CN116064744A - 酶切缓冲试剂、酶切缓冲体系及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物检测领域，尤其涉及酶切缓冲试剂、酶切缓冲体系及应用。本发明提供了酶切缓冲试剂，酶切缓冲试剂，包括：缓冲液，一价金属离子、镁离子和表面活性剂。本发明提供了一种提升CRISPR检测靶标核酸酶切效率的方法，靶标核酸经过恒温扩增后，添加表面活性剂并优化CRISPR剪切体系buffer，增强CRISPR体系对靶标病原体核酸的剪切效率及靶标核酸检测的灵敏度；使其能在30min内检测到1copy靶标RNA，为后续的核酸检测提供更快速的分子诊断平台，使得利用CRISPR分子检测技术建立快速、经济的POCT核酸检测成为可能。
Description
技术领域
本发明涉及生物检测领域，尤其涉及酶切缓冲试剂、酶切缓冲体系及应用。
背景技术
CRISPR/Cas本身是一种用以保护细菌和古细菌细胞不受病毒侵害的防御系统。CRISPR的全称是ClusteredRegularlyInterspacedShortPalindromic Repeat(成簇的规律间隔的短回文重复序列)，Cas的全称则是CRISPR associated(CRISPR关联)，合在一起简称为CRISPR/Cas系统。
CRISPR/Cas系统本身是一种基因编辑系统，近些年科学家们热衷于将此编辑系统应用到体外诊断(IVD)行业，尤其是今年应用此技术的新冠核酸检测，更是推动了此技术在体外诊断领域的应用。CRISPR/Cas诊断技术是平台型的核酸检测技术，可以快速诊断任何已知的核酸序列，可广泛应用于POCT、临床感染检测、肿瘤筛查、伴随诊断、食品安全等多个领域。目前将CRISPR技术应用于体外检测的主要有三种不同的系统，分别是CRISPR/Cas9，CRISPR/Cas12，CRISPR/Cas13，这三个常用的CRISPR/Cas系统在体外检测靶标核酸方面各有优势。其中CRISPR/Cas9，CRISPR/Cas12系统应用于体外诊断检测主要是以SHERLOCK(SpecificHigh-sensitivityEnzymaticReporter unLOCKing)-CRISPR/Cas13为基础来建立起来的不同分子检测平台。
CRISPR/Cas13是CRISPR/Cas家族中唯一的靶向单链RNA病毒的系统。其在体外诊断应用的检测体系主要由Cas13a蛋白酶，crRNA，带有荧光/淬灭基团的报告RNA探针以及靶标RNA构成。理论上讲，只要样本里有病毒RNA存在，crRNA能对其进行精准的识别并匹配，之后Cas13a被激活，进入激活状态，除了剪切靶RNA外，还具有非特异性地降解其它ssRNA的功能，这时报告RNA会被剪切，释放荧光基团，通过仪器检测有无荧光信号，就能知道样本里有无病毒的存在。
准确、快速、经济的核酸检测方法在感染性病原体诊断中起着重要的作用。以PCR为基础的诊断方法灵敏度高、特异度高，但需要特殊的仪器、实验检验场地和专业技术人员，限制了其广泛应用；测序在核酸检测中虽然也变得越来越重要，然而其高复杂性和高成本限制了其在现场快速诊断中的应用。核酸等温扩增技术与PCR相比，已成为一种有潜力的快速便携式检测方法，但其敏感性和特异性仍有待提高。相对比来说，CRISPR技术具有高特异性、高灵敏度、快速、高性价比和易用的特点。基于CRISPR技术的的检测系统非常简单，因此可以快速开发成传染病紧急爆发的诊断方法。那么对于公司来说，开发基于CRISPR技术的分子诊断平台未来发展前景非常可观。
但是，目前基于CRISPR技术的体外核酸检测方法处于刚起步发展阶段，现有诊断方法仍需长时间摸索和改进，如何实现无需扩增靶标序列即可对其进行检测？如何改进检测体系组分提高核酸检测的灵敏度？如何提高反应体系组分的特异性？如何更好的将所有反应过程实现一步法？这些都是亟待解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了酶切缓冲试剂、酶切缓冲体系及应用。本发明提供了一种提升CRISPR检测靶标核酸酶切效率的方法，目的是靶标核酸经过恒温扩增后，通过添加某种关键表面活性剂并优化现有CRISPR剪切体系buffer，以增强CRISPR体系对靶标病原体核酸的剪切效率及靶标核酸检测的灵敏度；使其能在30min内检测到1copy靶标RNA，为后续的核酸检测提供更快速的分子诊断平台，使得利用CRISPR分子检测技术去建立快速、经济的POCT核酸检测成为可能。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
