CN111235638A - 一种构建测序文库的方法及试剂盒 - Google Patents

Abstract

本申请提供一种构建测序文库的方法及试剂盒。所述方法与所述试剂盒透过酶组合物中包括核酸平末端内切酶，不需要额外步骤来修复DNA片段，就得直接利用连接酶连接所述DNA片段及接头来产生DNA文库。所述方法与所述试剂盒与以往的建库方法相比，特异性强、时间短、产量高且后期磁珠消耗少，有效改善应用于二代测序平台的DNA文库的建构。

Description

一种构建测序文库的方法及试剂盒

技术领域

本申请涉及测序技术领域，尤其涉及一种二代测序平台的DNA文库的构建方法及试剂盒。

背景技术

1977年，英国生物化学家弗雷德里克·桑格发明双脱氧链终止法DNA测序法，又称桑格法(Sanger method)。双脱氧链终止法与化学降解法以及其衍生方法统称为第一代DNA测序技术，为人类基因组计划所使用主要测序方法。但由于其存在成本高、检测周期长、通量低等不足，已经逐渐被淘汰。

高通量测序技术(High-throughput Sequencing)是对传统Sanger测序革命性的改变，由于该种方法能够一次同时对几十万到几百万核酸分子进行序列测定，因此被称为二代或者下一代测序技术(Next Generation Sequencing,NGS)。测序技术的发展大大推动了生命科学研究。随着HiSeq X-10,MiSeq和Nextseq 500为代表的第二代测序技术的快速发展，越来越多的生物学问题通过二代测序技术得以解决。通过基因组重测序等技术可以快速获得癌症以及各种传染疾病病毒或其它微生物的基因及耐药信息。在现代生物技术，临床医学诊断方面有极大的应用范围。

在NGS平台中，Ion Torrent是第一个没有采用光学感应的NGS平台。Ion Torrent的原理是测序前先将提取的DNA打碎为一定长度的碎片，而后把单个碎片与一个布满探针的微型小球相连接。接着通过扩增技术，将这个微球的表面布满的探针扩增为有相同序列的DNA片段，这时微球就像一个毛球。此后，将微球放入含有上百万微孔的测序芯片上，通过每次放入含有一个碱基的液体，每轮分别重复4次以放入不同碱基(A\T\G\C)，就会发生至少一次的DNA合成。在合成过程中，dNTP会释放出氢离子，使pH值改变，通过微孔底部的感受器如互补金属氧化物半导体 (complementary metal-oxide-semiconductor，CMOS)以及离子敏感场效应晶体管 (ion-sensitive field-effect transistor，ISFET)，来检测在某一轮的某个碱基所出现的信号转化成电信号。最终，将电信号整合就能获得DNA的实际序列。

本申请旨在提供一种操作简单、快捷的构建DNA文库的的试剂盒，及透过操作此试剂盒来完成的DNA文库的构建方法。透过本申请的构建DNA文库试剂盒与方法，节约磁珠用量1/3使成本降低，并让序列的覆盖区域变大，且节省步骤，而能高效制备用于ion torrent二代测序平台的病毒DNA文库。

发明内容

本申请的目的在于提供一种DNA文库的构建方法，以及一种构建DNA文库的试剂盒。

本申请的上述目的透过以下技术手段来实现。

一种构建DNA文库的方法，其特征在于，所述方法包括：

将样本DNA与酶组合物混合以截切产生DNA片段，其中所述酶组合物包括核酸平末端内切酶及磷酸酶；及

利用连接酶连接所述DNA片段及接头，以产生DNA文库。

优选地，其特征在于所述核酸平末端内切酶包括RsaI、HaeIII、AluI或其组合。

优选地，其特征在于所述磷酸酶包括小牛肠碱性磷酸酶(CIP)。

优选地，其特征在于所述连接酶包括T4连接酶。

优选地，其特征在于所述截切步骤在20-40℃、进行5-15分钟。

优选地，其特征在于所述连接步骤在20-37℃、进行5-40分钟。

优选地，所述方法进一步包括：将病毒RNA反转录为所述样本DNA。

优选地，其特征在于所述病毒包括HIV。

优选地，所述方法进一步包括：在所述连接步骤前，以磁珠纯化所述DNA片段。

一种构建DNA文库的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括酶组合物及连接酶，其中所述酶组合物包括核酸平末端内切酶及磷酸酶。

