CN105018577B - 硫柳汞在荧光定量pcr中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明针对生物化学领域，公开了一种荧光定量PCR反应液，所述反应液包含有作为增强剂或协同增强剂的硫柳汞。本发明涉及硫柳汞的一种新用途，对于PCR反应而言，其除了能作为防腐剂提高反应液的稳定性之外，还能单独或与其他PCR增强剂一起协同提高PCR反应的扩增效率、灵敏度，以及增加荧光值。另外，本发明的反应液配方避免了常规PCR体系配方中因添加其他剧毒防腐剂，如叠氮钠等带来的环境污染的弊端，为开发硫柳汞在新的领域中的应用奠定了基础。

Description

硫柳汞在荧光定量PCR中的应用

技术领域

本发明针对生物化学领域，涉及硫柳汞在荧光定量PCR中的应用，特别是用于核酸检测荧光定量PCR。

背景技术

定量PCR是在定性PCR基础上发展起来的核酸定量技术。实时荧光定量PCR技术（Real-time Fluorescent Quantitative Polymerase Chain Reaction,FQ-PCR）于1996年由美国Applied Biosystems推出，它是在PCR反应体系中加入荧光探针，通过荧光信号的不断积累来实时监测整个PCR过程，最后通过标准曲线来计算出待测样品的起始拷贝数。该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃，并且与普通PCR相比，它具有范围宽（0-1×10⁸）、灵敏度高（可检测<5个拷贝）、特异性强、精确度高（CV<2%）、无需后续处理、避免了交叉污染及可以进行多重检测的优点而被广泛应用于科研及临床诊断等领域。

PCR增强剂在PCR反应中起到提高反应的特异性、增加PCR扩增灵敏度及防止无效扩增等有益效果而被广泛应用于PCR体系中。迄今为止，在提高PCR扩增能力、增强反应体系稳定性的研究中，人们已经发现了越来越多的PCR增强剂和稳定剂，它们都以各自的特性在不同的方面对PCR反应起着促进作用。如甲酰胺是被较早发现并广泛应用的PCR添加剂之一，据报道，它能显著提高PCR反应的特异性。Rapley等人于1994年研究发现T4噬菌体基因32编码蛋白及大肠杆菌单链结合蛋白对数种模板的PCR反应均有提高效率的作用。Rees WA等人通过研究发现在长片段PCR中添加甜菜碱能降低热变性温度和退火温度，进而能促进高GC含量片段的扩增，而且还能提高PCR产物的产量。Eric Chevet等人发现在体系中添加氯化四甲基铵（TMAC）可以提高AT含量丰富的DNA片段的Tm值，从而通过改善引物的特异性结合来提高PCR反应的特异性。牛血清白蛋白（BSA）则能够通过防止聚合酶的变性提高扩增反应效率。DMSO是用于增强反应特异性的常见添加剂，加入DMSO有利于减少DNA的二级结构，使高GC含量的模板的易于完全变性。

随着对PCR增强剂的研究深入，人们逐渐从研究和应用单一型PCR增强剂转向研究和应用复合型PCR增强剂。Musso等应用1.3M甜菜碱，50uM7-deaza-dGTP及5％DMSO混合而成的复合型增强剂高产量扩增了GC含量为79％的长度为392bp的DNA片段，接下来在另外两段DNA片段（GC含量为67.8％和72.7％）的扩增中这种复合型PCR添加剂同样能帮助获得高特异性的扩增产物。随着荧光定量PCR应用的进一步扩大，传统PCR增强剂已经不能满足日新月异的PCR体系，近年来，科研人员已经将目光转向新材料、新化合物。比如纳米材料等。但是，多年来人们对这些添加剂的研究表明，它们在一定的浓度范围内对某些PCR有着增效作用，但在另外一些情况下或在其它的浓度范围内对PCR反应又有着抑制作用，所以PCR添加剂在不同反应体系中的应用应通过试验来合理选择，因此，优化的PCR反应体系配方或添加剂组合会使PCR反应获得很大的改善。

硫柳汞（LLG，又称乙汞硫柳酸钠）是一种有机汞化合物，长期以来，作为安全的防腐剂一直被广泛用于生物制品及药物注射剂中（包括乙肝疫苗、百日咳疫苗、眼药水、免疫球蛋白等），有报道表明0.0001%～0.02%即可对生物制品起到有效抑菌作用。硫柳汞在体内能被代谢变成二乙基汞和硫基水杨酸盐，乙基汞能够通过肠道被积极排除出去，而不像甲基汞那样在体内积累发生毒性反应。叠氮钠是一种常用于生物试剂或溶液保存的防腐剂，但它对热不稳定，水溶液遇酸放出剧毒的HN₃，和氰化物相似，对细胞色素氧化酶和其它酶有抑制作用。因此，与叠氮钠相比，硫柳汞作为防腐剂毒性更低、更为安全，对环境污染更小。

