CN112094887A - 一种可实用于大规模鸽子性别鉴定的基因识别优化方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术领域，涉及一种基于普通PCR技术的可实用于大规模鸽子性别鉴定的基因识别优化方法，其特征在于采集受检鸽的静脉血样、血样的前处理、处理后样品的再编号规范、处理后样品基因组DNA模板的制备、和制备的模板直接用于PCR扩增。本发明公布了采集鸽子静脉血作为鸽子性别鉴定的遗传材料，在对材料进行热灭活处理后，于实验室检测前对经样品再编号，然后利用离心获得沉淀于离心管底物带有颜色的块状物，将该块状物转移至一步法试剂中直接进行基因组DNA模板的制备，然后在其中直接加入PCR反应液，即可实现对鸽子性别的基因识别。本发明有效地减少了鸽子性别基因识别过程中的操作步骤，显著节约了人力和材料等生产成本。

Description

一种可实用于大规模鸽子性别鉴定的基因识别优化方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种基于普通PCR技术的可实用于大规模鸽子性别鉴定的基因识别优化方法，其特征在于采集受检鸽的静脉血样、血样的前处理、处理后样品的再编号规范、处理后样品基因组DNA模板的制备、和制备的模板直接用于PCR扩增。

技术背景

乳鸽及鸽蛋产品目前是为数不多的绿色产品之一，市场需求极为旺盛。近年来，我国鸽业产业发展迅速。在以江苏、广东、上海、山东等鸽业协会等为代表的行业组织带动下，全国已经形成了围绕品种繁育、饲养加工、休闲文化、饮食消费以及餐饮文化等多种产业模式。据估计，2016年，我国肉种鸽存栏达到5000万对以上，年产商品乳鸽8.5亿只以上，产值超过350亿元。同时，蛋鸽生产也突破了传统的饲养模式，正以突飞猛进的速度增长。在江苏、广东、上海和山东等省市，肉鸽或蛋鸽生产已形成一定的地区性产业集群，一些地方已形成区域特色，成为致富一方的特色产业和农业经济增长点。

同时，鸽的产业化发展也跟其它的动物集约化生产一样，同样存在一些制约因素。其中，鸽的性别鉴定就是一个制约肉鸽，特别是蛋鸽产业化发展且急需解决的一个瓶颈问题。由于鸽是单一形态性，生殖器在外形上难以鉴别，因此乳鸽性别早期不能鉴定，至4.5-5个月龄的青年鸽的性别才能通过外形加以鉴定。但这种依赖外部形态的鉴定准确率低，即使有丰富经验的技术人员的准确率也只有80-85％左右，且费时费工。鸽子性别不能准确和及时的鉴定的这一状况严重影响了种鸽配对、蛋鸽生产，以及鸽的品种选育，极大地制约了鸽业的快速发展。

解决乳鸽性别鉴定技术瓶颈，可以帮助鸽场在乳鸽阶段进行性别鉴定，有助于蛋鸽生产中的公乳鸽的淘汰及品种更新、(性成熟前)青年种鸽的分群饲养(笼养)或分群放飞、性成熟后种鸽适时的即时准确配对、商品父母代种鸽的性别鉴定、种鸽的早期选育(育种)等。因此，乳鸽性别鉴定技术的产业化开发，不仅使养鸽业得到快速的发展，从根本上改变传统的鸽业养殖模式，实现鸽业农业工业化，使大大提高企业赢利能力，而且对促进就业、增加农民收入都具有十分重要的意义。

遗传学上，鸽子的性别是由性染色体决定的。雄鸽的性染色体为ZZ型，雌鸽为ZW型，因此，通过遗传学方法对鸽子进行性别显然是一种准确率最高的方法，理论上，基因识别技术对鸽子性别鉴别的正确率可以达到100％。本发明涉及的乳鸽性别鉴定技术正是基于鸽子通过遗传学因素决定性别的基本生物学原理。具体到本项目所采用的技术上，主要是利用乳鸽微量血液细胞制备基因组DNA模板后，通过PCR 扩增鸽性染色体上的CHD基因来进行雌雄鉴别。

其中，乳鸽微量血液细胞基因组DNA模板制备技术的基本原理及技术内容是：利用基因组DNA 模板制备液破裂动物细胞膜，释放出细胞核DNA，然后利用试剂中关键的蛋白酶裂解包裹在基因组DNA 外面的组蛋白及细胞膜蛋白等蛋白，这样获得的基因组DNA粗品可直接用作PCR模板。

