CN110923301B - 一种dna甲基化多基因位点联合检测方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于基因检测领域，公开了一种DNA甲基化多基因位点联合检测方法。本发明采用重亚硫酸盐转化后的甲基化DNA为模板，进行两轮PCR扩增反应。通过磁珠特异捕获目标片段，并使用SAPE对其进行荧光标记，最后使用液相芯片检测平台检测荧光信号。本发明可以用于同步检测多达100种基因甲基化位点，且有高准确度、高敏感性以及高检测通量等特点，可以解决现有技术成本高、难以检测多位点以及检测精度不高等问题。本发明所述的方法可应用于在各领域1‑100个基因位点联合的甲基化检测，包括但不限于疾病诊断、司法鉴定、科研服务等。

Description

一种DNA甲基化多基因位点联合检测方法及其应用
技术领域
本发明属于基因检测领域，具体涉及一种DNA甲基化多基因位点联合检测方法及其应用。
背景技术
DNA甲基化是一种主要的表观遗传学修饰，人基因组中甲基化几乎只发生在CpG二核苷酸。在DNA甲基转移酶的催化下，将S-腺苷甲硫氨酸上的甲基转移到CpG岛5＇胞嘧啶上，生成5＇甲基胞嘧啶。当基因启动子区的CpG岛区域发生非正常高甲基化时，该基因的转录和表达就会受到抑制，引起疾病的发生。
根据检测的目的不同，检测DNA甲基化的方法主要分为两类：一类是检测特定的甲基化位点，包括甲基化敏感限制性内切酶-Southern印记杂交技术、重亚硫酸盐修饰后测序法、甲基化特异性PCR(MSP)、亚硫酸氢钠联合限制性内切酶分析法(C0BRA)等技术。
其中甲基化敏感限制性内切酶-Southern印记杂交技术是通过利用甲基化敏感的限制性内切酶只切割非甲基化DNA片段，而不切割甲基化DNA片段的特性。利用两种不同的内切酶对DNA片段进行切割，用带有放射性标记的探针对DNA片段进行杂交，比较条带来得到目的位点的甲基化状态。这种方法因为涉及酶切反应，需要控制时间温度，操作复杂，灵敏度有限，且很难甚至不能得到多基因位点的甲基化水平，所以难以在临床诊断方面进行推广。
重亚硫酸盐修饰高通量测序法是利用非甲基化胞嘧啶可以被重亚硫酸盐修饰转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不变的特性。将目的片段修饰后，再进一步通过高通量测序技术比较待测片段中的甲基化情况。这种方法分辨率虽高，但是由于要进行高通量测序，费用成本过高，得到信息冗余。并且所需待检DNA样本量较大，同样不适用于临床推广。
甲基化特异性PCR同样利用重亚硫酸盐对目的片段进行修饰，针对修饰后的甲基化或非甲基化DNA分别设计检测引物，进行PCR扩增反应。若用甲基化片段设计得到的引物可以扩增出片段，说明该检测位点发生了甲基化，反之亦然。这种方法虽然具有较高的特异性和灵敏度，但是该方法一般只能检测单个DNA甲基化位点，扩增过程容易产生假阳性信号，临床应用受限。
亚硫酸氢钠联合限制性内切酶分析法(COBRA)首先也是将目的片段进行重亚硫酸盐修饰，对修饰后的片段进行PCR扩增后使用限制性内切酶酶切PCR产物，根据电泳条带的不同位置以及亮度检测甲基化的状态和程度。这种方法虽简便，可定量，但是由于检测位点受限，不能排除假阴性的可能，亦无法用于临床应用。
第二类是检测基因组总体的甲基化水平，包括变性高液相色谱法(DHPLC)、基于抗5mC的免疫化学法、甲基转移酶法(M.Sssl)等。
其中变性高液相色谱法利用DNA序列中GC含量和DNA失配情况来确定DNA片段被色谱柱保留的时间。序列中CpG位点的甲基化导致PCR产物中的GC含量比未甲基化基因的含量增加，导致更高的熔融温度，增加了保留时间。所以在部分变性的条件下，通过检测由重亚硫酸盐处理的DNA片段保留时间，可以显示DNA甲基化的差异。这种方法可以对DNA甲基化进行定量检测，但是由于操作复杂，无法定位基因位点且不够精确，应用受到限制。
