CN103952485A - Runx1基因断裂及拷贝数增加检测试剂盒及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属RUNX1基因断裂及拷贝数增加检测技术领域，据该基因断裂特点，设计检测该基因断裂探针，提供一种RUNX1基因断裂及拷贝数增加检测试剂盒及其制备方法，挑选RP11-177L11BAC、RP11-77I17BAC克隆分别标记绿色、红色作探针序列，序列纯化、沉淀、溶解后与待测细胞FISH杂交，荧光显微观察细胞信号；正常体细胞为两黄色信号，一基因发生断裂，出现1红1绿和1黄色信号，拷贝数增加则出现相应数量的黄色信号。建立准确检测基因断裂方法，克服现有基因断裂检测手段缺陷，快速、准确检出以及识别RUNX1基因断裂及拷贝数增加事件，结合后续RACE检测，确定与RUNX1基因融合的伙伴基因。
Description
技术领域
本发明属于RUNX1基因断裂及拷贝数增加的检测方法技术领域，具体涉及一种RUNX1基因断裂及拷贝数增加检测试剂盒及其制备方法。
背景技术
RUNX1基因断裂或拷贝数增加可见于多种疾病中，RUNX1基因又称为AML1基因。研究发现，15%-40％的部分分化型急性髓系白血病(acute myeloid leukemia，AML)（AML-M2）具有RUNX1基因断裂，并与不同的伙伴基因发生融合形成新的融合基因。融合基因的形成可使瘤基因的位置发生移动和被激活，是肿瘤发生的原因之一。目前检测基因断裂的方法主要有G/R显带核型分析和以mRNA为主体的RT-PCR检测技术。G/R显带核型分析技术无法检测到染色体微小变异和基因的重复；RT-PCR技术灵敏度较好，是目前融合基因检测的主要方法，但由于融合基因断裂位点的多样性以及“伙伴”基因的复杂性，使得常规RT-PCR方法无法检测到新的未知基因的断裂融合。FISH技术也是检测基因断裂融合的常用方法，但是目前的FISH所用的探针依赖于融合基因已知的情况，比如目前所用的检测RUNX1基因断裂的商业探针是AML1/ETO双融合探针，只适用于RUNX1和ETO基因断裂融合的检测，不适合做RUNX1基因断裂的筛选。
鉴于融合基因的多样性和复杂性以及现有检测手段的不足，经分析比较了大量已报道的融合基因断裂位点，发现：虽然RUNX1基因可以与不同的“伙伴”基因及相同“伙伴”基因的不同断裂位点形成许多种不同的融合基因，但是它们自身的断裂位点却是相对恒定的。RUNX1基因断裂点恒定地发生在第5、6内含子，本发明将这一发现作为基础进行基因断裂融合事件的检测，本方法不依赖于RUNX1的伙伴基因已知的情况，可以对所有RUNX1基因断裂及拷贝数增加事件进行准确检测。
发明内容
本发明为了克服上述已有技术的不足，根据RUNX1断裂的特点，设计检测RUNX1基因断裂的探针，提供了一种RUNX1基因断裂及拷贝数增加检测试剂盒及其制备方法，能够快速、有效的检测基因断裂融合，该探针同时可检测RUNX1基因拷贝数的增加。
本发明是采用如下技术方案实现的：一种RUNX1基因断裂及拷贝数增加检测试剂盒，由下列成分组成：试剂I、纯化试剂Ⅱ、沉淀试剂Ⅲ、杂交缓冲试剂Ⅳ，试剂盒中各试剂用量见表1，所列试剂的量为10个探针用量：
表1
其中：试剂Ⅰ的组分及各成分浓度、用量见表2，
表2
试剂Ⅱ的组分及各成分浓度、用量见表3，
表3
试剂Ⅲ的组分及各成分浓度、用量见表4，
表4
试剂Ⅳ的组分及各成分浓度、用量见表5，
表5
所述试剂盒的制备方法包括以下步骤：
（1）从人类BAC克隆库中挑选RP11-177L11、RP11-77I17作为探针序列，RP11-177L11包括了人类RUNX1基因的5’端第一外显子及上游区序列，全长162kb，36287039-36449995，本发明仅提供探针序列RP11-177L11的末端序列，如SEQ ID NO.1所示；RP11-77I17包括了人类RUNX1基因的3’端第八外显子和下游的CLIC6基因序列，全长160kb，35948319-36108831，本发明仅提供探针序列RP11-77I17的末端序列，如SEQ ID NO.2所示；
