CN113652498B - 一种鉴定白化茶树品种的茶树mnp分子标记组合、方法及应用 - Google Patents

一种鉴定白化茶树品种的茶树mnp分子标记组合、方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种鉴定白化茶树品种的茶树MNP分子标记组合，所述分子标记组合包含59对引物组合，所述59对引物的序列如Seq ID No：1‑118所示。本发明还公开了含有上述MNP分子标记组合的试剂盒以及利用上述茶树MNP分子标记组合鉴定白化茶树品种的方法。本发明首次在茶树中开发了一批MNP分子标记组合，并对品种鉴定能力进行了验证。结果表明，59对引物包含的222个SNP位点可实现对18份白化茶树资源的准确鉴别，且鉴定效率高、鉴定成本低，有利于维护育种者和茶农的权益，规范市场秩序，适于推广应用。

Description

一种鉴定白化茶树品种的茶树MNP分子标记组合、方法及应用
技术领域
本发明涉及茶树生物技术领域，特别是涉及一种鉴定白化茶树品种的茶树MNP分子标记组合、方法及应用。
背景技术
近年来，随着新培育的白化茶树品种不断增多，且个别品种的茶苗价格较高，一些商贩利用茶苗性状不易鉴定等特点，对一些茶树品种进行更名销售，导致市场上“同物异名”和“同名异物”的现象时有发生，这极大的破坏了市场秩序，因此，为了规范市场秩序，维护育种者和茶农的权益，迫切需要对茶树品种进行精准鉴别。
利用分子标记技术分析茶树种质资源的遗传多样性及亲缘关系，是阐明茶树的遗传基础及改良茶树种质资源的基础。尽管近年来，分子标记技术发展迅速，但是在茶树遗传多样性的研究中目前还主要依靠SSR分子标记技术，较少的研究逐渐应用基于覆盖全基因水平的SNP标记研究茶树的遗传多样性。
靶向测序基因型检测技术(genotyping by target sequencing,GBTS)是近几年新发展起来的一种SNP检测技术，同全基因组测序和全基因组重测序相比，该技术不需要对整个基因组进行测序；同随机简化基因组测序相比，该技术可对基因组上任意感兴趣的位点进行测序和基因型检测。因此该技术具有检测效率高、成本低、适应性广、应用灵活等特点。
常规的靶向测序基因型检测技术，仅在一个扩增子内扩增一个SNP位点；近年来，随着分子标记技术的快速发展，依托于GBTS，发展出了在一个扩增子内可同时扩增多个SNP位点的分子标记技术，即为MNP分子标记技术。该技术同SSR标记和SNP标记相比，具有更为丰富的基因型信息、更高的检出效率、更高的准确性等特点，其品种区分能力是SSR标记的数倍。该项检测技术已经在水稻、玉米、小麦、番茄等多个领域有应用，但目前未见任何关于茶树领域的应用报道，茶树领域基因组复杂度高且重复位点较多，因此，增大了MNP分子标记技术在这一领域的应用难度。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种茶树MNP分子标记组合，使其能用于鉴定白化茶树品种，鉴定成本低、鉴定效率高且精准度高。
为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
一种鉴定白化茶树品种的茶树MNP分子标记组合，所述分子标记组合包含59对引物组合，所述59对引物的序列如Seq ID No：1-118所示。
作为本发明进一步地改进，所述白化茶树品种为白叶1号、中黄3号、中黄1号、黄金芽、建德白茶、黄金叶、天台白茶、景白1号、白鸡冠、中黄2号、花月、黄金菊、BJG-F1-1、BJG-F1-2、中茶129、BY-3、BY-1、BY-2中的任一种。
基于上述开发的茶树MNP分子标记组合：
本发明还提供了一种鉴定白化茶树品种的试剂盒。
以及，本发明还提供了上述茶树MNP分子标记组合在鉴定白化茶树品种中的应用。
以及，本发明还提供了利用上述茶树MNP分子标记组合鉴定白化茶树品种的方法，包括如下步骤：(1)提取待鉴定品种DNA；(2)利用MNP分子标记组合形成的液相芯片对目标区段进行深度测序；(3)对深度测序区段进行基因型分析；(4)将该待鉴定品种的所有MNP位点的基因型数据与预先建立的白化茶树品种MNP数据库进行比对，从而确定该品种名称。
进一步地，所述预先建立的白化茶树品种MNP数据库中包括18种白化茶树品种，分别为白叶1号、中黄3号、中黄1号、黄金芽、建德白茶、黄金叶、天台白茶、景白1号、白鸡冠、中黄2号、花月、黄金菊、BJG-F1-1、BJG-F1-2、中茶129、BY-3、BY-1、BY-2。。
通过采用上述技术方案，本发明至少具有以下优点：
(1)本发明选取国家种质杭州茶树圃内的18份茶树资源作为初始的实验材料，并基于18份白化茶树资源的重测序数据，首次在茶树中开发了一批MNP分子标记组合，并对品种鉴定能力进行了验证。结果表明，59对引物包含的222个SNP位点可实现对18份白化茶树资源的准确鉴别。
(2)利用本发明的茶树MNP分子标记组合进行白化茶树品种鉴定时，采用基于测序的液相芯片GBTS技术，和其它技术相比，具有检测平台的广适性、标记的灵活性、检测的高效性和信息的可加性等特点，应用前景广阔。
(3)本发明分别开发了260个标记位点、390个标记位点和650个标记位点的3套MNP标记，并通过亲缘关系对比分析，表明利用3套MNP标记分析18份茶树资源的亲缘关系具有一定的可靠性，且利用较少的MNP标记位点——260个MNP标记即能满足18份茶树的品种鉴别需求。
(4)本发明在260个MNP标记的基础上，通过设计多重PCR引物，利用GBTS技术对18份茶树资源进行靶向深度测序，通过对变异位点的分析，结果在260个MNP标记位点中，最后保留了59个MNP标记；并且对这18份茶树进行了亲缘关系分析，其亲缘关系分析结果与基于260个MNP位点和基于覆盖全基因组的SNP位点的聚类结果相一致，表明利用较少的MNP标记位点——59个MNP标记即能实现对18份白化茶树的品种区分。
(5)面对茶树基因组的复杂性，本发明通过大量实验、对比分析验证，最终获得了数量较少、成本较低的MNP分子标记组合，且该分子标记组合可实现18份白化茶树品种的精准、高效鉴定，有利于维护育种者和茶农的权益，规范市场秩序，适于推广应用。
附图说明
上述仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，以下结合附图与具体实施方式对本发明作进一步的详细说明。
图1是SNP和InDel变异分析图；其中，A.SNP变异位点统计；B.InDel变异位点统计；C.CDS区SNP位点功能注释结果统计；D.InDel区SNP位点功能注释结果统计；