抗5mC的免疫化学法是基于5mC抗体能够与5mC发生特异性反应所设计的方法。首先应用荧光素标记该抗体使之与预先已固定在DEAE膜上的样品DNA特异性结合，对DEAE膜上的荧光素进行测量，荧光素的强度与5mC的水平成正比。这种方法主要依靠于抗体的设计，而抗体的设计又较为困难，同样不易推广使用。
CpG甲基转移酶(M.Ssl)法是通过M.Ssl识别双链DNA上的CpG二核苷酸序列，并对其中的胞嘧啶残基进行甲基化修饰。该过程中修饰所用的甲基由3H-S-腺苷甲硫氨酸(3H-SAM)提供，剩余腺苷甲硫氨酸(SAM)的放射性强度则与所测DNA的甲基化水平成反比。但是由于M.Ssl甲基转移酶不稳定，导致该技术的精准度及稳定性不强。
由于DNA甲基化位点具有组织特异性和个体差异性，单位点基因甲基化检测敏感性和特异性相对较低，不足以成为可靠的诊断依据，目前临床上并没有高效、高敏感性、低成本的DNA甲基化多位点检测技术。
发明内容
本发明的目的在于克服上述不足之处，从而提供一种DNA甲基化多基因位点联合检测方法，该方法是基于荧光检测技术以及多重PCR扩增技术的DNA甲基化多位点联合检测方法，具有高准确度、高敏感性以及高检测通量等特点，可以解决现有技术成本高、难以检测多位点以及检测精度不高等问题。
本发明提供的一种DNA甲基化多基因位点联合检测方法，其中所述方法包括以下步骤：
步骤A：一轮PCR扩增反应扩增1-100个经重亚硫酸盐转化后的目标DNA基因片段；
步骤B：二轮PCR扩增反应扩增步骤A得到的目标DNA片段，从而为其添加可被捕获的标签序列和生物素；
步骤C：使用磁珠捕获步骤B产物
步骤D：使用链霉亲和素对步骤C产物进行荧光标记；
步骤E：上机检测步骤D产物荧光信号及数据分析判定。
优选的，所述步骤A中一轮PCR扩增反应DNA模板可以来源于任何生物。
优选的，所述步骤A中一轮PCR扩增反应引物根据目标基因甲基化特异位点进行设计。
优选的，所述步骤B中二轮PCR扩增反应体系包括生物素标记的dCTP。
优选的，所述步骤B引物根据目标基因甲基化特异位点进行设计，上游引物5’端添加标签序列。
优选的，所述步骤A和步骤B中引物是1-100对引物混合而成。
优选的，所述步骤B中DNA模板是步骤A产物经过磁珠纯化方法或纯化柱纯化方法或SAP纯化方法纯化得到的，更优选的，选用磁珠纯化方法进行纯化。
优选的，所述步骤C中磁珠是1-100种探针序列与步骤BPCR产物标签序列互补的磁珠混合物。
优选的，所述步骤C中杂交反应条件是85-100℃60-120s；25-40℃10-20min。
优选的，所述步骤E中使用液相芯片检测平台进行检测。
优选的，所述步骤E判定标准为如果样本检测数值大于等于阴性标准品数值的三倍，则判定该基因位点发生甲基化，如果样本检测数值小于阴性标准品数值的三倍，则判定该基因位点未发生甲基化。
1.本发明的显著效果是：本发明与现有技术相比具有以下优点：本发明可以用于检测含有DNA量小于100ng的样本，如血液游离DNA、血液循环肿瘤细胞等样本。本发明可以用于同步检测多达100种基因甲基化位点，且快速高通量(每60分钟可以检测9600位点)，敏感性和特异性高于大部分现有技术。本发明还可以评估特定DNA片段的多个CpG位点甲基化水平，对多种疾病的诊断及治疗具有重要意义。本发明所述的方法可应用于在各领域1-100个基因位点联合的甲基化检测，包括但不限于司法鉴定、疾病诊断、科学研究等。
附图说明
图1是本发明DNA甲基化多基因位点联合检测方法的流程示意图。
图2是本发明实施例的结果图。
具体实施方式
