CN106755556B

CN106755556B - 一种用于鉴别五灵脂的引物组、试剂盒及检测方法

Info

Publication number: CN106755556B
Application number: CN201710178196.7A
Authority: CN
Inventors: 张全芳; 刘艳艳; 谭晴晴; 范阳阳; 胡悦; 歩迅
Original assignee: Biotechnology Research Center of Shandong Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Shandong Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2017-03-23
Filing date: 2017-03-23
Publication date: 2020-12-01
Anticipated expiration: 2037-03-23
Also published as: CN106755556A

Abstract

本发明公开了一种用于鉴别五灵脂的引物组、试剂盒和检测方法，其引物组序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。本发明以五灵脂的一对特异性引物对待测样本DNA提取物进行PCR扩增，为五灵脂的检测和鉴定提供准确的靶标位点，快速准确进行鉴定。本发明的检测方法简便，快捷，有效，能够从干燥的五灵脂粪便中快速准确的鉴定出五灵脂。

Description

一种用于鉴别五灵脂的引物组、试剂盒及检测方法

技术领域

本发明涉及一种检测方法，具体涉及一种用于鉴别五灵脂的引物组、试剂盒及检测方法。属于分子生物技术领域。

背景技术

五灵脂为复齿鼯鼠的干燥粪便，始载于《开宝本草》，云：“出北地。此是寒号虫粪也”。五灵脂性味甘温，无毒，入肝经，具有疏通血脉，散瘀止痛的功效，主治血滞、经闭、腹痛；胸胁刺痛跌扑肿痛和蛇虫咬伤等症，是妇科要药。

目前，市场上发现五灵脂的质量参差不齐，来源比较混乱，主要来源于鼠兔科等10余种动物，据报道，部分不法分子甚至人为加工成品来冒充正品五灵脂。相对于不同科属的动物粪便区分相对容易，而对于鼯鼠科的动物粪便和人工加工品在外观和质地上都与正品五灵脂极其相似，形态鉴别存在难度。这些伪品的存在不仅危害整个中草药五灵脂市场，而且会损害患者的健康。因此，急需建立一种快速鉴别五灵脂真伪的方法，为五灵脂的检测和监督提供技术支撑。

传统的鉴别五灵脂的方法主要是通过形态学和显微镜鉴别，然而对于形态相近的粪便很难用传统的方法来辨别真伪。利用动物通用引物COI序列进行鉴定，会出现不同程度套峰，致使检测结果不准确，并且PCR扩增困难，所以急需建立一种高效、可靠地方法鉴别五灵脂真伪。

发明内容

本发明的目的是为克服上述现有技术的不足，提供一种用于鉴别五灵脂的引物组。

本发明还提供了一种用于鉴别五灵脂的试剂盒及检测方法。

为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：

一种用于鉴别五灵脂的引物组，包括一对特异性引物，序列如下：

上游引物：5' CGTGAAGAGGCGGAGATA 3'，如SEQ ID NO.1所示；

下游引物：5' AGCGGTTACACCATTTGGA 3'，如SEQ ID NO.2所示；

一种用于鉴别五灵脂的试剂盒，包含上述引物组。

上述引物组、试剂盒用于鉴别五灵脂的用途。

一种用于鉴别五灵脂的检测方法，包括步骤：

（1）从待测样品中提取DNA为模板；

（2）利用上述的引物组作为PCR扩增的引物，进行PCR扩增，得到扩增产物；

（3）利用琼脂糖凝胶电泳检测对扩增产物进行鉴定。

作为优选技术方案之一，步骤（2）的PCR反应体系为25 µL，包括：10×缓冲液2.5 µL，浓度为2.5 mmol/L的dNTPs 2.0 µL，浓度为10 µmol/L的如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的引物各1.0µL，Taq DNA聚合酶0.2 µL，待测样本DNA模板2.0 µL，重蒸水补足至25 µL。

