CN104195229A - 表皮生长因子受体抑制剂类药物疗效相关基因表达检测液相芯片试剂盒 - Google Patents

表皮生长因子受体抑制剂类药物疗效相关基因表达检测液相芯片试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种表皮生长因子受体抑制剂类药物疗效相关基因表达检测液相芯片试剂盒，所述检测试剂盒主要包括有：与胺基修饰的支持探针偶联的微球；连接支持探针与目标基因mRNA的支持延伸探针,每条支持延伸探针包括5’端能与对应的目标基因mRNA结合的特异性序列、间隔臂序列、3’端能与对应的支持探针的特异性序列互补配对的序列；连接目标基因mRNA与信号检测组分间的扩增延伸探针，每条扩增延伸探针包括5’端能与目标基因mRNA结合的特异性序列、间隔臂序列、3’端能与标记探针互补配对的序列。本发明所述试剂盒除了具有特异性好、信噪比高、能够在均一的反应条件下进行杂交反应等优点外，还能实现不同基因mRNA表达水平的稳定检测，即能够在不同样本间，3种内参基因的表达检测稳定,从而使检测结果更加准确。

Description

表皮生长因子受体抑制剂类药物疗效相关基因表达检测液相芯片试剂盒
技术领域
本发明属于分子生物学领域，涉及医学和生物技术，具体的是涉及表皮生长因子受体抑制剂类药物疗效相关基因表达检测液相芯片试剂盒。 
背景技术
酪氨酸激酶在细胞内信号转导通路中占据了十分重要的地位，调节着细胞体内生长、分化、死亡等一系列生理过程，其异常表达将导致细胞增殖调节紊乱，进而导致肿瘤发生。此外，酪氨酸激酶的异常表达还与肿瘤的侵袭和转移、肿瘤新生血管的生成、肿瘤的化疗抗性密切相关，以酪氨酸激酶为靶点进行药物研发已成为国际上抗肿瘤药物研究的热点。 
目前，肿瘤治疗的靶向治疗药物主要有两类，一类是受体酪氨酸激酶抑制剂类靶向药物(Tyrosine Kinase Inhibitor，TKI)，主要包括吉非替尼(Gefitinib，Ireasa)、厄洛替尼(Erlotinib，Taceva)等；另一类是单克隆抗体类靶向药物，包括西妥昔单抗(cetuximab)、帕尼单抗(Vectibix)等。受体酪氨酸激酶抑制剂类靶向药物通过扩散进入肿瘤细胞，与受体胞内段激酶结合区结合，从而抑制受体的磷酸化，阻断受体下游信号通路的传导，发挥抗肿瘤作用。 
TKI类靶向药物的疗效虽得到广泛认可，但患者用药后药效的个体差异很大。大量的临床研究已经证实，TKI的疗效/毒副作用与患者体内某些受体酪氨酸激酶相关基因的mRNA表达水平直接相关，它们分别是： 
(1)表皮生长因子受体(EGFR) 
表皮生长因子受体(EGFR)是靶向治疗的主要靶标，FDA已经批准的作用于EGFR的靶向药物包括EGFR酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKI)以及抗EGFR抗体药。但临床运用表明这些靶向药物仅对部分病人有效。临床研究已经证实：以EGFR通路为靶标的靶向药物疗效与肿瘤组织中EGFR基因mRNA表达水平密切相关，即EGFR基因表达水平高的患者对靶向药物敏感，反之表达水平低的患者表现药效较低。因此，美国国家癌症综合网络(NCCN)2009年临床指南中推荐：患者在接受靶向药物治疗之前，进行EGFR基因表达水平检测，确定是否接受靶向治疗，降低治疗费用，节省宝贵的医治时间。 
(2)胰岛素样生长因子1受体(insulin-like growth factor Ⅰ receptor，IGF-1R) 
胰岛素样生长因子1受体(IGF-1R)是靶向治疗的重要靶标，IGF-1R的信号转导途径与肿瘤的发生密切相关。抑制IGF-1R的活性，可以有效控制肿瘤细胞的生长和转移，增强肿瘤对化疗、放疗的敏感性。以IGF-1R为靶标的治疗主要有IGF-1R单克隆抗体、反义寡核苷酸、 IGF-1R单克隆抗体、小分子激酶抑制剂等。IGF-1R的信号转导还可引起细胞的恶性化以及细胞粘附性的改变。目前IGF-1R已经成为特异性治疗肿瘤的热点靶标。大量临床研究表明IGF-IR在结肠癌、前列腺癌、乳腺癌、非小细胞肺癌、食管癌、胃癌等恶性肿瘤组织中都呈现高表达。临床研究显示：IGF-1R与经吉非替尼治疗的NSCLC患者较长存活显著相关。肿瘤患者检测IGF-1R mRNA表达水平，对临床上靶向药物的选择、用药量、靶向药物敏感性的确定及预后的判断有着重要的意义，同时提高靶向治疗的有效性，为患者争取更多宝贵的医治时间，大幅节省医治费用。 
(3)张力蛋白同源物磷酸酯酶基因(PTEN) 
张力蛋白同源物磷酸酯酶基因(PTEN)为PI3K/AKT信号通路的一种负调节因子，目前研究显示，PTEN与肿瘤对曲妥珠单抗的敏感性有关。 
(4)持家基因β2-微球蛋白(B2M)、铁传递蛋白受体(TFRC)和TATA框结合蛋白(TBP) 