酶切缓冲试剂，包括：缓冲液，一价金属离子、镁离子和表面活性剂。
在本发明的一些实施方案中，上述酶切缓冲试剂中，所述缓冲液包括TRIS-HCl或HEPES；所述一价金属离子以NaCl或KCl的形式添加；所述镁离子以MgCl2的形式添加。
在本发明的一些实施方案中，上述酶切缓冲试剂中所述TRIS-HCl或所述HEPES的作用效果类似。
在本发明的一些实施方案中，上述酶切缓冲试剂中所述NaCl或所述KCl的作用效果类似。
在本发明的一些实施方案中，上述酶切缓冲试剂包括：
Tris-HCl或HEPES 30～60mmol/L
NaCl或KCl 50～80mmol/L
MgCl2 2～8mmol/L
表面活性剂 0.01～0.05％(体积浓度)。
在本发明的一些实施方案中，上述酶切缓冲试剂，包括：
在本发明的一些实施方案中，上述酶切缓冲试剂中所述表面活性剂包括：TritonX-100、NP40或CA-630中的一种或多种。
本发明还提供了上述酶切缓冲试剂在酶切反应体系中的应用。
在本发明的一些实施方案中，上述应用中，所述酶切反应体系包括-CRISPR/Cas酶切反应体系。
本发明还提供了酶切反应体系，包括：
在本发明的一些实施方案中，上述酶切反应体系，包括：
或
在本发明的一些实施方案中，上述酶切反应体系中，所述crRNA的序列如SEQ IDNO:2所示：5’-GAUUUAGACUACCCCAAAAACGAAGGGGAC UAAAACCAGAACGGUUCACAGCCUGAACAUUUG-3’。
在本发明的一些实施方案中，上述酶切反应体系中，所述crRNA一部分为Cas13蛋白识别序列，一部分序列为靶标核酸互补序列，在制备crRNA的DNA序列时，需要在其序列的前端加上T7RNA聚合酶识别的T7序列位点，为制备RNA做准备。
在本发明的一些实施方案中，上述酶切反应体系中，所述报告RNA的探针的序列如SEQ ID NO:5所示：5’-FAM-UUUUU-BHQ-3’。
在本发明的一些实施方案中，上述酶切反应体系中，所述-CRISPR核酸酶包括：Cas13a、Cas13b、Cas13c或Cas13d中的一种或多种。
本发明还提供了上述酶切缓冲体系或上述酶切反应体系在核酸检测中的应用。
在本发明的一些实施方案中，上述应用中，所述核酸检测包括：-CRISPR/Cas核酸检测。
本发明还提供了核酸的检测方法，取待测靶标与上述酶切反应体系混合，检测，根据荧光信号对检测结果进行判读。
在本发明的一些实施方案中，上述检测方法中所述检测靶标的序列如SE Q IDNO:1所示：5’-AACCCUAUUUCUCACAUCAGGGGGAGUAUUAUUA UCACUAUAUGUGUCAGCUUCAUUAUCAUACUUACUAUAUUCGGAUAUAUUGCUAAAAUUCUCACCAACAGAAAUAACUGCACCAACAAUGCCAUUGGAUUGUGCAAACGCAUCAAAUGUUCAGGCUGUGAACCGUUCUGCAACAAAAGGGGUGACACUUCUUCUCCCAGAACCGGAGUGGACAUACCCGCGUUUAUCUUGCCCGGGCUCAACCUUUCAGAAAGCACUUCUAAUUAGCCCUCAUAGA-3’。
在本发明的一些实施方案中，上述检测方法中，所述检测方法还包括恒温扩增的步骤。
在本发明的一些实施方案中，上述检测方法中，取待测靶标RT-ERA扩增后，体外转录，再与上述酶切反应体系混合，检测，根据荧光信号对检测结果进行判读。
在本发明的一些实施方案中，上述检测方法中，所述RT-ERA扩增的时间为20min，温度为37℃。
在本发明的一些实施方案中，上述检测方法中，所述RT-ERA扩增的正向引物如SEQID NO:3所示：：5’-TCACCAACAGAAATAACTGCACCAA CAATGC-3’；所述正向引物设计时须在其前端加上T7RNA聚合酶识别的T7序列位点，便于后续体外转录。