目前，申请人在研发荧光定量PCR体系配方试验中添加有一系列低浓度的硫柳汞作为防腐剂，通过实验结果意外发现，添加硫柳汞不但能起到防腐剂的作用，它还能与海藻糖、聚乙二醇、甘油等已知的PCR增强剂起到“协同增强作用”，提高PCR反应的扩增效率及灵敏度。这一发现为开发新型荧光定量PCR反应体系配方，提高包括临床检测试剂在内的各种核酸类荧光定量PCR检测试剂的特异性、灵敏度及稳定性提供了极大的帮助。

经分析，硫柳汞对PCR反应的增强作用可能与其含硫环状结构有关。对比对PCR反应具有明显增强作用的亚砜类物质，如tetramethylene sulfoxide，有研究者认为亚砜类环状结构化合物的独特作用效果可能是由于其破坏了模板DNA大沟和小沟里带有供体和受体互补氢键的理想构象，也有可能其通过限制DNA链的自由旋转而使得DNA骨架的相邻基团间位间排斥减小。另外，对比对PCR有增强作用的物质L-ectoine和homoectoine，在六元环上均有一羧基存在，硫柳汞与它们有类似结构。

对比观察硫柳汞、L-ectoine、Homoectoine和tetramethylene sulfoxide的结构式如下：

发明内容

本发明的目的在于提供硫柳汞作为一种新型增强剂在荧光定量PCR中的应用。硫柳汞在荧光定量PCR反应液中具有增加反应灵敏度、特异性和提升荧光值的效果，单独添加时起到“增强剂”的作用，配合其他试剂添加时起到“协同增强剂”的作用。

硫柳汞作为协同增强剂时，所述反应液还包含有甘油、聚乙二醇、海藻糖、硫酸铵和氯化铵中的一种或多种。

甘油、聚乙二醇、海藻糖、硫酸铵和氯化铵等在荧光定量PCR中，作为反应增强剂能促进耐热DNA聚合酶对高GC含量的DNA模板的有效扩增，增加PCR反应的特异性及灵敏度。其原理主要有通过降低DNA二级结构、提高DNA聚合酶的热稳定性等机制而达到提高目标片段扩增率。其中，海藻糖有助于提高GC含量及片段DNA的扩增。质量分数为2%-10%的甘油能增加酶的稳定性，提高扩增效率。氯化铵或硫酸铵能增加反应配方的离子强度，通过改变退火温度来间接调节酶活。聚乙二醇能改变引物与模板配对反应的溶解温度，进而改善高GC含量DNA的变形情况，使耐热DNA聚合酶更容易在二级结构处延伸。

经申请人实验推测，硫柳汞是通过与背景技术部分结构类似的增强剂相似的机理发挥作用，实践中可根据需要，选择一种或多种增强剂与其相配合。

进一步，所述反应液还包含有耐热DNA聚合酶，所述DNA聚合酶具有5’-3’聚合酶活性和5’-3’外切酶活性，如Taq DNA聚合酶；所述DNA聚合酶还可以是具有5’-3’聚合酶活性和3’-5’校正活性的DNA聚合酶，如pfu。

上述耐热DNA聚合酶优选热启动DNA聚合酶，包括化学修饰、抗体修饰或配基修饰（DNA酶抑制剂，以及单链或双链寡核苷酸抑制物修饰）的DNA聚合酶。热启动DNA聚合酶在常温至50℃范围聚合酶活性被封闭，因此，可以有效抑制由于引物与模板非特异性结合，或引物聚体引起的非特异性扩增，从而增加反应的特异性和灵敏度，以及反应体系的稳定性。

本发明还提供一种包含有硫柳汞的定量PCR反应液，所述反应液包含的组分终浓度（未注明浓度单位的均为质量浓度）：10-100mM Tris-HCl，PH7.7-9.0、0.0001-0.01%的硫柳汞，1-10%的PEG4000或100-600mM海藻糖，0-50mM或0-100mM KCl，0-50mM(NH₄)₂SO₄或NH₄Cl，0.2-0.4mM dNTP，2-12mM Mg²⁺，2-10%甘油和0.01-0.2U/μl热启动DNA聚合酶。