优选地，其特征在于，所述核酸平末端内切酶包括RsaI、HaeIII、AluI或其组合。

优选地，其特征在于，所述磷酸酶包括小牛肠碱性磷酸酶(CIP)。

优选地，其特征在于，所述连接酶包括T4连接酶。

优选地，所述试剂盒进一步包括接头。

优选地，所述试剂盒进一步包括反转录酶。

优选地，所述试剂盒进一步包括磁珠。

附图说明

图1显示本申请的建构方法的原理与操作流程。

图2显示内切酶RsaI在HIV-1基因组的切割位点。

图3显示内切酶HaeIII在HIV-1基因组的切割位点。

图4显示内切酶AluI在HIV-1基因组的切割位点。

图5与图6分别显示Agilent 2100Bioanalyzer检测DNA文库中片段长度分布的电泳图与谱图。

具体实施方式

除非特别定义，否则所有于此所用的技术及科学名词均与本领域技术人员所通常理解的意义相同。若于本文中所用定义与其他公开文献中所载定义有所矛盾或不一致，则应以此处所用的定义为准。

如本文中所用者，术语"选自"(selected from)、”由…构成”(composed of)与”包含”(comprising)同义。如本文中所用者，术语”包含”(comprises,comprising)、”包括”(includes,including)、”具有”(has,having)、”含有”(contains,containing)、或其任何其他变型，是意欲涵盖非排他性的涵括。例如，含有清单列出的复数元素的一组合物、制程、方法、制品或装置不一定仅限于清单上所列出的这些元素而已，而是可以包括未明确列出但却是所述组合物、制程、方法、制品或装置固有的其他元素。

当量、浓度、或其他数值或参数给出了范围、优选范围或上优选值与下优选值之列举时，应将其理解为特定公开由任何范围上限或优选值与任何范围下限或优选值之任何配对所形成之所有范围，无论该些范围是否分别公开。例如，当叙述一个范围为”1 至5”时，所叙述之范围应被理解为包括范围”1至4”、”1至3”、”1至2”、”1至2与 4至5”、”1至3与5”等等。若本说明书中叙述一个数值范围，则除非另有说明，该范围意欲包括其端点以及该范围内的所有整数和小数。

此外，除非另有明确说明，”或”意指包括性的”或”而非指排除性的”或”。例如，条件A”或”B满足于下述情况之任何一种：A成立(或存在)且B不成立(或不存在)、 A不成立(或不存在)且B成立(或存在)、以及A和B两者皆成立(或存在)。

同样地，除非上下文明确说明，否则位于本文的元素或成份之前的不定冠词”一”、”一个”及”一种”旨在非限制性地说明所述元素或成份的实例数目(即出现数)。因此，”一”、”一个”及”一种”应理解为包括一个或至少一个，且所述元素或成分的单数词形也包括复数形式。

本申请系基于Ion Torrent测序平台中建构DNA文库的方法，进行制剂混合与简化步骤所获得的改良方法与试剂盒。本申请建构DNA文库方法的操作原理与流程呈现如图1。在本申请的一个实施态样中，一种构建DNA文库的方法包括：将样本DNA 与酶组合物混合以截切产生DNA片段，利用连接酶连接所述DNA片段及接头以产生DNA文库。在本申请的一个实施态样中，所述酶组合物包括核酸平末端内切酶及磷酸酶。

