CN116287377A - 一种与冬瓜果肉颜色基因紧密连锁的InDel分子标记及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于分子标记辅助育种技术领域，具体涉及一种与冬瓜果肉颜色基因紧密连锁的InDel分子标记及其应用。为开发与果肉性状紧密连锁的分子标记，本发明公开了一个与控制冬瓜果肉颜色基因紧密连锁的InDel分子标记，并根据该分子标记设计了一对特异引物，该引物能够产生绿色果肉材料的特异性标记和白色果肉材料的特异性标记(共显性标记)，重复性好，特异性强。将该InDel分子标记应用于鉴定冬瓜果肉颜色，可在苗期快速鉴定冬瓜果肉颜色表型，能够简便、快捷、高通量的应用于冬瓜的育种实践中。
Description
技术领域
本发明属于分子标记辅助育种技术领域，具体涉及一种与冬瓜果肉颜色基因紧密连锁的InDel分子标记及其应用。
背景技术
冬瓜(学名：Benincasa hispida(Thunb.)Cogn.)果肉颜色分为绿色和白色两种类型，其中绿色果肉富含叶绿素。叶绿素及其衍生物不仅具有抗氧化和抗突变作用，而且还可以预防DNA的氧化损伤。目前，市场上的冬瓜以白色果肉品种为主，而随着人们的消费需求向多元化发展，绿色果肉品种作为高端类型越来越受到市场的青睐。
果肉颜色作为冬瓜重要的果实性状，在成熟前很难区分。因此，开发与果肉性状紧密连锁的分子标记，能够在苗期进行分子标记辅助选育，进而实现苗期果肉颜色的高通量筛选，显著提高育种效率，加速育种进程。
发明内容
为了克服上述现有技术的不足，本发明提出了一种控制冬瓜果肉颜色基因的InDel分子标记，并根据该分子标记开发了特异引物，该分子标记引物能产生绿色果肉材料特异性标记和白色果肉材料特异性标记(共显性标记)，重复性好，特异性强。该分子标记用于冬瓜果肉颜色的鉴定，具有较高的稳定性，可以简便、快速地应用于冬瓜绿色果肉/白色果肉的分子标记辅助育种中。
为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：
本发明第一方面提供了与冬瓜果肉颜色基因紧密连锁的InDel分子标记在冬瓜果肉颜色选育中的应用，所述与冬瓜果肉颜色基因紧密连锁的InDel分子标记为在SEQ IDNO.3所示序列的基础上插入于SEQ ID NO.4所示序列中的23bp碱基，所述23bp碱基如SEQID NO.5所示。
本发明以高代自交系绿色果肉冬瓜PF3-2与白色果肉冬瓜PF3-1为亲本构建6世代(P1、P2、F1、F2、BCP1、BCP2)分离群体，经果肉颜色遗传规律的研究发现绿色果肉和白色果肉为一对基因控制的质量性状，绿色对白色为显性。随后，利用F2群体构建冬瓜高密度遗传图谱，将果肉颜色基因定位于第5号染色体C5-11.347和C5-13.551两个InDel分子标记之间，与两侧标记(C5-11.347和C5-13.551)间的遗传距离分别为4.93cM和1.21cM(如图1)。进而根据亲本序列差异在两标记间开发多态性分子标记，发现其中一个InDel分子标记C5-11.421与控制冬瓜绿色果肉和白色果肉的基因紧密连锁。然后利用所述InDel分子标记的特异引物分别以绿色果肉和白色果肉亲本DNA为模板进行PCR扩增，通过比较绿色果肉和白色果肉亲本的DNA序列，发现与绿色果肉亲本F3-2(如序列表SEQ ID NO.3所示)相比，白色果肉亲本中该段DNA序列中有一个23bp碱基的插入(如序列表SEQ ID NO.4所示，插入序列为TTTGCAACATACCGAAAACAGTT)。提示，上述开发的InDel分子标记有望用于冬瓜果肉颜色的鉴定中，可在苗期快速鉴定冬瓜果肉颜色表型。
本发明第二方面提供了扩增第一方面所述的与冬瓜果肉颜色基因紧密连锁的InDel分子标记的引物在冬瓜果肉颜色选育中的应用。
优选地，所述冬瓜果肉颜色包括绿色和白色。
优选地，所述引物包括如SEQ ID NO.1所示的上游引物FC-F和如SEQ ID NO.2所示的下游引物FC-R。
