CN107475387B - 用于检测片段化dna突变的质控品及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了用于检测片段化DNA基因突变的质控品及其制备方法，包括如下步骤：以突变型基因组DNA或经构建的突变型质粒为模板，经引物扩增，得到突变型DNA片段；将突变型DNA片段随机打断，得到片段化突变型DNA样本，将片段化突变型DNA样本与片段化野生型基因组DNA样本混合，制得质控品。该方法优势在于：对突变型DNA片段随机打断，可以根据不同的检测样本，打断出与之相适应的片段长度。另外，该方法操作简单，相比于合成方法，无需对序列两端加酶切位点及保护性碱基。此外，基于该方法制备的质控品，由于突变型DNA片段为随机打断，断点随机，制备的质控品可以更真实地模拟临床样本。
Description
技术领域
本发明涉及临床检验领域，具体涉及一种用于检测片段化DNA突变的质控品及其制备方法。
背景技术
目前，基因检测技术已被广泛应用于个体化医疗，高通量测序(NGS)技术的出现使基因检测成本大幅下降，其主要特点是能够同时对输入的序列进行大规模平行测序，获得大量短序列的测序结果。
高通量测序的基本原理是将待测DNA打断成小片段，经末端修复、连接接头序列、PCR等步骤进行文库构建，最后使用Illumina，Ion Torrent等测序仪进行测序。但是随着这一技术的推广应用，不同实验室在应用NGS对基因突变检测的室间质量评价方面仍为空白。因此，急需对不同检测平台的分析性能及检测结果的准确性进行考察。
发明内容
基于此，有必要针对无法对基因突变检测的室间质量进行准确性评价的问题，提供一种用于检测片段化DNA突变的质控品的制备方法。
一种用于检测片段化DNA突变的质控品的制备方法，包括如下步骤：
以突变型基因组DNA为模板，经引物扩增，得到突变型DNA片段；
将所述突变型DNA片段随机打断，得到片段化突变型DNA样本，将片段化突变型DNA样本与含有片段化野生型基因组DNA的样本混合，制得质控品；
或
以突变型基因组DNA为模板，经引物扩增，得到突变型DNA片段前体，将所述突变型DNA片段前体与质粒连接，得到突变型质粒；
再经引物扩增或酶切，得到突变型DNA片段；
将所述突变型DNA片段随机打断，得到片段化突变型DNA样本，将片段化突变型DNA样本与含有片段化野生型基因组DNA的样本混合，制得质控品；
或
以人目标基因位点为野生型的DNA为模板，经引物扩增，得到野生型DNA片段；
将所述野生型DNA片段与质粒连接，构建野生型质粒；
再以所述野生型质粒为模板，经定点突变引物扩增，制得突变型质粒；其中，所述定点突变引物含有突变位点；
突变型质粒再经引物扩增或酶切，得到突变型DNA片段；
将所述突变型DNA片段随机打断，得到片段化突变型DNA样本，将片段化突变型DNA样本与含有片段化野生型基因组DNA的样本混合，制得质控品。
该方法可以通过对突变型DNA片段随机打断的步骤的调控，即可满足不同检测样本的需求，也就是说，随机打断时可以根据不同的检测样本，打断出与之相适应的片段长度。另外，该方法操作简单，相比于合成方法，无需对序列两端加酶切位点及保护性碱基。
基于该方法制备的质控品，由于突变型DNA片段为随机打断，断点随机，制备的质控品可以更真实地模拟临床样本。而直接PCR扩增或合成得到的DNA片段，其突变位点在片段中的位置都是固定的，不能反映石蜡包埋(FFPE)样本或血浆样本的真实情况；而且片段长度也是一定的。因此，用PCR扩增或合成的DNA片段制备的质控品，无法真实地模拟临床样本。
在其中一个实施例中，所述引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.8、SEQID NO.11～SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.21～SEQ ID NO.28、SEQ ID NO.31～SEQ ID NO.38。
在其中一个实施例中，所述定点突变引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.9～SEQ IDNO.10、SEQ ID NO.19～SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.29～SEQ ID NO.30。
在其中一个实施例中，所述片段化突变型DNA样本的长度为100bp-300bp。
在其中一个实施例中，所述突变型基因组DNA为突变细胞株基因组DNA或突变肿瘤组织DNA。
在其中一个实施例中，所述含有片段化野生型基因组DNA的样本为健康人血浆样本、经抽提的健康人血浆游离DNA、打断的健康人白细胞基因组DNA或FFPE组织样本DNA中的一种。
在其中一个实施例中，所述片段化突变型DNA样本占片段化野生型基因组DNA的样本拷贝数比例为0.01％～50％。
在其中一个实施例中，所述片段化突变型DNA样本为点突变DNA、插入突变DNA、缺失突变DNA或基因融合突变DNA中的一种。
在其中一个实施例中，所述片段化突变型DNA样本为人EGFR基因第21外显子的L858R突变DNA、人EGFR基因第20外显子的T790M突变DNA、人EGFR基因第19外显子E746_A750DEL-1缺失突变DNA或人EML4-ALK基因融合突变DNA中的一种。
此外，本发明还提供了一种用于检测片段化DNA突变的质控品。
一种用于检测片段化DNA突变的质控品，根据本发明的任一制备方法获得。
该质控品优点在于，质控品断点随机，可以更真实地模拟临床样本。质控品中掺杂不同比例的片段化突变型DNA均可被检测到，检测到的突变比例均与理论突变比例相符。进而说明，该质控品可用于检测片段化DNA样本中基因突变的质量控制。
具体实施方式
一种用于检测片段化DNA突变的质控品的制备方法，包括如下步骤：
S1：突变型DNA片段；
其中，S1制备得到突变型DNA片段的具体步骤可以通过以下三种方式得到；
以突变型基因组DNA为模板，经引物扩增，得到突变型DNA片段。
或以突变型基因组DNA为模板，经引物扩增，得到突变型DNA片段前体，将突变型DNA片段前体与质粒连接，得到突变型质粒。