为达到简化步骤的目的，本申请的所述酶组合物中，特别采用核酸平末端内切酶。一般的核酸内切酶会特异性地辨识样本DNA上的识别序列，并从切割位点打断样本 DNA，以截切产生DNA片段。在一部分的核酸内切酶中，打断后的DNA片段的两条链中，会有一条链的长度长于另一条链，呈现末端一条链长另一条链短的不平末端的态样，也就是黏性末端(Sticky Ends)。本申请限定的核酸平末端内切酶，则是使打断后的DNA片段中，两条链的长度等长，而呈现平末端(Blunt Ends)。在一个可行的实施态样中，所述酶组合物不可包含除上示的核酸平末端内切酶以外的其他核酸内切酶，以避免打断后的DNA片段中出现不平末端者。在本申请的一个实施态样中，核酸平末端内切酶包括RsaI、HaeIII、AluI或其组合。在一个可行的实施态样中，在不影响如上所列举的核酸平末端内切酶的效果的前提下，可另添加其他种类的核酸平末端内切酶，例如:AccII、HapI。在一个可行的实施态样中，核酸平末端内切酶的识别序列是四个碱基。

为达到试剂盒能操作简易的目的，本申请的所述酶组合物中，除核酸平末端内切酶外，一并包括有磷酸酶。所述磷酸酶(phosphatase)是能够将对应底物去磷酸化的酶，即通过水解磷酸单酯将底物分子上的磷酸基团除去，并生成磷酸根离子和自由的羟基。在许多生物体中普遍存在的一种磷酸酶是碱性磷酸酶(Alkaline Phosphatase)，其可将DNA与RNA的5’端磷酸基团去除。由于DNA连接酶催化DNA连接时，会需要截切后在切点端所保留的磷酸基团。因此，若将打断后的DNA片段经碱性磷酸酶去磷酸化，则因5’端无磷酸基团，而不会和自身3’端连接，以阻止DNA片段本身会优先发生的连接反应。在本申请的一个实施态样中，磷酸酶可采用小牛肠碱性磷酸酶(Calf intestinal alkaline phosphatase，CIP)。在一个可行的实施态样中，在不影响本申请试剂盒与方法的效果的前提下，可选用其他来源的碱性磷酸酶，例如:细菌的碱性磷酸酶(Bacterial alkaline phosphatase,BAP)和虾的碱性磷酸酶(Shrimp alkaline phosphatase,SAP)。

由于本申请的所述酶组合物中所采用的是核酸平末端内切酶，使截切后所产生的DNA片段呈现平末端，而不需要将不平末端补平的额外步骤。DNA片段在不经过末端补平，就能直接利用连接酶连接所述DNA片段及接头以产生DNA文库，以达到简化步骤、提高效率的目的。在本申请的一个实施态样中，所述连接酶包括T4连接酶。在一个可行的实施态样中，不影响所述连接酶效果的前提下，所述连接酶可采用其他种类的连接酶。

本申请的建构DNA文库的方法中，为使样本DNA与酶组合物混合后能适当反应，以顺利截切出DNA片段，所述截切步骤的温度视所使用的酶而定，一般在 20-40℃、优选在37℃。所述截切步骤的时间在5-15分钟、优选在10分钟。反应完成后，以温度65-75℃、时间8-12分钟来终止反应。

本申请的建构DNA文库的方法中，为利用连接酶连接所述DNA片段及接头以产生DNA文库，所述连接步骤的温度视所使用的酶而定，一般在20-30℃、优选在 25℃。所述截切步骤的时间在5-20分钟、优选在15分钟。反应完成后，以温度 65-75℃、时间3-10分钟来终止反应。

本申请的建构DNA文库的方法与试剂盒可应用于病毒。若病毒的遗传信息储存在脱氧核糖核酸(DNA)，则可直接抽提病毒的DNA，作为样本DNA来进行本申请所述的方法。若病毒的遗传信息储存在核糖核酸(RNA)上，则需要抽提病毒的RNA 利用反转录酶以及随机引物，来生成cDNA作为样本DNA来进行本申请所述的方法。在本申请的一个实施态样中，所述建构DNA文库的方法，进一步包括将病毒RNA 反转录为cDNA。所述cDNA作为样本DNA，续行与酶组合物混合的截切步骤。