以上InDel分子标记引物带型清晰、重复性好，能够产生197bp的白肉亲本F3-1特异性标记FC197(SEQ ID NO.4)和174bp的绿肉亲本F3-2特异性标记FC174(SEQ ID NO.3)，而且由于该标记为共显性标记，同时具有亲本特异性条带的单株为杂合体，果肉颜色为绿色。因此，本发明中的控制冬瓜果肉颜色基因的InDel分子标记引物能用于冬瓜果肉颜色的鉴定。
本发明第三方面提供了一种冬瓜果肉颜色的分子标记辅助选育方法，利用第一方面所述的与冬瓜果肉颜色基因紧密连锁的InDel分子标记的引物对待测冬瓜的DNA进行PCR扩增，并对扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，若扩增产物中仅有174bp大小的片段，该冬瓜为绿色果肉冬瓜；若扩增产物中同时有174bp和197bp两个大小的片段，该冬瓜为绿色果肉冬瓜；若扩增产物中仅有197bp大小的片段，该冬瓜为白色果肉冬瓜。
本发明通过对电泳结果进行分析发现，当InDel分子标记引物仅产生197bp的白色果肉亲本特异性标记FC197时，该冬瓜为白色果肉；当InDel分子标记引物能同时产生197bp的白色果肉亲本特异性标记FC197和174bp的绿色果肉亲本特异性标记FC174时，该冬瓜为绿色果肉；当InDel分子标记引物仅产生174bp的绿色果肉亲本特异性标记FC174bp时，该冬瓜为绿色果肉，由此可利用本发明的InDel分子标记用于冬瓜果肉颜色的鉴定。
优选地，所述引物包括如SEQ ID NO.1所示的上游引物FC-F和如SEQ ID NO.2所示的下游引物FC-R。
优选地，PCR扩增时，PCR反应体系为20μL，包括1μL浓度为100ng·μL-1的DNA、10μLPCR mix、0.5μL浓度为10mmol·L-1的上游引物、0.5μL浓度为10mmol·L-1的下游引物、8μLddH2O。
优选地，PCR扩增时，PCR扩增时，扩增程序为：94℃预变性5min后，94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环后，72℃终延伸5min，4℃保存。
优选地，所述待测冬瓜的DNA的冬瓜新鲜叶片的基因组DNA。
优选地，聚丙烯酰胺凝胶电泳采用质量百分含量为8％的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明公开了一个与控制冬瓜果肉颜色基因紧密连锁的InDel分子标记，并根据该分子标记设计了一对特异引物，该引物能够产生绿色果肉材料的特异性标记和白色果肉材料的特异性标记(共显性标记)，重复性好，特异性强。将该InDel分子标记应用于鉴定冬瓜果肉颜色，可在苗期快速鉴定冬瓜果肉颜色表型，能够简便、快捷、高通量的应用于冬瓜的育种实践中。总体而言，本发明的优点表现在：(1)本发明中的InDel分子标记与冬瓜果肉颜色基因紧密连锁，且InDel分子标记的引物特异性强，具有较高的稳定性；(2)本发明的方法可在苗期快速鉴定冬瓜果肉颜色表型；(3)本发明方法有利于绿色果肉/白色果肉的分子标记辅助育种体系的建立，可简便、快捷、高通量的应用于冬瓜的育种实践中。
附图说明
图1为BhGf基因定位结果(A：BSA-Seq测序结果，B：在初定位区间进一步开发InDel分子标记用于精细定位)；
图2为与冬瓜果肉颜色基因紧密连锁的InDel分子标记分别在白色果肉亲本F3-1、绿色果肉亲本F3-2和杂种一代F1中的扩增结果；
图3为与冬瓜果肉颜色基因紧密连锁的InDel分子标记2020年秋季F2群体中的扩增结果(M代表Marker；F2白色果肉单株和F2绿色果肉单株分别代表在2020年秋季F2群体中随机挑选的34株白色果肉植株和26株绿色果肉植株；F3-1：白色果肉亲本，F3-2：绿色果肉亲本；F1：F3-1与F3-2间的杂种一代)；