再经引物扩增或酶切，得到突变型DNA片段。
或以人目标基因位点为野生型位点的DNA为模板，经引物扩增，得到野生型DNA片段。
将野生型DNA片段与质粒连接，构建野生型质粒。
再以野生型质粒为模板，经定点突变引物扩增，制得突变型质粒；其中，定点突变引物含有突变位点。
突变型质粒再经引物扩增或酶切，得到突变型DNA片段。
S2：将突变型DNA片段随机打断，得到片段化突变型DNA样本，将片段化突变型DNA样本与含有片段化野生型基因组DNA的样本混合，制得质控品。
在S1中，突变型基因组DNA为突变细胞株基因组DNA或突变肿瘤组织DNA。当然可以理解的是，本发明的突变型基因组DNA不限于所列举的DNA。
在一优选实施方式中，突变型质粒经引物扩增或酶切后，扩增产物还可以经过纯化处理，得到突变型DNA片段，纯化的目的是去除多余引物和杂质。此外，突变型质粒的构建，无需依赖获取特定的突变细胞株，且相对于用基因编辑改造细胞的方法，操作上更简便。
在一优选实施方式中，突变型质粒还可以转化细胞，菌株保种，作为制备质控品所需的突变型质粒的稳定来源。重复试验过程中无需反复构建突变型质粒，只需将细胞扩大培养即可实现突变型质粒的供给。
在S2中，将突变型DNA片段随机打断；其中，随机打断中的随机是指打断的位点随机，而不是长度随机。
在一优选实施方式中，引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.8、SEQ IDNO.11～SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.21～SEQ ID NO.28、SEQ ID NO.31～SEQ ID NO.38。当然也可以为能够实现野生型DNA片段扩增的其它引物序列。
在一优选实施方式中，定点突变引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.9～SEQ IDNO.10、SEQ ID NO.19～SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.29～SEQ ID NO.30，当然也可以为能够实现相关基因定点突变的其它引物序列。定点突变引物是指含相关基因突变位点的引物。
在一优选实施方式中，突变型DNA片段或野生型DNA片段的长度为300bp-10000bp；优选地，突变DNA片段或野生型DNA片段的长度为500bp-2000bp。此片段长度区间范围内的突变DNA片段或野生型DNA片段，既有利于打断，又不易打断突变位点。此外，片段长度不能小于200bp，否则会对低频突变的检出率有一定影响，而且会打断突变位点，造成检测结果不准确。更优选地，突变型DNA片段或野生型DNA片段的长度为300bp、500bp、1000bp或2000bp。
在一优选实施方式中，片段化突变型DNA样本长度为100bp-300bp。优选地，片段化突变型DNA样本长度为150bp-200bp。当然，可以理解的是，在实际检测过程中，可以根据检测的样本不同，片段化突变型DNA样本长度可以被打断成与目标野生型基因组DNA相匹配的长度，制备不同的质控品。
在一优选实施方式中，质粒可以选自T载体，进一步选自pMD18-T、
T、
T或pMD19-T载体。
优选地，野生型DNA片段与质粒连接方式是T-A连接。
优选地，突变型DNA片段与质粒连接方式是T-A连接。
此外，用于本发明的突变型质粒转化的细胞优选DH5α感受态细胞，当然可以理解的是，其它能够实现菌株保种的细胞也在本发明可选范围之列。
在一优选实施方式中，随机打断为超声打断、酶切打断或离心打断。当然，可以理解的是，本发明不对打断方式做过多限制，能够实现随机打断，得到片段化突变型DNA样本的打断方式均可。
在一优选实施方式中，片段化突变型DNA样本包含点突变DNA、插入突变DNA、缺失突变DNA或基因融合突变DNA中的一种。
具体而言，片段化突变型DNA样本为人EGFR基因第21外显子的L858R突变DNA、人EGFR基因第20外显子的T790M突变DNA、人EGFR基因第19外显子E746_A750DEL-1缺失突变DNA或人EML4-ALK基因融合突变DNA中的一种。当然可以理解的是，片段化突变型DNA样本还可以为其它突变型DNA。
在一优选实施方式中，含有片段化野生型基因组DNA的样本为健康人血浆样本、经抽提的健康人血浆游离DNA、打断的健康人白细胞基因组DNA或FFPE组织样本DNA中的一种。当然可以理解的是，含有片段化野生型基因组DNA的样本不限于本发明所列举的片段化野生型基因组DNA的样本。
在一优选实施方式中，将片段化突变型DNA样本与片段化野生型基因组DNA混合，制得质控品。其中，片段化突变型DNA样本片段化突变型DNA样本占片段化野生型基因组DNA的样本拷贝数比例为0.01％～50％。优选地，片段化突变型DNA样本占片段化野生型基因组DNA的样本拷贝数比例为0.1％～1％。更优选地，片段化突变型DNA样本占片段化野生型基因组DNA的样本拷贝数比例为0.1％、0.5％或1％。更为重要的是，即便是0.01％拷贝数掺杂也可被准确检出，因此，制备的质控品适用于高灵敏度的突变检测质量控制。
该方法可以通过对突变型DNA片段随机打断的步骤的调控，即可满足不同检测样本的需求，也就是说，随机打断时可以根据不同的检测样本，打断出与之相适应的片段长度。另外，该方法操作简单，相比于合成方法，无需对序列两端加酶切位点及保护性碱基。
基于该方法制备的质控品，由于突变型DNA片段为随机打断，断点随机，制备的质控品可以更真实地模拟临床样本。而直接PCR扩增或合成得到的DNA片段，其突变位点在片段中的位置都是固定的，不能反映石蜡包埋(FFPE)样本或血浆样本的真实情况；而且片段长度也是一定的。因此，用PCR扩增或合成的DNA片段制备的质控品，无法真实地模拟临床样本。
本发明还提供了一种用于检测片段化DNA突变的质控品。
一种用于检测片段化DNA突变的质控品，根据本发明的用于检测片段化DNA突变的质控品的制备方法获得。