持家基因一般在体内可稳定表达，但由于这种稳定表达是相对的，在一定的病理状态或用药情况下，某些常用的持家基因的表达也会发生变化。选择在我们所研究对象中稳定表达的基因作持家基因，对保证检测结果的准确性至关重要。因此，本发明从一定数量的常用持家基因中进行筛选，确定3个合适的持家基因，分别是：β2-微球蛋白(B2M)、铁传递蛋白受体(TFRC)、TATA框结合蛋白(TBP)。 
基于以上基因的表达水平与受体酪氨酸激酶抑制剂类靶向药物疗效的相关性，专家推荐患者在接受靶向药物之前，应当进行相关的基因mRNA表达水平的检测，帮助临床医生根据患者的个体差异制定个体化用药方案，以提高药物疗效，减少药物毒副作用的发生。目前，对基因的mRNA表达水平进行检测的技术主要有：逆转录定量PCR法、实时荧光定量PCR法、RNA原位核酸杂交(RISH)等。其中，RISH主要用于分析组织或细胞内RNA分布以了解特定基因的表达情况，且其过程较长、操作繁琐，不适合用于临床应用；而逆转录定量PCR法与实时荧光定量PCR法，首先，这两种方法均需要进行RNA抽提、逆转录，检测的结果受RNA降解影响大；其次，这两种方法只通过一对引物进行PCR扩增，容易产生非特异性结合，从而导致假阳性高；再次，这两种方法一般只有一个持家基因作对照，其准确性容易受到病理状态的影响；因此，逆转录定量PCR法与实时荧光定量PCR法作为临床应用均存在着难以克服的技术缺陷。。针对现有技术存在的上述问题，本发明申请人在项目开发早期申请了的中国发明专利(申请号：200910193802.8)，但其针对同一样本不同基因mRNA检测信号的强弱不均衡，从而影响到目标基因EGFR、IGF-1R、PTEN的判读，因此急需对该产品进行改进。 
发明内容
本发明的目的是提供一种表皮生长因子受体抑制剂类药物疗效相关基因表达检测液相芯片试剂盒，该检测试剂盒除了可以高灵敏度和特异性地单独或者任意组合并列检测以下6种目标基因的表达水平：EGFR、IGF-1R、PTEN、B2M、TFRC、TBP,且其中3种内参基因表达检测更加稳定。 
实现上述目的的技术方案如下： 
一种表皮生长因子受体抑制剂类药物疗效相关基因表达检测液相芯片试剂盒，主要包括： 
(1)与胺基修饰的支持探针偶联的微球，每条支持探针主要包括5’端的间隔臂序列和3’端的能与支持延伸探针互补配对的特异性序列P1，所述特异性序列P1选自SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.6，每个目标基因选用一种微球，每种微球具有不同的荧光编码； 
(2)连接支持探针与目标基因mRNA的支持延伸探针,每条支持延伸探针的碱基序列从5’端到3’端依次为：与对应的目标基因mRNA互补配对的特异性序列P2、间隔臂序列、能与对应的支持探针的特异性序列P1互补配对的P3序列，所述支持延伸探针的特异性序列P2包括有：针对EGFR基因的选自SEQ ID NO.7－SEQ ID NO.11中的2条以上、针对IGF-1R基因的选自SEQ ID NO.12－SEQ ID NO.16中的2条以上、针对PTEN基因的选自SEQ ID NO.17－SEQ ID NO.21中的2条以上、针对B2M基因的选自SEQ ID NO.22－SEQ ID NO.26中的2条以上、针对TFRC基因的选自SEQ ID NO.27－SEQ ID NO.31中的2条以上、和/或针对TBP基因的选自SEQ ID NO.32－SEQ ID NO.36中的2条以上； 
(3)扩增延伸探针，每条扩增延伸探针的碱基序列从5’端到3’端依次为：能与目标基因mRNA互补配对的特异性序列P4、间隔臂序列、序列P5，3’末端还修饰有生物素；所述扩增延伸探针的特异性序列P4包括有：针对EGFR基因的选自SEQ ID NO.38－SEQ ID NO.47中的5条以上、针对IGF-1R基因的选自SEQ ID NO.48－SEQ ID NO.57中的5条以上、针对PTEN基因的选自SEQ ID NO.58－SEQ ID NO.67中的5条以上、针对B2M基因的选自SEQ ID NO.68－SEQ ID NO.77中的5条以上、针对TFRC基因的选自SEQ ID NO.78－SEQ ID NO.87中的5条以上、和/或针对TBP基因的选自SEQ ID NO.88－SEQ ID NO.97中的5条以上，所述P5为不存在发夹结构，探针内部和探针间不形成二聚体、不存在错配、与P1、P2、P3、P4和总mRNA之间均不存在非特异性结合的序列。 
或者，主要包括： 
(1)与胺基修饰的支持探针偶联的微球，每条支持探针主要包括5’端的间隔臂序列和3’端的能与支持延伸探针互补配对的特异性序列P1，所述特异性序列P1选自SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.6，每个目标基因选用一种微球，每种微球具有不同的荧光编码； 