上述反应液所包含的组分终浓度，作为优选的，硫柳汞为0.004-0.006%，海藻糖为180-220mM，PEG4000为2-8%，(NH₄)₂SO₄或NH₄Cl为10-30mM，MgCl₂为2-8mM，甘油为5-10%，热启动DNA聚合酶为0.08-0.12U/μl。

本发明还涉及一种荧光定量PCR试剂盒，所述试剂盒包含上述含有硫柳汞的任何一种反应液。

本发明的有益效果：本发明涉及硫柳汞的一种新用途，对于PCR反应而言，其除了能作为防腐剂提高反应液的稳定性之外，还能单独或与其他PCR增强剂一起协同提高PCR反应的扩增效率、灵敏度，以及增加荧光值。另外，本发明的反应液配方避免了常规PCR体系配方中因添加其他剧毒防腐剂，如叠氮钠等带来的环境污染的弊端，为开发硫柳汞在新的领域中的应用奠定了基础。

附图说明

图1荧光定量PCR探针法扩增曲线图；

Ⅰ（配方1）：优化前体系的扩增曲线

Ⅱ（配方2）：单独加入硫柳汞的扩增曲线

Ⅲ（配方3）：单独加入海藻糖的扩增曲线

Ⅳ（配方4）：同时加入硫柳汞和海藻糖的扩增曲线

图2四种反应体系Ct值比较；

图3四种反应体系荧光值比较；

图4荧光定量PCR SYBR Green染料法扩增曲线图；

Ⅰ（配方5）：优化前体系的扩增曲线

Ⅱ（配方6）：单独加入PEG4000的扩增曲线

Ⅲ（配方7）：单独加入硫柳汞的扩增曲线

Ⅳ（配方8）：同时加入硫柳汞和PEG4000的扩增曲线

图5四种反应体系Ct值比较；

图6四种反应体系荧光值比较。

具体实施方式

以下将参照附图，对本发明的优选实施例进行详细描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件。实施例中所用的试剂或仪器未注明生产厂商的，均为可以通过市面购到的常规产品。下文未注明浓度单位的均为质量浓度。

实施例1荧光定量PCR Taqman探针法比较

1.模板、引物及探针

模板的制备：从大米中采用磁珠法提取基因组DNA。所提取的模板DNA浓度经Thermo Nanodrop1000测定为491ng/μl。用去离子水将其稀释到49.1ng/μl，4.91ng/μl和0.491ng/μl，用作本实验的反应模板，应用下述引物探针扩增大米內源性gos9基因（X519090）。

引物11：5’TTAGCCTCCCGCTGCAGA3’

引物21：5’AGAGTCCACAAGTGCTCCCG3’

探针5’FAM-CGGCAGTGTGGTTGGTTTCTTCGG-TAMRA3’

2.试剂

其中10x PCR Buffer包含100mM Tris-HCl，500mM KCl。MgCl₂、甘油、NH₄Cl和HCl购自广州化学试剂厂；Tris购自广州威佳生物科技有限公司；dNTP购自上海申能博彩生物科技有限公司；Hotmaster Taq DNA Polymerase5U/μl，为申请人自产配体修饰的热启动酶；SYBR Green，购自北京索莱宝科技有限公司；引物及探针由Takara合成。

1）优化前的配方(配方1）为：

10×PCR Buffer	2.5μl	1×
			10mM dNTP	0.5μl	200μM
250mM MgCl<sub>2</sub>	0.4μl	4mM
			80%Glycerol	1.875μl	6%
5U/ul Hotmaster Taq DNA Polymerase	0.25μl	1.25U
			引物探针混合物（3.75μM引物，2.5μM探针）	2μl	0.3μM/0.2μM
模板	5μl
			ddwater	12.475μl
Total	25μl

2）单独加硫柳汞（LLG）的配方（配方2）为：

3）单独加海藻糖的配方（配方3）为：

4）同时含有硫柳汞和海藻糖的配方（配方4）为：

3.反应条件

荧光定量PCR仪：ABI7500。

反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性10S，60℃退火50S，共45个循环。

4.实验结果

反应结束后，将ABI System v1.3.0中相关荧光值和Ct值导出，进行统计分析。经统计，本发明配方4，即同时添加硫柳汞及海藻糖的优化体系较之单独添加硫柳汞的配方荧光值提高了50%以上；较之单独添加海藻糖的配方，荧光值提高了约20%；较之不加两种添加物的原始配方，荧光值提高约70%。配方4的Ct值在各浓度梯度模板下，与配方1、2、3相比，随添加物不同呈依次减小的趋势。