该质控品优点在于，质控品断点随机，可以更真实地模拟临床样本。质控品中掺杂不同比例的片段化突变型DNA均可被检测到，检测到的突变比例均与理论突变比例相符。进而说明，该质控品可用于检测片段化DNA样本中基因突变的质量控制。
以下结合具体实施例对本发明作进一步的阐述。
实施例1
主要试剂与材料
KOD Plus Mutagenesis Kit购自东洋纺(上海)生物科技有限公司。
PCR所用引物购自生工生物工程(上海)股份有限公司。
感受态大肠杆菌DH5α、Universal DNA纯化回收试剂盒和无内毒素质粒中量提取试剂盒均购自天根生化(北京)有限公司。
pMD18-T载体质粒购自宝生物工程(大连)有限公司。
组织基因组抽提试剂QIAamp DNA FFPE Tissue Kit、全血基因组抽提试剂QIAampDNA blood Mini Kit均购自QIAGEN China(shanghai)Co.，Ltd.。
血浆游离DNA提取纯化试剂盒(吸附柱法)和人类EGFR基因突变定量检测试剂盒(荧光PCR法)均购自格诺思博生物科技南通有限公司。
文库构建所用Ion AmpliSeqTM Library Kit 2.0，制备上机芯片所用Ion PITemplate OT2 200Kit v3(Cat.no.4488318)、Ion OneTouch 2System和Ion PI Chip v2，上机测序所用Ion PI Sequencing 200Kit v3和Ion Proton System测序仪，均购自Thermo公司。
取健康人抗凝血200微升，用全血基因组抽提试剂盒(QIAamp DNA blood MiniKit)抽提得到人EGFR基因第21外显子的L858R野生型DNA。用引物(表1中SEQ ID NO:7～SEQID NO:8)进行扩增，扩增出2000bp长度的野生型DNA片段。
将野生型DNA片段与质粒pMD18-T载体连接，连接方式是T-A连接，再加入到100微升的DH5α感受态细胞中，冰中放置30分钟，加入500微升SOC培养基，37℃培养箱中，培养60分钟，培养结束后，将培养液涂布在含有X-Gal、IPTG、Amp的L-琼脂平板培养基上过夜培养，形成单菌落。
挑选白色菌落，进行测序验证，测序结果证明已成功构建人EGFR基因第21外显子的L858R野生型质粒。
人EGFR基因第21外显子的L858R突变型质粒制备：
以人EGFR基因第21外显子的L858R野生型质粒为模板，用定点突变引物(表1中SEQID NO:9～SEQ ID NO:10)进行扩增，将扩增产物胶回收，用Dpn I酶酶切产物，再加入到100微升的DH5α感受态细胞中，冰中放置30分钟，加入500微升SOC培养基，37℃培养箱中，培养60分钟，培养结束后，将培养液涂布在含有X-Gal、IPTG、Amp的L-琼脂平板培养基上过夜培养，形成单菌落，
挑选白色菌落，得到人EGFR基因第21外显子的L858R突变型质粒。经测序验证正确。将菌液保种，可于-70℃长期保存。构建的质粒及所用引物见表1。
突变型DNA片段的获得：
将人EGFR基因第21外显子的L858R突变型质粒经引物(表1中SEQ ID NO:1～SEQID NO:8)扩增，
PCR扩增方式为先98℃、30秒下进行预变性，然后进行35个循环的扩增(变性：98℃、30秒，退火：72℃、120秒)。
将上述扩增后的突变型质粒纯化处理后，得到300、500、1000、2000bp人EGFR基因第21外显子的L858R突变型片段。
使用打断仪Covaris S220打断不同长度的突变型DNA片段，得到长度集中在100-300bp的范围内人EGFR基因第21外显子的L858R突变型片段化DNA样本。用Qsep100DNAAnalyzer测定上述打断产物的DNA片段长度分布，并用Qubit进行定量。使用格诺思博生物科技南通有限公司的人类EGFR基因突变定量检测试剂盒(荧光PCR法)确定突变型DNA拷贝数。
使用格诺思博生物科技南通有限公司的核酸提取纯化试剂盒(吸附柱法)，提取健康人血浆游离DNA，Qubit定量。使用格诺思博生物科技南通有限公司的人类EGFR基因突变定量检测试剂盒(荧光PCR法)确定野生型DNA拷贝数。
将人EGFR基因第21外显子的L858R突变型片段化DNA样本(由300bp人EGFR基因第21外显子的L858R突变型片段打断而成)与经抽提的健康人血浆游离DNA混合，其中，人EGFR基因第21外显子的L858R突变型片段化DNA样本占经抽提的健康人血浆游离DNA中野生型DNA拷贝数比例为0.1％，得到质控品A1。
将人EGFR基因第21外显子的L858R突变型片段化DNA样本(由500bp人EGFR基因第21外显子的L858R突变型片段打断而成)与经抽提的健康人血浆游离DNA混合，其中，人EGFR基因第21外显子的L858R突变型片段化DNA样本占经抽提的健康人血浆游离DNA中野生型DNA拷贝数比例为0.1％，得到质控品A2。
将人EGFR基因第21外显子的L858R突变型片段化DNA样本(由1000bp人EGFR基因第21外显子的L858R突变型片段打断而成)与经抽提的健康人血浆游离DNA，其中，人EGFR基因第21外显子的L858R突变型片段化DNA样本占经抽提的健康人血浆游离DNA中野生型DNA拷贝数比例为0.1％，得到质控品A3。
将人EGFR基因第21外显子的L858R突变型片段化DNA样本(由2000bp人EGFR基因第21外显子的L858R突变型片段打断而成)与经抽提的健康人血浆游离DNA混合，其中，人EGFR基因第21外显子的L858R突变型片段化DNA样本占经抽提的健康人血浆游离DNA中野生型DNA拷贝数比例为0.1％，得到质控品A4。
同理，将人EGFR基因第21外显子的L858R突变型片段化DNA样本与经抽提的健康人血浆游离DNA混合，其中，人EGFR基因第21外显子的L858R突变型片段化DNA样本占经抽提的健康人血浆游离DNA中野生型DNA拷贝数比例为0.5％，得到质控品B1(由300bp人EGFR基因第21外显子的L858R突变型片段打断而成)、质控品B2(由500bp人EGFR基因第21外显子的L858R突变型片段打断而成)、质控品B3(由1000bp人EGFR基因第21外显子的L858R突变型片段打断而成)、质控品B4(由2000bp人EGFR基因第21外显子的L858R突变型片段打断而成)。
