CN103627787A - 一种用于检测t(8;21)AML中目的基因拷贝数改变的探针试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用于检测t(8;21)AML中目的基因拷贝数改变的探针试剂盒,该探针试剂盒包括即用型杂交液,该即用型杂交液的组分及浓度为:AML1基因探针、ETO基因探针、WT1基因探针、P27基因探针和C-kit基因探针的浓度均为4ng/μl。本发明试剂盒的组合探针信号强度高,稳定性强,可以在单细胞水平同时检测定性定量检测5个目的基因的改变情况。
Description
技术领域
本发明涉及一种检测试剂盒,特别涉及一种应用高分辨定量多色荧光原位杂交,检测t(8;21)AML中目的基因拷贝数改变的探针试剂盒,尤其是用于检测亚克隆间的进化关系及在化疗药物的作用下优势克隆的演变及亚克隆的消长。本发明提供的组合探针信号强度高,稳定性强,在Chroma公司的DAPI(SP-100),Spectrum GreenTM(MF101),Cy3TMv1(SP-102),Texas Red(SP-107)和Zeiss公司的Cy5(50),PF-415(45)六种滤光片通道下无信号交叉,可以在单细胞水平同时定性定量检测5个目的基因的改变情况。可以用于检测目的基因拷贝数的改变、肿瘤异质性及亚克隆演变,检测肿瘤细胞基因组的不稳定性和复杂程度。为临床制定特异性的靶向治疗方案具有重要的指导意义。
背景技术
急性髓系白血病是一种克隆性异质性疾病,它的发生是一个多步骤的发病过程,累积多个基因,涉及多种遗传学异常。正常造血干祖细胞在致癌物质的作用下获得选择性的增殖优势,转化为前癌细胞。前癌细胞基因组不稳定,在增殖过程中不断获得遗传学损伤形成不同的变异体。在生存空间有限、营养物质缺乏、缺氧及最重要的在免疫杀伤的作用下,并非所有的亚克隆均能存活,直至出现的变异体能够突破上述进化屏障,这一变异体即为白血病起始细胞。白血病起始细胞克隆性增殖最终导致临床发病。虽然白血病细胞群全都来自白血病起始细胞,但是从生物学发病到临床发病的过程中,白血病起始细胞克隆性增殖的同时不断累积新的遗传学损伤形成一个异质性群体,亚克隆间的生长速度、侵袭能力及对药物的敏感性不同。其中比例最高的亚群称为优势亚克隆,优势亚克隆的生物学特性和白血病的临床表现相关。同一肿瘤患者体内可以存在有很多不同亚克隆细胞群,同一类肿瘤可以有不同的亚型,同一亚型的患者预后不同。单就急性白血病而言,其异质性存在的证据表现为:细胞形态学和免疫表型的多样性,细胞遗传学和分子生物学的异常。正是由于异质性的存在,使得肿瘤在治疗过程中逐渐表现出耐药、复发和侵袭力改变等行为。因此,在临床上研究肿瘤的异质性及亚克隆分群对肿瘤的靶向治疗具有重要意义。
目前,常用的检测异质性的方法具有两大类:一类是临床上治疗相关的检测指标:染色体核型分析、免疫表型、分子生物学检测等;另一类是近几年新近崛起的测序技术。但是目前应用的临床指标,在检测肿瘤细胞异质性上分辨率太低。以染色体核型分析为例:虽然可检测单细胞水平上多种基因组异常并列存在的情况,但分辨率太低(大约10Mb),只能检测大片段的缺失、扩增、异位等,而且染色体核型分析只能检测处于有丝分裂中期的细胞,计数的细胞少,只能反映增殖活跃细胞的遗传学改变;而测序技术虽然分辨率非常高,能获得海量的基因组异常信息也能观察到优势突变的演变,但是也只能从整体水平上反应异质性的存在及演变,不能分析多种基因异常在同一细胞水平同时存在的情况。
本发明检测t(8;21)AML中目的基因拷贝数改变的探针试剂盒,应用高分辨定量多色荧光原位杂交,克服了以上两种方法的不足,兼顾了以上两者的优势,不仅分辨率较高,可以检测到隐匿性的基因异位、缺失和基因扩增,而且可在单细胞水平同时检测多个基因的异变。从而直观的分析肿瘤的异质性,亚克隆间的进化关系及优势克隆的演变。
发明内容
本发明检测t(8;21)AML中目的基因拷贝数改变的探针试剂盒,可用于高分辨定量多色荧光原位杂交,检测单细胞水平上多种基因异常并列出现的情况,从而将个体细胞进行不同的亚克隆分群,本方法适用于大规模的临床研究并对靶向治疗具有重要的指导意义。
本发明的一个目的是提供一种AML1基因探针,ETO基因探针,WT1基因探针,P27基因探针、C-kit基因探针的制备方法。
本发明的另一目的是提供一种包括AML1基因探针,ETO基因探针,WT1基因探针,P27基因探针和C-kit基因探针的即用型杂交液。
本发明的另一目的是提供一种包括上述即用型杂交液的试剂盒。
本发明采用的技术方案是:
一种单个基因探针的制备方法,包括如下步骤:
1)、探针制作:在常用的数据库如NCBI Clone Registry、Ensembl Genome Browser和UCSCGenome Bioinformatics上定位检索含检测目的基因的BAC(Bacterial artificial chromosomes)克隆,获得目的基因的克隆后,大量提取质粒DNA,再采用缺口平移的方法将荧光素染料标记的dUTP或dCTP连接到酶切好的DNA上,沉淀DNA,用含有50%去离子甲酰胺的杂交缓冲液溶解探针;
2)、探针验证:采用正常人二倍体成纤维细胞的细胞爬片进行探针验证。