(2)连接支持探针与目标基因mRNA的支持延伸探针,每条支持延伸探针的碱基序列从5’端到3’端依次为：与对应的目标基因mRNA互补配对的特异性序列P2、间隔臂序列、能与对应的支持探针的特异性序列P1互补配对的P3序列，所述支持延伸探针的特异性序列P2包括有：针对EGFR基因的选自SEQ ID NO.7－SEQ ID NO.11中的2条以上、针对IGF-1R基因的选自SEQ ID NO.12－SEQ ID NO.16中的2条以上、针对PTEN基因的选自SEQ ID NO.17－SEQ ID NO.21中的2条以上、针对B2M基因的选自SEQ ID NO.22－SEQ ID NO.26中的2条以上、针对TFRC基因的选自SEQ ID NO.27－SEQ ID NO.31中的2条以上、和/或针对TBP基因的选自SEQ ID NO.32－SEQ ID NO.36中的2条以上； 
(3)扩增延伸探针，每条扩增延伸探针的碱基序列从5’端到3’端依次为：能与目标基因mRNA互补配对的特异性序列P4、间隔臂序列、序列P5；所述扩增延伸探针的特异性序列P4包括有：针对EGFR基因的选自SEQ ID NO.38－SEQ ID NO.47中的5条以上、针对IGF-1R基因的选自SEQ ID NO.48－SEQ ID NO.57中的5条以上、针对PTEN基因的选自SEQ ID NO.58－SEQ ID NO.67中的5条以上、针对B2M基因的选自SEQ ID NO.68－SEQ ID NO.77中的5条以上、针对TFRC基因的选自SEQ ID NO.78－SEQ ID NO.87中的5条以上、和/或针对TBP基因的选自SEQ ID NO.88－SEQ ID NO.97中的5条以上，所述P5为不存在发夹结构，探针内部和探针间不形成二聚体、不存在错配、与P1、P2、P3、P4和总mRNA之间均不存在非特异性结合的序列；和 
(4)标记探针，所述标记探针具有与扩增延伸探针P5互补配对的序列，且末端具有生物素修饰。 
在其中一个实施例中，所述的抗微管类化疗药物疗效相关基因mRNA表达水平检测液相芯片，还包括有填充序列，包括有：针对EGFR基因的选自SEQ ID NO.98－SEQ ID NO.99中一条或多条、针对IGF-1R基因的SEQ ID NO.100、针对PTEN基因的选自SEQ ID NO.101－SEQ ID NO.103中的一条或多条、针对B2M基因的选自SEQ ID NO.104－SEQ ID NO.107中的一条或多条、针对TFRC基因的选自SEQ ID NO.108－SEQ ID NO.109中的一条或多条、和/或针对TBP基因的SEQ ID NO.110—SEQ ID NO.111。 
在其中一个实施例中，所述间隔臂序列为5－10个T；所述P5的组成为SEQ ID NO.37。 
本发明的主要优点在于： 
(1)本发明在已有产品的基础上，通过各种探针的设计和组合的进一步优化，除了具有特异性好、信噪比高、能够在均一的反应条件下进行杂交反应等优点外，还能实现不同基因mRNA表达水平的稳定检测，即能够在不同样本间，3种内参基因的表达检测稳定,从而使检测结果更加准确。 
(2)所设计的各种探针能够在均一的反应条件下进行杂交反应，且各种探针之间基本不存在非特异性结合；所设计的探针在检测中特异性好、信噪比高。同时，多种探针的组合使用使液相芯片和检测方法形成一个检测效果完好的系统，有着操作简易、准确性高、特异性高的特点。 
具体实施方式
本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。 
除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。本发明所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。 
实施例1 表皮生长因子受体抑制剂类药物疗效相关基因表达检测液相芯片试剂盒，主要包括有： 
一、偶联有支持探针(SP)的微球 
支持探针由三部分组成，5’端是与微球结合的胺基端，3’端是与支持延伸探针结合(互补配对)的特异序列P1，长度为16nt，中间是间隔序，所述间隔臂为本领域的技术人员所理解的，即用于将支持探针与微球表面间隔开来，在支持延伸探针与扩增延伸探针内部也存在间隔臂序列，通过在探针序列与氨基之间、探针内部设置适当长度的间隔臂序列，可减少空间位阻，提高杂交反应的效率以及杂交反应的特异性。本发明支持探针的间隔臂优选为5－ 10个T，本实施例所述间隔臂序列是8个T。每个目标基因选用一种微球，并选用一条支持探针，每种微球具有不同的荧光编码。本实施例中，每个目标基因的支持探针如表1所示。 
表1 不同的目标基因及其选用微球的编号、支持探针(SP) 
所有探针由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。将合成的支持探针用灭菌ddH2O配成100nmol/ml的贮存液。微球包被的过程如下： 