同理，将人EGFR基因第21外显子的L858R突变型片段化DNA样本与经抽提的健康人血浆游离DNA混合，其中，人EGFR基因第21外显子的L858R突变型片段化DNA样本占经抽提的健康人血浆游离DNA中野生型DNA拷贝数比例为1％，得到质控品C1(由300bp人EGFR基因第21外显子的L858R突变型片段打断而成)、质控品C2(由500bp人EGFR基因第21外显子的L858R突变型片段打断而成)、质控品C3(由1000bp人EGFR基因第21外显子的L858R突变型片段打断而成)、质控品C4(由2000bp人EGFR基因第21外显子的L858R突变型片段打断而成)。检测结果见表2。
实施例2
用全血基因组抽提试剂盒(QIAamp DNA blood Mini Kit)抽提得到人EGFR基因第20外显子的T790M野生型DNA。实验方法与实施例1基本相同，不同之处在于，用引物(表1中SEQ ID NO:17～SEQ ID NO:18)进行扩增，扩增出2000bp长度的野生型DNA片段构建野生型质粒。定点突变引物序列选自表1中SEQ ID NO:19～SEQ ID NO:20；突变型DNA片段的构建所需引物序列选自表1中SEQ ID NO:11～SEQ ID NO:18。
将人EGFR基因第20外显子的T790M突变型片段化DNA样本与经抽提的健康人血浆游离DNA混合。其中，人EGFR基因第20外显子的T790M突变型片段化DNA样本占经抽提的健康人血浆游离DNA中野生型DNA拷贝数比例为0.1％。得到质控品D1(由300bp人EGFR基因第20外显子的T790M突变型片段打断而成，质控品D2(由500bp人EGFR基因第20外显子的T790M突变型片段打断而成)，质控品D3(由1000bp人EGFR基因第20外显子的T790M突变型片段打断而成)，质控品D4(由1000bp人EGFR基因第20外显子的T790M突变型片段打断而成)。
将人EGFR基因第20外显子的T790M突变型片段化DNA样本与经抽提的健康人血浆游离DNA混合。其中，人EGFR基因第20外显子的T790M突变型片段化DNA样本占经抽提的健康人血浆游离DNA中野生型DNA拷贝数比例为0.5％。得到质控品E1(由300bp人EGFR基因第20外显子的T790M突变型片段打断而成)，质控品E2(由500bp人EGFR基因第20外显子的T790M突变型片段打断而成)，质控品E3(由1000bp人EGFR基因第20外显子的T790M突变型片段打断而成)，质控品E4(由1000bp人EGFR基因第20外显子的T790M突变型片段打断而成)。
将人EGFR基因第20外显子的T790M突变型片段化DNA样本与经抽提的健康人血浆游离DNA混合。其中，人EGFR基因第20外显子的T790M突变型片段化DNA样本占经抽提的健康人血浆游离DNA中野生型DNA拷贝数比例为1％。得到质控品F1(由300bp人EGFR基因第20外显子的T790M突变型片段打断而成)，质控品F2(由500bp人EGFR基因第20外显子的T790M突变型片段打断而成)，质控品F3(由1000bp人EGFR基因第20外显子的T790M突变型片段打断而成)，质控品F4(由1000bp人EGFR基因第20外显子的T790M突变型片段打断而成)。检测结果见表3。
实施例3
用全血基因组抽提试剂盒(QIAamp DNA blood Mini Kit)抽提得到人EGFR基因第19外显子E746_A750DEL-1野生型DNA。实验方法与实施例1基本相同，不同之处在于，用引物(表1中SEQ ID NO:27～SEQ ID NO:28)进行扩增，扩增出2000bp长度的野生型DNA片段构建野生型质粒；定点突变引物序列选自表1中SEQ ID NO:29～SEQ ID NO:30；突变型DNA片段的构建所需引物序列选自表1中SEQ ID NO:11～SEQ ID NO:18。
将人EGFR基因第19外显子E746_A750DEL-1突变型片段化DNA样本与经抽提的健康人血浆游离DNA混合。其中，人EGFR基因第19外显子E746_A750DEL-1突变型片段化DNA样本占经抽提的健康人血浆游离DNA中野生型DNA拷贝数比例为0.1％。得到质控品G1(由300bp人EGFR基因第19外显子E746_A750DEL-1突变型片段打断而成)，质控品G2(由500bp人EGFR基因第19外显子E746_A750DEL-1突变型片段打断而成)，质控品G3(由1000bp人EGFR基因第19外显子E746_A750DEL-1突变型片段打断而成)，质控品G4(由2000bp人EGFR基因第19外显子E746_A750DEL-1突变型片段打断而成)。
将人EGFR基因第19外显子E746_A750DEL-1突变型片段化DNA样本与经抽提的健康人血浆游离DNA混合。其中，人EGFR基因第19外显子E746_A750DEL-1突变型片段化DNA样本占经抽提的健康人血浆游离DNA中野生型DNA拷贝数比例为0.5％。得到质控品H1(由300bp人EGFR基因第19外显子E746_A750DEL-1突变型片段打断而成)，质控品H2(由500bp人EGFR基因第19外显子E746_A750DEL-1突变型片段打断而成)，质控品H3(由1000bp人EGFR基因第19外显子E746_A750DEL-1突变型片段打断而成)，质控品H4(由2000bp人EGFR基因第19外显子E746_A750DEL-1突变型片段打断而成)。
将人EGFR基因第19外显子E746_A750DEL-1突变型片段化DNA样本与经抽提的健康人血浆游离DNA混合。其中，人EGFR基因第19外显子E746_A750DEL-1突变型片段化DNA样本占经抽提的健康人血浆游离DNA中野生型DNA拷贝数比例为1％。得到质控品I1(由300bp人EGFR基因第19外显子E746_A750DEL-1突变型片段打断而成)，质控品I2(由500bp人EGFR基因第19外显子E746_A750DEL-1突变型片段打断而成)，质控品I3(由1000bp人EGFR基因第19外显子E746_A750DEL-1突变型片段打断而成)，质控品I4(由2000bp人EGFR基因第19外显子E746_A750DEL-1突变型片段打断而成)。检测结果见表4。