一种包括AML1基因探针,ETO基因探针,WT1基因探针,P27基因探针和C-kit基因探针的即用型杂交液的制备方法,包括如下步骤:
2)、探针制作:在常用的数据库如NCBI Clone Registry、Ensembl Genome Browser和UCSCGenome Bioinformatics上定位检索分别含检测AML1、ETO、WT1、P27、C-kit基因的BAC(Bacterial artificial chromosomes)克隆,获得目的基因的克隆后,大量提取质粒DNA,再采用缺口平移的方法将荧光素染料标记的dUTP或dCTP连接到酶切好的DNA上,对标记好的目的DNA进行组合沉淀,用含有50%去离子甲酰胺的杂交缓冲液溶解沉淀,制得即用型杂交液;
2)、探针验证:采用正常人二倍体成纤维细胞的细胞爬片进行探针验证。
作为一个优选方案:含AML1基因最优的克隆,编号为:RP11-77G18,RP11-697C13或RP11-177L11中的一种或两种或三种;
作为一个优选方案:含ETO基因最优的克隆,编号为:RP11-118O8或RP11-122C21中的一种或两种;
作为一个优选方案:含WT1基因最优的克隆,编号为:RP11-258G7或RP11-955L20中的一种或两种;
作为一个优选方案:含p27基因最优的克隆,编号为:RP11-380E18,RP11-70N14或RP11-377D9中的一种、两种或三种;
作为一个优选方案:含c-kit基因最优的克隆,编号为:RP11-103A16或RP11-178P22中的一种或两种;
上述最优克隆均来源于UCSC Genome Bioinformatics数据库。
具体地,所述的步骤1)为在常用的数据库如NCBI Clone Registry、Ensembl GenomeBrowser和UCSC Genome Bioinformatics上定位检索分别含检测AML1、ETO、WT1、P27、C-kit基因的BAC(Bacterial artificial chromosomes)克隆,获得目的基因的克隆后,大量提取质粒DNA,再采用缺口平移的方法将荧光素染料标记的dUTP或dCTP连接到酶切好的DNA上,用100%的乙醇将连接好的DNA在-20℃进行组合沉淀过夜,次日离心14000rpm,4℃,20分钟,用枪尖小心吸弃上清,加入70%乙醇(4℃),混匀,离心14000rpm,4℃,15分钟,用枪尖小心吸弃上清,室温避光干燥沉淀10分钟,用含有50%去离子甲酰胺的杂交缓冲液溶解沉淀,制得即用型杂交液。
本发明还提供了一种检测t(8;21)AML中目的基因拷贝数改变的探针试剂盒,包括上述即用型杂交液。
优选地,所述即用型杂交液的组分及浓度为:AML1基因探针、ETO基因探针、WT1基因探针、P27基因探针和C-kit基因探针的浓度均为4ng/μl。
进一步,该检测试剂盒还包括:12*12mm盖玻片,18*18mm盖玻片,载玻片,DAPI复染剂和液体橡胶。
具体地,该试剂盒的应用方法,包括如下步骤:
1)杂交:将要检测的标本处理好后,加入试剂盒中的即用型杂交液,加上盖玻片,用液体橡胶封片,放入杂交仪,78-81℃变性5分钟37℃杂交过夜;
2)洗片,荧光显微镜检:标本杂交过夜后,去除盖玻片,放入核酸杂交的缓冲液(SalineSodium Phosphate EDTA,SSPE)中洗涤两次,梯度乙醇中脱水后晾干,用DAPI复染,在荧光显微镜下观察检测结果;
3)图像采集与分析:采用Zeiss公司多色荧光显微镜Axio Imager Z2型,六种滤光片采用Chroma公司分别为:DAPI(SP-100),Spectrum GreenTM(MF101),Cy3TMv1(SP-102),Texas Red(SP-107)和Zeiss公司Cy5(50),PF-415(45)组合,首先在DAPI滤光片下选择视野,定位,然后用高分辨率CCD(Charge-Coupled Device,电荷耦合原件)相机在63倍油镜下分别在六种滤光片通路中采集荧光信息,用图象处理软件Z-Stack采集模块在每个拍摄的细胞核上进行立体扫描5-10层,采用焦深延长模块将多层扫描的荧光杂交信号压缩在一张图像上,从而获得清晰的多色图像;
4)cut-off值建立:将试剂盒中的即用型杂交液与相应的正常细胞杂交,应用步骤3)采集图像信息,计数5种基因在正常细胞中表现出的异常信号的种类及其比例,以其比例的“M+2SD”为cut-off值,这种异常是由于信号重叠,弯曲折叠等造成的系统误差;
5)肿瘤细胞群中亚克隆的检测:将试剂盒中的即用型杂交液与病人的肿瘤细胞标本杂交,应用步骤3)采集图像信息,在AML1-ETO融合信号阳性的细胞中进行信息采集,内容包括:①计数每个细胞内的融合信号、非融合信号的个数;②计算每种信号在肿瘤细胞群(至少200个AML1-ETO融合信号阳性的细胞)中出现的比例,并将此比例减掉相对应的cut-off值:若结果>0则表示信号数目改变为阳性结果,若结果≤0则表示信号数目改变为假阳性;③将所有信号都为阳性且阳性信号表型相同的细胞归为一个阳性亚克隆,计算其比例;④建立克隆衍变进化图,根据阳性亚克隆间遗传学上的相关性,推演亚克隆间的进化关系,列入克隆衍变进化图中的亚克隆的比例均≥1%。