分别取5×106个上述编号的羧基化的微球(购自Luminex公司)悬浮于50ul0.1mol/L的MES溶液中(pH4.5)，加入10ul合成的捕获探针(100nmol/ml)。配制10ng/ml的EDC(N-(3-Dimethylaminopropyl)-N-ethylcarbodiimide)(购自Pierce Chemical公司)工作液。往微球悬液中加入2.5ul的EDC工作液，恒温孵育30分钟，再加入2.5ul的EDC工作液，再恒温孵育30分钟。反应结束后，用0.02％的Tween-20洗涤一次，再用0.1％的SDS液洗涤一次。将洗涤后的包被有支持探针的微球重悬于100ul的Tris-EDTA溶液[10mmol/L Tris(pH8.0)，1mmol/LEDTA]中，2-8℃避光保存。 
二、与目标基因mRNA特异结合的支持延伸探针(SE)、扩增延伸探针(AE) 
1)支持延伸探针(SE)是连接支持探针(SP)与目标基因mRNA之间的序列，SE由三部分组成，5’端是能与目标基因结合(互补配对)的特异序列P2，长度介于17nt至27nt，3’端是能与支持探针5’端通过碱基互补结合的特异序列P3，中间是间隔序列，本发明的支持延伸探针间隔臂优选为5－10个T，更为优选的是5个T。每个目标基因分别设计5条支持延伸探针，以提高检测的特异性。使用时，针对每种目标基因，选择2条或2条以上支持延伸探针即可完成检测，特异性和稳定性都很好(实验数据省略)，本实施例使用5条支持延伸探针，以使特异性达到最好。合成后的每条探针分别用10mmol/L Tris Buffer配制成100pmol/mL的贮存液。本实施例中，所述目标基因的支持延伸探针(SE)见表2。 
表2 目标基因的支持延伸探针(SE) 
2)扩增延伸探针(AE)是连接目标基因mRNA与信号检测组分之间的序列，AE由三部分组成，5’端是能与目标基因mRNA结合(互补配对)的特异性序列P4，3’端是能与标记探针互补配对的序列P5，(如不运用标记探针检测时，则3’端还修饰有生物素)，中间是5个寡聚核苷酸T的间隔臂序列(本发明的扩增延伸探针间隔臂优选为5－10个T，本实施例优选 的是5个T)。目标基因的扩增延伸探针(AE)见表3。所述P5的设计按照本领域的探针设计的公知常识，其为不存在内部发夹结构，探针内部和探针间都不形成二聚体、不存在错配，与P1、P2、P3、P4和总mRNA之间均不存在非特异性结合的序列，本实施例优选为碱基组成为TGAAGATTTGAAGTAATTG(SEQ ID NO.37)。 
每个目标基因分别设计10条扩增延伸探针，从而将检测信号进行级联放大。合成后的每条探针分别用10mmol/L Tris Buffer配制成100pmol/mL的贮存液。使用时，针对每种目标基因，选择5条或5条以上扩增延伸探针即可完成检测，特异性和稳定性都很好(实验数据省略)，本实施例优选同时使用10条扩增延伸探针，以使特异性达到最好。本实施例中，所述扩增延伸探针(AE)见表3。 
表3 目标基因的扩增延伸探针(AE) 
3)填充序列(FS)，将目标基因mRNA中没有与SE、AE特异结合的区域封闭，以减少后续 反应中生物素或标记探针的非特异性结合，从而减少检测背景。填充序列的Tm值应与SE、AE接近，如表4所示。 
本实施例所述目标基因的填充序列如表4所示。 
表4 目标基因的填充序列(FS) 
三、标记探针(LP) 
标记探针(LP)由两部分组成，其3’端是能与扩增延伸探针序列P5互补结合的序列，5’端带有生物素标记，通过与扩增延伸探针结合实现目标mRNA信号的级联放大。本实施例中所述的标记探针(LP)如表5。 
表5 标记探针 
实施例2 运用实施例1表皮生长因子受体抑制剂类药物疗效相关基因表达检测液相芯片试剂盒对临床样本的检测 
所述各种溶液的配方如下： 
本实施例中的支持探针、支持延伸探针、扩增延伸探针、标记探针均使用实施例1相应基因列表中的全部探针。且采取的是扩增延伸探针(AE)不带有生物标记，运用表5中的标记探针。 
一、裂解样本释放总RNA 
1.将FFPE肿瘤组织切片从载玻片上刮下，放入1.5ml离心管中，加入300ul匀浆缓冲液和3ul蛋白酶K(50ug/ul)，混合均匀，65℃消化2h。 
2.消化2h后的样品，室温下13,000rpm离心5分钟，吸取中间澄清的溶液转移至新的1.5ml离心管中备用。(如溶液仍不澄清，则重复本步骤1～2次。) 
二、目标mRNA通过与探针特异性结合固定在微球上 
1.取出探针工作液于室温融解，然后在95℃变性5分钟，马上置于冰上。 
2.按下表配制工作液，混合均匀 
3.将上述配制好的工作液分装至杂交板上，60ul/孔。然后将上述处理好的样品以40ul/孔分别加入杂交板中；空白对照加入匀浆缓冲液40ul/孔。密封杂交板，54℃±1℃，600rpm震荡孵育过夜(16-22h)。 
4.用洗涤缓冲液润湿滤板1分钟，除去洗涤缓冲液。 
5.将杂交板取出，500×g离心1分钟，将反应液全部转移至滤板中。 
6.除去溶液，用200ul洗涤缓冲液洗涤3次。 
三、通过杂交反应将目标RNA信号放大 