图4为与冬瓜果肉颜色基因紧密连锁的InDel分子标记在2022年春季F2群体中的扩增结果(M代表Marker；F2白色果肉单株和F2绿色果肉单株分别代表在2022年春季F2群体中随机挑选43株白色果肉植株和37株绿色果肉植株)。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为可通过常规的商业途径购买得到。
实施例1与冬瓜果肉颜色基因紧密连锁的InDel分子标记的开发
在本项目组(广东省农业科学院蔬菜研究所瓜类研究一室)现保存的不同生态型种质资源中，通过综合鉴评，选择2份在株型、叶片大小、叶色、茎色等农艺性状相似，但果肉颜色差异显著的高代自交系F3-2(绿色果肉)和F3-1(白色果肉)为亲本，构建6世代分离群体，其中F2群体超过5000株。
在2020年秋季种植的F2群体(共134个单株)中，分别提取30个绿色果肉和30个白色果肉单株的DNA，混合构建绿色果肉池和白色果肉池，利用BSA-Seq方法将BhGF基因定位在5号染色体8.8M-19.7M的物理区间。进一步在该区间内开发多态性InDel分子标记，通过对分离群体进行基因分型和连锁分析，将BhGF基因定位到C5-11.347和C5-13.551之间(图1)。其中以InDel分子标记C5-11.421对白色果肉亲本F3-1和绿色果肉亲本F3-2进行扩增，发现该标记引物带型清晰、重复性好，特异引物的序列如下所示：
FC-F：5’-GTTGGTTCTGGAGGATTGTT-3’(SEQ ID NO.1)；
FC-R：5’-GCTACATAAGTCTCCACGAT-3’(SEQ ID NO.2)；
同时，以冬瓜基因组DNA为模板，使用上述InDel分子标记特异引物进行PCR扩增—琼脂糖胶回收测序，分析结果得知：该标记引物能够产生197bp的白色果肉亲本F3-1特异性标记FC197和174bp的绿色果肉亲本F3-2特异性标记FC174。
绿色果肉亲本F3-2特异性标记FC174的序列(SEQ ID NO.3)如下：
GTTGGTTCTGGAGGATTGTTGATTCCCCTACTTCCCTTGATGTGTTGTAGAAAATCT GCTCAGGACCAATTGCCTGCATGGAGTACATAAATTACAACGGGCCACAAACAGAAAGA ATAAGTTCCTTCCAATTAATCATCTATGACATGAACATGCTACATCCTCCTCCACCAT。
白色果肉亲本F3-1特异性标记FC197的序列(SEQ ID NO.4)如下：
GTTGGTTCTGGAGGATTGTTGATTCCCCTACTTCCCTTGATGTGTTGTAGAAAATCAGCTCAGGACCAATTGCCTGCATGGAGTACATAAATTAAAACGGGCCACAAACAGAAAGTATAAGTTTTTGCAACATACCGAAAACAG TTCCTTCCAATTAATCATCTATGACATGAACATGCTACATCCTCCTCAACCAT(横线部分代表在SEQ IDNO.3序列基础上插入的23bp碱基)。
实施例2与冬瓜果肉颜色基因紧密连锁的InDel分子标记在冬瓜果肉颜色鉴定中的应用
(1)F2分离群体的构建
以高代自交系绿色果肉冬瓜PF3-2与白色果肉冬瓜PF3-1为亲本构建6世代(P1、P2、F1、F2、BCP1、BCP2)分离群体，研究果肉颜色的遗传规律，结果显示绿色果肉和白色果肉为一对基因控制的质量性状，绿色对白色为显性。
(2)冬瓜DNA的提取
用CTAB法提取亲本及F2分离群体叶片的基因组总DNA：
1)取刚刚展开的一片真叶至1.5mL离心管中并加入液氮，研磨组织成粉末状，加入700μL CTAB裂解缓冲液，剧烈振荡30秒，65℃水浴60分钟，期间上下颠倒充分混匀。
2)向上述匀浆裂解液中加入700μL氯仿异戊醇(24:1，v/v)，上下颠倒充分混匀，12000r/min、4℃离心15分钟。
3)吸取上清液400μL至新的离心管中，加入等体积异丙醇，上下颠倒充分混匀，于-20℃静置30分钟，12000r/min、4℃离心10分钟。