图2是MNP标记在染色体上的分布图，其中，A.260个位点；B.390个位点；C.650个位点；
图3是基于MNP标记和重测序数据的18份茶树资源的进化关系分析图，其中，A.260个位点；B.390个位点；C.650个位点；D.覆盖全基因组的SNP位点；
图4是基于59个MNP标记的18份茶树资源的遗传多样性分析(进化树分析)图；
图5是18份茶树的品种间距离分析；注：品种间距离表示样本间差异MNP位点数占总MNP位点数的比例。
具体实施方式
1材料与方法
1.1实验材料
以保存于国家种质杭州茶树圃内的‘白叶1号’、‘中黄3号’、‘中黄1号’、‘黄金芽’、‘建德白茶’、‘黄金叶’、‘天台白茶’、‘景白1号’、‘白鸡冠’、‘中黄2号’、‘花月’和‘黄金菊’、‘BJG-F1-1’、‘BJG-F1-2’、‘中茶129’、‘BY-3’、‘BY-1’、‘BY-2’等18份茶树资源作为试验材料，于2020年春季采摘初展的一芽二叶新梢与液氮中固定后，保存于-80℃，用于后续的实验。
1.2MNP分子标记开发全基因组重测序建库流程
1)18份白化茶树资源，其一芽二叶新梢利用液氮研磨法迅速研磨成粉末，称取0.1g粉末至2ml离心管中，利用天根植物基因组提取试剂盒按照说明书提取基因组DNA样品。
2)利用紫外分光光度计(NanoDrop oneC)测定基因组DNA的OD260/280值，该值需要满足≥1.8；并利用Qubit检测基因组DNA的浓度，基因组DNA的浓度需要达到文库构建的量。
3)利用Covaris System超声波打断仪将基因组DNA片段化，DNA的片段长度在250bp左右。
4)利用iontorrent的全基因组文库构建试剂盒构建高通量测序文库。
5)利用iontorrent S5高通量测序仪进行全基因组的重测序。
1.3全基因组重测序数据处理
测序完成后，首先对原始数据进行质控，包括去除接头和低质量的reads；随后，将获得的clean reads利用BWA mem软件比对到舒茶早(http://tpia.teaplant.org/download.html)参考基因组上，筛选比对到参考基因组上唯一位置的reads用于后续的变异检测；利用GATK软件进行SNP和indel的筛选，SNP和indel位点的最低测序深度至少需要5×。
1.4MNP分子标记开发流程
1)用于MNP分子标记开发的SNP位点的测序深度不低于5×；
2)单个SNP位点在样本间的检出率大于80％，SNP杂合率小于10％，，缺失比例(NA)小于20％，最小等位基因突变频率(MAF)大于0.01；
3)满足上述条件的SNP位点可进行SNP位点的合并，且多个SNP位点构成的MNP区段长度小于150bp；
4)可用MNP位点需满足：SNP数在2-10之间，PIC＞0.5，每个MNP区段至少有一个SNP位点的MAF＞0.35；
5)筛选的MNP位点服从均匀分布的原则，并且优先选择CDS区的，MAF、PIC值高的位点。
符合上述条件的位点作为最终的一个MNP分子标记集合。
1.5MNP分子标记引物设计
利用在线设计网页https://ampliseq.com根据开发的MNP分子标记位点设计多重PCR引物，引物的3’末端不能有低复杂序列的存在。
1.6验证MNP分子标记位点的多态性
利用18份白化茶树资源，利用天根植物基因组提取试剂盒提取基因组DNA，利用NanoDrop oneC和Qubit仪器检测DNA的质量和浓度，利用扩增子测序文库构建试剂盒和多重PCR引物构建高通量测序文库，最后利用Ion torrent S5进行高通量测序。
将测序数据比对到龙井43参考基因组上，并以每对引物在参考基因组上的位置为一个窗口，分析各窗口内测序片段的基因型，进而比较不同资源的差异。
2结果与分析
2.1全基因重测序数据统计及质控
本次测序共构建18个基因组测序文库，根据每个基因组测序文库下机数据的高质量reads数目、碱基错误率等数据统计结果，同时结合数据质控分析，显示除了reads的前几个碱基存在正常的不平衡现象外，碱基质量分布基本无AT、GC分离现象。表明本次全基因组重测序测序质量良好。18份茶树资源，在测序深度5×情况下，共获得554.75G的数据量；clean reads数量在163,009,946–245,996,848之间；Q30比例在76.01-87.73％之间。
2.2比对到参考基因组数据统计
18份茶树资源分别与参考基因组进行比较，比对率在63.95-98.64％之间；同时各样本的平均覆盖深度在4.98×-8.79×之间；且在18份样本中，1×覆盖深度的clean reads为66.86％以上，5×覆盖深度的clean reads为43.42％以上，10×覆盖深度的clean reads为17.76％。表明测序片段覆盖到参考基因组上的区域较多，可检测的变异位点数目也较多，同时也表明了测序的随机性较好，可用于后续的实验需求。
2.3SNP变异检测
通过将测序数据比较到参考基因组上，18份资源共检测到155,585,639个SNP位点，其中发生转换的SNP有113,490,437个，发生颠换的SNP有42,095,202个，两者之间的比率为2.70(图1A)。并且这些SNP变异位点主要分布于基因间区、内含子区域、基因上游2Kbp、基因下游2Kbp、剪接位点以及同时位于两个基因重叠的上游和下游2Kbp内，其中以分布在基因间区的SNP位点数最多，有134,143,997个。位于剪接位点区域的SNP数最少，有9,889个。由于CDS区是基因的编码区，决定基因的是否转录，并翻译为蛋白质，最终影响生物个体间的差异。因此对位于CDS区的变异位点做进一步分析，发现发生非同义变异的SNP位点有663,135个，发生同义突变的SNP位点有450,015个，导致蛋白提前终止的SNP位点有23,394个，引起终止密码子变异的SNP位点数有2,055个(图1C)。
2.4InDel变异检测
通过将测序数据比较到参考基因组上，18份资源共检测到12,037,356个Indel标记，其中缺失片段的InDel标记有6,332,335个，发生插入片段的InDel标记有5,705,021个(图1B)。且发生在CDS编码区的InDel变异有41,151个，包括移码缺失InDel标记15,859个，移码插入InDel标记9,672个，引起编码蛋白提前终止的InDel标记有769个，引起终止密码子变异的InDel标记有164个(图1D)。
2.5茶树MNP标记的开发