在本发明的一些实施方案中，上述检测方法中，所述RT-ERA扩增的反向引物如SEQID NO:4所示：5’-tctatgagggctaattagaagtgctttctga-3’。
在本发明的一些实施方案中，上述检测方法包括-CRISPR/Cas方法。。
本发明提供了酶切缓冲试剂，包括：酶切缓冲试剂，包括：缓冲液，一价金属离子、镁离子和表面活性剂。本发明还提供了酶切反应体系及应用，以及核酸的检测方法。
本发明提供了一种提升CRISPR检测靶标核酸酶切效率的方法，目的是靶标核酸经过恒温扩增后，通过添加某种关键表面活性剂并优化现有CRISPR剪切体系buffer，以增强CRISPR体系对靶标病原体核酸的剪切效率及靶标核酸检测的灵敏度；使其能在30min内检测到1copy靶标RNA，为后续的核酸检测提供更快速的分子诊断平台，使得利用CRISPR分子检测技术去建立快速、经济的POCT核酸检测成为可能。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1示不同buffer剪切效价比对；
图2示不同buffer终点荧光信号值比对；
图3示不同buffer检测不同稀释度靶标RNA；
图4示不同Cas13蛋白效价筛选(实时荧光数据值)；
图5示不同Cas13蛋白40min终点荧光值比对；
图6示Tris-HCL(mM)和结果方差分析比对；
图7示NaCl(mM)和结果方差分析比对；
图8示TritonX-100和结果方差分析比对；
图9示NP40与结果方差分析比对；
图10示CA-630与结果方差分析比对；
图11示优化酶切buffer+表活检测不同拷贝靶标；
图12示Cas13与结果方差分析比对；
图13示crRNA结果方差分析比对；
图14示报告RNA与结果方差分析比对；
图15示Triton-X与结果方差分析比对。
具体实施方式
本发明公开了酶切缓冲试剂、酶切缓冲体系及应用。
应该理解，表述“……中的一种或多种”单独地包括每个在所述表述后叙述的物体以及所述叙述的物体中的两者或更多者的各种不同组合，除非从上下文和用法中另有理解。与三个或更多个叙述的物体相结合的表述“和/或”应该被理解为具有相同的含义，除非从上下文另有理解。
术语“包括”、“具有”或“含有”，包括其语法同义语的使用，通常应该被理解为开放性和非限制性的，例如不排除其他未叙述的要素或步骤，除非另有具体陈述或从上下文另有理解。
应该理解，只要本发明仍可操作，步骤的顺序或执行某些行动的顺序并不重要。此外，两个或更多个步骤或行动可以同时进行。
本文中的任何和所有实例或示例性语言如“例如”或“包括”的使用，仅仅打算更好地说明本发明，并且除非提出权利要求，否则不对本发明的范围构成限制。本说明书中的任何语言都不应解释为指示任何未要求保护的要素对于本发明的实践是必不可少的。
此外，用以界定本发明的数值范围与参数皆是约略的数值，此处已尽可能精确地呈现具体实施例中的相关数值。然而，任何数值本质上不可避免地含有因个别测试方法所致的标准偏差。因此，除非另有明确的说明，应当理解本公开所用的所有范围、数量、数值与百分比均经过“约”的修饰。在此处，“约”通常是指实际数值在一特定数值或范围的正负10％、5％、1％或0.5％之内。
本发明提供了一种优化的核酸检测的CRISPR方法，包括：
与待测靶标序列互补的crRNA，Cas13a蛋白，报告RNA，背景RNA，RNaseinhibitor以及酶切缓冲体系，在加入待测靶标核酸后，Cas13a蛋白的酶活性及侧向切割活性被激活，报告RNA被切割。通过Bio-Tek酶标仪实时检测对应的荧光信号，完成对检测结果的判读。
本发明还提供了一种优化的核酸检测的CRISPR方法，直接检测靶标核酸的步骤包括：
步骤一，制备反应体系；
反应体系包括：与待测靶标序列互补的crRNA，Cas13a蛋白，报告RNA，背景RNA，RNaseinhibitor以及酶切缓冲体系；
步骤二，将待测靶标核酸加入crRNA与Cas13蛋白形成的复合体溶液中；
步骤三，Bio-Tek酶标仪37℃恒温实时检测荧光信号，时间设定40min，并进行检测结果的判读。