Ct值：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。

具体实验结果见表1和表2，以及图1、图2和图3。

表1四种反应体系下的平均Ct值

表2四种反应体系下的平均荧光值

5.结果分析

由图1、图2、图3及表1、表2可以看出，反应体系经优化即添加了硫柳汞及海藻糖后，Ct值不同程度的减小，而荧光值大幅度的提高。值得注意的是，我们发现，同时添加硫柳汞和海藻糖后荧光值的提高幅度大致等于单独添加这两种添加剂中任何一种所提高的幅度之和，即同时添加硫柳汞和海藻糖具有协同效应。终反应荧光值反映的是产物的有效累积量，荧光值的大幅度提高说明反应产物的有效累积量得到大幅度的提高。

此外，由图1可以看出，配方2、3、4的扩增曲线指数期的斜率明显要大于配方1的扩增曲线指数期斜率。曲线指数期斜率反映的是扩增效率，越大说明扩增效率越高。扩增曲线反应了加入这两种添加剂后的增强效果。

实施例2荧光定量PCR SYBR Green染料法比较

1.模板、引物及探针

模板的制备：从大米中采用磁珠法提取基因组DNA。所提取的模板DNA浓度经Thermo Nanodrop1000测定为491ng/μl。用去离子水将其稀释到49.1ng/μl，4.91ng/μl和0.491ng/μl，用作本实验的反应模板，应用下述引物探针扩增大米PLD基因（AB001919）。

PLD foward primer：5’tggtgagcgttttgcagtct3’

PLD reverse primer：5’ctgatccactagcaggaggtcc3’

2.试剂

10×PCR Buffer包含100mM Tris-HCl，200mM NH₄Cl，pH8.0。MgCl₂、甘油、NH₄Cl和HCl购自广州化学试剂厂；Tris购自广州威佳生物科技有限公司；dNTP购自上海申能博彩生物科技有限公司；HS Taq DNA Polymerase5U/μl，为申请人自产化学修饰的热启动酶；SYBRGreen（10000×），购自北京索莱宝科技有限公司；引物及探针由Takara合成。

1）优化前的配方(配方5）

10×PCR Buffer	2.0μl	1×
			10mM dNTP	0.4μl	200μM
250mM MgCl<sub>2</sub>	0.16μl	2mM
			80%Glycerol	1.5μl	6%
5U/μl HS Taq DNA Polymerase	0.25μl	1.25U
			10×SYBR Green	0.6μl	0.3×
PLD foward primer	1μl	0.25μM
			PLD reverse primer	1μl	0.25μM
模板	5μl
			ddwater	8.09μl
Total	20μl

2）单独加PEG4000的配方(配方6）

10×PCR Buffer	2.0μl	1×
			10mM dNTP	0.4μl	200μM

250mM MgCl<sub>2</sub>	0.16μl	2mM
			80%Glycerol	1.5μl	6%
5U/μl HS Taq DNA Polymerase	0.25μl	1.25U
			10×SYBR Green	0.6μl	0.3×
PLD foward primer	1μl	0.25μM
			PLD reverse primer	1μl	0.25μM
模板	5μl
			50%PEG4000	1μl	2.5%
ddwater	7.09μl
			Total	20μl

3）单独加硫柳汞（LLG）的配方(配方7）

10×PCR Buffer	2.0μl	1×
			10mM dNTP	0.4μl	200μM
250mM MgCl<sub>2</sub>	0.16μl	2mM
			80%Glycerol	1.5μl	6%
5U/μl HS Taq DNA Polymerase	0.25μl	1.25U
			10×SYBR Green	0.6μl	0.3×
PLD foward primer	1μl	0.25μM
			PLD reverse primer	1μl	0.25μM
模板	5μl
			0.1%硫柳汞	0.2μl	0.001%
ddwater	7.89μl
			Total	20μl

4）同时加入PEG4000和LLG的配方(配方8）

10×PCR Buffer	2.0μl	1×
			10mM dNTP	0.4μl	200μM
250mM MgCl<sub>2</sub>	0.16μl	2mM
			80%Glycerol	1.5μl	6%
5U/μl HS Taq DNA Polymerase	0.25μl	1.25U
			10×SYBR Green	0.6μl	0.3×