本发明首次在茶树中开发MNP分子标记，目的是实现对18份白化茶树资源的精准鉴别。参考其它物种利用MNP标记鉴别不同品种所需的标记数量以及该物种的参考基因组大小。我们初步按照MNP标记在染色体上的均匀分布原则，在众多的SNP位点中进行分析、筛选、组合；分别开发了260个标记位点、390个标记位点和650个标记位点的3套MNP标记(图2A,B,C)。随后，进一步利用3套MNP标记位点对18份白化茶树资源进行了亲缘关系分析，结果表明3套标记反映出18份白化茶树资源的亲缘关系基本一致(图3A，B，C)，并与基于覆盖全基因组水平的SNP聚类结果相一致(图3D)，其中‘花月’和‘黄金菊’均聚为一簇、‘建德白茶’和‘黄金叶’均聚为一簇、‘白鸡冠’、‘BJG-F1-1’和‘BJG-F1-2’均聚为一簇，且‘BJG-F1-1’和‘BJG-F1-2’作为‘白鸡冠’的子代，三者间的遗传背景明确，表明了分别利用3套MNP标记分析18份茶树资源的亲缘关系具有一定的可靠性，且利用最少的MNP标记位点——260个MNP标记即能满足18份茶树的品种鉴别需求。
基于260个MNP标记，设计多重PCR引物，随后利用GBTS技术对18份茶树资源进行靶向深度测序，通过对变异位点的分析，结果显示260个MNP标记位点中，193个MNP标记位点没有检测到，5个MNP标记位点存在非特异性扩增，最后保留了59个MNP标记，如下表1。
表1 MNP引物序列
2.6基于59个MNP标记的不同茶树资源遗传多样性分析
59个MNP标记的PIC值主要分布在0.4-0.8之间，表明这些标记位点具有较高的多态性。此外，59个MNP标记包括220个SNP位点，这些SNP位点主要分布在基因间区、其次分布在外显子和内含子区域，而分布在CDS区的SNP位点数较少。为了评估59个MNP标记是否能够满足18份茶树的品种鉴别需要，我们对这18份茶树进行了亲缘关系分析，从进化树(图4)可看出，其中的‘花月’和‘黄金菊’聚为一簇、‘建德白茶’和‘黄金叶’聚为一簇、‘白鸡冠’、‘BJG-F1-1’和‘BJG-F1-2’聚为一簇，这一结果与基于260个MNP位点和基于覆盖全基因组的SNP位点的聚类结果相一致，表明59个MNP标记即能实现对18份白化茶树的品种区分。
2.7MNP分子标记的品种鉴别能力分析
品种间距离表示每对品种间的差异MNP标记的比例，品种间距离的大小可反映MNP标记的区分能力。为了明确59个MNP标记对18份茶树资源的鉴别能力，我们将18份茶树资源中的59个MNP标记位点进行了两两比对分析(图5)，结果表明，‘白鸡冠’与‘BJG-F1-1’和‘BJG-F1-2’之间的品种间距离较小，均为0.36，均存在21个MNP标记的差异；其它品种间的距离分布在0.5-0.87之间，特别是‘黄金菊’和‘景白1号’间存在51个MNP标记位点的差异。结合利用59个MNP标记对18份茶树亲缘关系分析结果，说明MNP标记具有较强的品种鉴别能力。
2.8基于59个MNP标记的白化茶树品种鉴定方法
(1)提取待鉴定白化茶树品种的基因组DNA；
(2)利用MNP分子标记组合形成的液相芯片对目标区段进行深度测序，具体为：
利用前期已经过验证的59个MNP标记组成的引物混合液，对待鉴定白化茶树品种DNA进行PCR扩增，从而富集目标区段序列；
在扩增后混合液中添加测序接头、index序列，并进行第二轮PCR扩增，从而获得测序文库；
利用Ion torrent S5对测序文库进行高通量测序，获得全部59个MNP位点的500X以上的测序数据；
(3)对深度测序区段进行基因型分析；
(4)将测序获得的该待鉴定品种的所有MNP位点的基因型数据与预先构建的18个品种基因型数据库进行比对，当该品种59个MNP位点基因型与数据库中任意一品种完全吻合时，即可判定此待鉴定品种为该白化品种，并给出品种名。
综上所述，本发明选取国家种质杭州茶树圃内的18份茶树资源作为初始的实验材料，并基于18份白化茶树资源的重测序数据，首次在茶树中开发了一批MNP分子标记，并对品种鉴定能力进行了验证。结果表明，59对引物包含的222个SNP位点可实现对18份白化茶树资源的准确鉴别，且鉴定效率高、鉴定成本低，有利于维护育种者和茶农的权益，规范市场秩序，适于推广应用。
另外，在本发明中同时应用了覆盖全基因组的SNP标记以及首次在茶树中应用的MNP标记分析了18份茶树种质资源的遗传多样性。结果表明两种标记反映的遗传多样性结果相似，均是‘建德白茶’和‘黄金叶’聚为一类、‘白鸡冠’、‘BJG-F1-1’和‘BJG-F1-2’聚为一类、‘花月’和‘黄金菊’聚为一类，在两种标记反映的亲缘关系中，其它资源在聚类关系上存在一些差异。同时该结果与王松琳等(王松琳、马春雷、黄丹娟、马建强、金基强、姚明哲、陈亮.基于SSR标记的白化和黄化茶树品种遗传多样性分析及指纹图谱构建.茶叶科学.2018,38(1):58-68)利用SSR标记分析16份白化茶树资源的遗传多样性结果较为一致。从这一聚类关系来看，具有相似表型性状、具有同一遗传背景、产地相近的资源间具有相似的聚类趋势。这一结果也表明了利用MNP标记分析茶树亲缘关系的可靠性。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，本领域技术人员利用上述揭示的技术内容做出些许简单修改、等同变化或修饰，均落在本发明的保护范围内。
序列表
<110> 中国农业科学院茶叶研究所
<120> 一种鉴定白化茶树品种的茶树MNP分子标记组合、方法及应用
<160> 118
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
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<211> 25
<212> DNA
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<212> DNA
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<211> 25
<212> DNA
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
aagtgacaat tcaatcaccc caatc 25
<210> 10
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
agagtcatac aaaccagctg tagtt 25
<210> 11