下面通过具体实施例进一步阐述本发明，但是本领域技术人员将会理解下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。
下述实施例中所用的实验方法若无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例
本实施例采用本发明提供的方法检测来自肠癌患者经重亚硫酸盐转化后的人类组织DNA作为待检测样本、人类甲基化DNA和人类非甲基化DNA(ZYMO RESEARCH,D5014)作为阳性和阴性标准品，检测样本中SEPT9,MGMT,SDC2,RASSF1A,ACTB,ADHEF1基因是否发生甲基化，包括下述步骤：
1)PCR引物合成：
一轮PCR引物根据目标基因甲基化特异位点进行设计，序列如下：
基因名称 上游引物(5’-3’) 下游引物(5’-3’)
SEPT9 GTTGTAATTAAAGGATTATTT TGTTATTTGAAATTTTAAA
MGMT ATATGATTATAGATGTTATTT GGTATTATTTAGTGGTAGT
SDC2 ATAAATGAGGATTTAGTTT AAGTAGGAGGTAGGTTATT
RASSF1A AATTGTTTAATTAGGATA TTAATGTAGTGATGATTGG
ACTB AATGGTATTTATGATTAT TTATTTGGAAATAGTGGTT
ADHEF1 TTATTGTAAGAGATGGAAA TTGATTGTTGGGGAGTGA
二轮PCR引物根据目标基因甲基化特异位点进行设计，上游引物5＇端添加标签序列，序列如下：
Figure BDA0002282365570000041
Figure BDA0002282365570000051
2)一轮PCR扩增反应：
配制反应体系，每个反应包括：10μlPCR扩增混合液(Qiagen HotStarTaq2×master mix，203443)，1μl MgCl2溶液，2μl6种引物混合液，4μl去离子水，8μl经重亚硫酸盐转化后的DNA作为模板，混合后震荡均匀30s。按如下条件设置PCR仪并进行反应：预变性95℃2min，热循环95℃15s，59℃30s，72℃40s，25个循环，最后延伸72℃5min。
3)纯化：将纯化磁珠(AMPure XP，A63881)充分振荡混匀后，取25ul磁珠加入14ul步骤2)中的一轮PCR产物混合均匀，孵育5min，放置于磁力架上静置3min，弃上清，加入200ul 70％乙醇洗涤磁珠，室温静置孵育1min吸弃上清液。60℃干燥2min去除残留酒精，加入30ul去离子水混合均匀后60℃孵育5min。放置于磁力架上静置5min吸附至液体澄清，吸取上清进行下游实验。
4)二轮PCR扩增反应：
配制PCR体系，每个反应包括：11μlPCR扩增混合液(Qiagen HotStarTaq2×mastermix，203443)；3μl 6种引物混合液，1μl生物素标记的dCTP,10μl纯化后步骤3)PCR产物作为模板，混合后震荡均匀30s。按如下条件设置PCR仪并进行反应：预变性95℃5min，热循环95℃30s，55℃30s，72℃30s，最后延伸72℃5min。
5)杂交：使用96孔板(AXYGEN,PCR-96-LP-FLT-C)，每个反应孔中包括30μl 2×Tm杂交液(配制方法：0.4M NaCl，0.2M Tris，0.016％Triton X-100,PH＝8.0,4℃保存)、10μl步骤4)二轮PCR产物、3μl磁珠混合物(MagPlex-TAG Microspheres，
Figure BDA0002282365570000052
)、7μl去离子水，封膜后震荡混匀30s。按照如下条件设置PCR仪并进行反应：90℃，80s；30℃，20min。本步骤完成后判定杂交捕获完成。