鸽性别鉴定技术的基本原理及技术内容是：利用鸽CHD基因的雌雄差异来进行性别鉴定。鸽两条不同性染色体Z和W上均存在CHD基因，但两个基因存在明显的长度差异，不同于性染色体上的其它已知的基因，因此PCR扩增条带会出现公母鸽不同大小的条带，雌鸽会出现两条带(Z和W上的CHD基因片段长度不同)，而雄鸽仅出现一条带(雄鸽仅有Z性染色体)。

事实上，通过扩增CHD基因，利用雌雄鸽在该基因组成上的差异来辨别雌雄的技术早就有报道。但是由于技术成本的居高不下，使得该技术一直无法应用于市场。

为突破这一长期制约我国鸽业发展的技术瓶颈，我们自2013年起，历经近6年的研究和反复测试，研发了一种基于普通PCR技术的可实用于大规模鸽子性别鉴定的基因识别方法。在本发明中，只需采集1 滴鸽血，就可以实现鸽子的性别鉴定。迄今，使用本技术我们已成功测试从乳鸽到成年鸽的各类鸽样超过 10万羽，用户反馈的错误率小于2％(该错误包括在生产实践上从采样开始即可能存在将鸽号标计错误的可能；此外，基因识别技术是一种高灵敏度的技术，采用时的样品间的相互污染也有可能造成鉴定结果与实)。

通过基因识别技术进行性别鉴定，需要对目标基因组DNA进行PCR扩增，而PCR需要基因组DNA 模板。因此，如何快速有效地制备基因组DNA模板成为本类产品的关键。在生命科学研究中，一般地有三种方法，即传统的苯酚-氯仿抽提法、碱法以及酶法，用来进行样品的基因组模板制备。但已有的用于生命科学研究的已有产品无论那种方法都需要通过多个步骤才能实现，其成本高，耗时长。须知，在生产应用中，多一个步骤即意味着包括人力成本在内的生产成本的提高。因此，传统的方法无法满足农业市场的低成本的技术需求。

在本发明中，我们公布了一种从鸽子样本采取、样品前处理、样品的低温运输、样品的编号规范、样品的基因组DNA模板的一步法快速制备、目标基因组DNA片段的快速扩增、PCR产物电泳识别的完整基因识别技术方案。

发明内容

通过扩增鸽子的CHD基因，利用雌雄鸽在该基因组成上的差异来辨别雌雄的技术早就有报道。但是传统的方法中存在着诸如鸽组织处理过程负责、基因组DNA模板制备步骤多、耗时长和成本高等问题，使得相应的技术成本居高不下，因而一直无法应用于市场，成为鸽业发展的技术瓶颈。本发明在于公布了一种基于普通PCR技术的可实用于大规模鸽子性别鉴定的基因识别优化方法，其特征在于对鸽子样品的采集(采集受检鸽的静脉血样)、血样的前处理、处理后样品的再编号规范、处理后样品基因组DNA模板的制备、和制备的模板直接用于PCR扩增等多步骤提出了创新性的技术发明，对整个鸽子性别鉴定过程中的技术步骤进行了有效的优化，显著地节约了人力和材料等生产成本，因而使得本发明可实用于大规模鸽子性别鉴定。

为后续的PCR扩增提供遗传材料，传统的方法是从鸽子身上拔取羽毛。拔取羽毛本身看似简单，但获取的羽毛中是否含有羽髓、羽髓组织中组织液是否过多等成为拔取羽毛者较难掌握的技术难点。在生产实践中，采集样品者由于缺乏对遗传材料本身要求(含具的细胞)相关知识的了解，经常会提供无羽髓的羽毛；或者由于鸽子年龄较小或羽毛来源位置不正确，提供的羽毛羽髓含水量太高，使得保存成为困难 (其中的基因组DNA因为过高的含水量在样品递送过程中很快降解)。其次，在获取羽毛后，如何在实验室中分离获得羽髓也较困难。简单地说，羽毛运输到检测实验室后，需要人工逐一分别用小剪刀剪取获得羽髓，非常耗时耗工，人力成本很高，不利于大规模或自动化进行处理。再者，由于采自鸽子身体上的羽毛未经处理，直接进入实验室，给禽流感等人鸟共患病毒的传播带来了巨大的分险，因而为实验室检测人员的安全带来威胁，在禽流感流行时，普通实验室将无法开展相关鉴定工作。