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
aatcacgtgt cccatggcc 19
<210> 12
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
gaaaccgtct tgggcgttt 19
<210> 13
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
aatcattggg agtttccaga gagaa 25
<210> 14
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
tgtggtagag ttcagccatg aatat 25
<210> 15
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
aatttgccag acaatttgga ctctc 25
<210> 16
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
aaatcttgag gaggaatagc caagt 25
<210> 17
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
actaaagtga tattttggtg aaattgtt 28
<210> 18
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
ccaagtgcac ctatttgttt tagt 24
<210> 19
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
agacacataa atcaattgaa tcgccc 26
<210> 20
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
tgccccttct tttacatttc cctt 24
<210> 21
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
aggagaagtt ttccttgaga ggtta 25
<210> 22
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
cacaagcaga tgtactaagc acttc 25
<210> 23
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
atctgtctca ggttggcctc tattc 25
<210> 24
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
tatgttcaag gaataactcg accgc 25
<210> 25
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
atcttgcagg tttgatttcc attca 25
<210> 26
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
atctggaaac ttcagagaca tgtga 25
<210> 27
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
atgttgacgg gaaggatcag c 21
<210> 28
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
ccaaatcgtg gcccttgacc 20
<210> 29
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
attttctatt gtgttgggtt accgg 25
<210> 30
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
gtatctcagt ttccaaaagc catcc 25
<210> 31
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
caagtacagc ggtaaatgct ctc 23
<210> 32
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
ttggtaccaa gaggatacca agtg 24
<210> 33
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
cagtcttttt caggaacacc caaag 25
<210> 34
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
caggttccat tcagataaca agctg 25
<210> 35
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
cattttacaa gtacccttct tgcgt 25
<210> 36
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
ttatatgacc taaacataca tcacaagat 29
<210> 37
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
ccactttgtg ctcaattctg tagtt 25
<210> 38
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
tcaagcaact tatacacctt gggta 25
<210> 39
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
ccagttgtga ggtattgatt tgcat 25
<210> 40
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
ccagctatga gtgaagagaa agtct 25
<210> 41
