可用于多种蚊媒病原体检测的特异性核酸探针微球组。

三、抽提待测样本的RNA，并采用多重反转录反应的方法对RNA病毒的特定基因序列反转录成cDNA。

（一）、样本的准备

用常规方法抽提1-4号临床样本的总RNA，测浓度，备用。所述样本可以为蚊虫或者血清，提取RNA的方法采用常规方法即可。

（二）、反转录反应

1、按照表1合成下列反转录引物：YFV-RT、CHIKV-RT、WNV-RT和JEV-RT。

2、准备混合反转录引物工作液：

（1）合成的每个反转录引物用TE（pH8.0）配制成100μmol/L的储存液；

（2）分别取各反转录引物储存液10μl加入到同一1.5ml Eppendorf管中，加入420μl TE（pH8.0）补足到总体积为500μL，并振荡混匀，即为混合反转录引物工作液。

3、样本总RNA反转录反应

反应体系：使用TaKaRa公司反转录反应试剂对样本的总RNA进行反转录反应，反转录反应体系为10μl，其中，5×PrimeScript^TM Buffer 2μL、PrimeScript^TM RT Enzyme Mix I 0.5μL、混合反转录引物工作液0.5μL、总RNA 1μg，补RNase Free dH₂O至总体积为10μL。

反应程序：42℃ 15分钟→85℃ 5秒。

四、以cDNA为模板、采用步骤①中的引物对进行PCR扩增，制得PCR扩增产物。

本实施例中所述PCR扩增采用两个PCR反应体系，分别为PCR反应体系I和PCR反应体系Ⅱ；其中PCR反应体系I含有西尼罗引物对WNV-F和WNV-R，PCR反应体系Ⅱ含有黄热病毒的引物对YFV-F和YFV-R、CHIKV-F和CHIKV-R、以及JEV-F和JEV-R。具体的，两个PCR反应体系的工作液和反应条件如下：

（1）PCR反应体系I：PCR扩增反应体系为20μL，其中包括10×PCR Buffer 2μL、dNTP（2.5mmoL/L）2μL、goLdTaq酶（5U/μL）0.07μL、WNV-F（5μM）0.3μL、WNV-R（5μM） 1.5μL、样本反转录产物cDNA 1μL、补ddH₂O 13.13μL至终体积为20μL。

PCR反应程序I：94℃ 5分钟；94℃ 30秒、56℃ 30秒、72℃ 30秒，进行40个循环；72℃ 10分钟；10℃保温。

（2）PCR反应体系II：PCR扩增反应体系为20μL，其中包括10×PCR Buffer 2μL、dNTP（2.5mmoL/L）2μL、goLdTaq酶（5U/μL）0.07μL、YFV-F（5μM）0.3μL、YFV-R（5μM）1.5μL、CHIKV-F（5μM）0.3μL、CHIKV-R（5μM） 1.5μL、JEV-F（5μM）0.3μL、JEV-R（5μM），样本反转录产物cDNA 1μL，补ddH₂O 10.53μL至终体积为20μL；

PCR反应程序II：94℃ 5分钟；94℃ 30秒、60℃ 30秒、72℃ 30秒，进行40个循环；72℃ 10分钟；10℃保温。

对于本发明的引物对，西尼罗需独立进行PCR扩增，因其与其他病原体在同一体系扩增时会出现干扰；其他病原体的引物对均可在同一体系中进行扩增

五、将PCR扩增产物与微球组温育杂交，然后加入链霉亲和素－藻红蛋白与微球上捕获的PCR扩增产物上的生物素结合，形成微球-探针-PCR产物-生物素-SA-PE的复合物，利用液相芯片系统对待测样品进行定性和定量分析。

1、杂交

对于每个临床样本，分别取所对应的PCR扩增产物I和PCR扩增产物II各5μL加入到同一个洁净的0.25ml PCR反应管中，分别加入7μl TE（pH8.0）缓冲液和33μl核酸探针微球组（含4种核酸探针，每种核酸探针的微球数量约为5000个），振荡混匀后96℃变性5分钟，55℃杂交30分钟；同时按照上述比例制备阴性对照（模板为ddH₂O）。

2、信号标记

每管杂交产物中分别加入100μL SA-PE（20μg/ml）标记试剂，振荡混匀后50℃孵育20分钟，形成微球-探针-PCR产物-生物素-SA-PE的复合物。

3、检测

各取80μL信号标记产物加入96孔板中，使用Bio-Plex^TM 200对杂交结果进行检测，检测数据见表4。

表4、样品1-12和阴性对照的定量检测结果

并根据下述标准进行结果判定：以每种病毒特异性核算探针的阴性对照检测读数作为背景值；当样本检测读数/背景值≥3，则判定此样本的该种病原体检测结果为阳性；其样本检测读数/背景值＜3，则判定此样本的该种病毒检测结果为阴性。