4)弃上清，沿离心管壁加入200μL 75％乙醇，上下颠倒洗涤离心管管壁，12000r/min、4℃离心1分钟后弃去乙醇。
5)室温干燥沉淀30分钟，加入50μL ddH2O溶解，37℃水浴30分钟，核酸仪测定DNA浓度后用ddH2O稀释终浓度为100ng/μL，于-20℃备用。
(3)以冬瓜基因组DNA为模板，采用实施例1中设计出的InDel分子标记引物进行PCR扩增：
PCR扩增体系(20μL)如下表所示：
PCR扩增的程序为：94℃预变性5min后，94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸30min，30个循环后，72℃终延伸5min，置于4℃保存。
(4)对PCR扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)检测
取1μL扩增产物用8％(质量百分比)非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，180V稳压90min；将PAGE胶拆下，先用蒸馏水洗一遍，再用0.1％ AgNO3溶液染色10min；用蒸馏水洗2遍，再用包含2％NaOH、0.04％Na2CO3、0.4％甲醛的显色液显色10min，显色后用自来水洗两遍，然后在灯箱上拍照分析。
(5)扩增结果
该InDel引物在白色果肉亲本F3-1中扩增出197bp大小的条带，在绿色果肉亲本F3-2中扩增出174bp大小的条带，在F1中同时扩增出197bp和174bp的条带(见图2)。通过比较绿色果肉和白色果肉亲本的DNA序列，发现与绿色果肉亲本F3-2(如序列表SEQ ID NO.3所示)相比，白色果肉亲本(如序列表SEQ ID NO.4所示)中该段DNA序列中有一个23bp碱基的插入，回收特异条带，送北京擎科生物科技有限公司西安分公司测序，测得174bp、197bp条带的序列如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示，插入片段为：TTTGCAACATACCGAAAACAGTT(SEQ ID NO:5)，分别与实施例1中的F3-2和F3-1扩增产物的序列相符，说明该InDel分子标记为与冬瓜果肉颜色基因紧密连锁的InDel分子标记。
由上述结果可知，当InDel分子标记仅产生197bp的白色果肉亲本特异性标记FC197时，该冬瓜为白色果肉；当InDel分子标记能同时产生197bp的白色果肉亲本特异性标记FC197和174bp的绿色果肉亲本特异性标记FC174时，该冬瓜为绿色果肉；当InDel分子标记仅产生174bp的绿色果肉亲本特异性标记FC174bp时，该冬瓜为绿色果肉。
实施例3与冬瓜果肉颜色基因紧密连锁的InDel分子标记的应用
采用实施例2的方法分别对F3-1与F3-2在2020年秋季和2022年春季的F2分离群体单株进行验证。2020年秋季随机挑选34株白色果肉植株和26株绿色果肉植株(如图3)，2022年春季随机挑选43株白色果肉植株和37株绿色果肉植株(如图4)，对这些单株进行编号后，提取单株DNA进行检测，结果显示标记引物的检测结果与田间表型一致，准确率达到100％。
综合实施例1-3的实验结果可知，利用本发明的InDel分子标记，可在冬瓜苗期准确、快速的区分白色果肉颜色与绿色果肉颜色材料。
以上对本发明的实施方式作了详细说明，但本发明不限于所描述的实施方式。对于本领域的技术人员而言，在不脱离本发明原理和精神的情况下，对这些实施方式进行多种变化、修改、替换和变型，仍落入本发明的保护范围内。
Claims (10)
1.与冬瓜果肉颜色基因紧密连锁的InDel分子标记在冬瓜果肉颜色选育中的应用，其特征在于，所述与冬瓜果肉颜色基因紧密连锁的InDel分子标记为在SEQ ID NO.3所示序列的基础上插入于SEQ ID NO.4所示序列中的23bp碱基，所述23bp碱基如SEQ ID NO.5所示。