本发明所具有的有益效果:
本发明试剂盒的组合探针信号强度高,稳定性强,在Chroma公司的DAPI(SP-100),Spectrum GreenTM(MF101),Cy3TMv1(SP-102),Texas Red(SP-107)和Zeiss公司的Cy5(50),PF-415(45)六种滤光片通道下无信号交叉。用于高分辨定量多色荧光原位杂交,可以在单细胞水平同时检测定性定量检测5个目的基因的改变情况,可大规模检测临床标本的基因异位和等位基因拷贝数改变。从而检测同一标本中不同亚克隆的种类及比例,同一病人初诊和复发病例前后对照可以检测亚克隆的演变状况。总之,本发明提供了一种用于高分辨定量多色荧光原位杂交对t(8;21)AML中5种目的基因进行定性定量检测的试剂盒,不仅可以分析基因拷贝数的改变,而且能够以基因拷贝数作为亚克隆的标志检测肿瘤细胞群的异质性。而且适用于检测同一白血病患者初诊和复发的克隆衍变,通过比较初诊和复发时的克隆衍变图,判断是否发生优势克隆的演变、某些治疗敏感克隆的消失及某些耐药克隆的新生。对于指导临床的靶向治疗具有重大意义。
附图说明
图1为,分别用Green dUTP,PF555-dUTP,PF590-dUTP标记含AML1基因的3个BAC克隆(表2),将这3色探针杂交于正常人二倍体成纤维细胞,经荧光显微镜检测得到的图像,结果显示三个探针融合为1个点,说明这3个BAC克隆可以用来共定位检测AML1基因,来增强荧光信号强度。
图2为,分别用PF555-dUTP,Green dUTP,PF590-dUTP,HyPer5-dCTP,PF415-dUTP标记含有AML1,ETO,WT1,P27,C-kit基因的BAC克隆(如表3所示),将这五色探针混色后杂交于正常人二倍体成纤维细胞,经荧光显微镜检测得到的图像,结果显示每种探针都有两个清晰的荧光信号,信号强度高、稳定性强,可用于后续患者标本的检测。
图3为,应用本发明检测t(8;21)AML中目的基因拷贝数改变的探针试剂盒,在t(8;21)AML患者中检测的肿瘤异质性的表现以及4个亚克隆间的树状进化关系,从各个亚克隆的比例来看,该病人这个时期的优势克隆的信号表型为:1个AML1-ETO融合信号,2个AML1信号,1个ETO信号,2个WT1信号,2个p27信号,3个c-kit信号。
图4为,应用检测t(8;21)AML中目的基因拷贝数改变的探针试剂盒,在t(8;21)AML患者中检测的肿瘤异质性的表现,各个亚克隆间的树状进化关系,以及初诊(图4-1)和复发(图4-2)时优势克隆的演变关系的对比可以明显的看出亚克隆的演变:复发时有一个亚克隆消失,同时又有2个新生的亚克隆出现,而亚克隆“1F1G1O2R3I3B”(1个融合信号,1个ETO,1个AML1,2个WT1,3个p27,3个c-kit)的比例由初诊时的2.00%演变为复发时的27.59%,表现出明显的上升趋势。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步详细说明,但不限定本发明的保护范围。
实施例1:AML1基因探针的制备
一、探针DNA的获取
1)划线接种:将3个分别携带有AML1基因的BAC菌种(RP11-77G18,RP11-697C13,RP11-177L11;购买于Children's Hospital Oakland Research Institute)分别按照如下步骤操作,首先将BAC菌种划线接种于含有抗生素(氯霉素)的琼脂平板上,37℃培养过夜(约14小时)。
2)初始培养:次日挑取生长状态良好的单克隆菌种,接种于2ml含有抗生素(氯霉素)的LB液体培养基中,放入37℃摇床,设置摇床速度约200rpm,培养6-8小时。
3)过夜培养:每1ml步骤2)所得菌液转移至200ml含有抗生素(氯霉素)的LB液体培养基中,放置于37℃摇床,转速200rpm,培养过夜(约14-16小时)。
4)次日按照QIAGEN公司质粒大量提取试剂盒操作说明进行DNA大量提取和纯化。
二、探针标记
1.酶切DNA:
1)按照以下反应体系对目的DNA进行酶切
(SH是EcoRⅠ中自带的缓冲液:Restriction Endonuclease Buffer SH)
37℃孵育1小时,加入1μl的0.5M的乙二胺四乙酸(Ethylene Diamine Tetraacetic Acid,EDTA)(PH7.5)终止反应,混匀,瞬时离心。
2)沉淀DNA:加入步骤1)总液体量1/10体积的3M乙酸钠。
3)再加入步骤2)总液体量2倍体积100%乙醇(-20℃),混匀,瞬时离心,-70℃,沉淀约2小时。
4)离心14000rpm,4℃,20分钟,用枪尖小心吸弃上清,加入100μl70%乙醇(4℃),混匀,离心14000rpm,4℃,15分钟。
5)用枪尖小心吸弃上清,干燥沉淀10分钟,用10μl的10mM的Tris-HCl(PH8.5)重悬后在振荡器上连续震荡至少5小时,转速800rpm,将溶解好的DNA放在4℃保存直至连接反应。
2.连接反应:
采用切口平移法对酶切好的DNA进行荧光素标记,对AML1基因的三个BAC探针的荧光素标记按照表2所示进行。方法如下:
取避光的EP管,先加入水,最后加入DNaseⅠ(10ng/μl)和DNA polymeraseⅠ(10units/μl,酶始终放在冰盒或冰上)按如下反应体系加液:
混匀,瞬时离心,14℃孵育过夜(9-12小时)。
次日加入5μl的0.5M的EDTA(PH7.5)终止反应,混匀,瞬时离心,连接好的DNA放在-20℃避光保存。
3.沉淀DNA:
1)按照以下反应体系对标记好的DNA进行沉淀:
cotDNA:即Human Cot-1DNA。
再加入15μl的3M的乙酸钠,630μl的100%乙醇(-20℃)混匀,瞬时离心,-20℃,沉淀过夜。
其中AML1-R1对应的克隆编号为:RP11-77G18,AML1-R2对应的克隆编号为:RP11-697C13,AML1-R3对应的克隆编号为:RP11-177L11。
2)次日离心14000rpm,4℃,20分钟。用枪尖小心吸弃上清,加入100μl的70%乙醇(4℃),混匀,离心14000rpm,4℃,15分钟。用枪尖小心吸弃上清,室温避光干燥沉淀10分钟。
3)加入10μl的含有50%去离子甲酰胺的杂交缓冲液溶解沉淀,在振荡器上连续震荡至少6小时以充分溶解探针,转速800rpm,将溶解好的探针放在4℃保存直至后续实验。
4)将步骤3)制作好的探针从4℃中拿出,放入56℃中孵育1小时,室温离心14000rpm,20分钟,将离心好的探针转移至一个新的避光EP管中,4℃中保存,若长期不用探针应保存于-20℃。
三、杂交反应
1.细胞准备:
1)正常人二倍体成纤维细胞(Human diploid fibroblast cell,HDF)培养于含有20%胎牛血清的MEM与F12(1:1)混合培养基中,当细胞生长融合至90%时,用0.25%胰酶+0.02%EDTA溶液进行消化,传代;
2)取对数生长期的细胞,进行细胞爬片;
3)将制作好的细胞爬片放入甲醇中室温固定过夜;
4)次日放入1-2%的甲醛溶液中室温固定5分钟,磷酸缓冲液(PBS)中洗涤后放入70%的乙醇中-20℃保存;
5)将保存在70%的乙醇中的标本拿出,放入梯度乙醇(70%,85%,2×100%乙醇)中脱水,3分钟/梯度,脱水后晾干,加入制作好的探针,10μl/片,加上18×18mm普通盖玻片,避免产生气泡,用封片胶封片,37℃干燥20分钟。
2.杂交:
将玻片放入杂交仪中,85-90℃变性5分钟,47℃杂交过夜。
3.洗涤:
将杂交过夜的片子移去盖玻片,放在47℃的4×SSPE中洗涤5分钟,55℃的4×SSPE中洗涤10分钟。
4.梯度乙醇中脱水(70%,85%,2×100%乙醇),3分钟/梯度。
5.放入己烷:异丙醇(体积比60:40)混合液中10分钟再放入异丙醇中5分钟,最后放入100%的乙醇中5分钟。
6.空气中干燥片子约10分钟后加入10μl的DAPI,加上盖玻片,避免产生气泡,指甲油封片。
7.图像采集与分析:
采用Zeiss公司多色荧光显微镜Axio Imager Z2型,滤光片采用Chroma公司分别为:DAPI(SP-100),Cy3TMv1(SP-102),Texas Red(SP-107)和Zeiss公司PF-415(45)组合。首先在DAPI滤光片下选择视野,定位,用Axio Vision Rel.4.8.2软件中的重定位模块记录图像采集位置,然后用高分辨率CCD(Charge-Coupled Device,电荷耦合原件)相机在63倍油镜下分别在DAPI(Emission:450-490nm),Spectrum GreenTM(Emission:512-542nm),Cy3TMv1(Emission:559.5-574.5nm),PF-415(Emission:460-500nm)四个滤光片通路中采集荧光信息,用图象处理软件Z-Stack采集模块在每个拍摄的细胞核上进行立体扫描5-10层,采用焦深延长模块将多层扫描的荧光杂交信号压缩在一张图像上,从而获得清晰、稳定,理想的多色图像。
8.结果判断:
从获得的Green dUTP-AML1-R1(绿色),PF555-AML1-R2(红色),PF415-AML1-R3(蓝色)多色图像(图1)中可以看出,所挑选的3个含AML1基因序列的BAC克隆能够很好的结合在同一个基因位点(图1)。结果表明,联合使用这3个BAC克隆来制备AML1探针,可充分保证杂交信号的强度并提高分辨率。
实施例2:Green-ETO(绿色),PF555–AML1(黄色)PF590-WT1(红色),HyPer5-p27(紫色),PF415-c-kit(蓝色)探针组合的制备
一、探针DNA的获取
1)划线接种:将分别携带有AML1(RP11-77G18,RP11-697C13,RP11-177L11),ETO(RP11-118O8,RP11-122C21),WT1(RP11-258G7,RP11-955L20),p27(RP11-380E18,RP11-70N14,RP11-377D9)和c-kit(RP11-103A16,RP11-178P22)基因的BAC菌种分别划线接种于含有抗生素(氯霉素)的琼脂平板上,37℃培养过夜(约14小时)。
2)初始培养:次日挑取生长状态良好的单克隆菌种,接种于2ml含有抗生素(氯霉素)的LB液体培养基中,放入37℃摇床,设置摇床速度约200rpm,培养6-8小时。