1.加入标记探针工作液100ul/孔。50℃±1℃，600rpm震荡孵育1小时。 
2.除去溶液，用200ul洗涤液洗涤2次。 
四、与SA-PE结合，并在液相芯片阅读仪上检测 
1.加入SA-PE工作液100ul/孔，600rpm震荡室温孵育30min。 
2.除去溶液，用200ul SA-PE洗涤液洗涤2次。 
3.加入SA-PE洗涤液130ul/孔。室温，600rpm震荡孵育2至5分钟。 
4.在液相芯片仪上读取数据。 
五、数据分析 
在6个目标基因中，标志基因3个，分别是：EGFR、IGF-1R、PTEN、； 
持家基因3个，分别是：B2M、TFRC、TBP； 
将读取的荧光值按照以下方法进行均一化处理： 
步骤1：获得原始数据(MFI值) 
步骤2：样品的MFI减去空白孔N的MFI＝net MFI 
步骤3：每个样品的三个持家基因的net MFI值分别取几何平均值，得到相应的G1、G2、G3……Gn 
步骤4：每个样品目标基因mRNA的net MFI除以对应的Gn得到相应的Nn。Nn即为已排除上样量差异，可在样品间进行相对表达量比较的数值。 
本实施例中对10例样品进行检测，检测结果如下所示： 
表6 空白孔N与10例样品原始数据(MFI值) 
Sample EGFR IGF1R PTEN B2M TFRC TBP
N 6 2 4 11 4 11
1 1919 2431 2223 9832 6667 3848
2 2561 2336 628 12060 11202 9730
3 2393 1915 1723 5559 3872 9846
4 2350 627 1730 11136 9666 8922
5 1560 3018 1522 6455 2884 3461
6 1355 584 631 3331 9263 11885
7 961 1600 1362 11694 11193 10625
8 1950 1581 1930 3985 10962 7432
9 985 1122 1461 11510 5519 2515
10 3010 1312 2528 6536 11928 4619
表7 10例样品各基因的相对表达量 
Sample EGFR IGF1R PTEN
1 0.303 0.385 0.352
2 0.233 0.213 0.057
3 0.401 0.321 0.289
4 0.238 0.063 0.175
5 0.389 0.754 0.380
6 0.189 0.081 0.088
7 0.086 0.143 0.122
8 0.283 0.230 0.281
9 0.181 0.207 0.269
10 0.423 0.184 0.355
通过上述检测数据可见，本发明试剂盒能够稳定地检测到各样本的EGFR、IGF1R和PTEN基因mRNA的表达，通过内参基因TFRC、B2M和TBP的mRNA读数分析可见，3种内参基因的检测信号和变化趋势相当，即B2M的mRNA表达量最高，TFRC表达量居中，TBP表达量最低， 而在不同样本间，3种内参的表达检测稳定，从而使EGFR、IGF1R和PTEN基因mRNA的相对表达量检测更加准确。 
实施例3 不同间隔臂的液相芯片对表皮生长因子受体抑制剂类药物疗效相关基因表达水平的检测 
一、液相芯片制备的设计(间隔臂的选择) 
以EGFR、PTEN检测液相芯片的支持探针为例，分别选用不同的间隔臂，具体设计如表8所示。探针SP、SE与AE的合成、SP序列包被微球、检测方法等如实施例1和实施例2所述。 
表8 间隔臂及其长度 
间隔臂种类 长度 实验组
poly(dT) 8 1
poly(dA) 8 2
(CH2)n 15 3
poly(TTG) 3 4
二、样品检测 
采用上述设计制备的液相芯片，按实施例2所述检测过程和方法对样品11-15进行检测，检测结果如下(表中数据为检测荧光值)： 
表9a 样品EGFR检测结果(检测荧光值<MFI值>) 
表9b 样品PTEN检测结果(检测荧光值<MFI值>) 
将4组设计的检测荧光值进行统计学分析，证明4组设计的检测效果没有差异。因此，这4种间隔臂的设计是等效的。 
其它针对支持延伸探针、扩增延伸探针内部不同的间隔序列的液相芯片，其结果依然稳定可靠，具体数据省略。 
实施例4：标记探针的运用 
液相芯片制备的设计(信号检测组分) 
所述信号检测组分有两种选择，1)扩增延伸探针3’端序列P5的3’端带有生物素标记；2)扩增延伸探针3’端序列P5与标记探针(LP)通过碱基互补配对结合，同时标记探针的5’端带有生物素标记。这两种信号检测组分均能实现信号放大，检测到正常信号。其中，使用标记探针的生物素活性更加稳定，效果较优。 
以所述液相芯片的检测EGFR、PTEN、IGF1R基因的两种信号检测组分为例，具体设计如表10所示。即所述液相芯片的组成为： 
实验组1：支持探针偶联的微球、支持延伸探针、填充序列同实施例1，扩增延伸探针具有生物素标记；没有标记探针； 
