CN115820835A - 用于检测心肌病致病基因的试剂及其应用 - Google Patents

用于检测心肌病致病基因的试剂及其应用 Download PDF

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刘哲
梁庆渊
赵娜娜
赖开生
刘昕超
高璇
李方玉
曲晓欢
黄靖雯
侯青
惠汝太
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Abstract

发明涉及基因检测技术领域，具体涉及了用于检测心肌病致病基因的试剂，所述试剂包括引物SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:8；与野生型CTNNA3基因的参考序列相比，所述致病基因CTNNA3第2437位的碱基A突变为C，编码核苷酸序列为SEQ ID NO:1；与野生型DSP基因的参考序列相比，所述致病基因DSP第2126位的碱基T突变为C，编码核苷酸序列为SEQ ID NO:3。本发明还涉及上述试剂在制备检测试剂盒中的应用。本发明提供的致病基因CTNNA3和DSP可以作为临床辅助诊断的生物标志物，基于该致病基因CTNNA3和DSP开发的试剂及其检测试剂盒可以将携带CTNNA3 c.2437A>C和DSP c.2126T>C基因突变的患者和正常人群区分开，对致心律失常性右心室心肌病的早期诊断、辅助临床诊断、治疗和预后均具有重要意义。

Description

用于检测心肌病致病基因的试剂及其应用
技术领域
本发明涉及基因检测技术领域，尤其涉及用于检测心肌病致病基因的试剂及其应用。
背景技术
心肌病包括肥厚型心肌病、扩张型心肌病、致心律失常性右心室心肌病和代谢性心肌病，其中，致心律失常性右心室心肌病是以右心室为主的心肌细胞凋亡或坏死，并被脂肪和纤维结缔组织替代为病理特征的遗传相关性心肌病，也可同时或单独累及左心室。临床可发生心力衰竭、恶性心律失常和心脏性猝死(sudden cardiac death,SCD)等恶性事件。
目前已知致心律失常性右心室心肌病相关基因包含桥粒蛋白基因5个(JUP、DSP、PKP2、DSG2、DSC2)以及非桥粒蛋白基因10个(TMEM43、LMNA、DES、CTNNA3、PLN、TGFβ3、TTN、SCN5A、CDH2、FLNC)。CTNNA3基因编码的蛋白属于粘着斑蛋白/α-连环蛋白家族，在肌肉细胞的细胞粘附中起着重要作用。DSP基因编码中间丝与染色体斑结合蛋白，结合产物形成功能性桥粒的专性组分。桥粒是心肌和皮肤表皮中丰富的基于钙粘蛋白的特殊细胞–细胞粘附结构。在体外和动物模型中，突变的桥粒引起肌细胞凋亡、纤维化和脂肪生成，从而导致右心室功能受损和致心律失常性增加的机制已得到证实。此外，与细胞粘附复合物无关的非桥粒蛋白基因被认为是致心律失常性右心室心肌病的常染色体显性遗传形式的原因。
基因检测可以从基因层面上明确诊断，可以对基因阳性患者的家系进行筛查，识别暂无临床症状的人群，有效预防猝死的发生。目前已发现许多与致心律失常性右心室心肌病有关的CTNNA3和DSP突变位点，进一步发现新的CTNNA3和DSP基因突变将有助于进一步研究致心律失常性右心室心肌病，对致心律失常性右心室心肌病的早期诊断，或者辅助临床诊断具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于针对上述缺陷，提供用于检测心肌病致病基因的试剂及其应用。
本发明目的之一在于提供：用于检测心肌病致病基因的试剂，所述心肌病为致心律失常性右心室心肌病；所述致病基因为CTNNA3和DSP，所述试剂包括引物SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:8；与野生型CTNNA3基因的参考序列相比，所述致病基因CTNNA3第2437位的碱基A突变为C，编码核苷酸序列为SEQ ID NO:1，编码蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:2；与野生型DSP基因的参考序列相比，所述致病基因DSP第2126位的碱基T突变为C，编码核苷酸序列为SEQ ID NO:3，编码蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:4。具体突变信息如下：
Figure BDA0003906687780000021
本发明还提供了用于检测心肌病致病基因的试剂在制备检测试剂盒中的应用，所述检测试剂盒包括PCR预混液、阴性对照试剂和阳性对照试剂。
