CN105018476A - 一种用于分析dna样本中mlh1启动子甲基化状态的试剂盒、方法和引物 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术领域，涉及本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于分析DNA样本中MLH1启动子甲基化状态的试剂盒、方法和引物。本发明提供了一种用于分析DNA样本中与肿瘤性疾病相关的MLH1启动子甲基化状态的试剂盒，所述试剂盒包括寡核苷酸引物，所述寡核苷酸引物与在相对于转录起始位点从-248bp至-178bp的区域中的MLH1启动子的至少一部分序列互补并且与其中的甲基化位点重叠。本发明公开了准确、灵敏地检测临床样本中基因组MLH1启动子DNA差异甲基化的试验、组合物和方法。这些试验、组合物和方法可用于允许诊断和预兆方法适用特征为与甲基化基因组MLH1启动子DNA在不存在特定病症的情况下表现出的水平区别开的甲基化基因组MLH1启动子DNA的水平的病症。

Description

一种用于分析DNA样本中MLH1启动子甲基化状态的试剂盒、方法和引物

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于分析DNA样本中MLH1启动子甲基化状态的试剂盒、方法和引物。

背景技术

Lynch综合征是结肠直肠肠癌(CRC)的遗传形式，新诊断的CRC患者有2-5％与之有关。Lynch综合征是由DNA错配修复(MMR)基因(MLH1、MSH2、MSH6、PMS2)种系突变造成的，从而引起高的微卫星不稳定性并且导致MMR蛋白表达缺失。然而，仅有15％的MSI-H CRC与Lynch综合征相关联，剩余的85％在起源上大部分是偶发性的，由此错配修复缺陷是由MLH1基因的启动子超甲基化沉默造成的，并且这经常与基因BRAF突变相结合。因此，与BRAF V600E突变相结合的MLH1启动子DNA甲基化已经被认为一种可靠且标准的现有技术的分子测试，以区分Lynch综合征和具有MSI-H表型的偶发性CRC并且确定需要基因检测的Lynch综合征相关的CRC患者。作为一种遗传性结肠癌综合征，Lynch综合征的特点以及与之相关的这些基因标记详见于H.F.A.Vasen等(2007)J Med.Genet.44:353-362，M.Gala等(2011)Semin.Oncol.38:490-499，R.S.Nelson等(2009)Curr.Oncol.Rep.11:482-489，E.Lastra等(2012)Clin.Transl.Oncol.14:254-262，E.Domingo等(2004)J.Med.Genet.41:664-668以及E.Domingo等(2005)Oncogene 24:3995-3998。

Lynch综合征不过是在本发明的范围内的多种类型的癌症及非癌肿瘤性疾病。其他癌症可包括同样在本发明的范围内的子宫内膜癌和胃癌，以及任何未来发现的癌症或表现出MLH1基因启动子超甲基化的其他肿瘤性疾病。

存在几种现有技术的方法来确定MLH1 DNA甲基化状态的组织。然而，这些方法是非定量的，或者它们使用不专门检测甲基化MLH1 DNA的引物和探针，或不选择性靶向对于MLH1表达关键的启动子基因组区域的引物和探针。这些方法详见于M.Bettstetter(2007)Clin.Cancer Res.13:3221-3228，C.A.Eads等(2000)Nucl.Acids Res.28:e32，K.Rand等(2002)Methods 27:114-120,H.Thomassin(2004)Nucl.Acids Res.32:e168以及G.Deng等(1999)Cancer Res.59:2029-2023。此外，这些方法都未在大患者群中得到验证。这些限制会妨碍科学家和临床医生对测试的肿瘤的MLH1甲基化状态给出明确的解释。

用于分析MLH1甲基化的两种高引用的方法详见于M.Bettstetter等(2007)和C.A.Eads等(2000)。然而，我们已经发现没有方法对用MLH1蛋白表达和BRAF突变的已知信息明确确定在CRC肿瘤组中MLH1甲基化提供一贯明确的界限。

照惯例，结合MSI分析，MMR蛋白表达，MLH1启动子甲基化和BRAF突变已被认为是用于选择未来基因测试的Lynch综合征候选项的标准分子测试。E.Lastra等(2012)。然而，目前可用的测定MLH1 DNA甲基化的方法在不同的研究中频繁地产生不一致的结果，因此无法应用于诊断目的。MLH1甲基化的不同策略的比较详见于L.Pérez-Carbonell(2010)J.Mol.Diagn.12:498-504，该文献通过引用的方式全部并入本文中。此外，在现在临床的使用中，并没有FDA认准的对MLH1甲基化的标准测试。