6)荧光标记：配制链霉亲和素混合液包括1μl链霉亲和素原液(Moss SAPE-001G75,Life
Figure BDA0002282365570000053
S-886)、80μl 1X Tm杂交液(配制方法：0.2M NaCl，0.1MTris，0.008％Triton X-100,PH＝8.0,4℃保存)。将步骤5)杂交反应板从PCR仪取下立即置于磁力板(V&P Scientific,VP771LD-4CS)上静置60s，弃去上清。分别向每个反应孔中加入链霉亲和素混合液25ul，封膜后震荡混匀30s。按如下条件设置PCR仪并进行反应：35℃，10min。从PCR仪取下立即置于磁力板上静置60s，弃去上清。分别向每个反应孔中加入1XTm杂交液50ul，震荡混匀20-30s，置于磁力板静置60s后弃去上清，重复1次。分别向每个反应孔中加入1X Tm杂交液75ul，震荡混匀30s。本步骤完成后判定荧光标记完成。
7)上机检测：对步骤6)产物进行检测分析，使用Luminex200液相芯片检测平台检测，需严格按照Luminex200操作说明书操作，根据步骤6)96孔板上样位置编辑上样板。
8)数据分析判定：将检测数值与甲基化阴性标准品的甲基化水平读数进行比对，若某基因位点检测数值大于阴性标准品数值的三倍，则判定该基因位点发生甲基化；若某基因位点检测数值小于阴性标准品数值的三倍，则判定该基因位点未发生甲基化。
本发明不限于前面详细描述的实施方案。本发明可延伸至本申请文本(包括所附的权利要求书/摘要和附图)中所公开的特征的任何新的一个特征或任何新的组合，或者延伸至如此公开的任何方法或过程的步骤任何一个新的特征或任何新的组合。

Claims (5)

1.一种非疾病诊断目的的DNA甲基化多基因位点联合检测方法，其特征在于依次进行下述步骤：
步骤A：一轮PCR扩增反应扩增1-100个经重亚硫酸盐转化后的目标DNA基因片段；所述的步骤A中针对每个目标DNA基因的一对引物根据目标基因甲基化特异位点进行设计；
步骤B：二轮PCR扩增反应扩增步骤A得到的目标DNA片段，从而在目标序列上添加可被捕获的标签序列和生物素；所述的步骤B中二轮PCR扩增反应体系的针对每个目标DNA基因的上游引物是根据目标基因甲基化特异位点进行设计，只在上游引物的5＇端添加标签序列；所述的步骤B中二轮PCR扩增反应体系中的dCTP为生物素标记的dCTP；
所述的步骤A和步骤B引物是1-100对引物混合而成；
步骤C：使用磁珠捕获步骤B产物；所述的步骤C中磁珠是1-100种探针序列与步骤B PCR产物标签序列互补的磁珠混合物；
步骤D：使用链霉亲和素对步骤C产物进行荧光标记；
步骤E：上机检测步骤D产物荧光信号及数据分析判定；所述步骤E使用液相芯片检测平台进行检测。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的步骤A中DNA模板来源于任何生物。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的步骤B中二轮PCR扩增反应DNA模板是步骤A产物经过磁珠纯化方法或纯化柱纯化方法或SAP纯化方法纯化得到的。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤E判定标准为如果样本检测数值大于等于阴性标准品数值的三倍，则判定该基因位点发生甲基化，如果样本检测数值小于阴性标准品数值的三倍，则判定该基因位点未发生甲基化。
5.如权利要求1所述的方法的应用，其特征在于：用于1-100个基因位点联合的DNA甲基化情况的检测，包括但不限于司法鉴定、科学研究，所述应用为非疾病诊断目的。
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