实验组2：支持探针偶联的微球、支持延伸探针、填充序列、标记探针同实施例1，扩增延伸探针不具有生物素标记。 
表10 信号检测组分 
二、样品检测 
采用上述设计制备的液相芯片，按实施例2所述检测过程和方法对样品16-20进行检测，检测结果如下(表中数据为检测荧光值)： 
表11 样品检测结果(检测荧光值<MFI值>) 
将两组设计的检测荧光值进行统计学分析，证明两组设计的检测结果没有差异，因此，这两种信号检测组分对信号的检测是等效的。其中，使用标记探针的信号检测组分，由于其生物素的活性更为稳定，效果较优。 
实施例5：与现有技术中的液相芯片试剂盒的比较 
一、液相芯片试剂盒的比较 
在产品的早期开发过程中，申请人的中国发明专利(申请号：200910193802.8)，但其针对同一样本不同基因mRNA检测信号的强弱不均衡，从而影响到目标基因EGFR、IGF-1R和PTEN指标的判读。 
本发明试剂盒针对上述问题，进一步改进和优化EGFR、IGF-1R、PTEN、和3种内参基因的检测探针，从而获得本发明的技术方案。 
正如本领域技术人员所知，内参基因是在体内可相对稳定表达的，也就是说，不同样本之间，其不同的内参基因表达水平的变化趋势是一致的。本实施例，使用专利申请试剂盒(申 请号：200910193802.8,检测B2M、TFRC、TBP基因的试剂盒的支持探针、支持延伸探针、扩增延伸探针、标记探针均使用CN200910193802.8中实施例1相应基因列表中的全部探针，且采取的是扩增延伸探针(AE)不带有生物标记，运用表5中的标记探针，检测方法参照本发明的实施例2。)与本发明试剂盒(本实施例的对应基因的检测试剂盒和检测方法，都参照本发明实施例1和2)，对比内参基因的相对表达情况。 
二、样品检测 
分别采用专利申请(申请号：200910193802.8)试剂盒与本发明试剂盒，对样品21-25的内参基因的表达进行检测。其实验操作如本发明实施例1和2所示，检测结果如下(表中数据为检测荧光值)。 
表12 样品检测结果(检测荧光值<MFI值>) 
通过上述两种试剂盒的内参基因表达量对比可见，本发明试剂盒的3种内参基因检测信号和变化趋势相当，即B2M的mRNA表达量最高，TFRC表达量居中，TBP表达量最低，而在不同样本间，3种内参基因的表达检测稳定。 
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。 

Claims (10)

1.一种表皮生长因子受体抑制剂类药物疗效相关基因表达检测液相芯片试剂盒，其特征在于，主要包括：
(1)与胺基修饰的支持探针偶联的微球，每条支持探针主要包括5’端的间隔臂序列和3’端的能与支持延伸探针互补配对的特异性序列P1，所述特异性序列P1选自SEQ IDNO.1-SEQ ID NO.6，每个目标基因选用一种微球，每种微球具有不同的荧光编码；
(2)连接支持探针与目标基因mRNA的支持延伸探针,每条支持延伸探针的碱基序列从5’端到3’端依次为：与对应的目标基因mRNA互补配对的特异性序列P2、间隔臂序列、能与对应的支持探针的特异性序列P1互补配对的P3序列，所述支持延伸探针的特异性序列P2包括有：针对EGFR基因的选自SEQ ID NO.7－SEQ ID NO.11中的2条以上、针对IGF-1R基因的选自SEQ ID NO.12－SEQ ID NO.16中的2条以上、针对PTEN基因的选自SEQ ID NO.17－SEQ ID NO.21中的2条以上、针对B2M基因的选自SEQ IDNO.22－SEQ ID NO.26中的2条以上、针对TFRC基因的选自SEQ ID NO.27－SEQ IDNO.31中的2条以上、和/或针对TBP基因的选自SEQ ID NO.32－SEQ ID NO.36中的2条以上；
(3)扩增延伸探针，每条扩增延伸探针的碱基序列从5’端到3’端依次为：能与目标基因mRNA互补配对的特异性序列P4、间隔臂序列、序列P5，3’末端还修饰有生物素；所述扩增延伸探针的特异性序列P4包括有：针对EGFR基因的选自SEQ ID NO.38－SEQID NO.47中的5条以上、针对IGF-1R基因的选自SEQ ID NO.48－SEQ ID NO.57中的5条以上、针对PTEN基因的选自SEQ ID NO.58－SEQ ID NO.67中的5条以上、针对B2M基因的选自SEQ ID NO.68－SEQ ID NO.77中的5条以上、针对TFRC基因的选自SEQID NO.78－SEQ ID NO.87中的5条以上、和/或针对TBP基因的选自SEQ ID NO.88－SEQ ID NO.97中的5条以上，所述P5为不存在发夹结构，探针内部和探针间不形成二聚体、不存在错配、与P1、P2、P3、P4和总mRNA之间均不存在非特异性结合的序列。
