CN108841795A - 一种鸭圆环病毒的体外增殖及培养方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种鸭圆环病毒的体外增殖及培养方法，包括如下步骤：(1)采集健康成年番鸭血，进行PBMC的分离培养，制备PBMC细胞悬液；(2)将检测为鸭圆环病毒阳性的病料，加入到PBMC细胞悬液中培养。本发明提供了一种体外增殖培养DuCV的方法，接毒培养后病毒滴度有大幅度的提高，能够实现在实验室完成病毒的分离鉴定，对其致病机理及危害的研究提供较大的帮助。

Description

一种鸭圆环病毒的体外增殖及培养方法
技术领域
本发明涉及一种鸭圆环病毒的体外增殖及培养方法。
背景技术
鸭圆环病毒(duckcircovirus，DuCV)是圆环病毒科圆环病毒属的新成员，可导致鸭的免疫抑制，对养鸭业造成危害。鸭圆环病毒DuCV感染的鸭子所表现的临床症状主要表现为发育状况差，并且明显表现羽毛营养失调，在背部脊柱(的羽毛)尤其明显，许多羽毛羽轴出血，背部皮肤组织病理学检查主要表现为囊泡和围绕囊泡的组织异嗜性炎性渗出，内脏器官总的病理表现为鸭传染性浆膜炎协同感染的症状，对法氏囊组织病理学检查表明，淋巴细胞损伤、坏死、组织细胞增多(Hattermann etal.,2003)。
2003年DuCV就被发现，由于该病毒大多情况下不会致宿主细胞产生可见的病变，因此病毒的体外增殖一直没有进展，到目前尚没有可行的体外增殖培养DuCV的方法，无法在实验室完成病毒的分离鉴定。因此对其致病机理及危害的研究，疫苗的开发都存在很多困难，认识还非常肤浅。但目前对其流行病学的研究已经显示该病在我国鸭群中普遍存在，借鉴其它圆环病毒已有的研究成果推测DuCV的存在可能提高鸭瘟、鸭病毒性肝炎、鸭传染性浆膜炎、鸭巴氏杆菌病、大肠杆菌病等鸭常发病的发病率并加重了其致病性等，所以在养鸭业规模和数量飞速发展的今天，提出一种体外增殖培养DuCV的方法刻不容缓。
发明内容
本发明要解决的技术问题，在于提供一种鸭圆环病毒的体外增殖及培养方法。
本发明是这样实现的：
一种鸭圆环病毒的体外增殖及培养方法，包括如下步骤：
(1)采集健康成年番鸭血，进行PBMC的分离培养，制备PBMC细胞悬液；
(2)将检测为鸭圆环病毒阳性的病料，加入到PBMC细胞悬液中培养。
进一步地，步骤(1)中，所述PBMC细胞悬液的制备方法，包括以下步骤：
A、血液采集及外周血淋巴细胞的分离
使用肝素抗凝管，采集成年番鸭血，轻微上下混匀，在无菌操作下，将鸭血与PBS按1:2混匀；取1倍体积的Ficoll淋巴细胞分离液于离心管，将鸭血与PBS的混合液缓慢加入到淋巴细胞分离液上；将离心管转移至离心机进行离心，6000rpm/min离心20分钟，离心结束后分层，并吸取外周血淋巴细胞层；
B、细胞培养
在无菌状态下，吸取外周血淋巴细胞层转移至离心管中，2000rpm/min离心5分钟，弃去上清；用RPMI1640培养液(含10％番鸭血清)重悬细胞并转移至培养皿中进行培养，培养条件为5％CO2、温度37℃、湿度100％，得到PBMC细胞悬液。
进一步地，步骤(2)中检测鸭圆环病毒阳性，是从病料中提取鸭圆环病毒基因组DNA，进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果，从而检测鸭圆环病毒阳性。
进一步地，步骤(2)中检测为鸭圆环病毒阳性的病料，按常规方法匀浆后用PBS按1:5稀释，然后再用0.45微米的滤膜过滤，将滤液按10％加入到PBMC细胞悬液中培养。
本发明具有如下优点：本发明提供了一种体外增殖培养DuCV的方法，接毒培养后病毒滴度有大幅度的提高，能够实现在实验室完成病毒的分离鉴定，对其致病机理及疫苗的研究提供很大的帮助。
附图说明
下面参照附图结合实施例对本发明作进一步的说明。
图1为病料中病毒验证的电泳图。
图2为病毒滴度采用qPCR定量的标准曲线。
图3为病料接种PBMC细胞悬液后和PBMC细胞悬液对照组在荧光显微镜下的观察结果。
图4为接毒48小时后细胞活力。
具体实施方式
一种鸭圆环病毒的体外增殖及培养方法，具体包括如下步骤：
1、血液采集及外周血淋巴细胞的分离
使用肝素抗凝管(江苏康健医疗用品公司)，采集成年番鸭血，轻微上下混匀，冰浴保存送至实验室。在无菌操作下，将鸭血与PBS按1:2混匀，取1倍体积的淋巴细胞分离液(Ficoll-PaqueTMPREMIUM)于50ml离心管。将鸭血与PBS的混合液缓慢加入到淋巴细胞分离液上层形成良好的分层。将离心管转移至离心机进行离心，转速设置为6000rpm/min离心20分钟，离心的升速及降速设置为最小。离心结束后取外周血淋巴细胞层、淋巴细胞分离液层。
2、细胞培养
在无菌状态下，用移液器吸取外周血淋巴细胞层(白色细胞层)转移至1.5ml的离心管(购自THEROMISH)中，2000rpm/min离心5分钟弃去上清。用RPMI1640(购自GIBCO)培养液(含10％番鸭血清)重悬细胞(1*104细胞)并转移至培养皿中进行培养，培养条件为5％CO2、温度37℃、湿度100％，得到PBMC细胞悬液。在以下实验中也作为对照鸭淋巴细胞组。
3、鸭圆环病毒病料基因组提取及PCR
按常规操作，采集病料(脏器组织)研磨，用PBS按1:5稀释后取200μl混合液提取基因组，取100ng DNA模板进行PCR。引物为上游：5′-GGCGAAGAGCGGCAACTA-3′，下游：5′-CCGACGATAGCGAACTTGC-3′，琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果，检测鸭圆环病毒阳性(病毒滴度为1*103拷贝数)，结果见图1。其它鸭病未检出鸭圆环病毒。
4、接毒及收毒
将鸭圆环病毒阳性的病料研磨后用PBS按1:5稀释，然后再用0.45微米的滤膜过滤。将滤液按10％加入到PBMC细胞悬液进行共培养并观察细胞病变。待细胞病变达80％以上时收获细胞培养物，-20℃冻融3次进行离心收获上清。
5、病毒滴度测定
取200μl病毒上清提取基因组DNA，采用qPCR标准曲线法进行定量，引物序列为：上游：5′-GGCGAAGAGCGGCAACTA-3′，下游：5′-CCGACGATAGCGAACTTGC-3′。如图2所示，最后计算病毒滴度为8×107个拷贝每毫升，说明接毒培养后滴度有大幅度的提高。
6、接毒后淋巴细胞的活力检测
接毒48小时后，用少量的胰酶消化贴壁淋巴细胞，取鸭圆环病料液毒组和对照鸭淋巴细胞组(含1*106以上细胞)，用Calcein-am/PI双染细胞法检测细胞毒活性，在荧光显微镜下进行鉴别和计数，如图3所示。结果发现接完病料48小时，有70％鸭淋巴细胞是死的，而对照组70％的细胞是活的。这从侧面证面，该病毒液引起PBMC的死亡，如图4所示。因此可用于鸭圆环病毒的体外增殖及培养。
虽然以上描述了本发明的具体实施方式，但是熟悉本技术领域的技术人员应当理解，我们所描述的具体的实施例只是说明性的，而不是用于对本发明的范围的限定，熟悉本领域的技术人员在依照本发明的精神所作的等效的修饰以及变化，都应当涵盖在本发明的权利要求所保护的范围内。