PLD foward primer	1μl	0.25μM
			PLD reverse primer	1μl	0.25μM
模板	5μl
			50%PEG4000	1μl	2.5%
0.1%硫柳汞	0.2μl	0.001%
			ddwater	6.89μl
Total	20μl

3.反应条件

荧光定量PCR仪：Roche Lightcycler480。

95℃预变性10min；95℃变性5S，60℃退火30S，共40个循环，95℃5S，60℃15S。

4.实验结果

反应结束后，将Roche Lightcycler480中相关荧光值和Ct值导出，进行统计分析。由表3、表4和图5、图6可以看出，对于SYBR Green方法，4种配方在不同浓度模板下Ct值大致相当。单独添加PEG4000后荧光值无变化，单独添加硫柳汞后荧光值提高10%-17%，而同时添加硫柳汞和PEG4000后，荧光值提高17%-23%。具体实验结果见表3和表4，以及图4、图5和图6。

表3四种反应体系下的平均Ct值

表4四种反应体系下的平均荧光值

5.结果分析

通过表3和表4，以及图4、图5和图6可以看出，在SYBR Green方法的原反应体系中单独添加PEG4000后，与不添加组差异不明显，但单独添加硫柳汞后，荧光值提高明显。同时添加PEG4000和硫柳汞后，较单独添加硫柳汞荧光值有进一步提升，这表明PEG4000和硫柳汞这两种添加剂联合使用，能够产生协同增强效应。

本发明分别采用了两种荧光定量检测方法（探针法和染料法），两种热启动酶（配基修饰和化学修饰），并配合不同的PCR增强添加剂，在不同厂家仪器上，研究了硫柳汞对PCR反应的增强和协同增强效应。结果证明，虽然硫柳汞过去一直作为生物制品尤其是疫苗制品的防腐剂使用，但是申请人发现在荧光PCR扩增体系中，硫柳汞可以单独或与其他PCR增强剂协同起到增强作用，主要表现在将其加入荧光PCR反应体系中可以大幅度提高荧光值，并能小幅减小Ct值或者对Ct值无明显影响。

关于硫柳汞在荧光PCR扩增体系中新型应用的发现及PCR反应液配发组合的研究，不但可以更好的防止扩增体系的微生物污染，保障荧光PCR体系的保存稳定性，而且可以增强荧光PCR的检测灵敏度，更加有利于高稳定性高灵敏度分子诊断试剂的开发。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (7)

1.一种荧光定量PCR反应液，其特征在于，所述反应液包含有作为协同增强剂的硫柳汞；所述硫柳汞的终端质量浓度为0.001％，所述反应液还包含有终端质量浓度为2.5％的聚乙二醇4000或终端摩尔浓度为200mM的海藻糖；

所述反应液还包含有耐热DNA聚合酶，所述DNA聚合酶具有5’-3’聚合酶活性和5’-3’外切酶活性。

2.根据权利要求1所述的荧光定量PCR反应液，其特征在于，所述反应液还包含有耐热DNA聚合酶，所述DNA聚合酶具有5’-3’聚合酶活性和3’-5’校正酶活性。

3.根据权利要求2所述的荧光定量PCR反应液，其特征在于，所述的耐热DNA聚合酶为热启动DNA聚合酶，包括化学修饰、抗体修饰或配基修饰的DNA聚合酶。

4.一种包含有硫柳汞的定量PCR反应液，其特征在于，所述反应液按质量分数计包含0.001％的硫柳汞、2.5％的聚乙二醇4000和2～10％的甘油，此外所述反应液还包含有0-100mM的KCl、10～100mM的Tris-HCl、0～50mM的(NH₄)₂SO₄、0.2～0.4mM的dNTP、2～12mM的Mg²⁺和0.01～0.2U/μl的热启动DNA聚合酶。

5.一种包含有硫柳汞的定量PCR反应液，其特征在于，所述反应液按质量分数计包含0.001％的硫柳汞、2～10％的甘油，还包含有10～100mM的Tris-HCl、200mM的海藻糖、0-50mM的KCl、0～50mM的NH₄Cl、0.2～0.4的mM dNTP、2～12mM的Mg²⁺和0.01～0.2U/μl的热启动DNA聚合酶。

6.根据权利要求5所述的反应液，其特征在于，所述反应液按质量分数计包含0.001％的硫柳汞，还包含200mM的海藻糖，0.02-0.12U/μl的热启动DNA聚合酶。

7.一种荧光定量PCR试剂盒，包含权利要求1-5任一项所述的反应液。