CN114622018A - 用于检测met基因14号外显子跳跃突变的引物及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及MET基因检测技术领域，尤其涉及用于检测MET基因14号外显子跳跃突变的引物及方法，所述引物包括用于扩增样本的MET 13‑15号外显子片段的测序扩增引物MET.E13E15_F和MET.E13E15_R，所述方法包括如下步骤：a.从受试者样本中提取RNA；b.对RNA样本进行RT‑PCR扩增；c.对RT‑PCR扩增产物进行纯化后，使用上述测序扩增引物对纯化产物进行目标片段的扩增；d.对经步骤c扩增的产物纯化后，进行测序反应，并对测序结果进行分析。本发明针对MET基因14号外显子跳跃突变检测设计了测序扩增引物，使用该引物通过PCR‑Sanger测序法进行检测。本发明的检测方法经方法学验证实验进行评价，具有精密好、准确性高、灵敏度好的特点。
Description
【技术领域】
本发明涉及MET基因检测技术领域，尤其涉及用于检测MET基因14号外显子跳跃突变的引物及方法。
【背景技术】
MET也称c-Met或肝细胞生长因子（Hepatocyte Growth Factor，HFG）受体，具有酪氨酸激酶（Tyrosine kinase）活性，与多种癌基因产物和调节蛋白相关，参与细胞信息传导、细胞骨架重排的调控，是细胞增殖、分化和运动的重要因素。目前认为，c-met与多种癌的发生和转移密切相关，研究表明，许多肿瘤病人在其肿瘤的发生和转移过程中均有c-met过度表达和基因扩增。
在肺癌中，MET外显子14跳跃突变是NSCLC中仅次于EGFR激活突变的第二大可操作亚群(约4%)。证实在可行时可引起外显子跳跃，并与同时发生的MET扩增有关。与MET扩增类似，已经证明MET外显子14跳跃突变对MET抑制剂(如crizotinib、cabozantinib和capmatinib)具有敏感性。随着创新分子数量的增加，一个全面的肿瘤基因组图谱将很快成为必要的和必要的分层患者，以获得最合适和有效的治疗。现有的数据支持MET驱动基因突变与具有生物影响的肉瘤样成分的恶性肿瘤的发展之间的相关性，这与对标准治疗有耐药性的高度攻击性行为有关。这一观察为评估来自不同器官的肉瘤样恶性肿瘤中的MET改变提出了有趣的科学前景，这可能具有重要的治疗意义。因为，需要一种准确度高、灵敏度好的检测方法。
【发明内容】
本发明的目的在于提供用于检测MET基因14号外显子跳跃突变的引物及方法，利用RT- PCR方法，使用所设计的扩增引物对样本的MET 13-15号外显子片段进行扩增，利用Sanger平台测序进行序列确认。
为实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
一种用于检测MET基因14号外显子跳跃突变的引物，其特征在于：包括用于扩增样本的MET 13-15号外显子片段的测序扩增引物，所述测序扩增引物包括，
引物MET.E13E15_F，其序列如SEQ ID NO:1所示，
引物MET.E13E15_R，其序列如SEQ ID NO:2所示。
一种用于检测MET基因14号外显子跳跃突变的方法，其特征在于：包括如下步骤，
a. 从受试者样本中提取RNA；
b. 对RNA样本进行RT-PCR扩增；
c. 对RT-PCR扩增产物进行纯化后，使用上述测序扩增引物对纯化产物进行目标片段的扩增；
d. 对经步骤c扩增的产物纯化后，进行测序反应，并对测序结果进行分析。
作为本发明的进一步改进，所述步骤b的RT-PCR扩增程序为
作为本发明的进一步改进，所述步骤c中测序扩增的程序为
作为本发明的进一步改进，所述步骤d中使用Sanger平台进行测序。
与现有技术相比，本发明的有益之处在于：针对MET基因14号外显子跳跃突变检测设计了测序扩增引物，使用该引物通过PCR-Sanger测序法进行检测。本发明的检测方法经方法学验证实验进行评价，具有精密好、准确性高、灵敏度好的特点。
【附图说明】
图1是本发明的实施例3中批内精密度验证实验的谱图。
图2是本发明的实施例3中批间精密度验证实验的谱图1。
图3是本发明的实施例3中批间精密度验证实验的谱图2。
图4是本发明的实施例3中灵敏度（LOD）及干扰物验证实验的谱图。
【具体实施方式】
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明的范围。
实施例1