3)过夜培养:每1ml步骤2)所得菌液转移至200ml含有抗生素(氯霉素)的LB液体培养基中,放置于37℃摇床,转速200rpm,培养过夜(约14-16小时)。
4)次日按照QIAGEN公司质粒大量提取试剂盒操作说明进行DNA大量提取和纯化。
二、探针标记
1.酶切DNA:
1)按照以下反应体系对目的DNA进行酶切
(SH是EcoRⅠ中自带的缓冲液:Restriction Endonuclease Buffer SH)
37℃孵育1小时,加入1μl的0.5M的乙二胺四乙酸(Ethylene Diamine Tetraacetic Acid,EDTA)(PH7.5)终止反应,混匀,瞬时离心。
2)沉淀DNA:加入步骤1)总液体量1/10体积的3M乙酸钠。
3)再加入步骤2)总液体量2倍体积100%乙醇(-20℃),混匀,瞬时离心,-70℃,沉淀约2小时。
4)离心14000rpm,4℃,20分钟,用枪尖小心吸弃上清,加入100μl70%乙醇(4℃),混匀,离心14000rpm,4℃,15分钟。
5)用枪尖小心吸弃上清,干燥沉淀10分钟,用10μl的10mM的Tris-HCl(PH8.5)重悬后在振荡器上连续震荡至少5小时,转速800rpm,将溶解好的DNA放在4℃保存直至连接反应。
2.连接反应:
采用切口平移法对酶切好的DNA进行荧光素标记,对探针ETO、AML1、WT1、p27、c-kit分别采用Green dUTP,PromoFluor-555-aadUTP,PromoFluor-590-aadUTP,HyPer5dCTP,PromoFluor-415-aadUTP五种荧光素(表1)进行标记,对Green-ETO(绿色),PF555-AML1(黄色),PF590-WT1(红色),HyPer5-p27(紫色),PF415-c-kit(蓝色)探针组合标记如表3方法如下:
取避光的EP管,先加入水,最后加入DNaseⅠ(10ng/μl)和DNA polymeraseⅠ(10units/μl,酶始终放在冰盒或冰上)按如下反应体系加液:
混匀,瞬时离心,14℃孵育过夜(9-12小时)。
次日加入5μl的0.5M的EDTA(PH7.5)终止反应,混匀,瞬时离心,连接好的DNA放在-20℃避光保存。
3.沉淀DNA:
1)按照以下反应体系对目的标记好的DNA进行沉淀:
再加入15μl的3M的乙酸钠,630μl的100%乙醇(-20℃)混匀,瞬时离心,-20℃,沉淀过夜。
2)次日离心14000rpm,4℃,20分钟。用枪尖小心吸弃上清,加入100μl的70%乙醇(4℃),混匀,离心14000rpm,4℃,15分钟。用枪尖小心吸弃上清,室温避光干燥沉淀10分钟。
3)加入10μl的含有50%去离子甲酰胺的杂交缓冲液溶解沉淀,在振荡器上连续震荡至少6小时以充分溶解探针,转速800rpm,将溶解好的探针放在4℃保存直至后续实验,即为即用型杂交液,其中AML1基因探针、ETO基因探针、WT1基因探针、P27基因探针和C-kit基因探针的浓度均为4ng/μl。
4)将步骤3)制作好的探针从4℃中拿出,放入56℃中孵育1小时,室温离心14000rpm,20分钟,将离心好的探针转移至一个新的避光EP管中,4℃中保存,若长期不用探针应保存于-20℃。
三、杂交反应
1.细胞准备:
1)正常人二倍体成纤维细胞(Human diploid fibroblast cell,HDF)培养于含有20%胎牛血清的MEM与F12(1:1)混合培养基中,当细胞生长融合至90%时,用0.25%胰酶+0.02%EDTA溶液进行消化,传代;
2)取对数生长期的细胞,进行细胞爬片;
3)将制作好的细胞爬片放入甲醇中室温固定过夜;
4)次日放入1-2%的甲醛溶液中室温固定5分钟,磷酸缓冲液(PBS)中洗涤后放入70%的乙醇中-20℃保存;
5)将保存在70%的乙醇中的标本拿出,放入梯度乙醇(70%,85%,2×100%乙醇)中脱水,3分钟/梯度,脱水后晾干,加入制作好的探针,10μl/片,加上18×18mm普通盖玻片,避免产生气泡,用封片胶封片,37℃干燥20分钟。
2.杂交:
将玻片放入杂交仪中,85-90℃变性5分钟,47℃杂交过夜。
3.洗涤:
将杂交过夜的片子移去盖玻片,放在47℃的4×SSPE中洗涤5分钟,55℃的4×SSPE中洗涤10分钟。
4.梯度乙醇中脱水(70%,85%,2×100%乙醇),3分钟/梯度。
5.放入己烷:异丙醇(体积比60:40)混合液中10分钟,再放入异丙醇中5分钟,最后放入100%的乙醇中5分钟。
6.空气中干燥片子约10分钟后加入10μl的DAPI,加上盖玻片,避免产生气泡,指甲油封片。
7.图像采集与分析:
采用Zeiss公司多色荧光显微镜Axio Imager Z2型,滤光片采用Chroma公司分别为:DAPI(SP-100),Spectrum GreenTM(MF101),Cy3TMv1(SP-102),Texas Red(SP-107)和Zeiss公司Cy5(50),PF-415(45)组合。首先在DAPI滤光片下选择视野,定位,用Axio Vision Rel.4.8.2软件中的重定位模块记录图像采集位置,然后用高分辨率CCD(Charge-CoupledDevice,电荷耦合原件)相机在63倍油镜下分别在DAPI(Emission:450-490nm),SpectrumGreenTM(Emission:512-542nm),Cy3TMv1(Emission:559.5-574.5nm),Texas Red(Emission:619.5-642.5nm),Cy5(Emission:665-715nm),PF-415(Emission:460-500nm)六个滤光片通路中采集荧光信息,用图象处理软件Z-Stack采集模块在每个拍摄的细胞核上进行立体扫描5-10层,采用焦深延长模块将多层扫描的荧光杂交信号压缩在一张图像上,从而获得获得清晰、稳定,理想的多色图像。
8.结果判断:
从获得的Green-ETO(绿色),PF555-AML1(黄色),PF590-WT1(红色),HyPer5-p27紫色),PF415-c-kit(蓝色)多色图像(图2)中可以看出,同时检测的5个不同基因的荧光信号均较强,图像清晰,可用于后续的病人标本检测。
实施例3:
一种检测t(8;21)AML中目的基因拷贝数改变的探针试剂盒(20人份/盒),包括如下组分:
1)、实施例2中步骤3)得到的即用型杂交液,其中AML1基因探针、ETO基因探针、WT1基因探针、P27基因探针和C-kit基因探针的浓度均为4ng/μl,共200μl。
2)、DAPI复染液2ml。
3)、12*12mm盖玻片1盒。
4)、18*18mm盖玻片1盒。
5)、液体橡胶1瓶。
6)、载玻片1盒。
实施例4
t(8;21)AML中异质性亚克隆的检测
1、探针制备:
使用实施例3试剂盒中的即用型杂交液。
2、患者标本固定
1)洗涤:2ml骨髓液加PBS至8ml,于室温,1200rpm条件下离心10分钟;
2)低渗:离心结束后弃掉上清液,加低渗溶液至8ml,轻轻吹打混匀,于37℃水浴中孵育40分钟;
3)预固定:向低渗处理40分钟后的标本中加1ml固定液,充分吹打混匀,于室温,1200rpm条件下离心10分钟;
4)第一次固定:离心结束后弃掉上清液,加固定液至8ml,充分吹打混匀,室温固定30分钟,于室温,1200rpm条件下离心10分钟;
5)第二次固定:离心结束后弃掉上清液,加固定液至8ml,充分吹打混匀,室温固定15分钟,于室温,1200rpm条件下离心10分钟;
6)第三次固定:离心结束后弃掉上清液,加固定液至8ml,充分吹打混匀,室温固定15分钟,于室温,1200rpm条件下离心10分钟;
7)离心结束后弃掉上清液,加固定液重悬细胞核,置于-20℃保存备用。
3、滴片
1)将载玻片置于20%乙醇中浸泡过夜,使表面杂质充分溶解;
2)20%乙醇浸泡后的载玻片经去离子水冲洗三遍,然后浸泡于去离子水中,置于37℃水浴中预热;
3)将固定好的标本从-20℃中取出,充分重悬,混合均匀;
4)将载玻片从水浴中取出,吸掉过多的水分,平举稍向内倾斜,将混匀的标本在载玻片上方30cm以上的高度滴下,标本在载玻片表面慢慢摊开,形成单层细胞核薄膜;
5)室温晾干;
6)置于37℃2×SSC中洗片10分钟;
7)放入梯度乙醇(70%,80%,100%)中脱水,3分钟/梯度,脱水后晾干(20分钟),加入制作好的即用型杂交液,10μl/片,加上18×18mm普通盖玻片,避免产生气泡,用液体橡胶封片,37℃干燥20分钟。
4、杂交:
将玻片放入杂交仪,78-81℃变性5分钟,37℃杂交过夜。
5、杂交后处理:
1)洗涤:将杂交过夜的片子移去盖玻片,放在47℃的4×SSPE中洗涤5分钟,55℃的4×SSPE中洗涤10分钟。
2)梯度乙醇中脱水(70%,85%,2×100%乙醇),3分钟/梯度。
3)放入己烷:异丙醇(体积比60:40)混合液中10分钟,再放入异丙醇中5分钟,最后放入100%的乙醇中5分钟。
4)空气中干燥片子约10分钟后加入10μl的DAPI,加上盖玻片,避免产生气泡,指甲油封片。
6、图像采集
采用Zeiss公司多色荧光显微镜Axio Imager Z2型,滤光片采用Chroma公司分别为:DAPI(SP-100),Spectrum GreenTM(MF101),Cy3TMv1(SP-102),Texas Red(SP-107)和Zeiss公司Cy5(50),PF-415(45)组合。首先在DAPI滤光片下选择视野,定位,用AxioVision Rel.4.8.2软件中的重定位模块记录图像采集位置,然后用高分辨率CCD(Charge-Coupled Device,电荷耦合原件)相机在63倍油镜下分别在DAPI(Emission:450-490nm),Spectrum GreenTM(Emission:512-542nm),Cy3TMv1(Emission:559.5-574.5nm),Texas Red(Emission:619.5-642.5nm),Cy5(Emission:665-715nm),PF-415(Emission:460-500nm)六个滤光片通路中采集荧光信息,用图象处理软件Z-Stack采集模块在每个拍摄的细胞核上进行立体扫描5-10层,采用焦深延长模块将多层扫描的荧光杂交信号压缩在一张图像上,从而获得理想的多色图像。
7、信息分析