本发明中使用采集鸽子静脉血的办法，因为血液本身很容易辨识，因而在具体采样上，采样技术非常容易掌握，即使文化水平较低的工作人员也容易理解。当然，与直接拨取羽毛相比，就采样而言，采集鸽子静脉血，要复杂一些，但却给后续实验室处理的自动化和规模化带来了极大的方便。

实践中，受检鸽的静脉血的采集量为1-20μl，优选1μl。采集到的鸽子血液转移至内装有10-100μl 溶液A(成分是低渗液，其盐离子(氯化纳)含量范围是0至0.1％)的1.5ml小塑料离心管中。优选20 μl。以记号笔在塑料离心管盖上书写血样对应鸽子的唯一编号。优选以两位阿拉伯数字编号(00至96)；每96个样品为一盒或一袋；每盒或每袋另行编号，优选以英文26个字母编号。血样的前处理是将1.5ml 塑料管插入到塑料泡沫垫上，然后转移至沸水中孵育。沸水的温度为90℃以上，优选95℃；孵育时间为 5-15分钟，优选10分钟。热处理后的样品迅速转移至冰上保存。本发明所公布的血液样品的前处理方法为后续制备用于PCR扩增的模板提供了基础。此外，鸽子血样的高温灭活前处理，降低了人鸟共患病毒传播的风险。

综上所述，采集鸽子血液并进行特别的前处理以用作后续PCR扩增的遗传材料模板是一项本领域工作人员并不能自然想到的技术，因而符合发明的特征。

对于采集到的鸽子遗传材料样品进行再编号是一项在过去实践中被忽视的问题。本领域的工作人员能够经常能想到的是持续利用鸽子采样时的编号进行后续的检测。但是由于采样人员与实验人员非同一批人员，因而再行编号则有利于后续的检测。在本发明中，对处理后鸽子样品的再编号规范是通过优先编号未来用于PCR扩增的PCR管顺序来间接实现的。具体地，先以一个8联PCR管为一行顺序进行排列，以 12行为一组(共96个样)。每一行确认从左到右的方向，对应的列依次(自左向右)编号为A、B、C、D、 E、F、G、H(共8列)。12行确认从上到下的方向，行的编号(自上而下)顺序为1、2、3、4、5、6、7、 8、9、10、11、12(共12行)。然后在所有已编号的PCR管中分别加入0.5-2.0μl的一步法溶液(南京尧顺禹生物科技公司产品)(优选1.5μl)，再将经预先处理的鸽子遗传材料转移至已编号且已加入1.5μl的一步法溶液(南京尧顺禹生物科技公司产品)的8联管中，对应的待性别鉴定的鸽子样品按8联管的编号进行排列，从而以8联管的编号作为待鉴定鸽子的新编号。

经热灭活处理的鸽子样品中含有用于鸽子性别鉴定的遗传材料，本领域工作人员一般做法是将其中的部分溶液(因为低渗处理导致细胞破裂，细胞的基因组DNA应该被释放到溶液中)用作遗传材料样品进行后续处理以制作基因组DNA模板，但是在本发明公布的方法中，用作后续制作基因组DNA模板的遗传材料来自对预先处理样品进行快速离心后获得的沉淀于离心管(EP)底部带有颜色的(紫色或黑色)块状物，而非EP管中的溶液。在公布本发明的前期研究工作中，我们发现以快状物制作的基因组DNA模板用作后续的基因型鉴定远比以样品经热灭活前处理后获得的溶液效果要好(稳定且可重复)。其中可能的原因在于鸽子的血红细胞是具核细胞(含遗传物质)且含大量的血红蛋白，在热灭活时，变性的血红蛋白随基因组DNA一起形成不溶于水的沉淀，经快速离心后聚于试管底部。因而，使用快状物而非溶液作为制作基因组DNA模板的样品材料是一项本领域工作人员并不能经常想到的新发现。

将经热灭活处理获得的黑色或紫色块状物转移至带有0.5-2μl(优选1.5μl)一步法试剂(南京尧顺禹生物科技公司产品)中直接进行基因组DNA模板的制备也是在生产实践上通过实验比较获得的新发现。传统的，如南京尧顺禹生物科技公司产品一步法试剂盒说明书所述，制备基因组DNA模板需要加入10μl 的一步法试剂，过少的一步法试剂将不能有效裂解细胞、消化细胞中的蛋白，从而导致样品基因组DNA 不能被有效暴露以供后续的PCR扩增。而本发明公布的方法表明将将经热灭活处理获得的黑色或紫色块状物转移至带有0.5-2μl(优选1.5μl)一步法试剂的PCR管后，经快速离心，然后按孵育、变性、和保存的程序进行处理即可获得可有效用于后续PCR扩增的基因组DNA模板。其中孵育温度是50-65℃，优选 65℃；孵育时间是10-45分种，优选30分钟；变性温度是85-100℃；优选95℃；变性时间是2-30分钟，优选5分钟；保存温度是4-16℃，优选16℃。保存时间为1分钟-12小时，优选1分钟。