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 41
cctgcatcta tagggaactt ggg 23
<210> 42
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 42
gattgaacca gtgagattgt tcgtt 25
<210> 43
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 43
ccttaggtct tgaactttaa tgcca 25
<210> 44
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 44
cccacatctt tgtcttcatt acagg 25
<210> 45
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 45
cctttcttca ctcctctcta ctctg 25
<210> 46
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 46
attcgtttta cttatctttg cgcga 25
<210> 47
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 47
cgatctgggt acatggatga cttat 25
<210> 48
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 48
ctactgccag ctcatcatct tcttc 25
<210> 49
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 49
cggatgaaat tttcgtaaaa tggcc 25
<210> 50
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 50
cagaacctgg ccaaataaca gaaat 25
<210> 51
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 51
ctcagtaaaa gcaaaggacc gaac 24
<210> 52
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 52
tctttgtttg agccctgtct tattt 25
<210> 53
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 53
ctgtacccca aagagaatga gagag 25
<210> 54
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 54
ctcagtgaaa ctggccatcg aa 22
<210> 55
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 55
gaaacctcga agtcgacaat ttctt 25
<210> 56
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 56
gaaatgctcg gatcttctca gagtt 25
<210> 57
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 57
gaagagttcc ttctccggtt gg 22
<210> 58
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 58
aaagagaagc caatcgagga tcatt 25
<210> 59
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 59
gaagatgatg gggaaattgg gaaaa 25
<210> 60
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 60
tgtgattgat tcttggctaa atcgg 25
<210> 61
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 61
gaagtcatgc tgagtcaaga agaag 25
<210> 62
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 62
ccactgattc atgtcccaat atctt 25
<210> 63
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 63
gagagattcg atggaggagc agatg 25
<210> 64
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 64
attggacaca gatctacgca atcta 25
<210> 65
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 65
gagtggaaac tatggtggtt ggaag 25
<210> 66
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 66
cgagagagct aacctagtac ttcac 25
<210> 67
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 67
gagttcatcc aagcttatct gatgc 25
<210> 68
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 68
caaatacagg ggttgagcca c 21
<210> 69
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 69
gatggattgg caaagggctc atc 23
<210> 70