从步骤6采集的图片信息中计数至少200(≥200)个t(8;21)融合信号阳性的细胞,①每个细胞的记录内容包括:AML1-ETO融合信号的个数(F)、PF555-AML1黄色信号的个数(O),Green-ETO绿色信号的个数(G),PF590-WT1红色信号的个数(R),HyPer5-P27紫色信号的个数(I),PF415-C-kit蓝色信号的个数(B)。②计算200个细胞中每类信号的比例:n(n=正整数)个融合信号(nF)的比例,n(n=非负整数)个PF555-AML1黄色信号(nO)的比例,n(n=非负整数)个Green-ETO绿色信号(nG)的比例,n(n=非负整数)个PF590-WT1红色信号(nR)的比例,n(n=非负整数)个HyPer5-P27紫色信号(nI)的比例,n(n=非负整数)个PF415-C-kit蓝色信号(nB)的比例。③将每类信号的比例减掉相应的cut-off值,若结果为大于零(>0),则表示此类信号为阳性信号。④将所有信号均为阳性信号且阳性信号表型相同的细胞归为一个亚克隆。计算其比例,大于1%的称为阳性亚克隆。同时推测不同亚克隆之间的进化关系。
8、结果判断:
通过统计分析可以看出,在该例t(8;21)AML病人中,有多个亚克隆存在,各个亚克隆之间形成树状进化关系,这充分证明了白血病的异质性,也反应了在肿瘤发生过程中,瘤细胞的变异是一个不断累积的过程,如图3所示。
实施例5:在一例t(8;21)AML病人当中,亚克隆的演变
1、探针制备:
使用实施例3试剂盒中的即用型杂交液。
2、患者标本固定
1)洗涤:2ml骨髓液加PBS至8ml,于室温,1200rpm条件下离心10分钟;
2)低渗:离心结束后弃掉上清液,加低渗溶液至8ml,轻轻吹打混匀,于37℃水浴中孵育40分钟;
3)预固定:向低渗处理40分钟后的标本中加1ml固定液,充分吹打混匀,于室温,1200rpm条件下离心10分钟;
4)第一次固定:离心结束后弃掉上清液,加固定液至8ml,充分吹打混匀,室温固定30分钟,于室温,1200rpm条件下离心10分钟;
5)第二次固定:离心结束后弃掉上清液,加固定液至8ml,充分吹打混匀,室温固定15分钟,于室温,1200rpm条件下离心10分钟;
6)第三次固定:离心结束后弃掉上清液,加固定液至8ml,充分吹打混匀,室温固定15分钟,于室温,1200rpm条件下离心10分钟;
7)离心结束后弃掉上清液,加固定液重悬细胞核,置于-20℃保存备用。
3、滴片
1)将载玻片置于20%乙醇中浸泡过夜,使表面杂质充分溶解;
2)20%乙醇浸泡后的载玻片经去离子水冲洗三遍,然后浸泡于去离子水中,置于37℃水浴中预热;
3)将固定好的标本从-20℃中取出,充分重悬,混合均匀;
4)将载玻片从水浴中取出,吸掉过多的水分,平举稍向内倾斜,将混匀的标本在载玻片上方30cm以上的高度滴下,标本在载玻片表面慢慢摊开,形成单层细胞核薄膜;
5)室温晾干;
6)置于37℃2×SSC中洗片10分钟;
7)放入梯度乙醇(70%,80%,100%)中脱水,3分钟/梯度,脱水后晾干(20分钟),加入制作好的即用型杂交液,10μl/片,加上18×18mm普通盖玻片,避免产生气泡,用液体橡胶封片,37℃干燥20分钟。
4、杂交:
将玻片放入杂交仪,78-81℃变性5分钟,37℃杂交过夜。
5、杂交后处理:
1)洗涤:将杂交过夜的片子移去盖玻片,放在47℃的4×SSPE中洗涤5分钟,55℃的4×SSPE中洗涤10分钟。
2)梯度乙醇中脱水(70%,85%,2×100%乙醇),3分钟/梯度。
3)放入己烷:异丙醇(体积比60:40)混合液中10分钟,再放入异丙醇中5分钟,最后放入100%的乙醇中5分钟。
4)空气中干燥片子约10分钟后加入8-10μl的DAPI,加上盖玻片,避免产生气泡,指甲油封片。
6、图像采集
采用Zeiss公司多色荧光显微镜Axio Imager Z2型,滤光片采用Chroma公司分别为:DAPI(SP-100),Spectrum GreenTM(MF101),Cy3TMv1(SP-102),Texas Red(SP-107)和Zeiss公司Cy5(50),PF-415(45)组合。首先在DAPI滤光片下选择视野,定位,用AxioVision Rel.4.8.2软件中的重定位模块记录图像采集位置,然后用高分辨率CCD(Charge-Coupled Device,电荷耦合原件)相机在63倍油镜下分别在DAPI(Emission:450-490nm),Spectrum GreenTM(Emission:512-542nm),Cy3TMv1(Emission:559.5-574.5nm),Texas Red(Emission:619.5-642.5nm),Cy5(Emission:665-715nm),PF-415(Emission:460-500nm)六个滤光片通路中采集荧光信息,用图象处理软件Z-Stack采集模块在每个拍摄的细胞核上进行立体扫描5-10层,采用焦深延长模块将多层扫描的荧光杂交信号压缩在一张图像上,从而获得理想的多色图像。
7、信息分析