另外，选择患者进行基因测试以诊断Lynch综合征在临床实践中具有挑战性。用于确定应当测试MSI的人的Amsterdam和Bethesda标准在Lynch综合征检测的敏感性和特异性方面有大量限制，详见于S.A.Wahlberg等(2002)CancerRes.62:3485-3492以及A.Umar(2004)J.Natl Cancer Inst.96:261-268。结果，忽视了大量的Lynch综合征患者并且并没有错配修复基因突变的许多患者却被送去进行基因测试，从而导致不必要地增加患者的不便以及实验室开支。因此，需要额外的更特异的测试方法。

包括结合MSI的分析、MMR蛋白表达、MLH1启动子甲基化和BRAF突变的常规测试已被当作候选未来基因检测选择Lynch综合征的标准分子测试。然而，目前可用的方法是非定量的，或者它们使用不专门检测甲基化MLH1 DNA的引物和探针，或不选择性靶向对于MLH1表达关键的启动子基因组区域的引物和探针。这些限制妨碍对测试的肿瘤的MLH1甲基化状态给出明确的解释并且得出假阳性。

因此，需要一种可复制的方法用于明确检测患者(包括但不限于患有结肠直肠癌、胃癌和子宫内膜癌的患者)的某些瘤细胞，并且定量测量MLH1启动子DNA的甲基化DNA，这种定量测量提供正-负DNA甲基化的离散测量。还需要一种连续测量DNA甲基化水平及模式方法，以分类并预测癌症的不同类型及阶段、癌症的治疗结果及患者的生存率。

发明内容

本发明公开了通过以下方式对与一般在个体中的一些癌症和肿瘤性疾病有关的差异甲基化MLH1启动子DNA序列进行识别并定量分析的方法和单管试验：从个体获得包含DNA的生物样本；检测甲基化MLH1启动子序列并且测量其水平；并且将样本中的甲基化和甲基化水平与在同一单管反应中扩增的“正常”的β-肌动蛋白基因启动子的正常化参照水平作比较，其中，样本甲基化的水平或模式与正常化参数水平相比的差异识别异常甲基化MLH1启动子序列。

本发明的第一方面提供了一种用于分析DNA样本中与肿瘤性疾病相关的MLH1启动子甲基化状态的试剂盒，试剂盒包括寡核苷酸引物，所述寡核苷酸引物与在相对于转录起始位点从-248bp至-178bp的区域中的MLH1启动子的至少一部分序列互补并且与其中的甲基化位点重叠。

优选的，所述寡核苷酸引物为正向和反向寡核苷酸引物，作为相对于所述转录起始位点从-248bp至-178bp的所述MLH1启动子区域的至少一部分的侧翼，并且其中所述正向和反向寡核苷酸引物的至少一个在其中的甲基化位点重叠。

优选的，所述正向寡核苷酸引物选自由以下组成的组：SEQ ID NO.:1，SEQID NO.:3，SEQ ID NO.:5，SEQ ID NO.:6，SEQ ID NO.:7和SEQ ID NO.:8；

所述反向寡核苷酸引物选自由以下组成的组：SEQ ID NO.:2和SEQ IDNO.:9。

优选的，所述试剂盒还包括寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针与所述MLH1启动子互补，并且在5’端用荧光报告剂标记并且在3’端用荧光淬灭剂标记。

本发明的第二方面提供了一种用于分析单管DNA样本中与肿瘤性疾病相关的MLH1启动子甲基化状态的试剂盒，所述试剂盒包括：

第一对正向和反向寡核苷酸引物，作为相对于所述转录起始位点从-248bp至-178bp的所述MLH1启动子区域的至少一部分的侧翼，并且其中所述正向和反向寡核苷酸引物的至少一个在其中的甲基化位点重叠；以及

第二对正向和反向寡核苷酸引物，所述引物为所述样本DNA的未甲基化区域的侧翼；所述样本DNA的未甲基化区域是β-肌动蛋白基因。

优选的，所述的试剂盒进一步包括：

第一寡核苷酸探针，与所述MLH1启动子序列互补，并且在5’端用第一荧光报告剂标记并且在3’端用荧光淬灭剂标记；以及

第二寡核苷酸探针，与所述样本DNA的未甲基化区域互补，并且在5’端用第二荧光报告剂标记并且在3’端用荧光淬灭剂标记，其中所述第一和第二荧光报告剂不同。

本发明的第三方面提供了一种用于分析DNA样本中与肿瘤性疾病相关的MLH1启动子甲基化状态的方法，包括以下步骤：

提供第一对正向和反向寡核苷酸引物，所述第一对正向和反向寡核苷酸引物作为相对于所述转录起始位点从-248bp至-178bp的所述MLH1启动子区域的至少一部分的侧翼，并且其中所述正向和反向寡核苷酸引物的至少一个在其中的甲基化位点重叠；并且