本发明提供了一种优化的核酸检测的CRISPR方法，结合恒温扩增的靶标核酸检测步骤包括：
步骤一，配制恒温扩增体系，将待测靶标进行RT-ERA扩增(RT-ERA试剂盒，先达基因)，37℃进行扩增20min；
步骤二，配制转录体系，将RT-ERA恒温扩增后的产物进行体外转录，将双链DAN转录为单链RNA，以实现Cas13蛋白结合进行后续剪切靶标。
步骤三，配制Cas13酶切反应体系，将转录后的靶标RNA与配制的酶切反应体系置于Bio-Tek酶标仪37℃恒温实时检测荧光信号，时间设定40min，并进行检测结果的判读。
上述一种优化的核酸检测的CRISPR方法，关键原料如下：
1)本发明所述靶标序列为：
5’-AACCCUAUUUCUCACAUCAGGGGGAGUAUUAUUAUCACUAUA UGUGUCAGCUUCAUUAUCAUACUUACUAUAUUCGGAUAUAUUGCUAAAAUUCUCACCAACAGAAAUAACUGCACCAACAAUGCCAUUGGAUUGUGCAAACGCAUCAAAUGUUCAGGCUGUGAACCGUUCUGCAACAAAAGGGGUGACACUUCUUCUCCCAGAACCGGAGUGGACAUACCCGCGUUUAUCUUGCCCGGGCUCAACCUUUCAGAAAGCACUUCUAAUUAGCCCUCAUAGA-3’；
2)所述的crRNA序列为：
5’-GAUUUAGACUACCCCAAAAACGAAGGGGACUAAAACCAGAAC GGUUCACAGCCUGAACAUUUG--3’，此序列一部分为Cas13蛋白识别序列，一部分序列为靶标核酸互补序列。在制备crRNA的DNA序列时，需要在其序列的前端加上T7RNA聚合酶识别的T7序列位点，为制备RNA做准备；
3)所述RT-ERA恒温扩增正向引物为：5’-TCACCAACAGAAATAACT GCACCAACAATGC-3’；正向引物设计时须在其前端加上T7RNA聚合酶识别的T7序列位点，便于后续体外转录；
4)所述RT-ERA恒温扩增反向引物为：5’-tctatgagggctaattagaagtgctttctga-3’
5)所述的报告RNA探针为：5’-FAM-UUUUU-BHQ-3’；
6)所述的CRISPR/Cas13蛋白为Cas13a，Cas13b，Cas13c，Cas13d，中的某一种；
所述的酶切缓冲体系如下：
基础酶切缓冲体系：60mMTris-HCl(pH7.3)；40mMNaCl；2mMMgCl2；
优化酶切缓冲体系：30～60mMTris-HCl(pH7.3)；50～80mMNaCl；2～8mMMgCl2；
优化酶切缓冲体系+表面活性剂：30～60mMTris-HCl(pH7.3)；50～80mM NaCl；2～8mMMgCl2；表面活性剂是TritonX-100，NP40，CA-630中的一种，浓度范围在0.01％～0.05％；
所述酶切反应体系组分：5X酶切缓冲buffer、20～100nMCas13蛋白、50～200nMcrRNA、5U/μLRNA酶抑制剂、100ng背景细胞RNA、50～200nM报告RNA、1μL靶标(10^11copies/μL)，总反应体系为50μL，反应条件为37℃孵育40min，使用Bio-Tek酶标仪检测实时及终点荧光信号。
本发明实施例1、实施例2和效果例1～效果例6中，所用原料及试剂均可由市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1不同酶切缓冲buffer检测靶标核酸单链RNA
步骤一，样本处理：在进行CRISPR酶切检测之前，依据不同样本的特性选择不同的合适的
样本处理方法，以最终获取检测靶标RNA形式。当然靶标核酸不限于单链RNA，也可以是双链DNA，单链DAN，依据本发明所用的Cas13蛋白，只需要对相应核酸形式进行转换即可。
步骤二，制备三种不同酶切缓冲体系，如表1所示；
表1
步骤三，如表2所示制备酶切反应体系，包括：与待测靶标序列互补的crRNA，Cas13蛋白，报告RNA，背景RNA，RNaseinhibitor以及三种不同酶切缓冲体系，配制整体酶切反应总体积为50μL；每种buffer比对检测进行重复实验；