按南京尧顺禹生物科技公司产品一步法试剂盒说明书所述，以一步法试剂制备的基因组DNA模板需要按照1∶20的比例(即在20μl的PCR扩增体系中加入1μl的基因组DNA模板)才能有效扩增，但本发明公布的方法是可以直接将按常规方法准备的PCR反应液(含1×PCR Mastermix和扩增引物各0.25 μM(正向引物的序列为gatccagtgcttgtttcc和反向引物序列aacgtggcaacagagtac)9.5μl直接加入到以1.5μl 一步法试剂制备的基因组模板中，然后按照常规的PCR反应条件(95℃ 2min；30×(95℃ 30s，56℃ 30s， 72℃ 40s)；72℃10min；16℃储存)即可实现有效扩增。这一新发现有利于在实践中减少将以一步法试剂制备的基因组DNA模板转移到新的含有PCR反应液中的操作步骤，有效地节约了人力和材料等生产成本。

具体实施方式

实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

1、受检鸽的编号

根据鸽子养殖企业自身习惯对待性别鉴定的鸽子进行编号；优选以阿拉伯数字形式编号，每96羽鸽子为一组，以26个英文字母作为各组编号。

2、采集受检鸽的血样

2.1按需要进行性别鉴定的鸽子数，准备相应的1.5ml EP管(塑料离心管)个数。96个为一组。

2.2用100μl移液器在每个EP管中分别加入20μl A液。

2.3在鸽子翅膀的腹侧静脉丰富处用大头针刺破静脉，出血后，(将大头针放置一专门的回收盒子内，请勿随机丢弃大头针，以避免伤人)，然后用2.5μl移液器吸取1μl血液(注意不能只吸取淡黄色的血清，要吸取红色的血液；同时请注意如果吸头外沾有血液外需要用吸水纸吸去，确保取样量准确)，移入每个EP管中，加样时以接触到A液的液面为准。弃去枪头(使用专门的垃圾管收集使用过的枪头，然后集中处理)。吸取新的样本时请注意更换枪头。合上EP管盖子后，在EP管上用记号笔写上相应鸽子的编号，然后立即将样品放在自制的冰上。

2.4换用新的大头针，(以防止鸽子基因组样品的交叉污染)，重复上述2.3步骤，采集另1只鸽子的血样。一直采满96个鸽子样本。

3、血样的前处理

3.1将水浴锅温度调节至95℃，打开电源开关，准备好95℃水浴。

3.2待样品采集完成后，用迷你离心机将样品快速离心至EP管底部。

3.3将上述装有血样的EP管插入带有插孔的泡沫悬浮块中

3.4将插有EP管的泡沫悬浮块放入95℃水浴锅中，孵育10分钟；切勿直接接触95℃水，以免烫伤！

4、前处理样品的低温保存和运输

4.1处理后样品的置于冰上或放入冰箱冷藏室中，运输时以低温运输(实际操作时，可将空矿泉水瓶灌满90％的水然后在冰箱冷冻室中预先冷冻过夜，然后作为冰袋运输经前处理的样品)。时间不超过48 小时。

5、处理后样品的编号规范

5.1根据待鉴定的鸽子样品组数，每组预先准备好0.2ml 8联PCR管12个。同时准备好一步法试剂 (南京尧顺禹生物科技有限公司产品)。

5.2用自动移液器在每一个8联PCR管的每管内加入1.5μl一步法试剂。

5.3然后以一个8联PCR管为一行顺序进行排列，以12行为一组(共96个样)。每一行确认从左到右的方向，对应的列依次(自左向右)编号为A、B、C、D、E、F、G、H(共8列)。12行确认从上到下的方向，行的编号(自上而下)顺序为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12(共12行)。8联管每管的编号即将作为未来样品的编号方式。