提供第一寡核苷酸探针，所述第一寡核苷酸探针与所述MLH1启动子序列互补，并且在5’端用第一荧光报告剂标记并且在3’端用荧光淬灭剂标记；

用亚硫酸氢钠处理所述DNA样本；

将经过亚硫酸氢钠处理的所述DNA样本与所述第一对寡核苷酸引物和所述第一寡核苷酸探针混合；

通过使用具有5’至3’核酸外切酶活性的DNA聚合酶的聚合酶链反应使经过亚硫酸氢钠处理的所述DNA样本混合物扩增；并且

测量所述扩增的DNA样本的荧光强度；

所述DNA样本提取自由组织、尿液、大便、唾液、血液和血清组成的组。

优选的，所述正向寡核苷酸引物选自由SEQ ID NO.:1、SEQ ID NO.:3、SEQID NO.:5、SEQ ID NO.:6、SEQ ID NO.:7和SEQ ID NO.:8组成的组；所述反向寡核苷酸引物选自由SEQ ID NO.:2和SEQ ID NO.:9组成的组；并且所述寡核苷酸探针具有SEQ ID NO.:4的序列。

优选的，所述方法进一步包括以下步骤：

提供第二对正向和反向寡核苷酸引物，所述引物为所述样本DNA的未甲基化区域的侧翼；所述样本DNA的未甲基化区域是β-肌动蛋白基因；

提供第二寡核苷酸探针，所述第二寡核苷酸探针与所述样本DNA的未甲基化区域互补，并且在5’端用第二荧光报告剂标记并且在3’端用荧光淬灭剂标记，其中所述第一和第二荧光报告剂不同；并且

其中经过亚硫酸氢钠处理的所述DNA样本与所述第一和第二对寡核苷酸引物以及所述第一和第二寡核苷酸探针在单管内混合。

本发明的第四方面提供了一种具有选自由SEQ ID NO.:1、SEQ ID NO.:2、SEQ ID NO.:3、SEQ ID NO.:5、SEQ ID NO.:6、SEQ ID NO.:7、SEQ ID NO.:8和SEQ ID NO.:9组成的组的序列的寡核苷酸引物。

所述序列与癌症和其他肿瘤性疾病相关，包括但不限于一些CRCs、子宫内膜癌及胃癌。在另外的实施例中，公开了确定受试者存在肿瘤性疾病的单管试验，所述试验包括：使用本发明的探针，从取自受试者的生物样本中分离编码MLH1的单链DNA，其中，生物样本选自组织、尿液、大便、唾液、血液和血清；用亚硫酸氢盐处理DNA样本；使用本发明的引物使所述DNA扩增，并且确定单链DNA的MLH1启动子区域的甲基化水平，其中，MLH1启动子甲基化的存在表示受试者存在肿瘤性疾病。在替代实施例中，所述方法和单管试验可与微型阵列平台结合，从而允许对样本处理和数据处理实现高水平的试验多重复用和可扩展的自动化。也公开了基因组探针和对应的引物，这些探针和引物因其允许检测目前与结肠直肠癌、子宫内膜癌和胃癌相关的差异甲基化基因组MLH1启动子序列而可用于本发明的方法，但这些序列将来或许与其他癌症和其他表型相关。

附图说明

图1是MLH1启动子引物和探针的位置的图示。

图2A是荧光密度与使用现有技术的MLH1启动子引物的定量甲基化特异性PCR的周期数的数据图。

图2B是荧光密度与定量甲基化特异性PCR的周期数的数据图，其中使用相对于转录起始位点从-248bp至-178bp的MLH1启动子序列区域的至少一部分的侧翼的引物。

图2C是荧光密度与定量甲基化特异性PCR的周期数的数据图，其中使用相对于转录起始位点从-248bp至-178bp的MLH1启动子序列区域的至少一部分的侧翼的引物。

图3A是BRAF突变阴性(第1组)与MSI-H、MLH1蛋白阴性和BRAF突变阳性(第2组)的CRC肿瘤甲基化百分比的数据图,这些数据通过使用现有技术引物的定量甲基化特异性PCR确定。