从步骤6采集的图片信息中计数至少200(≥200)个t(8;21)融合信号阳性的细胞,①每个细胞的记录内容包括:AML1-ETO融合信号的个数(F)、PF555-AML1黄色信号的个数(O),Green-ETO绿色信号的个数(G),PF590-WT1红色信号的个数(R),HyPer5-p27紫色信号的个数(I),PF415-c-kit蓝色信号的个数(B)。②计算200个细胞中每类信号的比例:n(n=正整数)个融合信号(nF)的比例,n(n=非负整数)个PF555-AML1黄色信号(nO)的比例,n(n=非负整数)个Green-ETO绿色信号(nG)的比例,n(n=非负整数)个PF590-WT1红色信号(nR)的比例,n(n=非负整数)个HyPer5-p27紫色信号(nI)的比例,n(n=非负整数)个PF415-c-kit蓝色信号(nB)的比例。③将每类信号的比例减掉相应的cut-off值,若结果为大于零(>0),则表示此类信号为阳性信号。④将所有信号都为阳性且阳性信号表型相同的细胞归为一个亚克隆,计算其比例,同时可以推测不同亚克隆之间的进化关系。
8、结果判断:
通过统计分析可以看出,在该例t(8;21)AML病人中,有多个亚克隆存在,各个亚克隆之间形成树状进化关系。比较病人初诊与复发两个时间段的克隆进化谱,可以清晰的看出亚克隆的演变,及亚克隆(1F1G1O2R3I3B)逐渐上升为优势克隆,如图4-1和4-2所示。
本发明一种用于高分辨定量多色荧光原位杂交,检测t(8;21)AML中目的基因拷贝数改变的探针组合及试剂,不仅信号强度高、稳定性强,而且具有操作简便,费用低廉的特点。同时,标本的需求量不大,制备简单。现有的高分辨定量多色荧光原位杂交方法稳定性好,空间定位精确。这些特点使得该方案具有大规模临床检测的可行性。
由于肿瘤的异质性,使得肿瘤性疾病的临床治疗效果欠佳。由于肿瘤细胞群亚克隆的进化,即使一些初期治疗敏感的肿瘤目也会逐渐出现耐药,复发等治疗难题。业内专家普遍认为肿瘤的发生是一个多基因突变逐步累积的过程,这也是肿瘤异质性的根源所在。因此,检测肿瘤细胞基因表型的异质性及其进化,对于发现肿瘤亚克隆细胞群的普遍演变规律,从而指导临床的靶向治疗具有重大意义。
综上所述,本发明内容并不局限在上述实施例,在该方案的指导下,可以轻而易举的提出其他实施例,但是这些实施例都包括在本发明的范围之内。
表1 荧光染料
表2 实施例1AML1基因片段标记
表3 实施例2五种基因探针的荧光素标记
Claims (6)
1.一种即用型杂交液,其特征在于:该即用型杂交液的组分及浓度为:AML1基因探针、ETO基因探针、WT1基因探针、P27基因探针和C-kit基因探针的浓度均为4ng/μl。
2.权利要求1所述即用型杂交液的制备方法,其特征在于:包括如下步骤:
1)、探针制作:在常用的数据库如NCBI Clone Registry、Ensembl Genome Browser和UCSCGenome Bioinformatics上定位检索分别含检测AML1、ETO、WT1、P27、C-kit基因的BAC(Bacterial artificial chromosomes)克隆,获得目的基因的克隆后,大量提取质粒DNA,再采用缺口平移的方法将荧光素染料标记的dUTP或dCTP连接到酶切好的DNA上,对标记好的目的DNA进行组合沉淀,用含有50%去离子甲酰胺的杂交缓冲液溶解沉淀,制得即用型杂交液;
2)、探针验证:采用正常人二倍体成纤维细胞的细胞爬片进行探针验证。
3.根据权利要求2所述的方法,其特征在于:所述含AML1基因最优的克隆,编号为:RP11-77G18,RP11-697C13和RP11-177L11的组合;所述含ETO基因最优的克隆,编号为:RP11-118O8和RP11-122C21的组合;所述含WT1基因最优的克隆,编号为:RP11-258G7和RP11-955L20的组合;所述含p27基因最优的克隆,编号为:RP11-380E18,RP11-70N14和RP11-377D9的组合;所述含c-kit基因最优的克隆,编号为:RP11-103A16和RP11-178P22的组合。
4.根据权利要求2或3所述的方法,其特征在于:所述的步骤1)为在常用的数据库如NCBI Clone Registry、Ensembl Genome Browser和UCSC Genome Bioinformatics上定位检索分别含检测AML1、ETO、WT1、P27、C-kit基因的BAC(Bacterial artificial chromosomes)克隆,获得目的基因的克隆后,大量提取质粒DNA,再采用缺口平移的方法将荧光素染料标记的dUTP或dCTP连接到酶切好的DNA上,用100%的乙醇将连接好的DNA在-20℃进行组合沉淀过夜,次日离心14000rpm,4℃,20分钟,用枪尖小心吸弃上清,加入70%乙醇(4℃),混匀,离心14000rpm,4℃,15分钟,用枪尖小心吸弃上清,室温避光干燥沉淀10分钟,用含有50%去离子甲酰胺的杂交缓冲液溶解沉淀,制得即用型杂交液。
5.一种检测t(8;21)AML中目的基因拷贝数改变的探针试剂盒,其特征在于:包括权利要求1所述即用型杂交液。
6.根据权利要求5所述的探针试剂盒,其特征在于:该检测试剂盒还包括:12*12mm盖玻片,18*18mm盖玻片,载玻片,DAPI复染剂和液体橡胶。
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