表2
步骤四，将待测靶标加入酶切反应体系，Bio-Tek酶标仪37～42℃恒温实时进行荧光信号检测及结果判读。
对酶标仪检测的荧光信号值进行结果分析，比对3种不同buffer对同一靶标相同体系的酶切效率的影响，具体实验数据结果图1和图2所示。
如图1所示，通过实时荧光信号值显示发现，三种酶切缓冲体系对于CRISPR体系检测靶标的酶切效率效价不同。
如图2、表3和表4所示，通过终点荧光信号值数据计算，优化酶切缓冲体系与基础酶切缓冲体系相比，酶切效率提升25％；优化酶切缓冲体系+表活与优化酶切缓冲体系相比，酶切效率提升20％；而优化酶切缓冲体系+表活与基础酶切缓冲体系相比，酶切效率提升50％。说明通过优化CRISPR整个酶切反应体系，可以显著提升CRISPR剪切靶标核酸的酶切效价，从而有助于提升检测靶标的灵敏度。
表3
表4
实施例2与恒温扩增相结合，不同酶切缓冲buffer检测靶标核酸单链RNA的灵敏度
步骤一，样本处理：在进行CRISPR酶切检测之前，依据不同样本的特性选择不同的合适的；
样本处理方法，以最终获取检测靶标RNA形式。将靶标RNA稀释为10^4，10^3，10^2，10^1，10^0copies/μL，以检测三种不同酶切缓冲体系对靶标灵敏度的影响；
步骤二，使用先达基因的RT-ERA恒温扩增试剂盒，对靶标RNA进行37℃的恒温扩增，扩增时间为20min；使不同稀释度的靶标核酸扩增，提升靶标检测的灵敏度；
步骤三，将RT-ERA产物进行体外转录，以获得不同稀释度的Cas13蛋白识别的靶标RNA；
步骤四，制备三种不同酶切缓冲体系，如表1所示；
步骤五，如表2所示制备酶切反应体系，包括：与待测靶标序列互补的crRNA，Cas13蛋白，报告RNA，背景RNA，RNaseinhibitor以及三种不同酶切缓冲液，配制整体酶切反应体系的总体积为50μL；每种buffer比对检测进行重复实验；
步骤六，将待测靶标加入酶切反应体系，Bio-Tek酶标仪37～42℃恒温实时进行荧光信号检测及结果判读。
对酶标仪检测的终点荧光信号值进行结果分析，比对3种不同酶切缓冲体系对相同体系同一靶标核酸不同稀释度的的酶切效率影响，同步检测三种不同酶切缓冲体系对靶标灵敏度最低检测限的效价影响。具体荧光信号数据实验结果如表5～表7所示：
表5
表6方差分析：单因素方差分析
表7方差分析
| 差异源 | SS | df | MS | F | P-value | Fcrit |
| 组间 | 2808369827 | 2 | 1404184914 | 7.499444396 | 0.005525807 | 3.682320344 |
| 组内 | 2808577888 | 15 | 187238525.9 | |||
| 总计 | 5616947716 | 17 |
从表6和表7可知，利用方差分析(全称为单因素方差分析)对3组buffer不同梯度之间数据按照行进行分析，发现组间的P＜0.01，呈现显著性差异，表明优化buffer+表活的试剂组分配方能显著提升靶标剪切信号值以及靶标剪切灵敏度，其最低能检测到1copy。
如图3所示，通过检测终点荧光信号值发现，三种酶切缓冲体系对于CRISPR体系检测不同梯度的扩增靶标的酶切效率效不同。基础酶切缓冲体系剪切靶标的荧光信号值很低，且在40min的检测时间内不能达到荧光信号平台期，能检测到的扩增靶标核酸的最低检测限在10^2copies/μL且信号较弱；优化酶切缓冲体系剪切扩增靶标核酸的荧光信号值与基础酶切缓冲体系相比，虽在40min的检测时间内不能达到荧光信号检测平台期，但是优化酶切缓冲体系能检测到的扩增靶标核酸的最低检测限在10^0copies/μL；优化酶切缓冲体系+表面活性剂的剪切buffer，其剪切扩增靶标的荧光信号值很高，且10^2copies/μL以上的扩增靶标均能在10min以内达到荧光信号平台期，目前能检测到的扩增靶标核酸的最低检测限在10^0copies/μL。
效果例1CRISPR/Cas13蛋白为Cas13a，Cas13b，Cas13c，Cas13d中的某一种实验数据