图3B是BRAF突变阴性(第1组)与MSI-H、MLH1蛋白阴性和BRAF突变阳性(第2组)的CRC肿瘤甲基化指数(Mdex)的数据图，这些数据通过使用相对于转录起始位点从-248bp至-178bp的MLH1启动子序列区域的至少一部分的侧翼的引物的定量甲基化特异性PCR确定。

具体实施方式

公开了准确、灵敏地检测临床样本中基因组MLH1启动子DNA差异甲基化的试验、组合物和方法。这些试验、组合物和方法可用于允许诊断和预兆方法适用特征为与甲基化基因组MLH1启动子DNA在不存在特定病症的情况下表现出的水平和/或模式区别开的甲基化基因组MLH1启动子DNA的水平和/或模式的病症。

通过使用靶向MLH1蛋白表达所必要的基因组区域的新型引物和探针允许仅对甲基化MLH1 DNA序列进行定量检测。具体地讲，公开了一种核酸引物板和探针，这种核酸引物板和探针可用于检测与存在肿瘤性疾病或易受肿瘤性疾病有关的差异甲基化基因组MLH1启动子DNA，该肿瘤性疾病包括在患有MMR基因缺陷的个人中的CRC、子宫内膜癌和胃癌。在试验中独特设计的引物和探针以及管内正常化对照给出了对MLH1 DNA甲基化准确且灵敏的测试。鉴于易发生癌症(包括但不限于结肠直肠癌、胃癌和子宫内膜癌)和可能其他的非癌肿瘤性疾病以及对大量患者测试MLH1甲基化的要求，这些方法显著改善临床护理癌症患者的效果。

尽管参照各种类型的CRC进行了详细描述，但是还预料到公开的试验、组合物和方法可以用于任何肿瘤性疾病或发生MLH1启动子甲基化的病症。这些病症可以包括但不限于，CRC、子宫内膜癌、胃癌，并且可以进一步包括其他癌症和非癌肿瘤性疾病。公开的试验、组合物和方法也可用于预测个体对特征为甲基化基因组MLH1启动子DNA序列的水平和/或模式的病症的敏感性，这种甲基化基因组MLH1启动子DNA序列的水平和/或模式区别于不存在这种病症时表现出的甲基化基因组MLH1启动子DNA序列的水平和/或模式。

因为甲基化检测靶向基因组DNA而不是RNA或蛋白质，所以在临床诊断环境下具有几个技术优势：(1)现成可用的源材料，这对预兆研究特别重要，因为典型的DNA能够比RNA更可靠地从用于研究的存档生物样本提取；(2)多路复用的能力，从而允许同时测量多个目标以提高试验的特异性；(3)容易放大试验产品以获得高灵敏度；以及(4)检测因错配修复基因的至少一个等位基因的甲基化失活而引起的肿瘤细胞中的正信号的能力。

通过在相对于转录起始位点从-248bp至-178bp的临界区或该临界区的一部分中MLH1启动子的甲基化特异性聚合酶链反应(PCR)来进行CRC(或其他疾病)的诊断和预兆试验。通过用现有技术中已知的亚硫酸氢钠进行处理来分析样本基因组DNA。亚硫酸氢盐处理将DNA的胞核嘧啶残余物尿嘧啶，但是不修饰甲基化的胞核嘧啶(5-甲基胞嘧啶)。通过使用相对于转录起始位点从-248bp至-178bp的MLH1启动子序列区域的至少一部分的侧翼的一对正向和反向引物来进行亚硫酸氢盐处理DNA样本的PCR。正向和反向引物之一或两者在该区域的至少一部分互补并且在临界区内重叠一个或多个甲基化位点。这些引物仅使抵抗亚硫酸氢盐转化的甲基化的序列退火且改性。通过使用重叠多个甲基化位点和/或甲基化位点为引物的3'端的引物来增加试验的灵敏度。在替代实施例中，本领域技术人员会理解的是，通过使用未甲基化特异性引物也可以进行反向试验。

在优选实施例中，通过定量的实时PCR来进行试验。通过本领域已知的各种方法可以检测甲基化MLH1启动子DNA的扩增。例如，对于双链DNA结可以使用荧光报告剂(reporter)染料，例如，绿(Life Technologies，GrandIsland,NY)。通过荧光亮度增大来检测并测量在PCR期间DNA产物的扩增。扩增的程度可以相对于标准DNA样本进行量化，并且也可以相对于未甲基化特异性扩增进行归一化。