如上示的可应用于本申请的病毒包括且并不限定于:艾滋病病毒(humanimmunodeficiency virus，HIV)、丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus)、乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)、流感病毒(Influenza A virus)、鼻病毒(rhinovirus)，脊髓灰质炎病毒(poliovirus)、柯萨奇病毒(coxsackievirus)、登革热病毒(Dengue virus, DENV)、轮状病毒(Rotavirus，RV)、烟草花叶病毒(Tobacco mosaicvirus，TMV)、严重急性呼吸综合征冠状病毒(severe acute respiratory syndromecoronavirus, SARS-CoV)、中东呼吸综合症冠状病毒(Middle East respiratorysyndrome coronavirus, MERS-CoV)、埃博拉病毒(Ebola virus)、马尔堡病毒(Marburgvirus)、部分噬菌体、新型冠状病毒(2019-nCoV)。在本申请的一个实施态样中，所述病毒包括HIV-1或 HIV-2。在本申请的一个实施态样中，本申请中所采用的核酸平末端内切酶RsaI、HaeIII 及AluI针对HIV-1的基因组的切割位点，分别显示于图2、图3及图4。

本申请经过截切步骤所获得的DNA片段，在连接步骤前，可因应需求进行纯化。在本申请的一个实施态样中，以磁珠纯化DNA片段。

进行如上示的DNA文库建构的方法，得采用但不限于本申请的构建DNA文库的试剂盒。本申请的构建DNA文库的试剂盒包括酶组合物及连接酶，其中所述酶组合物包括核酸平末端内切酶及磷酸酶。所述核酸平末端内切酶、磷酸酶及连接酶的作用与选用如上示说明。在本申请的一个实施态样中，试剂盒进一步包括接头，以与 DNA片段连接。在本申请的一个实施态样中，试剂盒进一步包括反转录酶，以将病毒的RNA反转录为cDNA作为样本DNA以应用于本申请的试剂盒。在本申请的一个实施态样中，试剂盒进一步包括磁珠，在连接步骤前以磁珠纯化DNA片段。

以本申请的建构DNA文库的方法或操作本申请的建构DNA文库的试剂盒所获得的DNA文库得进一步进行定量、定性检测所得DNA文库的质量。在本申请的一个实施态样中，可选用但不限于以Real-time PCR方法或使用荧光染料法对DNA文库进行定量。在本申请的一个实施态样中，可选用但不限于以琼脂糖凝胶电泳或毛细管电泳系统检测DNA文库中的片段分布范围。

实施例

如下以具体实施方式，进一步阐述本申请请求保护的发明。这些实施例仅用于说明本申请请求保护的发明而不用于限制本申请请求保护的发明的范围。此外，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

DNA样本制备

采用Verso 1-Step RT-PCR Kit ReddyMix(ThermoFisher(中国)有限公司)，反转录混合物所包含的成分，如反转录酶、随机引物，及其比例如下表1所示。

表1

将反转录混合物与从HIV-1所提取的RNA混合，透过反应条件:50℃、30分钟；94℃、2分钟；94℃、30秒，55℃、30秒，及72℃、2分钟，共30个循环；72℃、10分钟；4℃、1分钟，生成cDNA作为样本DNA。

DNA片段制备

将作为核酸平末端内切酶的RsaI、HaeIII、AluI(New England Biolabs，NEB (北京)有限公司)或其组合，与作为磷酸酶的Quick CIP混合，以制备酶组合物。将该酶组合物以涡旋3秒混匀后，取10μL加入到如下表2的内切酶反应缓冲液中，混合该酶组合物与样本DNA。