本发明的原理和有益效果在于：本发明提供的致病基因CTNNA3和DSP可以作为临床辅助诊断的生物标志物，基于该致病基因CTNNA3和DSP开发检测试剂盒可以将携带CTNNA3 c.2437A>C和DSP c.2126T>C基因突变的患者和正常人群区分开，对致心律失常性右心室心肌病的早期诊断、辅助临床诊断、治疗和预后均具有重要意义。为生育需求的患者提供为受试者提供优生优育指导和遗传咨询，能够有效减少患儿的出生。
附图说明
图1为实施例1中致心律失常性右心室心肌病患者的Sanger测序图；
图2为实施例2中先证者的家系图；
图3为实施例3中致心律失常性右心室心肌病患者的Sanger测序图；
图4为实施例4中先证者的家系图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式进一步详细说明：
试剂来源：PCR预混液：2×Taq MasterMix(Dye)，购自江苏康为世纪生物科技有限公司，货号：l01037/70335；包含如下成分：Taq DNA Polymerase、PCR Buffer、Mg2+、dNTPs、PCR稳定剂和增强剂等常规PCR所需要的组分。Agencourt AMPure XP磁珠：购自贝克曼库尔特商贸(中国)有限公司，货号：311303。扩增用引物均委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成。RNase-Free H2O：购自北京索莱宝科技有限公司。磁珠法全血基因组DNA提取体外诊断检测试剂盒：购自江苏百世诺医疗科技有限公司，批号：20031886-01C。
实施例1：CTNNA3 c.2437A>C验证实验
在临床诊断为致心律失常性右心室心肌病患者及其家属自愿签署知情同意书的前提下，寄送5-10mL人类全血EDTA抗凝样本，建立病历资料库，详细记录病情、家系情况等资料。本研究已得到本单位伦理委员会批准。
S1、提取基因组DNA：对患者的人类全血EDTA抗凝样本进行全基因组DNA的提取，采用江苏百世诺医疗科技有限公司磁珠法全血基因组DNA提取体外诊断检测试剂盒，操作步骤按照产品说明书进行。对DNA的浓度和纯度进行检测，作为PCR扩增的模板DNA。
S2、准备PCR反应体系用于扩增包含目的基因位点在内的一段DNA序列，其组成为：PCR预混液25μL、正向引物(10μM)2μL、反向引物(10μM)2μL、模板DNA＜1000ng，加RNase-Free H2O补至50μL。所用的正、反向引物信息如下：
正向引物(CTNNA3-E18P2F，SEQ ID NO:5)：5'CCACAAAGCACAGAAGAGACACT 3'；反向引物(CTNNA3-E18P2R，SEQ ID NO:6)：5'AGCCTTCATTCTCCACATCACA 3'。长度642bp。
S3、扩增目的片段：将反应体系混合，在PCR仪上进行目的基因片段的扩增反应，扩增程序为：95℃预变性2min；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，共35循环。72℃终延伸2min。
S4、PCR产物的检测：取2μL的PCR产物，使用1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，选用1000bp Marker作为参考，检测验证扩增产物为预期的大小。
S5、PCR产物纯化：PCR产物检测后，使用Agencourt AMPure XP磁珠对PCR产物进行纯化，纯化步骤按照产品说明书进行，具体步骤如下：(1)涡旋振荡磁珠30s，使其彻底混匀为均一溶液。(2)向1.5mL的离心管中加入待纯化的PCR产物，然后加入2倍样品体积的磁珠溶液。涡旋振荡混匀后，室温下在1400rpm的Thermomixer上振荡5min。(3)将上一步的离心管放于磁力架上约1min，直至磁珠完全吸附。(4)保持离心管固定于磁力架上，弃去溶液，期间避免接触磁珠。(5)向上一步的离心管中加入500μL Buffer PW后，将离心管从磁力架上取下，涡旋振荡10s后将离心管重新放回磁力架，静置1min，待磁珠完全吸附于离心管侧壁后彻底弃去漂洗液。(6)重复步骤(5)。(7)保持离心管固定于磁力架上静置10min，使乙醇完全挥发干净。(8)将离心管从磁力架上取下，加入20-100μL Buffer EB，涡旋振荡将磁珠重悬于洗脱液中后将离心管放于65℃、1400rpm的Thermomixer上振荡洗脱5min。(9)将离心管放于磁力架上约1min，直至磁珠完全吸附。(10)将洗脱液转移至一个新的1.5mL离心管中，此时，可弃去磁珠。