在特别优选的实施例中，通过使用现有技术中已知的荧光报告剂探针来检测并量化甲基化MLH1启动子序列的扩增。试验(Life Technologies)是使用荧光报告剂探针的示例性实时PCR系统。与扩增的MLH1启动子DNA互补并杂交的寡核苷酸探针用在5'端的荧光报告剂和在3'端的荧光淬灭剂标记。通过使用具有5’至3’核酸外切酶活性的聚合酶，例如Taq聚合酶，来进行PCR。在MLH1启动子DNA的PCR期间，聚合化一直进行到达到寡核苷酸探针，此时核酸外切酶活性从寡核苷酸探针的5'端劈开荧光报告剂，从而从淬灭剂分离荧光报告剂，并且允许检测未淬灭的荧光。MLH1启动子序列的扩增导致荧光成比例地增加。本领域的技术人员会理解的是通过使用不同颜色的荧光探针扩增并检测多个序列可以将此过程进行多路复用。

在替代实施例中，试验可以提供控制未甲基化的序列的扩增。常规的定量化实时甲基化特异性PCR一般使用两管PCR，其中甲基化靶基因和未甲基化的正常化基因在两个独立的PCR反应中进行扩增。例如，由于不同PCR反应的差异扩增效率以及样本移液的变化，此实验系统有时候会在靶基因的反应与正常化控制的反应之间得到明显的扩增偏差。

为了使实验偏差最小化，此试验可以包括单管量化实时甲基化特异性PCR试验，该试验检测MLH1临界区以及同一反应试管中的正常化基因的甲基化。除测试样本DNA之外，试验包含用于MLH1靶基因和正常化基因的定量PCR扩增的所有成分(例如，引物和探针)。用于检测MLH1甲基化的探针和用于正常化基因的探针用不同的报道剂染料标记。示例性的正常化基因包括β-肌动蛋白基因(ACTB)，并且反应条件和PCR成分对本领域的技术人员来说是已知的。

此试验提供许多优点，这些优点使其成为比现有技术精确的用于MLH1DNA甲基化的分子测试。首先，在我们的试验中的引物的探针被设计成专门扩增甲基化的MLH1 DNA并且特定靶向对其表达很关键的MLH1启动子区域。试验的这些特征确保可靠地解释与基因组MLH1甲基化状态和MLH1蛋白质表达最好相关的MLH1 DNA甲基化。其次，单管反应中的MLH1甲基化和正常化ACTB基因的结合扩增缓解了因MLH1甲基化的独立扩增引起的技术偏差以及控制ACTB模板的效果。

相比之下，出于研究目的开发了用于确定CRC患者中的MLH1 DNA甲基化的现有技术的方法。这些方法是非定量的，或者它们使用不专门检测甲基化MLH1 DNA的引物和探针，或不选择性靶向对于MLH1表达关键的启动子基因组区域的引物和探针。此外，这些方法都未在大量患者群中进行验证。

以下实例用于证明本发明的优选实施例。本领域的技术人员应当理解，在随后实例中公开的技术代表本发明发现的技术以在本发明的实践中发挥良好效果，并且因此可以被认为构成本发明的实践的优选模式。然而，鉴于本发明，本领域的技术人员应当理解，对于在不脱离本发明的范围的情况下已经公开并且仍然获得相似或类似结果的特定实施例可以进行许多修改。

实例1引物和探针

公开了各种实施例，这些实施例允许识别用于改善包括CRC的肿瘤性疾病的敏感性诊断和预测、诊断和分期的可靠的MLH1甲基化标记物。为了开发用于精确检测MLH1 DNA甲基化的可靠试验，设计了具有引物和探针的新型定量实时系统用于专门扩增甲基化的MLH1 DNA。这些引物和探针特别地靶向对其表达很关键的MLH1启动子区域的区域，如同G.Deng等(1999)所指认的。按照以下详细讨论，已经发现该试验在CRC组织中提供MLH1甲基化状态的精确测定。

尽管开发了用于MLH1 DNA甲基化的几种方法，但是这些方法主要用于研究目的并且这些方法都未成功地发展成临床分子诊断用途的可接受的标准试验。综合研究已经认为MLH1启动子序列中从-248bp至-178bp的DNA序列是与CRC细胞系和肿瘤中的MLH1表达紧密相关的基因组区域。然而，源自许多此前的方法的引物和探针不专门靶向此临界区，因此通过这些方法检测的MLH1甲基化无法与CRC肿瘤中的MLH1蛋白质表达一致地一一对应相关。此外，我们的测试揭示了源自一些高引用的现有技术的方法的引物在检测甲基化的MLH1 DNA中不具有高的选择性。为了克服在此前报道的试验中的上述潜在问题，我们设计了专门靶向相对于转录起始位点从-248bp至-178bp的MLH1启动子的区域的一组引物和探针，这组引物和探针可用于专门检测甲基化的MLH1序列。