实施例4
用组织基因组抽提试剂盒(QIAamp DNA FFPE Tissue Kit)从NCI-H2228细胞株抽提含人EML4-ALK基因融合突变型DNA的基因组DNA。用引物(表1中SEQ ID NO:37～SEQ IDNO:38)进行扩增，扩增出2000bp长度的突变型DNA片段。
人EML4-ALK基因融合突变型质粒制备：
将突变型DNA片段与质粒pMD18-T载体连接，连接方式是T-A连接，再加入到100微升的DH5α感受态细胞中，冰中放置30分钟，加入500微升SOC培养基，37℃培养箱中，培养60分钟，培养结束后，将培养液涂布在含有X-Gal、IPTG、Amp的L-琼脂平板培养基上过夜培养，形成单菌落。
挑选白色菌落，进行测序验证，测序结果证明已成功构建人EML4-ALK基因融合突变型质粒。
突变型DNA片段的获得：
将人EML4-ALK基因融合突变型质粒经引物(表1中SEQ ID NO:31～SEQ ID NO:38)扩增，
PCR扩增方式为先94℃、120秒下进行预变性，然后进行40个循环的扩增(变性：98℃、10秒，退火：65℃、30秒，延伸：68℃、90秒)。
将上述扩增后的突变型质粒纯化处理后，得到300、500、1000、2000bp人EML4-ALK基因融合突变型DNA片段，并用Qubit进行定量。
使用打断仪Covaris S220打断突变型DNA片段，得到长度集中在100-300bp的范围内的片段化突变型DNA样本。用Qsep100DNA Analyzer测定上述打断产物的DNA片段长度分布。
使用荧光定量PCR法确定突变型DNA拷贝数。将片段化突变型DNA样本中EML4-ALK基因融合突变片段用引物(表1中SEQ ID NO:39～SEQ ID NO:40)进行扩增定量。PCR扩增方式为先98℃、30秒下进行预变性，然后进行35个循环的扩增(变性：98℃、30秒，退火：72℃、120秒)。所用Taqman探针序列见表1(SEQ ID NO:43)。
使用格诺思博生物科技南通有限公司的核酸提取纯化试剂盒(吸附柱法)，提取健康人血浆游离DNA，Qubit定量。
使用荧光PCR法确定野生型DNA拷贝数。将健康人血浆游离DNA中EML4-ALK基因融合突变片段和总ALK基因片段分别用引物(表1中SEQ ID NO:39～SEQ ID NO:40和SEQ IDNO:41～SEQ ID NO:42)进行扩增定量。PCR扩增方式为先98℃、30秒下进行预变性，然后进行35个循环的扩增(变性：98℃、30秒，退火：72℃、120秒)。所用Taqman探针序列见表1(SEQID NO:43)。通过总ALK基因片段拷贝数减去EML4-ALK基因融合突变片段拷贝数算得经抽提的健康人血浆游离DNA拷贝数。
将人EML4-ALK基因融合突变型片段化DNA样本与经抽提的健康人血浆游离DNA混合。其中，人EML4-ALK基因融合突变型片段化DNA样本占经抽提的健康人血浆游离DNA中野生型DNA拷贝数比例为0.1％。得到质控品J1(由300bp人EML4-ALK基因融合突变型片段打断而成)，质控品J2(由500bp人EML4-ALK基因融合突变型片段打断而成)，质控品J3(由1000bp人EML4-ALK基因融合突变型片段打断而成)，质控品J4(由2000bp人EML4-ALK基因融合突变型片段打断而成)。
将人EML4-ALK基因融合突变型片段化DNA样本与经抽提的健康人血浆游离DNA混合。其中，人EML4-ALK基因融合突变型片段化DNA样本占经抽提的健康人血浆游离DNA中野生型DNA拷贝数比例为0.5％。得到质控品K1(由300bp人EML4-ALK基因融合突变型片段打断而成)，质控品K2(由500bp人EML4-ALK基因融合突变型片段打断而成)，质控品K3(由1000bp人EML4-ALK基因融合突变型片段打断而成)，质控品K4(由2000bp人EML4-ALK基因融合突变型片段打断而成)。
将人EML4-ALK基因融合突变型片段化DNA样本与经抽提的健康人血浆游离DNA混合。其中，人EML4-ALK基因融合突变型片段化DNA样本占经抽提的健康人血浆游离DNA中野生型DNA拷贝数比例为1％。得到质控品L1(由300bp人EML4-ALK基因融合突变型片段打断而成)，质控品L2(由500bp人EML4-ALK基因融合突变型片段打断而成)，质控品L3(由1000bp人EML4-ALK基因融合突变型片段打断而成)，质控品L4(由2000bp人EML4-ALK基因融合突变型片段打断而成)。检测结果见表5。
表1
性能测试
文库构建
通过Ion Torrent Proton测序平台验证，选择合适的突变DNA片段长度，具体操作如下：
采用Ion AmpliSeqTM Library Kit 2.0(Cat.no.4475345)进行文库构建。
文库质检，采用Qubit 3.0Fluorometer进行定量检测。
测序
芯片制备：采用Ion PI Template OT2 200Kit v3(Cat.no.4488318)、IonOneTouch 2System和Ion PI Chip v2，对上述构建好的文库制备上机芯片。
上机测序：采用Ion PI Sequencing 200Kit v3和Ion Proton System测序仪进行测序反应。
表2
表3
表4
表5
从表2—表5中可以看出，质控品中掺杂不同比例的片段化突变型DNA均可被检测到，检测到的突变比例均与理论突变比例相符。说明本发明的质控品能准确地模拟真实临床样本的情况，可用于检测片段化DNA样本中基因突变的质量控制。
血浆质控品的稳定性验证
为了考察血浆质控品的稳定性，野生型基因组DNA选自健康人血浆样本，制备的质控品以血浆的形式保存，保存时间更长。也可以更好地对包括血浆DNA提取等血浆样本NGS检测的全过程进行质量控制。