（2）采用缺口平移法标记RP11-77I17为红色，标记RP11-177L11为绿色，标记探针所用具体组分以及各组分浓度、用量见表6；
表6
（3）用试剂Ⅱ将标记的探针序列纯化：按试剂Ⅱ的比例加入标记红色和绿色的探针序列各200μl及试剂Ⅱ的组成成分，混匀，-80℃静置1小时或-20℃静置过夜,然后4℃、12000rpm/min离心30min，弃上清；加入预冷的70%乙醇200μl，4℃，12000rpm/min离心10min，弃上清，45℃干燥，各加入100μl去离子水溶解，棕色管中保存；
（4）用试剂Ⅲ将纯化的探针序列沉淀，进一步纯化：取标记了红色、绿色的探针各10μl，分别加入试剂Ⅲ中各组分的1/10，-80℃沉淀1h以上或过夜；取出沉淀的探针，4℃、12000rpm/min离心30min，弃上清，加入预冷的70%乙醇300μl，然后4℃、12000rpm/min离心15min，弃上清，45℃干燥5min，沉淀为半透明即可，这是一个探针的用量，剩余的探针继续在-80℃保存，用前沉淀；
（5）使用前用试剂Ⅳ溶解探针：FISH操作前，将干燥的沉淀探针按照试剂Ⅳ的比例加入杂交缓冲液，1个探针用1/10试剂Ⅳ溶解，振荡溶解，离心数秒混匀，将沉淀完全溶解。
使用该试剂盒对RUNX1基因断裂及拷贝数增加的检测方法，包括以下步骤：
（1）用溶解的探针与待测细胞滴片进行FISH杂交：用杂交溶液溶解的探针加入载玻片上的杂交区，盖上盖片，橡胶泥封片，置于杂交仪上，72℃处理5min，37℃处理16h；取出载玻片，镊子去掉橡胶泥，2×SSC中洗掉盖片；洗片：72℃、2×SSC处理2min；室温、0.4×SSC处理2min；室温100%乙醇处理2min，暗处自然干燥；DAPI复染：加5μl的DAPI，盖上免洗盖片，暗处放置10min～20min后，复染后的玻片于-20℃湿盒中保存；（2）在荧光显微镜下观察细胞中红色和绿色信号及融合信号并分析结果。
本发明所述试剂盒检测对象是以AML1基因为代表的自身断裂位点恒定于某一区域，但可以和不同基因发生融合的这类基因的断裂融合（如与RARα相关的染色体易位RARα基因断裂点恒定地发生在第2内含子，与MLL相关的染色体易位MLL基因断裂点恒定地发生在第5-9内含子之间）。
本发明所述试剂盒探针的设计原理：分析比较了大量已报道的融合基因断裂位点，发现：虽然RUNX1可以与不同的“伙伴”基因及相同“伙伴”基因的不同断裂位点形成许多种不同的融合基因，但是RUNX1基因断裂点恒定地发生在第5、6内含子，根据RUNX1基因的这一断裂特点，设计两个探针，将探针设计在该基因的第一外显子及其上游和第八外显子及其下游。从人类BAC克隆库中查阅相应的基因序列片段，挑选RP11-177L11，该克隆包括了人类RUNX1基因的5’端包括第一外显子及上游区序列；RP11-77I17，该克隆包括了人类RUNX1基因的3’端包括第八外显子和下游的CLIC6基因序列。将RP11-177L11中RUNX1基因的5’端包括第一外显子及上游区序列标记为绿色，将RP11-77I17中RUNX1基因的3’端包括第八外显子和下游的CLIC6基因序列标记为红色。检测显示：正常体细胞荧光显微镜下为两个红绿融合（黄色）信号，若一个RUNX1基因发生断裂，则出现1红1绿两个分离信号和1个红绿融合（黄色）信号。若细胞中出现3个或3个以上融合信号，表明细胞中具有3个以上拷贝的RUNX1基因；拷贝数增加则出现相应数量的融合信号。
本发明根据RUNX1基因断裂的特点设计断裂点分离的探针，建立了一种准确的检测基因断裂的方法，克服了现有基因断裂事件检测手段的缺陷，可以较准确快速地检出RUNX1基因断裂事件，通过本方法有望寻找到新的断裂位点及“伙伴”基因，新的断裂位点的发现有助于阐明基因断裂融合发生的分子机制，新的“伙伴”基因的发现有助于解释白血病发生的异质性，并筛选出新的白血病发生相关基因。该探针还可以鉴定RUNX基因拷贝数增多。使用本发明所述试剂盒，可以快速、准确识别RUNX1基因断裂及拷贝数增加事件，结合后续RACE检测，确定与RUNX1基因融合的伙伴基因。