表2

*Y:经样本DNA的制备实验后，具体所得的cDNA的量。

该酶组合物与样本DNA混合后，透过反应条件:37℃、15分钟；70℃、10分钟，生成DNA片段。

DNA片段纯化

将磁珠纯化试剂Agencourt AMPure XP(Backman Coulter商贸(中国)有限公司)与DNA片段混合，制备如下表3的磁珠混合物。

表3

将该磁珠混合物，透过纯化条件:1.8×beads纯化；以200μL的70％乙醇漂洗2 次；以25μL的Low TE洗脱，获得纯化的DNA片段。

DNA片段连接接头

接头采用Ion XPress Barcode Adaptors 1-16Kit(ThermoFisher(中国)有限公司)、连接酶采用T4 DNA Ligase(New England Biolabs(北京)有限公司)，并与Bst 2.0

DNA Polymerase、纯化的DNA片段混合，制备如下表4的连接混合物。

表4

将该连接混合物，透过反应条件:25℃、15分钟；72℃、5分钟，获得与接头连接的DNA片段，完成DNA文库的构建。DNA文库保存于4℃中，以供后续测序的步骤使用。

DNA文库定量与质量检测

采用定量试剂盒Ion Library TaqMan Quantitation Kit(ThermoFisher(中国)有限公司)，制备qPCR混合物如下表5。

表5

将该qPCR混合物，透过反应条件:50℃、2分钟；95℃、20秒；95℃、1秒及60℃、20秒的40个循环，定量所得DNA文库。

随后以2100Bioanalyzer微流体电泳分析仪(Agilent 2100Bioanalyzer)检测DNA文库中片段长度分布，所得结果如图5与图6。从图5的电泳结果中，200-300bp间呈现带型，表示存在有长度为200-300bp的DNA片段。从图6的片段长度分布中，讯号出现在35bp、150-300bp、10380bp。其中150-300bp的讯号波幅大，表示所得片段的长度多在150-300bp间。DNA文库定量与质量检测的结果来看，透过本申请的的方法与试剂盒，所建构的DNA文库的质量佳，适用于二代测序的后续步骤。

虽然本申请所述发明已以实施例揭露如上，然其并非用以限定本申请所述发明，任何所属技术领域中技术人员，在不脱离本申请所述发明的精神和范围内，当可更动与组合上述各种实施例。

Claims (16)

1.一种构建DNA文库的方法，其特征在于，所述方法包括：

将样本DNA与酶组合物混合以截切产生DNA片段，其中所述酶组合物包括核酸平末端内切酶及磷酸酶；及

利用连接酶连接所述DNA片段及接头，以产生DNA文库。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述核酸平末端内切酶包括RsaI、HaeIII、AluI或其组合。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述磷酸酶包括小牛肠碱性磷酸酶(CIP)。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述连接酶包括T4连接酶。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述截切步骤在20-40℃进行5-15分钟。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述连接步骤在20-37℃进行5-40分钟。

7.如权利要求1所述的方法，进一步包括：将病毒RNA反转录为所述样本DNA。

8.如权利要求7所述的方法，其中所述病毒包括HIV。

9.如权利要求1所述的方法，进一步包括：在所述连接步骤前，以磁珠纯化所述DNA片段。

10.一种构建DNA文库的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括酶组合物及连接酶，其中所述酶组合物包括核酸平末端内切酶及磷酸酶。

11.如权利要求10所述的试剂盒，其特征在于，所述核酸平末端内切酶包括RsaI、HaeIII、AluI或其组合。

12.如权利要求10所述的试剂盒，其特征在于，所述磷酸酶包括小牛肠碱性磷酸酶(CIP)。

13.如权利要求10所述的试剂盒，其特征在于，所述连接酶包括T4连接酶。

14.如权利要求10所述的试剂盒，进一步包括接头。

15.如权利要求10所述的试剂盒，进一步包括反转录酶。

16.如权利要求10所述的试剂盒，进一步包括磁珠。

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