作为优选技术方案之一，步骤（2）中PCR扩增条件为：94℃ 3min；94℃ 30s，55℃30s，72℃ 30s，35个循环；72℃10min。

作为优选技术方案之一，步骤（3）采用质量浓度2%的琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，只扩增出一条340bp左右的特异性条带。

本发明的有益效果：

本发明以五灵脂的一对特异性引物对待测样本DNA提取物进行PCR扩增，为五灵脂的检测和鉴定提供准确的靶标位点，快速准确进行鉴定。本发明的检测方法简便，快捷，有效，能够从干燥的五灵脂粪便中快速准确的鉴定出五灵脂。

本发明灵敏度高，所需要的DNA用量少，与传统的形态鉴定和常规的动物通用引物PCR检测方法相比，具有实用性好，特异性强和准确性高的优点。本发明直接从待测样品中提取DNA后直接进行PCR扩增，可在5～6个小时内完成对五灵脂的检测，大大提高了检测效率。总之，本发明可用于五灵脂真伪的快速鉴别，为中草药五灵脂市场的健康稳定发展具有重要的意义。

附图说明

图1是使用五灵脂本发明的一对特异性引物鉴定8种待测样品是否为五灵脂正品的PCR扩增图谱。其中各泳道中，M代表分子量标准；1代表以水作为模板的空白对照，2代表鼠属伪品，3～10代表待测样品。

图2是对所扩增序列测序峰图。

图3是五灵脂引物特异性验证图谱。其中各泳道中，M代表分子量标准；1～5代表五灵脂正品，6代表大鼠粪便，7代表小鼠粪便，8代表兔粪便，9以水作为模板的空白对照。

图4是五灵脂特异性引物灵敏度检测图谱。其中各泳道中，M代表分子量标准；1代表稀释10⁰倍，2代表稀释10^-1倍，3代表10^-2倍，4代表稀释10^-3倍，5代表稀释10^-4倍，6代表稀释10^-5倍。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明进行进一步的阐述，应该说明的是，下述说明仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。

1、本发明采用的主要试剂及仪器如下

OMEGA Stool DNA 试剂盒购自OMEGA公司，Taq DNA聚合酶、10×缓冲液、 dNTPs购自宝生物（大连）生物公司。

PCR扩增仪（Eppendorf PCR扩增仪），测序仪（ABI3700XL DNA测序仪），离心机（德国Eppendorf 5810 多功能台式离心机），凝胶成像系统（BIO-RAD）。

2、样品DNA的提取

采用OMEGA Stool DNA试剂盒，具体的操作步骤参考说明书进行样品DNA的提取。

3、PCR检测体系的建立

利用提取的待测样本作为模板，选择线粒体16S rRNA基因作为研究对象，在Genbank中查找该基因序列，设计五灵脂的特异性引物，进行PCR扩增，检测扩增效果。

引物组序列：

上游引物：5' CGTGAAGAGGCGGAGATA 3'，如SEQ ID NO.1所示

下游引物：5' AGCGGTTACACCATTTGGA 3'，如SEQ ID NO.2所示

PCR反应：

以待测样本为模板，进行PCR扩增，25 µL反应体系中包括以下溶液或试剂：

Taq DNA聚合酶 0.2 µL

10×缓冲液 2.5 µL

dNTPs（2.5 mmol/L） 2.0 µL

上游引物（10 µmol/L） 1.0µL

下游引物（10 µmol/L） 1.0µL

DNA模板 2.0 µL

重蒸水补足至25 µL；

经过梯度PCR摸索实验条件，最终确定退火温度采用55℃，PCR反应扩增程序为：94℃ 3min；94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 30s，35个循环；72℃10min，16℃保存。

PCR扩增产物经2%的琼脂糖凝胶电泳检测，片段大小为340bp左右，五灵脂正品能很好地扩增，而伪品无扩增产物。

PCR扩增产物测序：

将PCR产物利用特异性引物进行正反向测序，得到的序列拼接后，与NCBI数据库Blast比对，结果与五灵脂的16S rRNA基因序列均一致，说明该引物特异性强，可快速鉴定出五灵脂正品。