附图说明
图1为检测RUNX1基因发生断裂的探针位置示意图；图2为正常细胞以及部分患者RUNX1探针检测结果图；图3为PCR扩增RP11-77I17和RP11-177L11后用1.5%琼脂糖凝胶电泳结果图；图4 BAC质粒末端以及PCR扩增产物测序图。
图中：A：表示正常细胞，显示两个黄色融合信号；B：表示RUNX1-ETO阳性细胞FISH结果，显示1红1绿两个分离信号和1个黄色融合信号；C～E：表示具有3～4个拷贝的RUNX1基因的细胞；r-红色信号；g-绿色信号；y-黄色信号；M-DL1000 DNA Marker；1- RP11-77I17质粒经PCR扩增后电泳结果；2- RP11-177L11质粒经PCR扩增后电泳结果。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步描述，但本发明不局限于实施例的内容。
一种RUNX1基因断裂及拷贝数增加检测试剂盒，由下列成分组成：试剂I、纯化试剂Ⅱ、沉淀试剂Ⅲ、杂交缓冲液试剂Ⅳ，试剂盒中各试剂用量见表1，所列试剂的量为10个探针用量：
表1
其中：试剂Ⅰ的组分及各成分浓度、用量见表2，
表2
试剂Ⅱ的组分及各成分浓度、用量见表3，
表3
试剂Ⅲ的组分及各成分浓度、用量见表4，
表4
试剂Ⅳ的组分及各成分浓度、用量见表5，
表5
探针纯化及标记由下列试剂组成：试剂Ⅰ为用Spectrum Red标记的RP11-77I17和用Spectrum Green标记的RP11-177L11的BAC克隆、试剂Ⅱ为纯化试剂、试剂Ⅲ为沉淀试剂、试剂Ⅳ为杂交缓冲液。
所述试剂盒的制备方法包括以下步骤：
（1）BAC克隆序列鉴定：如图1所示，设计RUNX1基因的5’端包括第一外显子及上游区序列及RUNX1基因的3’端包括第八外显子和下游的CLIC6基因序列为探针区域，不包括易断裂的第5,6内含子区：从人类BAC克隆库中查阅相应的基因序列片段，挑选RP11-177L11、RP11-77I17作为探针序列，RP11-177L11包括了人类RUNX1基因的5’端第一外显子及上游区序列，全长162kb，36287039-36449995，本发明仅提供探针序列RP11-177L11的末端序列，如SEQ ID NO.1所示；RP11-77I17包括了人类RUNX1基因的3’端第八外显子和下游的CLIC6基因序列，全长160kb，35948319-36108831，本发明仅提供探针序列RP11-77I17的末端序列，如SEQ ID NO.2所示；
a.引物设计：
RP11-77I17包括了RUNX1基因第8外显子及其下游序列，以及CLIC6基因全长，因此在CLIC6基因上设计引物如下：CLIC6 F:5'GGTAAAGGGGTCCGAAGAAG 3'；CLIC6 R:5'GAAGAGGGTGATGTCGTGCT 3'。
RP11-177L11包括了RUNX1基因第1外显子及其上游序列，因此在RUNX1基因第一外显子上设计引物如下：RUNX1 F:5'GAACCACAAGTTGGGTAGCCTG 3'；RUNX1 R:5'ATGCTGTCTGAAGCCATCGC 3'。
b.分别用BAC克隆RP11-77I17和RP11-177L11作为模板，进行PCR扩增：50μl的PCR体系中加入表7中所述试剂：
表7
PCR条件：95℃5min，95℃30s，56℃退火30s，72℃延伸45s，35个循环，最后72℃延伸10min，扩增产物直接测序。
c.PCR扩增后用1.5%琼脂糖凝胶电泳，结果见图3。图3中M表示TaKaRa公司的DL1000 DNA Marker，1表示用CLIC6F及R引物扩增77I17质粒结果，片段约为500bp；2表示用RUNX1F及R引物扩增177L11质粒的结果，片段约为340bp。