一种用于检测MET基因14号外显子跳跃突变的引物，包括用于扩增样本的MET 13-15号外显子片段的测序扩增引物，所述测序扩增引物包括，
引物MET.E13E15_F，其序列如SEQ ID NO:1所示，
引物MET.E13E15_R，其序列如SEQ ID NO:2所示。
实施例2
本实施例中所使用的仪器，包括：离心机（湖南湘仪TG16-WS）、PCR扩增仪（ABI9700）、凝胶电泳仪（Bio-Rad）、凝胶成像仪（勤翔-GenoSens1800系列）、测序仪（ABI3130XL）。
本实施例中所使用的试剂，包括：Deparaffinization Solution （Qiagen-19093）、RecoverAll™ Multi-Sample RNA/DNA Isolation Workflow（Invitrogen-A26069）、SuperScriptTM Ⅳ One-Step RT-PCR System（Invitrogen-12594025）、QIAquickPCR Purification Kit（Qiagen-28104）、BigDye Terminator v3.1 Cycle SequencingKit（ABI-4336917）。
一种用于检测MET基因14号外显子跳跃突变的方法，包括如下步骤，
a. 从受试者样本中提取RNA，具体操作步骤如下：
a1. 配置如下试剂：
Wash 1：第一次使用时，加入 42ml 无水乙醇(≥99.8%)，配置为 Wash 1 Buffer。
Wash 2/3：第一次使用时，加入 48ml 无水乙醇(≥99.8%)，配置为 Wash 2/3Buffe。
Digestion Buffer：对 Digestion Buffer 使用 Nuclease-Free Water 稀释5倍，即每 25μl Digestion Buffer 加入 75μl Nuclease-Free Water 配置为工作液。
a2. 对样本进行脱蜡处理：
向1.5mL离心管加入1mL脱蜡液，刮取组织切片样本至1.5mL离心管中，剧烈震荡10s后，瞬时离心，使样本沉降至管底；50℃孵育3min，置于室温回温后，16800g离心5min；小心移除所有上清液至最少残留，若组织漂动时，即时停止吸取上清液以避免组织遗失。
a3. RNA提取
1) 向1.5ml离心管中的剩余液体中分别加入100μL的稀释后的Digestion Buffer与4μL的Protease，轻弹管壁以拍散组织结块，若是组织粘在管壁上，使用枪头将组织推到液面下。
2) 55℃孵育1h后，短暂离心沉降，吸掉多余的脱蜡液。
3) 90℃孵育1h后，短暂离心沉降，吸掉多余的脱蜡液。
4) 将金属浴温度调至95℃，将Nuclease-Free Water放置于95℃预热。
5) 加入120μL的Isolation Additive，并使用移液枪混合均匀。
6) 小心转移全部液体到Filter Cartridges中，10000g离心30s，弃掉FilterCartridges。
7) 拿取新的Filter Cartridge，标上相对应的编号，放置在新的 collectiontube。
8) 在装有 RNA 液体的collection tube中，加入1.25倍体积的100% 乙醇（约275μL），用移液枪吹打混匀。
9) 吸取混合液到准备好的新的Filter Cartridges中。
10) 以10000g离心30s，除去下层溶液，将Filter Cartridges重新放回原来的collection tube中。
11) 加入600μL的Wash 1 Buffer到Filter Cartridges中，以10000g离心30s，除去下层溶液，将Filter Cartridges重新放回原来的collection tube中。
12) 再以10000g离心30s，除去下层溶液，将Filter Cartridges重新放回原来的collection tube中。
13) 配制DNase Mix: 每一个反应需混和4μL的DNase、6μL的10x DNase Buffer与50μL的Nuclease-Free Water， 反复反转小管以混和均匀，短暂离心沉降。按照当次实验的反应数量n+1个量。
14) 将DNase Mix小心加到RNA的Filter Cartridges中，室温孵育30min。
15) 加入600μL的Wash 1 Buffer到Filter Cartridges中，室温孵育1min后，以10000g离心30s，去除下层溶液，将Filter Cartridges重新放回空的collection tube中。