6、处理后样品基因组DNA模板的制备

6.1将低温运输的家鸽血液样品分别放入迷你离心机，将样品快速离心至EP管底部(此时EP管底部可见黑或紫色沉淀)。

6.2逐一从离心机中取出离心好的装有预处理样品的EP管，以2.5μl移液枪携带的白色10μl枪头从EP管底部挑取部分黑或紫色沉淀物转移至5.3中已加入1.5μl一步法试剂的PCR管内，转移样品时，以沉淀物接触到一步法试剂液面为准。样品转移好后，弃去吸头。然后将该EP管放置在96孔塑料托板上 (注意样品EP管顺序与5.3中的顺序一致，以下实验保持样品顺序不变，不能弄混！)。注意：吸取新的样本时请注意更换枪头。每8个EP管中的样品对应一个8联管，12排8联管，共96个样品。

6.3将加入了黑或紫色沉淀的8联PCR管快速离心，确保样品在8联PCR管的底部。

6.4将PCR管盖上盖子后放入PCR仪，按以下程序进行孵育：65℃ 30分钟、95℃ 5分钟、16℃ 1 分钟。

6.5如果反应完成的的样品不能立即使用，则放入4℃冰箱中或存储于-20℃中。

7、目标基因组片段的PCR扩增

7.1 PCR扩增体系的配制(100个PCR反应用量)：将500μl的2×PCR Master Mix；50μl的正向引物(5μM)；50μl的反向引物(5μM)和350μl超纯水依次加入到1.5ml EP管中，然后以涡旋仪混匀，再快速离心。

7.2以自动移液器将由7.1配制好的PCR溶液9.5μl分别加入到由6.3获得的基因组模板的PCR管内，待加样完毕，盖上管盖。然后以涡旋仪混匀，再快速离心。

7.3将8联管(或PCR板)分别按顺序依次放入PCR仪器内，按以下程序进行性别特异基因扩增： 95℃ 2min；30×(95℃ 30s，56℃ 30s，72℃ 40s)；72℃ 10min；16℃储存。

8、凝胶电泳的检测

8.1用电子天平秤取0.6克琼脂糖，倒入100ml三角烧瓶内，加入60ml 0.5×TAE缓冲液；然后放入微波炉内加热煮沸；待琼脂糖溶解后，放室温下冷却至60℃，加入3μl溴化乙锭(10mg/ml)，混匀后倒入凝胶制备板内，插上样品梳(含17个梳孔)。室温冷却30分钟。

8.2拨去样品梳。用排枪吸取扩增好的PCR产品5μl分别加入琼脂糖凝胶的样品孔内(1a-1h)号样品加入第一排样品孔的奇数孔内，2a-2h号样品加入第一排样品孔的偶数孔内；依次类推；一块凝胶可加入48个样品)。

8.3在充满0.5×TAE液(可重复使用)的电泳槽内，以电压200V，电泳15分钟

8.4在紫外灯下进行拍照记录

9、电泳结果阅读及报告

图1显示的是鸽子性别鉴定的实验室出具的电泳结果图，在所示的48羽鸽子中，其中出现两个电泳条带(其中较小电泳条带信号较强，而较大条带的信号较弱)的样品对应的鸽子为雌性(图中标有F的为雌鸽)，仅出现较大条带对应的鸽子为雄性。注意；每一组样品电泳结果中靠近凝胶最前沿的条带为引物二聚体。

10、讨论

2013年初开始，我们投入技术力量对鸽子性别鉴定技术进行研究，先后试验和比较了羽髓法和血液法制备测试样品，结果发现，与羽髓法相比，血液法取样简单、运输方便、操作安全、易于进行产业化的大规模检测、样品鉴定结果重复性好、实验室准确率可达100％。在2014年进行小试后，2015年我们对来自山东、河南、江西、安徽等多家鸽厂从乳鸽到成年鸽的不同鸽样进行了性别鉴定，迄今合计鉴定鸽子数量超过10万羽，客户反馈的错误率小于2％，实验室结果重复率为100％。

遗传学上，鸽子的性别是由性染色体决定的。因此，理论上，利用基因识别技术，在实验室对鸽子性别鉴别的正确率可以达到100％。但是，考虑到生产实践上，从采样开始即可能存在将鸽号标计错误的可能；此外，基因识别技术是一种高灵敏度的技术，采用时的样品间的相互污染也有可能造成鉴定结果与实际鸽子直接的差错。因此，正确地采样、准确地标记样品对应的鸽子是提高准确率，避免鉴定误差的首先要注意的问题。