S6、Sanger测序：使用Applied Biosystems 3500Dx系列基因分析仪对扩增产物进行Sanger测序。
S7、测序结果进行生物信息学分析：将测序结果和在NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中获取的野生型CTNNA3基因序列(SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10)在软件Chromas中进行序列比对，确定检测位点是否发生变异。
S8、基因变异论证：患者携带CTNNA3 c.2437A>C杂合错义变异，即与野生型CTNNA3基因的参考序列SEQ ID NO:9相比，致病基因CTNNA3第2437位的碱基A突变为C，与野生型CTNNA3基因编码蛋白的氨基酸序列SEQ ID NO:10，致病基因CTNNA3编码核苷酸序列为SEQID NO:1，编码蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:2。测序结果如图1所示。
查询千人基因组(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/variation/tools/1000genomes/)：无。ClinVar(https://www.snpedia.com/index.php/ClinVar)：无。ESP6500(https://esp.gs.washington.edu/drupal/)：无。ExAC(http://exac.hms.harvard.edu/)：无。HGMD(http://www.hgmd.c.ac.uk/ac/index.php)：无。
采用多个生物信息预测软件(包括SIFT和Polyphen-2等)交叉预测，结果多为有害(SIFT为“D”，Polyphen-2为“D”，MutationTaster_pred为“D”，VEST3评分为“0.594”，其他为“4个D/1个M/1个T”)，氨基酸由极性不带电荷的天冬酰胺变为极性带正电荷的组氨酸，提示该变异所致的氨基酸改变可能会对蛋白功能产生影响。根据现有证据：该变异为罕见变异、软件预测该变异可能会对蛋白功能产生影响、该位置氨基酸在脊椎动物中高度保守，该变异为致心律失常性右心室心肌病的高度可疑致病突变。
实施例2：CTNNA3 c.2437A>C样本验证实验
招募1000名未患有致心律失常性右心室心肌病的健康人群和5000名致心律失常性右心室心肌病患者，使用实施例1中的方法检测该患者家系的每个成员以及对照人群的是否携带CTNNA3c.2437A>C变异。
基于样本信息保密，现公开部分样本信息。样本可公开信息：(1)致心律失常性右心室心肌病家系；国别/地区：中国/重庆；家系成员男女比例：1﹕1；家系成员年龄分布：20-55岁；(2)对照人群国别/地区：中国/重庆；对照人群男女比例：1﹕1；对照人群年龄分布：20-55岁。
仅在致心律失常性右心室心肌病的家系(家系图如图2所示)的患病成员中检测到CTNNA3c.2437A>C杂合错义变异；未患有致心律失常性右心室心肌病的健康人群未见该位点的突变。
实施例3：DSP c.2126T>C验证实验
在临床诊断为致心律失常性右心室心肌病患者及其家属自愿签署知情同意书的前提下，寄送5-10mL人类全血EDTA抗凝样本，建立病历资料库，详细记录先证者病情、家系情况等资料。本研究已得到本单位伦理委员会批准。
正向引物(DSP-E24-P-F5，SEQ ID NO:3)：5'ATATAGCCAGTGTTCTTCGTG 3'；反向引物(DSP-E24-P-R5，SEQ ID NO:4)：5'TTAGCACTTCAGACGCACT 3'。长度614bp。
S3、扩增目的片段：将反应体系混合，在PCR仪上进行目的基因片段的扩增反应，扩增程序为：95℃预变性2min；98℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，共35循环。72℃终延伸2min。
测序结果进行生物信息学分析：将测序结果和在NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中获取的野生型DSP基因序列(SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12)在软件Chromas中进行序列比对，确定检测位点是否发生变异。