本申请公开了可靠的基因组序列用于检测基因组靶，以便在本文描述的诊断及预兆方法中使用，基因组序列已经被设计为SEQ ID NO.:1-9，其中SEQ IDNO.:1、3和5-8是正向低聚核苷酸引物，SEQ ID NO.:2和9是反向低聚核苷酸引物，并且SEQ ID NO.:4是寡核苷酸探针。这些引物和探针与相对于转录起始位点从-248bp至-178bp的MLH1启动子的区域对应，并且用于检测用作与某些肿瘤性疾病相关的标记物的差异甲基化的基因组MLH1启动子序列。以下情况中所示的核苷酸表示与共有序列中最常见的核苷酸对应的核苷酸。

图1的基因组图示出了这些引物序列(MethylTek))的位置，该基因组图还表示MLH1启动子甲基化位点(CpG)以及相对于转录起始位点从-248bp至-178bp的靶区域(对表达很关键)。还示出了在Bettstetter等(2007)(引用1)和Eads等(2000)(引用2)中公开的现有技术的引物的位置。TSS表示转录起始位点。

应当理解，基因组靶序列为特定基因组靶序列内测量的一个或多个选定的基因组MLH1启动子序列提供了环境。此外，可以测量基因组靶序列内总基因组MLH1二核苷酸序列的任何部分，包括基因组靶序列内的一个或多个，两个或多个，三个或多个，四个或多个，五个或多个，或所有基因组MLH1二核苷酸序列。

核酸探针和扩增启动子能检测MLH1启动子区域的已知基因组靶内的超甲基化区域，并且可以用于检测生物样本中基因组MLH1启动子序列的甲基化比参考水平的变化水平。

可以使用这些正向和反向引物的任何组合。示例性的组合包括：SEQ IDNO.:1+2+4，SEQ ID NO.:2+3+4，SEQ ID NO.:2+5+4，SEQ ID NO.:2+6+4，SEQID NO.:2+7+4，和SEQ ID NO.:8+9+4。具有多种引物的探针的其他有用的组合在本发明的范围内。

实例2检测MLH1甲基化的试验

用于检测MLH1 DNA甲基化的试验在新型单管系统中结合引用MLH1甲基化和ACTB正常化控制。这种设计使得因移液和不同PCR反应中的扩增效率的变化而产生的MLH1与ACTB控制之间的扩增偏差最小化。此试验包括选自SEQID NO.:1～NO.:9中阐述的引物和探针的用于MLH1甲基化的引物和6-FAM/TAMRA探针，以及用于ACTB控制的引物和探针。用于检测MLH1甲基化和ACTB控制的探针用不同的报道剂染料标记，例如，分别用6-FAM和HEX标记。然而，现在已知或此后开发的任何合适的报道剂在本发明的范围内。用于ACTB控制的示例性引物和VIC/TAMRA标记的探针可商购地得自AppliedBiosystems(ABI)和Life Technologies。

制备样本基因组DNA，并用亚硫酸氢钠进行处理，这在本领域中是已知的。然后用以下成分与亚硫酸氢盐处理的样本DNA混合：每种dNTP 200μM，每种引物0.5-1μM，每种探针0.2μM，1单位Taq DNA聚合酶(AmpliTaq--ABI,Life Technologies)和2.0-4.0mM氯化镁。使用ABI 3900和Roche 480定量实时PCR进行PCR。按照制造商PCR通常的建议使用PCR反应条件和循环参数。本领域的技术人员会理解，各种反应成分的量仅仅是实例，可以使用适量范围的每种试剂。此外，反应不限于使用Taq聚合酶，并且现在已知或此后开发的适合在PCR中使用且具有5’至3’核酸外切酶活性的任何聚合酶在本发明的范围内。此外，其他合适的PCR系统是可商购的。

实例3测试定量

测试试验以便能选择性地检测甲基化DNA。通过使用正向引物MLH1-qMSPJHF1(SEQ ID NO.:1)、反向引物MLH1-qMSPJHR1&2(SEQ IDNO.:2)和探针MLH1-qMSPJHP(SEQ ID NO.:4)，按照实例2中的描述进行试验。体外甲基化淋巴细胞DNA用作正控制。未甲基化或未经过亚硫酸氢盐处理的淋巴细胞DNA用作负控制。

发现试验比高引用的Bettstetter(2007)的现有技术的方法(图1)在检测MLH1 DNA甲基化中具有很高的特异性和敏感性。如图2A所示，Bettstetter(2007)的方法在选择性检测体外全甲基化DNA与未甲基化DNA中仅具有8倍差异(3次循环)。此外，还发现此方法未特异性扩增亚硫酸氢盐未转化的DNA。

