CN117025788A - 一种线纹海马的生长性状相关的微卫星标记及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种线纹海马的生长性状相关的分子标记及其应用，所述的分子标记的核苷酸序列为SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2。本发明再一个方面提供所述的分子标记的一种用途，是在筛选具有生长优势的线纹海马个体中的应用。本发明通过对不同生长性状的线纹海马品种的扩增产物进行分析，获得了与线纹海马生长性状相连锁的微卫星标记，使用该微卫星标记可以筛选具有更好生长潜力的线纹海马个体，从而为线纹海马的遗传育种操作提供有效的分子标记。

Description

一种线纹海马的生长性状相关的微卫星标记及其应用

技术领域

本发明提供一种线纹海马的生长性状相关的微卫星标记及其应用，属于水产养殖品种的遗传育种技术领域

背景技术

海马又被称为“水马”，唐代陈藏器《本草拾遗》中首次出现“海马”一词，并沿用至今。海马是一味常用名贵动物类中药材，具有温肾壮阳、散结消肿的功效。药理研究表明海马类药材具有性激素样作用以及抗炎、抗氧化、抗肿瘤和提高机体免疫力等功能。近年来海洋随生态环境的变化、近海污染的加剧和人类的过度捕捞对海马的摄食、栖息环境及海马种群的繁衍均造成了严重的破坏。目前海马的野生种群已经濒危，人工增养殖已成为满足市场需求,保护海马资源的唯一选择。我国人工养殖的海马种类主要有三斑海马、大海马，少量的鲍氏海马、日本海马以及从美国引进的线纹海马，但养殖海马面临着繁殖效率低、幼苗成活率低、池塘网箱养殖成活率低、不同生长阶段对饵料的不同需求等问题。

线纹海马(Hippocampus erectus)隶属于海龙科、海龙属，主要分布于美洲海岸,是原产于美洲地区的海马品种，又名灰海马。最大体长可达27cm，寿命3～4年，2009年由我国学者从美国引进。相对国内传统养殖的三斑海马跟大海马更加适合人工养殖。人工环境下3个月可以长至12cm，6个月可以长至16cm，成活率可以达到90％以上，具有生长速度快、成活率高、抗病能力强等特点。

然而,线纹海马经过多代养殖驯化加之近亲繁殖，出现繁殖能力降低、性早熟、体型偏小、生长速度减缓、抗病力下降等现象。因此，对线纹海马进行良种选育迫在眉睫。

养殖实践中线纹海马的最佳养殖水温为24～25℃，在此温度范围外线纹海马的死亡率增加，生长速率也受到影响。而在山东海区的养殖的池塘水体，在6月中下旬海水温度会从24℃开始升温至25～27℃，7月温度维持在27～29℃，8月温度会升到29～31℃，直至9月中旬水温才会降至25度。

在目前的养殖过程中，夏天高温天气的控温成本是影响养殖户收入的主要因素之一。而且，夏天池塘养殖海马唯一受限是水温，即如能使养殖的线纹海马品系的最适生长水温(24～25℃)提高3度，其养殖的经济效益也会大大提高。因此，筛选能够在相对高温(高于25℃，但低于其耐受的最高温度)条件下也具有稳定生长性能的线纹海马的个体/品系就成为线纹海马遗传育种的研究热点。

发明内容

本发明的目的是提供一种线纹海马的生长性状相关的分子标记及其应用，即通过分析在高于线纹海马的最适生长温度(高于25℃，但低于其耐受的最高温度)的海水中养殖的正常生长群体和生长缓慢群体的微卫星引物扩增产物，来筛选与生长性状相连锁的分子标记，并使用筛选的分子标记来筛选亲本用于线纹海马的遗传育种。

本发明首先提供与线纹海马生长性状相连锁的分子标记，所述分子标记为微卫星位点HE-8和HE-10，其中HE-8的核苷酸序列如下：

GGACGAGGTCACGTTGATGCGACCCACGATCTCTATGAGCTGAGGAAGCCTTCAGAGGTAGCATAAAAAAAAGGAACGAATGAATTTGATGTCTGAATACACTTACACTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGCGTCTCACAGCTGGTTGACCACCCAAAGCAAGCTTTCCCATCCGGTGGTCCCTTCATGCTCTAGTTGGTGGTCGTAGAGAAGGAGCAAGGCACTCAGCATCTCCCTGCTGCCGATG(SEQ ID NO:1)；

其中HE-10的核苷酸序列如下：

CGCCGGAAGATGTGTACAGATAAAGTTGATTTATATATATAT ATATATATATATATATATATATATATTTCTTTTTTCTCCTTCCTGGG TGAAAGCTGTG(SEQ ID NO:2)。

本发明再一个方面提供所述的分子标记的一种用途，是在筛选具有生长优势的线纹海马个体中的应用；

本发明还提供一种筛选线纹海马亲本的方法，所述的方法是检测上述分子标记的特异片段来筛选线纹海马亲本，其中微卫星位点HE-8的特异性片段的长度为272bp，HE-10的特异性片段的长度为96bp；