d.扩增产物测序：PCR产物送测序，BAC质粒RP11-77I17为模板扩增，测序结果与CLIC6 mRNA序列匹配。BAC质粒RP11-177L11为模板扩增，测序结果与RUNX1序列匹配，说明BAC克隆位置正确。测序结果中部分序列见图4，结果显示：RP11-77I17质粒序列与CLIC6 mRNA序列一致；RP11-177L11质粒与AML1序列一致。通过对BAC克隆以及本发明所设计探针比对的鉴定结果表明，所购买的BAC克隆包括了本发明所设计的探针序列，完全能达到本探针所要检测的RUNX1基因断裂的目的。
（2）采用缺口平移法标记RP11-77I17为红色，标记RP11-177L11为绿色，标记所用具体组分以及各组分浓度、用量见表6；
表6
（3）用试剂Ⅱ将标记的探针序列纯化：按试剂Ⅱ的比例加入标记红色和绿色的探针序列各200μl及试剂Ⅱ的组成成分，混匀，-80℃静置1小时或-20℃静置过夜,然后4℃、12000rpm/min离心30min，弃上清；加入预冷的70%乙醇200μl，4℃，12000rpm/min离心10min，弃上清，45℃干燥，加入100μl去离子水溶解，棕色管中保存；
（4）用试剂Ⅲ将纯化的探针序列沉淀，进一步纯化：取标记了红色、绿色的探针各10μl,分别加入试剂Ⅲ中各组分的1/10，-80℃沉淀1h以上或过夜；取出沉淀的探针，4℃、12000rpm/min离心30min，弃上清，加入预冷的70%乙醇300μl，然后4℃、12000rpm/min离心15min，弃上清，45℃干燥5min，沉淀为半透明即可，这里是一个探针的用量，剩余探针-80℃保存备用；
（5）使用前用试剂Ⅳ溶解探针：FISH操作前，将干燥的沉淀探针按照试剂Ⅳ的比例加入杂交缓冲液，每个探针加入1/10试剂Ⅳ，振荡溶解，离心数秒混匀，沉淀完全溶解即可用于FISH操作。
使用该试剂盒对RUNX1基因断裂及拷贝数增加的检测方法，包括以下步骤：
（1）用杂交Buffer溶解的探针与待测细胞进行FISH杂交：将患者的骨髓细胞常规培养24小时，在收获前1小时加入秋水仙碱，收集细胞，通过低渗、固定、滴片，在玻片上进行原位杂交；在载玻片上将杂交Buffer溶解的探针加入杂交区，盖上18mm×18mm盖片，注意避免气泡产生，橡胶泥封片，置于杂交仪上，72℃处理5min，37℃处理16h；取出载玻片，镊子去掉橡胶泥，2×SSC中洗掉盖片；洗片：72℃、2×SSC处理2min；室温、0.4×SSC处理2min；室温100%乙醇处理2min，暗处自然干燥；DAPI复染：加5μl的DAPI，盖上免洗盖片，暗处放置10min～20min后，复染后的玻片于-20℃湿盒中保存；（2）在荧光显微镜下观察复染后的玻片中红色和绿色融合信号并分析结果。
结果分析
对BAC克隆扩增、标记、纯化后，进行FISH检测，荧光显微镜下观察，经过大量样本的观察分析，发现正常细胞中有两个红绿融合（黄色）信号，如图2中的A，若发生一个拷贝的RUNX1基因断裂，则细胞中出现一红一绿两个分离信号和一个正常的红绿融合（黄色）信号，若细胞中出现3个或3个以上融合信号，表明细胞中具有3个以上拷贝的RUNX1基因；拷贝数增加则出现相应数量的融合信号。若出现一红一绿两个分离信号，则接下来采用RACE（Rapid amplification of cDNA ends）方法结合克隆测序进行新的融合基因断裂位点的鉴定，寻找到新的“伙伴”基因。利用本试剂盒筛选部分RUNX1基因断裂，且AML1/ETO融合基因阳性的个体。这些个体之前用RT-PCR方法检测RUNX1/ETO融合基因阴性，经过RT-PCR法重新验证，证明该融合基因是阳性的。说明试剂盒检测RUNX1断裂是非常特异的。
用RUNX1断裂探针共检测了140例骨髓细胞，有9例个体细胞中出现3个或3个以上的融合信号，细胞遗传学证实这9例个体细胞内为21号染色体增加了1条或2条以上(RUNX1基因位于21号染色体上)。检测结果如图2所示，部分细胞显示有3～4个融合信号，表明细胞中具有3～4个拷贝的RUNX1基因。图2中的B为RUNX1-ETO阳性细胞用RUNX1断裂探针检测结果，显示患者骨髓细胞中有一红一绿两个分离信号和一个红绿融合（黄色）信号，表明细胞内发生了一个拷贝的RUNX1基因断裂，RT-PCR证实该细胞融合基因AML1-ETO阳性。