采用同实施例1中的方法构建长度为1000bp的人EGFR基因第21外显子的L858R突变型DNA片段，将长度为1000bp的人EGFR基因第21外显子的L858R突变型DNA片段打断成100-300bp长度的片段化突变型DNA样本，再与健康人血浆样本混合，制备片段化突变型DNA样本占健康人血浆样本中野生型DNA拷贝数比例分别为0.1％的质控品M1，0.5％的质控品M2和1％的质控品M3。即时检测。用格诺思博生物科技南通有限公司的核酸提取纯化试剂盒(吸附柱法)提取血浆质控品的游离DNA，采用Ion Torrent Proton测序平台检测。结果见表6。表6为血浆质控品的稳定性检测结果。
将长度为1000bp的人EGFR基因第21外显子的L858R突变型DNA片段打断成100-300bp长度的片段化突变型DNA样本，再与健康人血浆混合，置于-80℃冰箱中保存。保存3个月后，制备片段化突变型DNA样本占健康人血浆样本中野生型DNA拷贝数比例分别为0.1％的质控品N1，0.5％的质控品N2和1％的质控品N3。然后测序检测，DNA提取方法和测序检测同上。结果见表6。
此外，将长度为1000bp的人EGFR基因第21外显子的L858R突变型DNA片段打断成100-300bp长度的片段化突变型DNA样本，再与健康人血浆混合，置于-80℃冰箱中保存。保存6个月后，制备片段化突变型DNA样本占健康人血浆样本中野生型DNA拷贝数比例分别为0.1％的质控品O1，0.5％的质控品O2和1％的质控品O3。然后测序检测，DNA提取方法和测序检测同上。结果见表6。
同理，将长度为1000bp的人EGFR基因第20外显子的T790M突变型DNA片段打断成100-300bp长度的片段化突变型DNA样本，再与健康人血浆混合，制备片段化突变型DNA样本占健康人血浆样本中野生型DNA拷贝数比例分别为0.1％的质控品P1，0.5％的质控品P2和1％的质控品P3。即时检测。用格诺思博生物科技南通有限公司的核酸提取纯化试剂盒(吸附柱法)提取血浆质控品的游离DNA，采用Ion Torrent Proton测序平台检测。结果见表6。
将长度为1000bp的人EGFR基因第20外显子的T790M突变型DNA片段打断成100-300bp长度的片段化突变型DNA样本，再与健康人血浆混合，置于-80℃冰箱中保存。保存3个月后，制备片段化突变型DNA样本占健康人血浆样本中野生型DNA拷贝数比例分别为0.1％的质控品Q1，0.5％的质控品Q2和1％的质控品Q3。然后测序检测，DNA提取方法和测序检测同上。结果见表6。
将长度为1000bp的人EGFR基因第20外显子的T790M突变型DNA片段打断成100-300bp长度的片段化突变型DNA样本，再与健康人血浆混合，置于-80℃冰箱中保存。保存6个月后，制备片段化突变型DNA样本占健康人血浆样本中野生型DNA拷贝数比例分别为0.1％的质控品R1，0.5％的质控品R2和1％的质控品R3。然后测序检测，DNA提取方法和测序检测同上。结果见表6。
同理，将长度为1000bp的人EGFR基因第19外显子E746_A750DEL-1突变型DNA片段打断成100-300bp长度的片段化突变型DNA样本，再与健康人血浆混合，制备片段化突变型DNA样本占健康人血浆样本中野生型DNA拷贝数比例分别为0.1％的质控品S1，0.5％的质控品S2和1％的质控品S3。即时检测。用格诺思博生物科技南通有限公司的核酸提取纯化试剂盒(吸附柱法)提取血浆质控品的游离DNA，采用Ion Torrent Proton测序平台检测。结果见表6。
将长度为1000bp的人EGFR基因第19外显子E746_A750DEL-1突变型DNA片段打断成100-300bp长度的片段化突变型DNA样本，再与健康人血浆混合，置于-80℃冰箱中保存。保存3个月后。制备片段化突变型DNA样本占健康人血浆样本中野生型DNA拷贝数比例分别为0.1％的质控品T1，0.5％的质控品T2和1％的质控品T3。然后测序检测，DNA提取方法和测序检测同上。结果见表6。
将长度为1000bp的人EGFR基因第19外显子E746_A750DEL-1突变型DNA片段打断成100-300bp长度的片段化突变型DNA样本，再与健康人血浆混合，置于-80℃冰箱中保存。保存6个月后。制备片段化突变型DNA样本占健康人血浆样本中野生型DNA拷贝数比例分别为0.1％的质控品U1，0.5％的质控品U2和1％的质控品U3。然后测序检测，DNA提取方法和测序检测同上。结果见表6。
表6
以上结果显示，血浆质控品在保存六个月后，质控品中掺杂不同比例的片段化突变型DNA均可被检测到。检测到的突变比例均与理论突变比例相符，说明本发明的血浆质控品具有良好的稳定性。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 上海格诺生物科技有限公司
格诺思博生物科技南通有限公司
<120> 用于检测片段化DNA突变的质控品及其制备方法
<160> 43
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atctgtccct cacagca 17
<210> 2
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gagcatcctc ccctg 15
<210> 3
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ccagccataa gtcctcg 17
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
atcctcattc actgtccc 18
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ggcaagtcca gtaagttca 19
<210> 6
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tgggagggca ttcg 14
<210> 7
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
aggcatccgt caagca 16