与现有技术的方法相比，如图2B所示，本试验表明，在检测甲基化的DNA中与未甲基化的DNA相比具有多于1000倍的选择度(13次循环)，并且没有迹象表明未经过亚硫酸氢盐处理的DNA扩增。另外的系列稀释度实验表明，如图2C所示，本试验可以比完全未甲基化的DNA用接近1000倍的选择度(约10次循环差)在90％未甲基化的DNA的混合物中检测10％甲基化的DNA。

实例4生物DNA样本分析

测试试验以便能选择性地检测患者组织中的甲基化DNA，并且确定用于检测MLH1甲基化的清楚且可靠的界限。通过使用实例2中描述的试验分析41例CRC肿瘤中的MLH1甲基化，并且与Bettstetter(2007)的现有技术的方法(图1)进行比较。CRC肿瘤分成两组。第1组的BRAF突变为阴性，因此其MLH1 DNA甲基化为阴性。第2组的MSI-H、MLH1蛋白质为阴性，并且BRAF突变为阳性，因此应当经历体MLH1启动子超甲基化。

如图3A所示，通过使用Bettstetter等(2007)(图1)的现有技术的方法对CRC肿瘤分析甲基化MLH1 DNA。按照Bettstetter等(2007)所公开的计算甲基化百分比。在第2组肿瘤中检测到高水平的MLH1甲基化。然而，现有技术的方法也在具有阳性MLH1蛋白质表达的第1组的一些肿瘤中检测到较高水平的MLH1甲基化。因此，现有技术的方法表现出非特异性扩增未甲基化或部分甲基化的MLH1 DNA序列，或检测在与MLH1表达无关的启动子区域中的甲基化序列。

与现有技术对比，如图3B所示，使用本试验分析CRC肿瘤提供清楚且精确解释的MLH1 DNA甲基化。为了在原发性CTC肿瘤中证明此试验的功效，用此试验通过盲试的方式对41例CRC肿瘤的MLH1 DNA甲基化进行评估。对MSI、MMR蛋白质表达和BRAF V600E突变进行综合分析。通过免疫组织化学分析MMR蛋白质表达，通过碎片分析来分析MSI，通过测序来分析BRAF突变，并且通过本发明的试验对500例CRC组织样本分析MLH1 DNA甲基化。

根据以下公式计算甲基化指数(Mdex)：

Mdex＝2-(MLH1的CT-ACTB的CT)×10

其中CT是PCR循环的次数。根据MLH1蛋白质表达、MSI和BRAF突变的状态来确定MLH1启动子甲基化的最佳界限，并且通过亚硫酸氢盐DNA测序进一步确认。通过合适的统计分析评价该试验的性能(灵敏度和特异性)。

令人吃惊的是，具有阳性MLH1甲基化(Mdex>3)的全部8例肿瘤的MSI-H、MLH1未阴性，并且BRAF突变未阳性(图3B，第2组)，而剩余的33例肿瘤(图3B，第1组)的MLH1甲基化未阴性(Mdex<1)，并且它们都不存在BRAF突变。两组之间MLH1甲基化流行极为显著(p值未<0.0001，Fisher的精确测试，两侧)。没有情况落入1至3值之间的模糊的Mdex范围(图3B)。

这些实例证明，本试验在癌症患者，尤其是CRC患者中作为MLH1 DNA超甲基化的临床诊断试验是有效的。41例CRC肿瘤分析生成1-3的Mdex界限区，而非在现有技术Bettstetter(2007)解释甲基化的单一临界值。MLH1表达和BRAF突变阴性的肿瘤Mdex值必然接近3以上，然而MLH1表达阳性的所有肿瘤或LS患者的Mdex值在1以下。肿瘤在灰色区域1-3内没有模糊的Mdex值。

本发明的试验被推定为对证明有MLH1超甲基化的其他肿瘤组织有效，尽管Mdex值可以有些不同。使用此试验诊断其他类型的肿瘤性疾病(例如但不限于胃癌和子宫内膜癌)被认为是本发明的范围内。

尽管已经参照优选实施例详细描述了本发明，但是在以下权利要求书中描述并限定的本发明的范围和精神内存在多种变化和修改。

Claims (10)

1.一种用于分析DNA样本中与肿瘤性疾病相关的MLH1启动子甲基化状态的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括寡核苷酸引物，所述寡核苷酸引物与在相对于转录起始位点从-248bp至-178bp的区域中的MLH1启动子的至少一部分序列互补并且与其中的甲基化位点重叠。