2.根据权利要求1所述的表皮生长因子受体抑制剂类药物疗效相关基因表达检测液相芯片试剂盒，其特征在于：还包括有填充序列，所述填充序列为：针对EGFR基因的选自SEQ ID NO.98－SEQ ID NO.99中一条或多条、针对IGF-1R基因的SEQ ID NO.100、针对PTEN基因的选自SEQ ID NO.101－SEQ ID NO.103中的一条或多条、针对B2M基因的选自SEQ ID NO.104－SEQ ID NO.107中的一条或多条、针对TFRC基因的选自SEQ ID NO.108－SEQ ID NO.109中的一条或多条、和/或针对TBP基因的SEQ ID NO.110—SEQ ID NO.111。
3.根据权利要求1所述的表皮生长因子受体抑制剂类药物疗效相关基因表达检测液相芯片试剂盒，其特征在于：所述特异性序列P1为：针对EGFR基因的SEQ ID NO.1、针对IGF-1R基因的SEQ ID NO.2、针对PTEN基因的SEQ ID NO.3、针对B2M基因的SEQ ID NO.4、针对TFRC基因的SEQ ID NO.5、和/或针对TBP基因的选自SEQ ID NO.6。
4.根据权利要求1所述的表皮生长因子受体抑制剂类药物疗效相关基因表达检测液相芯片试剂盒，其特征在于：所述间隔臂序列为5－10个T。
5.根据权利要求1—4任一项所述的表皮生长因子受体抑制剂类药物疗效相关基因表达检测液相芯片试剂盒，其特征在于：所述P5的组成为SEQ ID NO.37。
6.一种表皮生长因子受体抑制剂类药物疗效相关基因表达检测液相芯片试剂盒，其特征在于：主要包括：
(1)与胺基修饰的支持探针偶联的微球，每条支持探针主要包括5’端的间隔臂序列和3’端的能与支持延伸探针互补配对的特异性序列P1，所述特异性序列P1选自SEQ IDNO.1-SEQ ID NO.6，每个目标基因选用一种微球，每种微球具有不同的荧光编码；
(2)连接支持探针与目标基因mRNA的支持延伸探针,每条支持延伸探针的碱基序列从5’端到3’端依次为：与对应的目标基因mRNA互补配对的特异性序列P2、间隔臂序列、能与对应的支持探针的特异性序列P1互补配对的P3序列，所述支持延伸探针的特异性序列P2包括有：针对EGFR基因的选自SEQ ID NO.7－SEQ ID NO.11中的2条以上、针对IGF-1R基因的选自SEQ ID NO.12－SEQ ID NO.16中的2条以上、针对PTEN基因的选自SEQ ID NO.17－SEQ ID NO.21中的2条以上、针对B2M基因的选自SEQ IDNO.22－SEQ ID NO.26中的2条以上、针对TFRC基因的选自SEQ ID NO.27－SEQID NO.31中的2条以上、和/或针对TBP基因的选自SEQ ID NO.32－SEQ ID NO.36中的2条以上；
(3)扩增延伸探针，每条扩增延伸探针的碱基序列从5’端到3’端依次为：能与目标基因mRNA互补配对的特异性序列P4、间隔臂序列、序列P5；所述扩增延伸探针的特异性序列P4包括有：针对EGFR基因的选自SEQ ID NO.38－SEQ ID NO.47中的5条以上、针对IGF-1R基因的选自SEQ ID NO.48－SEQ ID NO.57中的5条以上、针对PTEN基因的选自SEQ ID NO.58－SEQ ID NO.67中的5条以上、针对B2M基因的选自SEQ IDNO.68－SEQ ID NO.77中的5条以上、针对TFRC基因的选自SEQ ID NO.78－SEQ IDNO.87中的5条以上、和/或针对TBP基因的选自SEQ ID NO.88－SEQ ID NO.97中的5条以上，所述P5为不存在发夹结构，探针内部和探针间不形成二聚体、不存在错配、与P1、P2、P3、P4和总mRNA之间均不存在非特异性结合的序列；和
(4)标记探针，所述标记探针具有与扩增延伸探针P5互补配对的序列，且末端具有生物素修饰。
7.根据权利要求6所述的表皮生长因子受体抑制剂类药物疗效相关基因表达检测液相芯片试剂盒，其特征在于：还包括有填充序列，所述填充序列为：针对EGFR基因的选自SEQ ID NO.98－SEQ ID NO.99中一条或多条、针对IGF-1R基因的SEQ ID NO.100、针对PTEN基因的选自SEQ ID NO.101－SEQ ID NO.103中的一条或多条、针对B2M基因的选自SEQ ID NO.104－SEQ ID NO.107中的一条或多条、针对TFRC基因的选自SEQ ID NO.108－SEQ ID NO.109中的一条或多条、和/或针对TBP基因的SEQ ID NO.110—SEQ ID NO.111。
8.根据权利要求6所述的表皮生长因子受体抑制剂类药物疗效相关基因表达检测液相芯片试剂盒，其特征在于：所述特异性序列P1为：针对EGFR基因的SEQ ID NO.1、针对IGF-1R基因的SEQ ID NO.2、针对PTEN基因的SEQ ID NO.3、针对B2M基因的SEQ ID NO.4、针对TFRC基因的SEQ ID NO.5、和/或针对TBP基因的选自SEQ ID NO.6。