16) 加入500μL的Wash 2/3 Buffer到Filter Cartridges中，以 10000g离心3min，移除残余的液体。
17) 再次加入500μL的Wash 2/3 Buffer，10000g离心30s，倒弃滤液。
18) 全速（168000g）离心3min，倒弃残余液体。
19) 将Filter Cartridges套在一个新的1.5mL离心管中，加入50μL 95℃预热好的Nuclease-Free Water。
20) 室温静置1min后，全速（16800g）离心1min。
21) 弃掉洗脱柱，盖上离心管盖子。如果暂不进行下游反应，请将RNA 保存于-80℃中。
22）使用Nanodrop进行RNA浓度定量。若RNA浓度小于2ng/μL，则进行富集复测。
b. 对RNA样本进行RT-PCR扩增，具体操作步骤如下：
1) 使用 SuperScript™ IV One-Step RT-PCR System试剂盒进行RT-PCR扩增，使试剂盒中组分置于冰盒上融化后振荡混匀，瞬时离心将管盖及管壁的残留溶液离至底部。
2) 按以下表1的反应体系配置 RT-PCR 混合液（单人份），分别加入96孔板中。
表1 RT-PCR混合液的配置
| 组分 | 体积（μL） |
| RNA(100pg-200ng) | 8 |
| F primer (10μM) | 1.25 |
| R primer (10μM) | 1.25 |
| 2X master Mix | 12.5 |
| RT mix | 0.25 |
| Nuclease-Free Water | 1.75 |
| 总体积 | 25 |
3)加入待检测样本RNA至96孔板，封好板，瞬时离心，移至PCR仪按以下表2的程序扩增。
表2 RT-PCR的扩增程序
扩增结束后，取5μL PCR扩增产物进行3-4%琼脂糖凝胶电泳（180V,15min），观察是否有目的条带的扩增，阳性质控目的条带大小为100-250bp(146bp)，野生型目的条带大小为 250-500bp（287bp）。如样本孔无目的条带，重新加大浓度上机扩增。
c. 对RT-PCR扩增产物进行纯化后，使用上述测序扩增引物对纯化产物进行目标片段的扩增。具体操作步骤如下：
c1. RT-PCR扩增产物的纯化操作步骤如下：
1) 分别转移待纯化的RT-PCR扩增产物（20μL）至新的1.5mL离心管中，分别加入1005μL Buffer PB，混匀后转移至套在收集管的column内。
2) 13000rpm×1min，倒弃滤液，将column套回收集管。
3) 加入750μL Buffer PE，13000rpm×1min，倒弃滤液，将column套回收集管。
4) 13000rpm×3min，倒弃滤液，将column套在一个新的1.5mL离心管上，打开盖子室温静置5min。
5) 加入20μL Buffer EB至column膜中央处，静置1min后13000rpm×1min。丢弃column并在管子上作好标记。
6) 对纯化后的RT-PCR扩增产物用Nanodrop进行浓度定量。
c2. 使用上述测序扩增引物对步骤c1的纯化产物进行目标片段的扩增，具体操作步骤如下：
1） 使用1.5mL离心管，按如下表3的测序反应体系（单人份）配制测序PCR混合液，使用实施例1的测序扩增引物对每个样本的目标片段进行测序扩增。
表3 测序PCR混合液的配置
| 试剂 | 用量（μL） |
| PCR 纯化产物 | X(3-10ng) |
| BigDye Seqencing Buffer | 3 |
| BigDye | 2 |
| F primer (10μM) | 1 |
| 水（PCR 级） | 14-X |
| 总体积 | 20 |
2） 将反应液加入96孔板相应的位置，瞬时离心，将样本离心至管底。盖上封膜然后放上PCR仪，按以下表4的程序进行测序扩增：
表4 测序扩增程序
d. 对经步骤d扩增的产物进行纯化后，使用Sanger平台进行测序反应，并对测序结果进行分析。具体操作步骤如下：
d1. 测序PCR扩增产物的纯化操作步骤如下
1） 取出扩增完成的96孔PCR板，掀开封膜，分别向样本孔加入 2μL 125μM EDTA和 2μL 3MEDTA 醋酸钠（pH5.2）。
125μM EDTA 配置方法：20μL 0.5M EDTA与60μL去离子水混合均匀。
2） 再加入50μL无水乙醇，盖紧封口膜，振荡混匀，室温避光放置15min。