2.一种用于分析DNA样本中与肿瘤性疾病相关的MLH1启动子甲基化状态的试剂盒，其特征在于，寡核苷酸引物为正向和反向寡核苷酸引物，作为相对于所述转录起始位点从-248bp至-178bp的所述MLH1启动子区域的至少一部分的侧翼，并且其中所述正向和反向寡核苷酸引物的至少一个在其中的甲基化位点重叠。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述正向寡核苷酸引物选自由以下组成的组：SEQ ID NO.:1，SEQ ID NO.:3，SEQ IDNO.:5，SEQ ID NO.:6，SEQ ID NO.:7和SEQ ID NO.:8；

所述反向寡核苷酸引物选自由以下组成的组：SEQ ID NO.:2和SEQ ID NO.:9。

4.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，还包括寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针与所述MLH1启动子互补，并且在5’端用荧光报告剂标记并且在3’端用荧光淬灭剂标记。

5.一种用于分析单管DNA样本中与肿瘤性疾病相关的MLH1启动子甲基化状态的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：

第一对正向和反向寡核苷酸引物，作为相对于所述转录起始位点从-248bp至-178bp的所述MLH1启动子区域的至少一部分的侧翼，并且其中所述正向和反向寡核苷酸引物的至少一个在其中的甲基化位点重叠；以及

第二对正向和反向寡核苷酸引物，所述引物为所述样本DNA的未甲基化区域的侧翼；所述样本DNA的未甲基化区域是β-肌动蛋白基因。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，还包括：

第一寡核苷酸探针，与所述MLH1启动子序列互补，并且在5’端用第一荧光报告剂标记并且在3’端用荧光淬灭剂标记；以及

第二寡核苷酸探针，与所述样本DNA的未甲基化区域互补，并且在5’端用第二荧光报告剂标记并且在3’端用荧光淬灭剂标记，其中所述第一和第二荧光报告剂不同。

7.一种用于分析DNA样本中与肿瘤性疾病相关的MLH1启动子甲基化状态的方法，其特征在于，包括以下步骤：

提供第一对正向和反向寡核苷酸引物，所述第一对正向和反向寡核苷酸引物作为相对于所述转录起始位点从-248bp至-178bp的所述MLH1启动子区域的至少一部分的侧翼，并且其中所述正向和反向寡核苷酸引物的至少一个在其中的甲基化位点重叠；并且

提供第一寡核苷酸探针，所述第一寡核苷酸探针与所述MLH1启动子序列互补，并且在5’端用第一荧光报告剂标记并且在3’端用荧光淬灭剂标记；

用亚硫酸氢钠处理所述DNA样本；

将经过亚硫酸氢钠处理的所述DNA样本与所述第一对寡核苷酸引物和所述第一寡核苷酸探针混合；

通过使用具有5’至3’核酸外切酶活性的DNA聚合酶的聚合酶链反应使经过亚硫酸氢钠处理的所述DNA样本混合物扩增；并且

测量所述扩增的DNA样本的荧光强度；

所述DNA样本提取自由组织、尿液、大便、唾液、血液和血清组成的组。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述正向寡核苷酸引物选自由SEQ ID NO.:1、SEQ ID NO.:3、SEQ ID NO.:5、SEQ IDNO.:6、SEQ ID NO.:7和SEQ ID NO.:8组成的组；所述反向寡核苷酸引物选自由SEQ ID NO.:2和SEQ ID NO.:9组成的组；并且所述寡核苷酸探针具有SEQ ID NO.:4的序列。

9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，还包括以下步骤：

提供第二对正向和反向寡核苷酸引物，所述引物为所述样本DNA的未甲基化区域的侧翼；所述样本DNA的未甲基化区域是β-肌动蛋白基因；

提供第二寡核苷酸探针，所述第二寡核苷酸探针与所述样本DNA的未甲基化区域互补，并且在5’端用第二荧光报告剂标记并且在3’端用荧光淬灭剂标记，其中所述第一和第二荧光报告剂不同；并且

其中经过亚硫酸氢钠处理的所述DNA样本与所述第一和第二对寡核苷酸引物以及所述第一和第二寡核苷酸探针在单管内混合。

10.一种具有选自由SEQ ID NO.:1、SEQ ID NO.:2、SEQ IDNO.:3、SEQ ID NO.:5、SEQ ID NO.:6、SEQ ID NO.:7、SEQ ID NO.:8和SEQ ID NO.:9组成的组的序列的寡核苷酸引物。