所述的方法，其一种方式是PCR扩增方法，其中检测HE-8的引物对，其序列信息如下：

正向引物F:GGACGAGGTCACGTTGATGCGA(SEQ ID NO:3)、反向引物R:CATCGGCAGCAGGGAGAT(SEQ ID NO:4)，

检测HE-10的引物对，其序列信息如下：

F:CGCCGGAAGATGTGTACAGAT(SEQ ID NO:5)、

R:CACAGCTTTCACCCAGGAA(SEQ ID NO:6)。

本发明通过对不同生长性状的线纹海马品种的扩增产物进行分析，获得了与线纹海马生长性状相连锁的微卫星标记，使用该微卫星标记可以筛选具有更好生长潜力的线纹海马个体，从而为线纹海马的遗传育种操作提供有效的分子标记。

附图说明

图1：线纹海马体长随生长日龄变化图，

图2：30日龄时正常生长组和非正常生长组特定生长率和肥满度图。

图3：基因组DNA电泳检测结果图；

图4：微卫星位点HE-8的ABI分形图；

图5：微卫星位点HE-10的ABI分形图。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明进行详细的描述。

实施例1：筛选获得在30℃条件下的正常生长群体和生长缓慢群体

在申请人前期工作中进行了线纹海马在30℃养殖条件下具有更高生长性能的个体的筛选，将筛选的个体作为亲本育苗，并将育种后的鱼苗再次在30℃进行培养，在培养4个月后根据生长性状分为正常生长群体和生长缓慢群体。具体的步骤如下：

1)2019年6月份在滨州海阔水产有限公司选择成熟的、生长速度较快的大规格个体线纹海马作为亲鱼，按照一定的雌雄亲鱼比例养殖于容积为300L的塑料水槽中。实验设雄雌数量比为1:2、2:3、1:1、3:2、2:1等5种配对方式，每种配对方式亲鱼的密度不一。1:2配对方式设1♀+2♂、4♀+8♂、8♀+16♂等3个实验组；2:3配对方式设2♀+3♂、6♀+9♂、10♀+15♂等3个实验组；1:1配对方式设2♀+2♂、6♀+6♂、10♀+10♂等3个实验组；3:2配对方式设3♀+2♂、9♀+6♂、15♀+10♂等3个实验组；2:1配对方式设2♀+1♂、8♀+4♂、12♀+6♂等3个实验组。

实验期间自然水温24.2±0.8℃。亲鱼饵料以经消毒的新鲜糠虾为主，配合少量的卤虫。每天上午10时、下午4时各投喂一次糠虾，以略微过量为度，投饵0.5h左右通过吸底清理残饵；实验周期30d。实验结果如下：

不同亲鱼密度、配对方式，线纹海马亲鱼群体数量不同对其产苗量的影响情况见表1。

表1：不同亲鱼密度、配对方式对产苗量的影响数据表

线纹海马雄鱼日均产苗量为1.7～2.8尾/d，由多到少顺序依次为2♀:3♂组、1♀:1♂组、3♀:2♂组、2♀：1♂组及1♀：2♂。5种配对方式中，各实验组中，亲鱼数量较少的其雄鱼日均产苗量均较少，亲鱼数量较多的雄鱼日均产卵量相对较多，但不同配对方式1:2和2:3两组随亲鱼数量增加反而降低日均产卵量。雄雌比为1:2、3:2及2：1的实验组，亲鱼数量少的实验组日均产苗量也相对较少。实验结果表明雄雌比例的比值小于1：2，或将影响亲鱼种群的生殖行为，日均产苗量相对较少。

2)2020年6月将繁育的1日龄海马幼鱼苗种放养于容积100L白色塑料水槽中，苗种砂滤自然海水微流水培育，实验期间水温为28±1℃，日换水量30％；每日吸污。其中1日龄海马开口摄食时，投喂桡足类哲水蚤作为生物饵料。10日龄海马(2厘米左右)投喂人工孵化的丰年虫、轮虫来代替哲水蚤。体长5厘米以下的仔海马，投喂小型浮游甲壳类。在养殖30d后，转入室内大体积养殖池进行育成养殖。

正常海马生长速率约1mm/d,30天后正常生长组体长约为40±5mm左右，低于35mm认为是生长缓慢组，40mm以上为正常生长组。小水体养殖的海马体长体重的数据统计如下：