实验方法：使用高拷贝线性RNA靶标(10^10copies)，按照表2的酶切反应体系配制，体系中加入相同100nmol/L的不同的Cas13蛋白(包括Cas13a/b/c/d)，按照实施例1的实验步骤，置于Bio-Tek酶标仪37℃恒温实时检测荧光信号，时间设定40min，进行检测结果的判读；
表8
表9
| 蛋白种类 | 40min终点荧光值 |
| Cas13a | 52367 |
| Cas13b | 39729 |
| Cas13c | 29422 |
| Cas13d | 9938 |
实验结果如表8、表9、图4和图5所示，在相同体系中，相同浓度的不同Cas13蛋白效价不同：Cas13a>Cas13b>Cas13c>Cas13d；Cas13a效价最优。效果例2优化酶切缓冲buffer
使用低拷贝线性RNA(10^3copies)按照实施例2扩增制备线性靶标，按照优化酶切缓冲体系配方配制酶切反应体系，体系分为不同的单因素分析设计(包括30～60mmol/LTris-HCl(pH7.3)；50～70mmol/LNaCl；4～8mmol/LMgCl2)，按照实施例2的操作步骤，置于Bio-Tek酶标仪37℃恒温实时检测荧光信号，时间设定40min，进行检测结果的判读；
表1030～60mmol/LTris-HCl(pH7.3)
表11
| Tris-HCl(mmol/L)PH7.3 | 均值 |
| 30 | 18730.4 |
| 40 | 19147.2 |
| 50 | 18227 |
| 60 | 18368.2 |
实验结果如表10、表11和图6所示，利用方差分析(全称为单因素方差分析)去研究Tris-Hcl(mmol/L)对于结果虽然未呈现显著性(p＞0.05)，但其最优浓度为40mmol/L。
表12
表13
| NaCl(mmol/L) | 均值 |
| 50 | 18810.8 |
| 60 | 18811.4 |
| 70 | 19230.4 |
| 80 | 18028 |
实验结果如表12、表13和图7所示，利用方差分析(全称为单因素方差分析)去研究NaCl(mmol/L)对于结果虽然未呈现显著性(p＞0.05)，但随着浓度的变化其荧光值有一定变化，但其最优浓度为70mmol/L。
表14
表15
| <![CDATA[MgCl<sub>2</sub>(mmol/L)]]> | 均值 |
| 2 | 19160.6 |
| 4 | 20879.6 |
| 6 | 18393.4 |
| 8 | 18176.2 |
实验结果如表14、表15和图8所示，利用方差分析(全称为单因素方差分析)去研究MgCl2(mmol/L)对于结果呈现显著性(p＜0.05)，但其最优浓度为4mmol/L。
效果例3表面活性剂是TritonX-100，NP40，CA-630中的一种或多种，浓度范围在0.01％～0.05％
使用低拷贝线性RNA(10^3copies)按照实施例2扩增制备线性靶标，按照优化酶切缓冲体系配方配制酶切反应体系，在优化酶切缓冲体系中加入不同浓度梯度的表面活性剂(包括0.01％～0.05％TritonX-100、NP40或CA-630)，按照实施例2的实验步骤置于Bio-Tek酶标仪37℃恒温实时检测荧光信号，读取40min终点荧光值，进行检测结果的判读。
表160.01％～0.05％TritonX-100
表17方差分析：单因素方差分析
表18方差分析
| 差异源 | SS | df | MS | F | P-value | Fcrit |
| 组间 | 19085373.73 | 4 | 4771343.433 | 12.86217846 | 0.000591963 | 3.478049691 |
| 组内 | 3709592 | 10 | 370959.2 | |||
| 总计 | 22794965.73 | 14 |
实验结果如表16～表18和图9所示，利用方差分析(全称为单因素方差分析)去研究TritonX100(％)对于结果呈现显著性(p＜0.01)，其最优浓度为0.03％。
表190.01％～0.05％NP40
表20方差分析：单因素方差分析
表21方差分析
| 差异源 | SS | df | MS | F | P-value | Fcrit |