2.扩增权利要求1所述的与冬瓜果肉颜色基因紧密连锁的InDel分子标记的引物在冬瓜果肉颜色选育中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述冬瓜果肉颜色包括绿色和白色。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述引物包括如SEQ ID NO.1所示的上游引物FC-F和如SEQ ID NO.2所示的下游引物FC-R。
5.一种冬瓜果肉颜色的分子标记辅助选育方法，其特征在于，利用权利要求1所述的与冬瓜果肉颜色基因紧密连锁的InDel分子标记的引物对待测冬瓜的DNA进行PCR扩增，并对扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，若扩增产物中仅有174bp大小的片段，该冬瓜为绿色果肉冬瓜；若扩增产物中同时有174bp和197bp两个大小的片段，该冬瓜为绿色果肉冬瓜；若扩增产物中仅有197bp大小的片段，该冬瓜为白色果肉冬瓜。
6.根据权利要求5所述的一种冬瓜果肉颜色的分子标记辅助选育方法，其特征在于，所述引物包括如SEQ ID NO.1所示的上游引物FC-F和如SEQ ID NO.2所示的下游引物FC-R。
7.根据权利要求5所述的一种冬瓜果肉颜色的分子标记辅助选育方法，其特征在于，PCR扩增时，PCR反应体系为20μL，包括1μL浓度为100ng·μL-1的DNA、10μL PCR mix、0.5μL浓度为10mmol·L-1的上游引物、0.5μL浓度为10mmol·L-1的下游引物、8μL ddH2O。
8.根据权利要求5所述的一种冬瓜果肉颜色的分子标记辅助选育方法，其特征在于，PCR扩增时，PCR扩增时，扩增程序为：94℃预变性5min后，94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环后，72℃终延伸5min，4℃保存。
9.根据权利要求5所述的一种冬瓜果肉颜色的分子标记辅助选育方法，其特征在于，所述待测冬瓜的DNA的冬瓜新鲜叶片的基因组DNA。
10.根据权利要求5所述的一种冬瓜果肉颜色的分子标记辅助选育方法，其特征在于，聚丙烯酰胺凝胶电泳采用质量百分含量为8％的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。
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| CN114410818A (zh) * | 2022-01-18 | 2022-04-29 | 广东省农业科学院蔬菜研究所 | 一种与冬瓜果实大小紧密连锁的Indel分子标记引物及其应用 |
| CN114410824A (zh) * | 2022-01-28 | 2022-04-29 | 扬州大学 | 与黄瓜黄色果肉紧密连锁的一个SNP标记、检测SNP标记的dCAPS引物对及其应用 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| XIE DASEN等: "The wax gourd genomes offer insights into the genetic diversity and ancestral cucurbit karyotype", 《NATURE COMMUNICATIONS》, vol. 10, no. 1, 14 November 2019 (2019-11-14), pages 5158 * |
| 刘文睿等: "冬瓜果皮颜色基因的定位", 《园艺学报》, vol. 42, 26 December 2015 (2015-12-26), pages 2741 * |
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