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ggattatgac tcaccgtagc 20
<210> 9
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
gatcacagat tttgggcggg ccaaactgct gggtg 35
<210> 10
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
cacccagcag tttggcccgc ccaaaatctg tgatc 35
<210> 11
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
ccatgcgaag ccaca 15
<210> 12
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
cttgctatcc caggagc 17
<210> 13
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
gcgtaaacgt ccctgtg 17
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
caacttgatt gaatccaaaa 20
<210> 15
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
ttcctacagg ccctcatg 18
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
gctccactcc accactatca 20
<210> 17
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
tttagcttcc tcagcccaa 19
<210> 18
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
gacctgccca ggccgggtg 19
<210> 19
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
ccaccgtgca gctcatcatg cagctcatgc cct 33
<210> 20
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
agggcatgag ctgcatgatg agctgcacgg tgg 33
<210> 21
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
caccttcggg gtgc 14
<210> 22
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
aggatgtgga gatgagc 17
<210> 23
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
gtgattcgtg gagccc 16
<210> 24
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
cctgtttcca gcctttt 17
<210> 25
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
gggccattga ccttg 15
<210> 26
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
gcacgccatc atattctag 19
<210> 27
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
gagaaggcgt acatttg 17
<210> 28
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
atgaggcgga ggatat 16
<210> 29
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
aaaattcccg tcgctatcaa aacatctccg aaagccaa 38
<210> 30
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
ttggctttcg gagatgtttt gatagcgacg ggaatttt 38
<210> 31
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
tttaaataga gtcggcggt 19
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<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
agagtgggct agtgcat 17
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<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
aactcctggg ctcaagca 18
<210> 34
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
accttggctc acaggctg 18
<210> 35
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
accagctgca acgtggtta 19
<210> 36
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
ctatgcaatg gaccgaccgt 20
<210> 37