患者携带DSP c.2126T>C杂合错义变异，即与野生型DSP基因的参考序列SEQ IDNO:11相比，致病基因DSP第2126位的碱基T突变为C，与野生型DSP基因编码蛋白的氨基酸序列SEQ ID NO:12相比，编码核苷酸序列为SEQ ID NO:3，编码蛋白的氨基酸序列为SEQ IDNO:4。测序结果如图3所示。
查询千人基因组(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/variation/tools/1000genomes/)：无。ClinVar(https://www.snpedia.com/index.php/ClinVar)：无。ESP6500(https://esp.gs.washington.edu/drupal/)：无。ExAC(http://exac.hms.harvard.edu/)：无。HGMD(http://www.hgmd.c.ac.uk/ac/index.php)：无。
文献检索未发现该变异与疾病相关的报导。多个生物信息预测软件(包括SIFT和Polyphen-2等)交叉预测，结果多为有害(SIFT为“D”，Polyphen-2为“P”，MutationTaster_pred为“D”，VEST3评分为“0.935”，其他为“3个T/2个D/1个L”)，氨基酸由非极性的亮氨酸变为非极性的脯氨酸，提示该变异所致的氨基酸改变可能会对蛋白功能产生影响。查询数据库发现该位置的氨基酸在脊椎动物中保守性好。根据现有证据：该变异为罕见变异、软件预测该变异可能会对蛋白功能产生影响、该位置氨基酸在脊椎动物中保守性好，该变异为致心律失常性右心室心肌病的高度可疑致病突变。
实施例4：DSP c.2126T>C样本验证实验
招募500名未患有致心律失常性右心室心肌病的健康人群和3000名致心律失常性右心室心肌病患者，使用实施例1中的方法检测该患者家系的每个成员以及对照人群的是否携带DSP c.2126T>C变异。
基于样本信息保密，现公开部分样本信息。样本可公开信息：(1)致心律失常性右心室心肌病家系；国别/地区：中国/南京；家系成员男女比例：1﹕1；家系成员年龄分布：20-55岁；(2)对照人群国别/地区：中国/南京；对照人群男女比例：1﹕1；对照人群年龄分布：20-55岁。
仅在致心律失常性右心室心肌病的家系(家系图如图4所示)的患病成员中检测到DSP c.2126T>C杂合错义变异；未患有致心律失常性右心室心肌病的健康人群未见该位点的突变。
实施例5：检测试剂盒
1.组成：
表2.组成
Figure BDA0003906687780000051
Figure BDA0003906687780000061
2.使用方法：(1)基因组DNA提取：使用DNA提取体外诊断检测试剂盒提取外周血液样本基因组DNA。(2)PCR扩增：采用上述的体外诊断检测试剂盒进行PCR扩增，反应体系和反应条件参照实施例1。(3)对PCR扩增产物进行纯化。(4)对纯化的PCR扩增产物进行Sanger测序。(5)分析测序结果，比对是否有CTNNA3 c.2437A>C或DSP c.2126T>C杂合错义变异。
以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术人员无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。

Claims (3)

1. 用于检测心肌病致病基因的试剂，其特征在于，所述致病基因为CTNNA3和DSP，所述试剂包括引物SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:8；与野生型CTNNA3基因的参考序列相比，所述致病基因CTNNA3第2437位的碱基A突变为C，编码核苷酸序列为SEQ ID NO:1；与野生型DSP基因的参考序列相比，所述致病基因DSP第2126位的碱基T突变为C，编码核苷酸序列为SEQ IDNO:3。
2. 根据权利要求1所述的用于检测心肌病致病基因的试剂，其特征在于，所述致病基因CTNNA3编码蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:2；所述致病基因DSP编码蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:4。
3.根据权利要求1或2所述的用于检测心肌病致病基因的试剂在制备检测试剂盒中的应用，其特征在于，所述检测试剂盒包括PCR预混液、阴性对照试剂和阳性对照试剂。
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