9.根据权利要求6所述的表皮生长因子受体抑制剂类药物疗效相关基因表达检测液相芯片试剂盒，其特征在于：所述间隔臂序列为5－10个T。
10.根据权利要求6—9任一项所述的表皮生长因子受体抑制剂类药物疗效相关基因表达检测液相芯片试剂盒，其特征在于：所述P5的组成为SEQ ID NO.37。
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Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1997008183A1 (en) * 1995-08-25 1997-03-06 Lane Michael J Nucleic acid capture moieties
WO2001077373A2 (de) * 2000-04-06 2001-10-18 Epigenomics Ag Detektion von variationen des dna-methylierungsprofils
WO2005047533A1 (en) * 2003-11-17 2005-05-26 Tm Bioscience Corporation Method of detecting mutations associated with thrombosis
WO2005117514A2 (en) * 2004-06-01 2005-12-15 Tm Bioscience Corporation Method of detecting cystic fibrosis associated mutations
WO2006002526A1 (en) * 2004-06-30 2006-01-12 Tm Bioscience Pgx, Inc. Method of detecting mutations in the gene encoding cytochrome p450-2d6
CN101705283A (zh) * 2009-11-10 2010-05-12 广州益善生物技术有限公司 靶向药物疗效相关基因mRNA表达水平检测液相芯片和检测方法
CN103911462A (zh) * 2014-04-03 2014-07-09 河北国际旅行卫生保健中心 黄热、乙型脑炎、基孔肯雅、西尼罗的鉴别检测方法及引物和探针

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1997008183A1 (en) * 1995-08-25 1997-03-06 Lane Michael J Nucleic acid capture moieties
WO2001077373A2 (de) * 2000-04-06 2001-10-18 Epigenomics Ag Detektion von variationen des dna-methylierungsprofils
WO2005047533A1 (en) * 2003-11-17 2005-05-26 Tm Bioscience Corporation Method of detecting mutations associated with thrombosis
WO2005117514A2 (en) * 2004-06-01 2005-12-15 Tm Bioscience Corporation Method of detecting cystic fibrosis associated mutations
WO2006002526A1 (en) * 2004-06-30 2006-01-12 Tm Bioscience Pgx, Inc. Method of detecting mutations in the gene encoding cytochrome p450-2d6
CN101705283A (zh) * 2009-11-10 2010-05-12 广州益善生物技术有限公司 靶向药物疗效相关基因mRNA表达水平检测液相芯片和检测方法
CN103911462A (zh) * 2014-04-03 2014-07-09 河北国际旅行卫生保健中心 黄热、乙型脑炎、基孔肯雅、西尼罗的鉴别检测方法及引物和探针

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MICHAEL FLAGELLA等: "A multiplex branched DNA assay for parallel quantitative gene expression profiling", 《ANALYTICAL BIOCHEMISTRY》, vol. 352, 2 March 2006 (2006-03-02), pages 50 - 60 *

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