3） 4℃ 3000g离心30min，立即小心倒弃上清并翻转96孔PCR板扣于干净的吸水纸上980rmp离心3min。
4） 往有样本的每孔分别加入150μL 70%乙醇，4℃ 3000g离心15min，立即小心倒弃上清并翻转96孔PCR板扣于干净的吸水纸上980rmp离心3min。
5） 重复上述步骤4)操作一次。
6） 室温避光放置15-30min（让70%乙醇挥发干净）。
7） 根据ABI 3130XL仪器上机规则，往有样本的整2列每孔分别加入10μL甲酰胺（Hi-Di），震荡溶解DNA，瞬时离心。
d2. 将样本置于基因扩增仪上，95℃变性4min，迅速置冰上冷却4min后，使用Sanger平台进行测序反应，使用Sequencing Analysis v5.2 分析软件对测序结果进行分析。
实施例3
检测MET基因14号外显子跳跃突变方法的验证实验
按照如下表5所示，准备验证实验样本。
表5 验证实验样本信息
| 序号 | 样本号 | 样本类型 | 样本突变型 |
| 1 | Sample-1 | RNA标准品 | MET exon 14 Skipping |
| 2 | Sample-2 | RNA标准品 | MET exon 14 Skipping |
| 3 | Sample-3 | RNA标准品 | MET exon 14 Skipping |
| 4 | Sample-4 | 人FFPE RNA | 野生型 |
| 5 | Sample-5 | 人FFPE RNA | 野生型 |
| 6 | Sample-6 | 人FFPE RNA | 野生型 |
| 7 | Sample-7 | NC（无核酸水） | NA |
| 8 | Sample-8 | NTC（无核酸水） | NA |
1、精密度验证
1.1 批内精密度验证
验证方法：同一时间同一批次内对表5中的8例验证样本进行三次重复（步骤包括：目的片段扩增，凝胶电泳），根据凝胶电泳结果进行比较（MET exon 14 Skipping 预计目的片段为167bp、野生型样本预计目的片段为287bp），同一样本三次检测，目的片段位置需一致，以验证检测方法的批内精密度是否达标，结果符合率需达到100%。
表6 批内精密度检测结果
| 样本号 | 预计目的片段长度(bp) | 实际扩增产物长度（bp） | 检测批次 | 结果一致率 |
| Sample-1 | 167bp | 100-250bp | 三次重复 | 100% |
| Sample-2 | 167bp | 100-250bp | 三次重复 | 100% |
| Sample-3 | 167bp | 100-250bp | 三次重复 | 100% |
| Sample-4 | 287bp | 250-500bp | 三次重复 | 100% |
| Sample-5 | 287bp | 250-500bp | 三次重复 | 100% |
| Sample-6 | 287bp | 250-500bp | 三次重复 | 100% |
| Sample-7 | NA | NA | 三次重复 | 100% |
| Sample-8 | NA | NA | 三次重复 | 100% |
注：“NA”代表没有扩增条带，“100-250bp”和“250-500bp”代表在DL 2000 DNAMarker参照下扩增产物的片段长度。
由表6的批内精密度验证实验的检测结果可知，8例验证样本经三次检测，结果一致率都为100%。结论：批内精密度验证通过。
1.2 批间精密度验证
验证方法：8例验证样本分三个不同时间点进行目的片段扩增、扩增产物跑凝胶电泳，根据凝胶电泳结果进行比较（MET exon 14 Skipping预计目的片段为167bp、野生型样本预计目的片段为287bp），同一样本三次检测，目的片段位置需一致，以验证检测方法的批间精密度是否达标，结果符合率需达到100%。
表7 批间精密度检测结果
| 样本号 | 预计目的片段长度(bp) | 实际扩增产物长度（bp） | 检测批次 | 结果一致率 |
| Sample-1 | 167bp | 100-250bp | 三次重复 | 100% |
| Sample-2 | 167bp | 100-250bp | 三次重复 | 100% |
| Sample-3 | 167bp | 100-250bp | 三次重复 | 100% |
| Sample-4 | 287bp | 250-500bp | 三次重复 | 100% |