如前所说，虽然鸽子性别鉴定的基因识别技术很早就有报道，但是鉴定成本居高不下一直是制约鸽子性别鉴定技术推广的关键障碍。我们经过多年的努力，对基因识别技术的整个过程进行了优化，在保证实验结果准确性的前提下，整合实验过程，减少实验步骤，从而有效地降低了实验所需的人力成本；在仪器设备上，我们优选性价比最高的实验设备，实现所有设备的国产化，从而有效地降低了设备投入和折旧成本；在实际使用上，我们创新性地发明了实验用独特试剂，有效地降低了试剂和耗材的使用成本。

还需要指出的是，本发明的鸽子性别鉴定技术是一项基于基因识别技术的高科技的技术，从事实验室鉴定工作的实验人员需要接受专业训练方可能胜任工作。同样，高技术的基因识别法，对实验室设备和环境也有具体的细节要求。目前，根据我们的大规模的测试结果表明，本发明所公布的一种可实用于大规模鸽子性别鉴定的基因识别方法，有望极大地降低鸽业的生产成本、提高企业的赢利能力、改变鸽业的传统生产模式，从而实现经济和社会效益的双丰收的现代农业发展目标。

Claims (9)

1.一种可实用于大规模鸽子性别鉴定的基因识别方法，其特征在于采集受检鸽的静脉血样、血样的前处理、处理后样品的再编号规范、处理后样品基因组DNA模板的制备、和制备的模板直接用于PCR的直接扩增。

2.如权利要求1所述的特征，受检鸽的血样采集的是静脉血，采集量为1-20μl，优选1μl。

3.如权利要求1所述的特征，将采集的血液转移至内装有10-100μl溶液A的1.5ml小塑料离心管中。优选20μl。以记号笔在塑料离心管盖上书写血样对应鸽子的唯一编号。优选以两位阿拉伯数字编号(00至96)；每96个样品为一盒或一袋；每盒或每袋另行编号，优选以英文26个字母编号。血样的前处理是将1.5ml塑料管插入到塑料泡沫垫上，然后转移至沸水中孵育。沸水的温度为90℃以上，优选95℃；孵育时间为5-15分钟，优选10分钟。热处理后的样品迅速转移至冰上保存。

4.如权利要求3所述的特征，溶液A的成分是低渗液，其盐离子(氯化纳)含量范围是0至0.1％。

5.如权利要求3所述的特征，经预处理的样品在用作模板前将快速离心，以便将样品集中至EP管底部(此时EP管底部可见黑或紫色沉淀)。

6.如权利要求1所述的特征，处理后样品的再编号规范是通过优先编号未来用于PCR扩增的PCR管顺序来间接实现的。具体地，先以一个8联PCR管为一行顺序进行排列，以12行为一组(共96个样)。每一行确认从左到右的方向，对应的列依次(自左向右)编号为A、B、C、D、E、F、G、H(共8列)。12行确认从上到下的方向，行的编号(自上而下)顺序为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12(共12行)。8联管每管的编号即将作为未来样品的编号方式。

7.如权利要求6所述的特征，将所有已编号的PCR管中分别加入0.5-2.0μl的一步法溶液(南京尧顺禹生物科技公司产品)(优选1.5μl)，然后将经快速离心至管底的黑或紫色沉淀(如权利要求5所述)挑选部分转移至已编号且已加入1.5μl的一步法溶液(南京尧顺禹生物科技公司产品)的8联管中，对应的待性别鉴定的鸽子样品按8联管的编号进行排列，以8联管的编号作为待鉴定鸽子的新编号。

8.如权利要求1所述的特征，处理后样品基因组DNA模板的制备方法是将权利要求7所获得的样品盖上PCR管盖后快速离心，然后将PCR管按序转移至PCR仪中，按孵育、变性、和保存的程序进行处理。其中孵育温度是50-65℃，优选65℃；孵育时间是10-45分种，优选30分钟；变性温度是85-100℃；优选95℃；变性时间是2-30分钟，优选5分钟；保存温度是4-16℃，优选16℃。保存时间为1分钟-12小时，优选1分钟。

9.如权利要求1所述的特征，PCR直接扩增的方法是将按常规方法准备的PCR反应液(含1×PCR Mastermix和扩增引物各0.25μM(正向引物的序列为gatccagtgcttgtttcc和反向引物序列aacgtggcaacagagtac)9.5μl直接加入到如权利要求8所制备的鸽样基因组DNA模板溶液内。然后直接进行PCR反应。反应条件为：95℃ 2min；30×(95℃ 30s，56℃ 30s，72℃40s)；72℃ 10min；16℃储存。

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