对收集到的8个五灵脂样品进行PCR检测，以无菌水和鼠属伪品作为阴性对照，见图1结果显示，五灵脂为阳性，扩增出预期340bp左右的条带。将所扩增的产物进行测序，测序结果见图2，序列如SEQ ID NO.3所示。将扩增序列拼接进行Blast分析，结果显示所扩增的序列与五灵脂的宿主复齿鼯鼠的相似度99%，说明本研究的方法能够快速检测出五灵脂。

4、五灵脂引物特异性验证：

利用鼠兔的粪便与正品五灵脂进行对比，检测五灵脂引物的特异性。结果见图3，正品五灵脂扩增出一条340bp特异性条带，而无菌水和其他动物的粪便均未扩增出条带。

5、五灵脂特异性引物灵敏度检测

用紫外线分光光度计检测五灵脂基因组DNA 原始浓度为44.35ng/µL，按照10倍梯度进行稀释（10⁰、10^-1、10^-2、10^-3、10^-4和10^-5），检测其特异引物的灵敏度。结果如图4，根据本发明的PCR反应体系，五灵脂特异引物的检测灵敏度达到4.43 ng/µL。

上述虽然结合附图对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东省农业科学院生物技术研究中心

<120> 一种用于鉴别五灵脂的引物组、试剂盒及检测方法

<130> 2017

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

cgtgaagagg cggagata 18

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

agcggttaca ccatttgga 19

<210> 3

<211> 544

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ctctagcata tttagtatta gaggcactgc ctgcccagtg acacatgtta aacggccgcg 60

gtatcctgac cgtgcaaagg tagcataatc atttgttcct taaataggga cttgtatgaa 120

tggcctaacg agggtttaac tgtctcttac tcttaatcag tgacattgac ctctccgtga 180

agaggcggag atatcttaat aagacgagaa gaccctatgg agctttaaat ctattaacct 240

aagcacttta ataatatctt ccttagaaat ataacataaa gctaacaggt tataaatttt 300

ggttggggtg acctcggagt ataaattaac ctccgaatga tattaatcaa gacttcacta 360

gtctaaatta taattcatta attgacccaa attattgatc aacggaacaa gttaccctag 420

ggataacagc gcaatcctac tcaagagtcc atatcgacag tagggtttac gacctcgatg 480

ttggatcagg acatccaaat ggtgtaaccg ctattaaggg ttcgtttgtt caacgattaa 540

agtc 544

Claims

1.一种用于鉴别五灵脂的引物组，其特征在于，包括一对特异性引物，序列如下：

上游引物：5' CGTGAAGAGGCGGAGATA 3'，如SEQ ID NO.1所示；

下游引物：5' AGCGGTTACACCATTTGGA 3'，如SEQ ID NO.2所示。

2.一种用于鉴别五灵脂的试剂盒，其特征在于，包含权利要求1所述的引物组。

3.权利要求1所述的引物组、权利要求2所述的试剂盒用于鉴别五灵脂的用途。

4.一种用于鉴别五灵脂的检测方法，其特征在于，包括步骤：

（1）从待测样品中提取DNA为模板；

（2）利用权利要求1的引物组作为PCR扩增的引物，进行PCR扩增，得到扩增产物；

（3）采用质量浓度2%的琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，出现分子量340bp的特异性扩增条带，即鉴定为五灵脂。

5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，步骤（2）的PCR反应体系为25 µL，包括：10×缓冲液2.5 µL，浓度为2.5 mmol/L的dNTPs 2.0 µL，浓度为10 µmol/L的如SEQ IDNO.1和SEQ ID NO.2所示的引物各1.0µL，Taq DNA聚合酶0.2 µL，待测样本DNA模板2.0 µL，重蒸水补足至25 µL。

6.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，步骤（2）中PCR扩增条件为：94℃3min；94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 30s，35个循环；72℃10min。