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 70
cgattttctt ggcatctcag ttgat 25
<210> 71
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 71
gcattgaccc cagatgatat cac 23
<210> 72
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 72
gagttcggtg gtttatttga aagga 25
<210> 73
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 73
gctaggaaga ttctggaaag agtca 25
<210> 74
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 74
cattctcatg gttatctgtg ccatc 25
<210> 75
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 75
gctcaacaca caacaattct tagga 25
<210> 76
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 76
taaagcacag ctggcttaat tcctc 25
<210> 77
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 77
ggaattgggt tttatggcct aacat 25
<210> 78
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 78
taaaggatac catttccagg gacag 25
<210> 79
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 79
ggagggtgat tatgcaacat ttat 24
<210> 80
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 80
aggagctcta acatatctgt gcc 23
<210> 81
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 81
gggatcctca ggtattccaa ttagt 25
<210> 82
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 82
ccacataaac accagggttt agaaa 25
<210> 83
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 83
ggtctattcc tcacaaaaac tgcaa 25
<210> 84
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 84
gacgaagatt ggctgaatta gacac 25
<210> 85
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 85
gtcaatagac caaaagatga aggga 25
<210> 86
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 86
caaatatgct tagtggtcca atccc 25
<210> 87
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 87
gtctctatct attcgttgca ctcca 25
<210> 88
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 88
aaaaggtttg agtactttga gccag 25
<210> 89
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 89
taagggaagt gcagtttgga atttc 25
<210> 90
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 90
tatgaagaat tgggtttggt ttggg 25
<210> 91
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 91
tacatgagcc ccatttcaac ctc 23
<210> 92
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 92
ttatgacatt cgtagatctt tccga 25
<210> 93
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 93
tacttgccag aagttatgca gact 24
<210> 94
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 94
agaattgtta aagtacgaac gtctat 26
<210> 95
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 95
taggggaatg gatgaacaag gagta 25
<210> 96
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 96
cggacaagac gcatacttac ttaac 25
<210> 97
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 97
tatgtccatc ttcgctatgg taagc 25
<210> 98
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 98
taacaacgga tccaacaaag aggta 25