| 组间 | 46865596.93 | 4 | 11716399.23 | 22.48959102 | 5.51126E-05 | 3.478049691 |
| 组内 | 5209698.667 | 10 | 520969.8667 | |||
| 总计 | 52075295.6 | 14 |
实验结果如表19～表21和图9所示，利用方差分析(全称为单因素方差分析)去研究NP40(％)对于结果呈现显著性(p＜0.01)，其最优浓度为0.04％。
表220.01％～0.05％CA-630
表23方差分析：单因素方差分析
表24方差分析
| 差异源 | SS | df | MS | F | P-value | Fcrit |
| 组间 | 62843864.93 | 4 | 15710966.23 | 57.54738754 | 7.24512E-07 | 3.478049691 |
| 组内 | 2730092 | 10 | 273009.2 | |||
| 总计 | 65573956.93 | 14 |
实验结果如表22～表24和图10所示，利用方差分析(全称为单因素方差分析)去研究CA630(％)对于结果呈现显著性(p＜0.01)，其最优浓度为0.02％。
表250.01％～0.05％TritonX-100vsNP40vsCA-630
| 浓度(％) | TritonX-100 | NP40 | CA-630 |
| 0.01 | 16859 | 13192 | 16859 |
| 0.02 | 19581 | 15389 | 22863 |
| 0.03 | 20080 | 16746 | 21746 |
| 0.04 | 19307 | 17974 | 21307 |
| 0.05 | 19439 | 17772 | 20439 |
表26方差分析：单因素方差分析
表27方差分析
| 差异源 | SS | df | MS | F | P-value | Fcrit |
| 组间 | 50320774.1 | 2 | 25160387.05 | 7.032688303 | 0.009521458 | 3.885293835 |
| 组内 | 42931611.87 | 12 | 3577634.322 | |||
| 总计 | 93252385.97 | 14 |
实验结果如表25～表27所示，在相同体系中，最优表面活性剂为CA-630，其最适浓度为：0.02％。
效果例4
使用不同拷贝线性RNA(10^5～10^2copies)按照实施例2扩增制备线性靶标，按照优化酶切缓冲体系配方+表面活性剂配制酶切反应体系，按照实施例2实验步骤置于Bio-Tek酶标仪37℃恒温实时检测荧光信号，时间设定40min，进行检测结果的判读。
表28
实验结果如表28和图11所示，10^2copies/μL以上的扩增靶标均能在10min以内达到荧光信号平台期。
效果例5酶切反应体系组分优化
使用高拷贝线性RNA(10^11copies)，按照基础酶切缓冲体系配方配制酶切反应体系，体系分为不同的单因素分析设计(包括20～100nmol/LCas13蛋白、50～200nmol/LcrRNA、50～200nmol/L报告RNA)，按照实施例1的实验步骤置于Bio-Tek酶标仪37℃恒温实时检测荧光信号，时间设定40min，进行检测结果的判读。
表2920～100nmol/LCas13
表30方差分析：单因素方差分析
表31方差分析
| 差异源 | SS | df | MS | F | P-value | Fcrit |
| 组间 | 463909695 | 3 | 154636565 | 352.6175223 | 7.78689E-09 | 4.066180551 |
| 组内 | 3508312.667 | 8 | 438539.0833 | |||
| 总计 | 467418007.7 | 11 |
实验结果如表29～表31和图12所示，利用方差分析(全称为单因素方差分析)去研究Cas13蛋白(nmol/L)对于结果呈现显著性(p＜0.01)，其最优浓度为50nmol/L。
表3250～200nmol/LcrRNA
表33方差分析：单因素方差分析