本发明所述试剂盒探针的设计原理：分析比较了大量已报道的融合基因断裂位点，发现：虽然RUNX1可以与不同的“伙伴”基因及相同“伙伴”基因的不同断裂位点形成许多种不同的融合基因，但是RUNX1基因断裂点恒定地发生在第5、6内含子，根据RUNX1基因的这一断裂特点，设计两个探针，将探针设计在该基因的第一外显子及其上游和第八外显子及其下游。从人类BAC克隆库中查阅相应的基因序列片段，挑选RP11-177L11，该克隆包括了人类RUNX1基因的5’端包括第一外显子及上游区序列；RP11-77I17，该克隆包括了人类RUNX1基因的3’端包括第八外显子和下游的CLIC6基因序列。将RP11-177L11中RUNX1基因的5’端包括第一外显子及上游区序列标记为绿色，将RP11-77I17中RUNX1基因的3’端包括第八外显子和下游的CLIC6基因序列标记为红色。检测显示：正常体细胞荧光显微镜下为两个红绿融合（黄色）信号，若一个RUNX1基因发生断裂，则出现1红1绿两个分离信号和1个红绿融合（黄色）信号。
探针标记原理：此标记反应体系的主要成分有DNaseI，大肠杆菌DNA聚合酶I，3种三磷酸脱氧核糖核苷酸如dATP、dTTP、dGTP，用光谱红-dCTP或光谱绿-dCTP标记的核苷酸，待标记的BAC克隆。在极微量DNA聚合酶的作用下，在双链DNA分子的一条链上随机切开若干个缺口而不是切断DNA或将其降解，然后，大肠杆菌DNA聚合酶I在切口的3’-OH端逐个加入新的核苷酸，同时由于该酶具有5，-3’外切酶的活性，它同时切除5’端游离的核苷酸，3’端核苷酸的加入和5’端核苷酸的切除同时进行导致切口沿着DNA链移动。新链核苷酸的合成是以另一互补链为模板，按碱基互补的原则合成，所以新旧链的核苷酸序列完全相同。由于反应体系中含有用光谱红或光谱绿标记的单核苷酸，使新合成的链带有核素标记，所以缺口平移实际上是标记的核苷酸取代了原DNA链中不带标记的同种核苷酸。DNaseI是在两条链的不同部位随机打开缺口，从而使两条链都被核素均匀地标记。
探针纯化的原理：由于鲑精DNA含有大量高度重复顺序，探针纯化时加入鲑精DNA可减少探针与目的基因的非特异性杂交，使得背景更干净。
探针沉淀的原理：人Cot-1DNA与基因组DNA不同的是富含高度和中度DNA重复序列，不含有单一序列，能够与标记探针中的重复序列产生竞争性杂交，起到封闭作用，从而避免探针中重复序列与基因组DNA非特异性结合，而且探针与靶序列更容易结合，结果更为可靠，减少了杂交背景信号。
本发明所述RUNX1基因断裂及拷贝数增加检测试剂盒的检测原理：试剂盒主要是利用了FISH原理，杂交所用的探针为RUNX1基因特异性序列探针，由RUNX1基因5’端和3’端序列组成，模板来源于BAC克隆中含有目的片段的RP11-77I17\RP11-177L11两个克隆。通过缺口平移法将Spectrum-Red-dCTP 或Spectrum-Green-dCTP掺入。
将患者的骨髓细胞常规培养24小时，通过低渗、固定、滴片，在玻片上进行原位杂交。将玻片和探针72℃变性5分钟后，探针和染色体会变性为单链，37℃杂交16小时，此时，按照碱基互补的原则，探针与待检细胞中的RUNX1基因单链核酸进行特异性结合，形成可被检测的杂交双链核酸。由于DNA分子在染色体上是沿着染色体纵轴呈线性排列，因而探针可直接与染色体进行杂交从而将RUNX1基因在染色体上定位(分裂期细胞中可见)、观察是否具有断裂信号、拷贝数是否增加等。
本发明所述试剂盒检测对象是以RUNX1基因为代表的自身断裂位点恒定于某一区域，但可以和不同基因发生融合的这类基因的断裂融合（如与RARα相关的染色体易位RARα基因断裂点恒定地发生在第2内含子，与MLL相关的染色体易位MLL基因断裂点恒定地发生在第5-9内含子之间）。