Claims (3)

1.一种鸭圆环病毒的体外增殖及培养方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)采集健康成年番鸭血，进行PBMC的分离培养，制备PBMC细胞悬液；
(2)将检测为鸭圆环病毒阳性的病料，加入到PBMC细胞悬液中培养。
2.根据权利要求1所述的鸭圆环病毒的体外增殖及培养方法，其特征在于：步骤(1)中，所述PBMC细胞悬液的制备方法，包括以下步骤：
A、血液采集及外周血淋巴细胞的分离
使用肝素抗凝管，采集成年番鸭血，轻微上下混匀，在无菌操作下，将鸭血与PBS按1:2混匀；取1倍体积的Ficoll淋巴细胞分离液于离心管，将鸭血与PBS的混合液缓慢加入到淋巴细胞分离液上；将离心管转移至离心机进行离心，6000rpm/min离心20分钟，离心结束后分层，并吸取外周血淋巴细胞层；
B、细胞培养
在无菌状态下，吸取外周血淋巴细胞层转移至离心管中，2000rpm/min离心5分钟，弃去上清；用含10％番鸭血清的RPMI1640培养液重悬细胞并转移至培养皿中进行培养，培养条件为5％CO2、温度37℃、湿度100％，得到PBMC细胞悬液。
3.根据权利要求1所述的鸭圆环病毒的体外增殖及培养方法，其特征在于：步骤(2)中检测为鸭圆环病毒阳性的病料，按常规方法匀浆后用PBS按1:5稀释，然后再用0.45微米的滤膜过滤，将滤液按10％加入到PBMC细胞悬液中培养。
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