表34方差分析
实验结果如表32～表34和图13所示，利用方差分析(全称为单因素方差分析)去研究crRNA(nmol/L)对于结果呈现显著性(p＜0.01)，但其最优浓度为150nmol/L。
表3550～200nmol/L报告RNA
表36方差分析：单因素方差分析
表37方差分析
| 差异源 | SS | df | MS | F | P-value | Fcrit |
| 组间 | 195475748.9 | 4 | 48868937.23 | 740.0168576 | 2.58881E-12 | 3.478049691 |
| 组内 | 660376 | 10 | 66037.6 | |||
| 总计 | 196136124.9 | 14 |
实验结果如表35～表37和图14所示，利用方差分析(全称为单因素方差分析)去研究crRNA(nmol/L)对于结果呈现显著性(p＜0.01)，但其最优浓度为100nmol/L。
效果例6优化酶切缓冲体系+表面活性剂中，表面活性剂TritonX-100与专利浓度(0.008％)比对实验
使用低拷贝线性RNA(10^3copies)按照实施例2扩增制备线性靶标，按照优化酶切缓冲体系配方配制酶切反应体系，在优化酶切缓冲体系中加入不同浓度梯度的表面活性剂0.00％～0.01％TritonX-100，按照实施例2的实验步骤后置于Bio-Tek酶标仪37℃恒温实时检测荧光信号，读取40min终点荧光值，进行检测结果的判读。
表380.00％～0.01％TritonX-100
表39方差分析：单因素方差分析
表40方差分析
| 差异源 | SS | df | MS | F | P-value | Fcrit |
| 组间 | 118469888.7 | 3 | 39489962.89 | 925.2080874 | 1.67694E-10 | 4.066180551 |
| 组内 | 341458 | 8 | 42682.25 | |||
| 总计 | 118811346.7 | 11 |
实验结果如表38～表40和图15所示，利用方差分析(全称为单因素方差分析)去研究TritonX100(％)发现，随着浓度的升高荧光值在持续升高，但还未到达最适浓度范围，本验证例所使用的最优浓度范围详见效果例3。
另外，在以上实验在基础上，将缓冲液TRIS-HCl替换成HEPES、或者将NaCl替换成KCl，所有实验验证结论均相近似，符合实验预期。
综上可见，通过加入适量的表面活性剂去优化CRISPR剪切buffer，可以显著提高检测靶标核酸的灵敏度及缩短检测时间，可以在30分钟内实现1copy靶标检测。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.酶切缓冲试剂，其特征在于，包括：缓冲液，一价金属离子、镁离子和表面活性剂。
2.如权利要求1所述的酶切缓冲试剂，其特征在于，
所述缓冲液包括TRIS-HCl或HEPES；
所述一价金属离子以NaCl或KCl的形式添加；
所述镁离子以MgCl2的形式添加。
3.如权利要求2所述的酶切缓冲试剂，其特征在于，包括：
4.如权利要求1至3任一项所述的酶切缓冲试剂，其特征在于，所述表面活性剂包括：Triton X-100、NP40或CA-630中的一种或多种。
5.酶切反应体系，其特征在于，包括：
6.如权利要求5所述的酶切反应体系，其特征在于，所述CRISPR核酸酶包括：Cas13a、Cas13b、Cas13c或Cas13d中的一种或多种。
7.核酸的检测方法，其特征在于，取待测靶标与如权利要求5或6所述的酶切反应体系混合，检测，根据荧光信号对检测结果进行判读。
8.如权利要求7所述的检测方法，其特征在于，所述检测方法还包括恒温扩增的步骤。
9.如权利要求8所述的检测方法，其特征在于，取待测靶标RT-ERA扩增后，体外转录，再与如权利要求5或6所述的酶切反应体系混合，检测，根据荧光信号对检测结果进行判读。
10.如权利要求9所述的检测方法，其特征在于，所述RT-ERA扩增的时间为20min，温度为37℃。
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