| Sample-5 | 287bp | 250-500bp | 三次重复 | 100% |
| Sample-6 | 287bp | 250-500bp | 三次重复 | 100% |
| Sample-7 | NA | NA | 三次重复 | 100% |
| Sample-8 | NA | NA | 三次重复 | 100% |
注：“NA”代表没有扩增条带，“100-250bp”和“250-500bp”代表在DL 2000 DNAMarker参照下扩增产物的片段长度。
由表7的批间精密度验证实验的检测结果可知，8例验证样本经不同时间点的三次检测，结果一致率都为100%。结论：批间精密度验证通过。
2、准确度验证
验证方法：8例样本经目的片段扩增、扩增产物纯化后扩增及测序反应，测序结果分析后与reference序列进行比对，以验证该检测方法的准确度是否达标，序列相似度需达到90%以上。
表8 准确度检测结果
| 样本号 | 分析片段 | 序列相似度 | 结论 |
| Sample-1 | 167bp | 98.50% | Pass |
| Sample-2 | 167bp | 99.61% | Pass |
| Sample-3 | 167bp | 98.12% | Pass |
| Sample-4 | 287bp | 99.17% | Pass |
| Sample-5 | 287bp | 98.39% | Pass |
| Sample-6 | 287bp | 96.75% | Pass |
| Sample-7 | NA | NA | Pass |
| Sample-8 | NA | NA | Pass |
注：“NA”表示测序无信号
由表8的准确度验证实验的检测结果可知，8例验证样本的测序结果分析后与reference序列做比对，序列相似度都达到90%以上。结论：准确度验证通过。
3、干扰性验证
验证方法：以1：9质量比混合RNA标准品及人FFPE RNA（样本号：Sample-9），再取10ng RNA混合物分别与10ng g DNA和50ng g DNA混合均匀，进行RT-PCR扩增。
表9 RT-PCR扩增结果
表9的RT-PCR扩增结果中，“100-250bp”代表扩增产物长度，即g DNA对实验无影响。结论：干扰性验证通过。
4、灵敏度验证
验证方法：以1:9质量比混合RNA标准品及人FFPE RNA（样本号：Sample-9）,并按照1pg、10pg、100pg、10ng、、200ng梯度上样量进行RT-PCR扩增。
表10 灵敏度验证实验结果
表10的灵敏度验证实验结果中，“+”代表有扩增条带，“NA”表示无扩增条带，结论：最低扩增条带为10pg上样量。
序列表
<110> 上海观合医药科技有限公司
<120> 用于检测MET基因14号外显子跳跃突变的引物及方法
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gattgattgctggtgttgtc 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gtctcctatgacgtgaacag 20
Claims (5)
1. 一种用于检测MET基因14号外显子跳跃突变的引物，其特征在于：包括用于扩增样本的MET 13-15号外显子片段的测序扩增引物，所述测序扩增引物包括，
引物MET.E13E15_F，其序列如SEQ ID NO:1所示，
引物MET.E13E15_R，其序列如SEQ ID NO:2所示。
2.一种用于检测MET基因14号外显子跳跃突变的方法，其特征在于：包括如下步骤，
a. 从受试者样本中提取RNA；
b. 对RNA样本进行RT-PCR扩增；
c. 对RT-PCR扩增产物进行纯化后，使用上述测序扩增引物对纯化产物进行目标片段的扩增；
d. 对经步骤c扩增的产物纯化后，进行测序反应，并对测序结果进行分析。
3.根据权利要求2所述的一种用于检测MET基因14号外显子跳跃突变的方法，其特征在于：所述步骤b的RT-PCR扩增程序为
4.根据权利要求2所述的一种用于检测MET基因14号外显子跳跃突变的方法，其特征在于：所述步骤c中测序扩增的程序为
5.根据权利要求2所述的一种用于检测MET基因14号外显子跳跃突变的方法，其特征在于：所述步骤d中使用Sanger平台进行测序。
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