30日龄时分别计算正常生长组和非正常生长组特定生长率和肥满度如图2所示。

结果表明正常生长海马和生长缓慢海马的日均增重量分别为(0.0284+0.0009)和(0.0109+0.0011)g/d，二者差异极显著(P<0.01)。正常生长海马和生长缓慢海马的特定生长率分别为4.63％+0.61％和3.73％士0.57％，二者差异显著(P<0.05)；正常生长海马和生长缓慢海马的肥满度分别为(0.31土0.04)和(0.270.03)/cm，二者差异显著(P<0.05)。

实施例2：筛选与线纹海马生长性状相关的微卫星标记

1、筛选能扩增出产物的微卫星位点

通过从NCBI中筛选海马属的微卫星位点，设计扩增微卫星位点用的引物对，将设计的引物对进行合成，正向引物的5′端标记荧光素。合成的引物对使用5个线纹海马的基因组DNA进行初步扩增产物筛选，有扩增产物的微卫星引物对的序列信息如表1所示。

表1：本实施例中使用的线纹海马微卫星的引物信息表

2、在正常生长组和非正常生长组线纹海马中进行多态性扩增

采用TIANGEN海洋动物基因组DNA提取试剂盒从正常生长组和非正常生长组的线纹海马鳍条组织中来提取总DNA，每组各20条鱼；具体步骤如下：

1)将待提取DNA的线纹海马的鱼鳍无菌剪下后，通过液氮研磨的方法先将组织磨碎成粉末，再放入装有200μL组织裂解液的离心管(1.5mL)中，涡旋振荡30秒。

2)向裂解液中加入20μL蛋白酶K(20mg/mL)，涡旋振荡15s以充分混匀。

3)将反应体系置于56℃的水浴锅中消化2-3h直至组织消化完全。

4)向裂解液体系中加入200μL的异丙醇，颠倒混匀后会出现絮状沉淀。

5)将吸附柱套入收集管中，然后把4)中的混合物移至吸附柱中，12 000rpm离心60s，倒掉收集管中的废液。

6)向吸附柱中加入600μL的漂洗液，12 000rpm离心30s，倒掉收集管中的废液。

7)空管离心后，吸附柱放回空的收集管中，12 000rpm离心2min，除去漂液，避免漂洗液中残留的乙醇抑制下游的反应。

8)将吸附柱放入一个干净的灭菌离心管中，在膜的中间滴加50μL预热的洗脱缓冲液，然后放置在室温下3-5min，12000rpm离心1min。

将5μL的DNA样品与5×的上样缓冲液(6×Lodingbuffer)混合在一起，用移液器吹打混匀，然后加样于核酸染料染色的1.5％的琼脂糖凝胶上，4V/cm的条件下电泳20min，在凝胶成像系统中观察并拍照，并用OD260/OD280的比值来判断DNA的纯度和质量。

对提取的DNA样品进行琼脂糖凝胶电泳检测，使用酶标仪检测DNA浓度，结果显示，条带清晰，提取质量较好，260/280值在1.8-2.0之间，满足后续试验要求(图3)。

3、正常生长组和非正常生长组DNA模板进行微卫星扩增

将正常生长组和非正常生长组DNA模板，按照每5个为一组，将基因组DNA按照等体积进行混合，作为PCR扩增的模板，即正常生长组和非非正常生长组分别四个DNA模板进行扩增。

PCR反应总体积为13μL，含有10ng基因组DNA，其它组分根据Taq酶的说明书要求进行添加。

PCR反应条件如下：94℃2min；94℃30s，50℃30s，72℃30s，30个循环；72℃延伸2min；4℃保存。

扩增产物用ABI3730XL DNA分析仪进行自动荧光检测，用Genemapper4.0软件生成每个位点的图谱文件，测出PCR扩增产物长度与荧光强度峰值，获得每个位点的基因型。Popgene32计算等位基因数(numbers of the alleles，Na)、有效等位基因数(numbers ofthe effective alleles，Ne)、期望杂合度(expected heterozygosity，He)、观测杂合度(observed heterozygosity，Ho)及Hard-weinberg平衡检验(P值)。

结果如表2显示，10个微卫星位点在正常生长组模板中共扩增出37个等位基因。而在非正常生长组中共检测到30个等位基因，从等位基因上来看，两个耐高温特性的线纹海马群体，由于经过了人工选育，其遗传多态性相还相对较高，并没有进入选择育种导致的遗传多样性降低，这也从另一个方面证明现在线纹海马的养殖没有进行有效的育种选育。

表2：两个具有耐高温特性的线纹海马群体遗传多样性分析

4、与生长相关的微卫星位点标记

对正常生长组、非正常生长组的线纹海马进行扩增，用Genemapper4.0软件生成每个样品的扩增图谱文件，获得每个检测个体的微卫星位点的基因型，并确定正常生长组特有的等位基因片段。