<210> 99
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 99
tcaaagttca caaataataa ttcaaatgga 30
<210> 100
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 100
accatgtttg atgagaggtg tctaa 25
<210> 101
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 101
tctgatcaaa aaccacccca gatat 25
<210> 102
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 102
caaagaaact ggcagatctc actg 24
<210> 103
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 103
tgatccttgt gttattcctc tctct 25
<210> 104
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 104
aggtttggct tttattgggc taaaa 25
<210> 105
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 105
tgctttagtt atagatgagt tgacga 26
<210> 106
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 106
agttcttggt tctcaatctt cctct 25
<210> 107
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 107
tggaaatagt accaggcaac agaag 25
<210> 108
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 108
gaattgttgg ggattggaca atgat 25
<210> 109
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 109
tgtagtccct catgtgctca aag 23
<210> 110
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 110
tatatttacc cacagatcac ttggc 25
<210> 111
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 111
ttaaaatcga ccacattaaa gccgg 25
<210> 112
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 112
accaaaacat tgaaaaatac ccggt 25
<210> 113
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 113
ttcgcagttg ttacaaaacc tgtag 25
<210> 114
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 114
gcaccagtaa agggattggc a 21
<210> 115
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 115
tttgccacgg gtagatctta gttaa 25
<210> 116
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 116
aggtgtattt atgttaggtg tgtct 25
<210> 117
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 117
tttttgaata atccctttct cggcc 25
<210> 118
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 118
acaagagaat gtctgttttg agagc 25

Claims (5)

1.一种鉴定白化茶树品种的茶树MNP引物组合，其特征在于，包含59对引物组合，所述59对引物组合的序列如SEQ ID No.1-118所示。
2.根据权利要求1所述的鉴定白化茶树品种的茶树MNP引物组合，其特征在于，所述白化茶树品种为白叶1号、中黄3号、中黄1号、黄金芽、建德白茶、黄金叶、天台白茶、景白1号、白鸡冠、中黄2号、花月、黄金菊、BJG-F1-1、BJG-F1-2、中茶129、BY-3、BY-1、BY-2中的任一种。
3.一种鉴定白化茶树品种的试剂盒，其特征在于，包含权利要求1或2所述的鉴定白化茶树品种的茶树MNP引物组合。
4.一种权利要求1或2所述的茶树MNP引物组合在鉴定白化茶树品种中的应用，其特征在于，所述白化茶树品种为白叶1号、中黄3号、中黄1号、黄金芽、建德白茶、黄金叶、天台白茶、景白1号、白鸡冠、中黄2号、花月、黄金菊、BJG-F1-1、BJG-F1-2、中茶129、BY-3、BY-1、BY-2。
5.一种利用茶树MNP引物组合鉴定白化茶树品种的方法，其特征在于，采用权利要求1或2所述的茶树MNP引物组合来鉴定白化茶树品种,包括如下步骤：(1)提取待鉴定品种DNA；(2)利用MNP引物组合形成的液相芯片对目标区段进行深度测序；(3)对深度测序区段进行基因型分析；(4)将该待鉴定品种的所有MNP位点的基因型数据与预先建立的白化茶树品种MNP数据库进行比对，从而确定该品种名称；
所述预先建立的白化茶树品种MNP数据库中包括18种白化茶树品种，分别为白叶1号、中黄3号、中黄1号、黄金芽、建德白茶、黄金叶、天台白茶、景白1号、白鸡冠、中黄2号、花月、黄金菊、BJG-F1-1、BJG-F1-2、中茶129、BY-3、BY-1、BY-2。
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