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
gtaacttctg gctacttgct 20
<210> 38
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
gagccacatc atgaaaagat c 21
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<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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aatatagtaa ctagtatc 18
<210> 40
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
agctttcacc atcg 14
<210> 41
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 41
gtatcctcct ggctgat 17
<210> 42
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 42
gagctttcac catcgt 16
<210> 43
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 43
ctccttcagt gtccatc 17
Claims (10)
1.一种用于检测片段化DNA突变的质控品的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
以突变型基因组DNA为模板，经引物扩增，得到突变型DNA片段,所述突变型DNA片段的长度为500-2000bp；
将所述突变型DNA片段随机打断，得到片段化突变型DNA样本，将片段化突变型DNA样本与含有片段化野生型基因组DNA的样本混合，制得质控品；所述随机打断是指打断的位点随机，所述随机打断为超声打断，所述片段化突变型DNA样本的长度在100-300bp的范围内；
或
以突变型基因组DNA为模板，经引物扩增，得到突变型DNA片段前体，将所述突变型DNA片段前体与质粒连接，得到突变型质粒；
再经引物扩增或酶切，得到突变型DNA片段,所述突变型DNA片段的长度为500-2000bp；
将所述突变型DNA片段随机打断，得到片段化突变型DNA样本，将片段化突变型DNA样本与含有片段化野生型基因组DNA的样本混合，制得质控品；所述随机打断是指打断的位点随机，所述随机打断为超声打断，所述片段化突变型DNA样本的长度在100-300bp的范围内；
或
以人目标基因位点为野生型的DNA为模板，经引物扩增，得到野生型DNA片段；
将所述野生型DNA片段与质粒连接，构建野生型质粒；
再以所述野生型质粒为模板，经定点突变引物扩增，制得突变型质粒；其中，所述定点突变引物含有突变位点；
突变型质粒再经引物扩增或酶切，得到突变型DNA片段,所述突变型DNA片段的长度为500-2000bp；
将所述突变型DNA片段随机打断，得到片段化突变型DNA样本，将片段化突变型DNA样本与含有片段化野生型基因组DNA的样本混合，制得质控品；
所述随机打断是指打断的位点随机，所述随机打断为超声打断，所述片段化突变型DNA样本的长度在100-300bp的范围内。
2.根据权利要求1所述用于检测片段化DNA突变的质控品的制备方法，其特征在于，所述引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1~ SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.11~ SEQ ID NO.18、SEQID NO.21~ SEQ ID NO.28、SEQ ID NO.31~ SEQ ID NO.38。
3.根据权利要求1所述用于检测片段化DNA突变的质控品的制备方法，其特征在于，所述定点突变引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.9~ SEQ ID NO.10、
SEQ ID NO.19~ SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.29~ SEQ ID NO.30。
4.根据权利要求1所述用于检测片段化DNA突变的质控品的制备方法，其特征在于，所述片段化突变型DNA样本的长度为100bp-300bp。
5.根据权利要求1所述用于检测片段化DNA突变的质控品的制备方法，其特征在于，所述突变型基因组DNA为突变细胞株基因组DNA。
6.根据权利要求1所述用于检测片段化DNA突变的质控品的制备方法，其特征在于，所述突变型基因组DNA为突变肿瘤组织DNA。
7.根据权利要求1所述用于检测片段化DNA突变的质控品的制备方法，其特征在于，所述含有片段化野生型基因组DNA的样本为健康人血浆样本、经抽提的健康人血浆游离DNA、打断的健康人白细胞基因组DNA或FFPE组织样本DNA中的一种。
8.根据权利要求1所述用于检测片段化DNA突变的质控品的制备方法，其特征在于，所述片段化突变型DNA样本占片段化野生型基因组DNA的样本拷贝数比例为0.01%~50%。
9.根据权利要求1所述用于检测片段化DNA突变的质控品的制备方法，其特征在于，所述片段化突变型DNA样本为点突变DNA、插入突变DNA、
缺失突变DNA或基因融合突变DNA中的一种。
10.根据权利要求9所述用于检测片段化DNA突变的质控品的制备方法，其特征在于，所述片段化突变型DNA样本为人EGFR基因第21外显子的L858R突变DNA、人EGFR基因第20外显子的T790M突变DNA、人EGFR基因第19 外显子E746_A750 DEL-1缺失突变DNA或人EML4-ALK基因融合突变DNA中的一种。
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