序列表
<110> 山西医科大学
<120> RUNX1基因断裂及拷贝数增加检测试剂盒及其制备方法
<160>2
<170> PaUentIn Version 3.5
<210> 1
<211> 612
<212> DNA
<213> 人工序列
<223>根据探针位置要求得到的BAC克隆RP11-177L11的末端序列
<400> 1
1 tgcactatag aaggatccgc ggaattcagc attgggaagc ctgtgtggct gcacttcaca
61 gccccattct gcaacttggc cttgagctgg catttggatc tgcatgtgtc ccacttcttt
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601 aagggagtgc ac
<210> 2
<211> 564
<212> DNA
<213>人工序列
<223>根据探针位置要求得到的BAC克隆RP11-77I17的末端序列
<400> 2
1 cggaattctc caaaactgct gtgccctata atatggtgac tggaggggaa gaaatgcagg
61 aaagcttgtg gaaaattttt attcataccc aacagctcaa caatgtagtt taccttagat
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481 ttttcccttt actttaaatc agtctttgat tgtcttgtgt gcacacagga agaatgatga
541 atattaaaaa taaaacgcat atca
Claims (2)
1.一种RUNX1基因断裂及拷贝数增加检测试剂盒，其特征在于：由下列成分组成：试剂I、纯化试剂Ⅱ、沉淀试剂Ⅲ、杂交缓冲试剂Ⅳ，试剂盒中各试剂用量见表1，所列试剂的量为10个探针用量：
表1
其中：试剂Ⅰ的组分及各成分浓度、用量见表2，
表2
试剂Ⅱ的组分及各成分浓度、用量见表3，
表3
试剂Ⅲ的组分及各成分浓度、用量见表4，
表4
试剂Ⅳ的组分及各成分浓度、用量见表5，
表5
。
2.根据权利要求1所述的一种RUNX1基因断裂及拷贝数增加检测试剂盒，其特征在于：制备方法包括以下步骤：（1）从人类BAC克隆库中挑选RP11-177L11、RP11-77I17作为探针序列，RP11-177L11包括了人类RUNX1基因的5’端第一外显子及上游区序列，全长162kb；RP11-77I17包括了人类RUNX1基因的3’端第八外显子和下游的CLIC6基因序列，全长160kb；
（2）采用缺口平移法标记RP11-77I17为红色，标记RP11-177L11为绿色，标记探针所用具体组分以及各组分浓度、用量见表6；
表6
（3）用试剂Ⅱ将标记的探针序列纯化：按试剂Ⅱ的比例加入标记红色和绿色的探针序列各200μl及试剂Ⅱ的组成成分，混匀，-80℃静置1小时或-20℃静置过夜,然后4℃、12000rpm/min离心30min，弃上清；加入预冷的70%乙醇200μl，4℃，12000rpm/min离心10min，弃上清，45℃干燥，加入100μl去离子水，棕色管中保存；
（4）用试剂Ⅲ将纯化的探针序列沉淀，进一步纯化：取试剂Ⅱ纯化了的红色、绿色的探针各10μl，分别加入试剂Ⅲ中各组分的1/10，-80℃沉淀1h以上或过夜；取出沉淀的探针，4℃、12000rpm/min离心30min，弃上清，加入预冷的70%乙醇300μl，然后4℃、12000rpm/min离心15min，弃上清，45℃干燥5min，沉淀为半透明即可；
（5）使用前用试剂Ⅳ溶解探针：FISH操作前，将干燥的沉淀探针按照试剂Ⅳ的比例加入杂交缓冲液，一个探针用1/10的试剂Ⅳ溶解，振荡溶解，离心数秒混匀，沉淀完全溶解后备用。
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