扩增结果表明微卫星位点HE-8和HE-10在正常生长组中扩增出特定的片段。其中微卫星位点HE-8，使用序列如下的引物对：

正向引物F:GGACGAGGTCACGTTGATGCGA(SEQ ID NO:3)、反向引物R:CATCGGCAGCAGGGAGAT(SEQ ID NO:4)，

在正常生长组中扩增出了特殊的272bp的条带，在正常生长组中存在268/272基因型(15/20)、272/272基因型(5/20)；而在非正常生长组中仅仅存在268/268基因型(图4)。

微卫星位点HE-8的核苷酸序列如下：

GGACGAGGTCACGTTGATGCGACCCACGATCTCTATGAGCTGAGGAAGCCTTCAGAGGTAGCATAAAAAAAAGGAACGAATGAATTTGATGTCTGAATACACTTACACTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTG TGTGTGTGCGTCTCACAGCTGGTTGACCACCCAAAGCAAGCTTTCCCATCCGGTGGTCCCTTCATGCTCTAGTTGGTGGTCGTAGAGAAGGAGCAAGGCACTCAGCATCTCCCTGCTGCCGATG(SEQ ID NO:1)。

其核心重复单位为(TG)n，即使用SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4的上下游引物进行扩增，在非正常生长组中只能扩增出重复次数为22次的片段，而在正常生长组中即能扩增出重复次数为22次的核酸片段，也能扩增出重复次数为24次的核酸片段。

微卫星位点HE-10在正常生长组中存在96/100基因型(13/20)、96/96基因型(6/20)和100/100基因型(1/20)；而在非正常生长组中仅仅存在100/100基因型基因型(图5)。

微卫星位点HE-10的核心重复单位为(AT)_n，其使用序列为

F:CGCCGGAAGATGTGTACAGAT(SEQ ID NO:5)、

R:CACAGCTTTCACCCAGGAA(SEQ ID NO:6)的引物对进行扩增，其扩增产物的核苷酸序列如下：

CGCCGGAAGATGTGTACAGATAAAGTTGATTTATATATATATATATATATATATATATATATATATATTTCTTTTTTCTCCTTCCTGGGTGAAAGCTGTG(SEQ ID NO:2)，

即使用SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6的上下游引物进行扩增，在非正常生长组中只能扩增出重复次数为18次的片段，而在正常生长组中即能扩增出重复次数为18次的核酸片段，也能扩增出重复次数为16次的核酸片段。

因此，通过上下游序列为SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6的引物对，序列为SEQ IDNO:5和SEQ ID NO:6的引物对可以通过待筛选个体是否存在特异条带来筛选在高温下生长快的亲本；其中特异性条带，微卫星位点HE-8是272bp的条带，而微卫星位点HE-10的是96bp的条带。

2022年5月在滨州海阔水产有限公司对100头线纹海马的子代个体进行检测，通过无损伤取样的方式获得每头线纹海马的基因组DNA，使用上下游序列为SEQ ID NO:5和SEQID NO:6的引物对，序列为SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6的引物对进行微卫星扩增检测；筛选具有272bp或96bp的条带。

从总共100头线纹海马中共筛选了15头具有特定片段的线纹海马，其中含有HE-8位点特异片段的个体共12头，含有HE-8位点特异片段的个体共6头，且同时具有197bp和254bp的片段的个体为3头。

将筛选出的个体与其它个体在相同的养殖条件下进行室内养殖，养殖三个月后进行生长性状测量，结果表明含有特定条带的个体具有显著的生长效果，表面本发明所提供的微卫星标记能够用于更好生长性状的线纹海马亲本的筛选。

Claims (10)

1.一种与线纹海马生长性状相连锁的分子标记，其特征在于，所述的分子标记的核苷酸序列为SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2。

2.权利要求1所述分子标记在筛选具有生长优势的线纹海马个体中的应用。

3.一种筛选线纹海马亲本的方法，其特征在于，所述的方法是检测权利要求1所述的分子标记的特异片段来筛选线纹海马亲本。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的方法是使用DNA分析仪进行自动荧光检测来进行特异片段的分型。

5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的特异片段，其中核苷酸序列为SEQ IDNO:1的分子标记的特异性片段的长度为272bp，核苷酸序列为SEQ ID NO:2的分子标记的特异性片段的长度为96bp。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的核苷酸序列为SEQ ID NO:1的分子标记，其扩增引物对的序列为SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4。

7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的核苷酸序列为SEQ ID NO:2的分子标记，其扩增引物对的序列为SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6。

8.一种引物对，其特征在于，所述的引物对用于检分核苷酸序列为SEQ ID NO:1或SEQID NO:2的分子标记。

9.如权利要求8所述的引物对，所述的用于检测核苷酸序列为SEQ ID NO:1的分子标记的引物对，其序列为SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4。

10.如权利要求8所述的引物对，所述的用于检测核苷酸序列为SEQ ID NO:2的分子标记的引物对，其序列为SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6。