表5、样品1-12定性判定结果

上述检测结果与临床确诊结果完全相同，没有出现假阳性的情况，证明本发明检测方法的可靠性。

综上所述，本发明利用多重PCR反应结合液相芯片，可以一次平行检测鉴定黄热病毒、流行性乙型脑炎（日本脑炎）病毒和西尼罗病毒及基孔肯雅病毒，具有通量大，特异性及灵敏度高，结果稳定，重复性好，操作简单，检测速度快的优点。

SEQUENCE LISTING

<110> 河北国际旅行卫生保健中心

<120> 黄热、乙型脑炎、基孔肯雅、西尼罗的鉴别检测方法及引物和探针

<130> 0

<160> 16

<170> PatentIn version 3.3

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<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

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ccatcgcctc aaccaat 17

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tccaggacat ttccgctacg 20

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tacccggaga cgccaca 17

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<212> DNA

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gaggcgcacg ccacaaa 17

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<212> DNA

<213> 人工序列

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acagcggcaa tcaataaa 18

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<212> DNA

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gtgggttcac ctcaatca 18

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accctccgaa ggaccaca 18

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gatgtggaag cctggatg 18

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<212> DNA

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gagtctggaa acggaacg 18

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gcacagcgtg gagaaaca 18

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ccaagagcaa caacggact 19

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aaaggcagag ccaaacacc 19

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gaacgacacg catagca 17

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tttccaccac gacactca 18

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<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

aatgacaact gttccgtggc 20

Claims

1.一种黄热、乙型脑炎、基孔肯雅、西尼罗的鉴别检测用探针，其特征在于所述探针包括：黄热病毒的探针YFV-PF、基孔肯雅病毒的探针CHIKV-PF、西尼罗病毒的探针WNV-PF和乙型脑炎病毒的探针JEV-PF，上述探针的核酸序列分别依次参见SEQ ID NO：1-4。

2.一种黄热、乙型脑炎、基孔肯雅、西尼罗的鉴别检测用引物，其特征在于所述引物包括下述PCR扩增引物对：

黄热病毒的引物对YFV-F和YFV-R，其序列分别参见SEQ ID NO：5-6；

基孔肯雅病毒的引物对CHIKV-F和CHIKV-R，其序列分别参见SEQ ID NO：7-8；

西尼罗病毒的引物对WNV-F和WNV-R，其序列分别参见SEQ ID NO：9-10；

乙型脑炎病毒的引物对JEV-F和JEV-R，其序列分别参见SEQ ID NO：11-12。

3.根据权利要求2所述的黄热、乙型脑炎、基孔肯雅、西尼罗的鉴别检测用引物，其特征在于每对引物对中下游引物的5’端修饰有生物素标记，每个探针5’端均带有胺基化修饰且连有C12邻接臂序列、并分别与相应荧光标记的微球偶联。

4.根据权利要求2所述的黄热、乙型脑炎、基孔肯雅、西尼罗的鉴别检测用引物，其特征在于所述引物还包括下述反转录引物：YFV-RT、CHIKV-RT、WNV-RT和JEV-RT，其核酸序列分别参见SEQ ID NO：13-16。

5.一种黄热、乙型脑炎、基孔肯雅、西尼罗的鉴别检测方法，基于微球的液相芯片技术，其特征在于具体包括以下步骤：

6.根据权利要求5所述的黄热、乙型脑炎、基孔肯雅、西尼罗的鉴别检测方法，其特征在于步骤③中所述反转录采用权利要求4所述的反转录引物。

7.根据权利要求5所述的黄热、乙型脑炎、基孔肯雅、西尼罗的鉴别检测方法，其特征在于步骤④中的PCR扩增采用不对称扩增，每对引物对中下游引物的浓度是上游引物浓度的3~8倍。

8.根据权利要求5所述的黄热、乙型脑炎、基孔肯雅、西尼罗的鉴别检测方法，其特征在于步骤④中所述PCR扩增采用两个PCR反应体系，分别为PCR反应体系I、和PCR反应体系Ⅱ；其中PCR反应体系I含有西尼罗病毒的引物对WNV-F和WNV-R，PCR反应体系Ⅱ含有黄热病毒的引物对YFV-F和YFV-R、基孔肯雅病毒的引物对CHIKV-F和CHIKV-R、乙型脑炎病毒的引物对JEV-F和JEV-R；

步骤⑤中，首先从PCR反应体系I和PCR反应体系Ⅱ中取等体积的扩增产物加入至同一试管内，然后再与微球组温育杂交。

9.根据权利要求5所述的多种蚊媒病原体的检测方法，其特征在于步骤⑤中温育杂交的条件为：96℃变性5分钟，55℃杂交30分钟。