CN103361438A - 一种模板扩增和信号放大结合检测核酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种模板扩增和信号放大结合检测核酸的方法。先待测核酸分子通过模板的线性扩增得到核酸信号的第一次放大；再将扩增得到的RNA产物与放大桥分子、捕获桥分子一起加入到固相上进行杂交，将RNA产物捕获到固相上，而放大桥分子的一端与RNA产物杂交识别，另一端与下一步加入的放大分子结合，放大分子上连接的多个生物素分子再与标记物如辣根过氧化物酶结合，最终实现核酸信号的双重放大过程。本发明的检测核酸方法具有极高的灵敏度。
Description
技术领域
本发明涉及一种模板扩增和信号放大结合检测核酸的方法，属于生物检测领域。
背景技术
核酸检测是直接检测病原体核酸的一系列技术的总称，可通过血液、其他体液或细胞对靶核酸进行检测。比起常规的血清学检测，核酸检测技术的灵敏度较高，是对免疫学检测方法的重要补充，在缩短检测窗口期、提高病原体检出率方面具有相当的优势。
目前核酸检测已是各类病原体检测的重要手段，其中PCR方法应用的最为普遍，然而使用基于PCR的分子检测方法常常遇到一些问题，例如:(1)需要分别扩增单个病原体，对于多种病原体检测效率不高，而出现传染病疫情时，需要对大量样本病原体集中快速检测；(2)前次扩增产物污染会导致假阳性；(3)实时PCR技术需要昂贵的荧光探针和昂贵的检测仪器，检测成本高。
因此需要发展替代性的非PCR方法，以达到对病原体核酸高通量的、准确的、成本低廉的检测，提高传染病检测的能力和水平。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种线性扩增与信号放大相结合的检测核酸的方法，以降低检测成本，提高检测灵敏度，获得更可靠的数据。
本发明设计一种将核酸模板的线性扩增和通过多生物素分子对信号放大相结合的双重放大方法，其中包括：核酸分离，从样本中分离核酸；线性扩增，通过针对特异启动子的RNA聚合酶进行RNA扩增，得到RNA产物；信号放大，应用多生物素分子对扩增得到的RNA产物进行信号放大，实现双重放大效果。
本发明方法具体包括以下步骤：
1）用商品化的试剂盒从样本中抽提出待测核酸或者直接裂解样本释放出待测核酸；
2）核酸的线性扩增
将待测核酸转化为带有启动子的双链DNA，再通过针对启动子的RNA聚合酶进行RNA扩增，得到RNA产物；
3）应用多生物素分子对核酸信号放大
a)涉及的功能分子的设计和合成
捕获分子为寡核苷酸，包被于固相上；捕获桥分子为DNA，一端能与捕获分子部分杂交，另一端能与线性扩增的RNA产物部分杂交；放大分子包括载体分子和标记分子，所述载体分子为DNA或RNA，所述标记分子为生物素标记的多核苷酸，一个载体分子通过多核苷酸与多个生物素分子相连；放大桥分子为DNA，一端能与线性扩增的RNA产物部分杂交，另一端能与载体分子部分杂交；
b)将RNA产物与放大桥分子、捕获桥分子一起加入到固相上进行杂交，42-50℃孵育1-16小时，RNA产物通过捕获桥分子与预包被在固相上的捕获分子的特异识别而捕获到固相上；
c)洗去未结合于固相上的RNA产物和放大桥分子、捕获桥分子，将放大分子加入到固相上，42-50℃孵育0.5-1小时；
d)将标记物标记的链霉亲和素或亲和素加入到固相上，室温孵育；
e)通过链霉亲和素或亲和素上的标记物的特征反应，实现核酸信号的放大和检测。
上述步骤2）核酸的线性扩增中，对于待测核酸是DNA的情况，在带有特定启动子的一对引物和DNA聚合酶的作用下，合成一带有特定启动子的双链DNA。
对于待测核酸是RNA的情况，在带有特定启动子的一条引物和反转录酶的作用下，将待测RNA转化为cDNA，再用RNaseH消化cDNA中的RNA，得到单链cDNA，在第二条引物和反转录酶的DNA聚合酶功能的作用下合成第二链，形成带有特定启动子的双链DNA。
上述双链DNA合成过程中，包括两条引物，一条引物的3’端序列与待测核酸3’端或者靠近3’端的序列互补，5’端为启动子序列，启动子序列可以为T7、T3或SP6；另一条引物的序列与待测核酸的负链3’端序列互补。当待测核酸为DNA时，待测核酸的负链已存在与样本中；当待测核酸为RNA时，待测核酸的负链即为第一条引物和反转录酶作用下得到的cDNA链。该过程所述的反转录酶可以为AMV反转录酶或者MMLV反转录酶。
本发明所述的线性扩增过程中，所用的RNA聚合酶可以为T7、T3或SP6聚合酶。应根据启动子序列选择相对应的RNA聚合酶。合成的带有特定启动子的双链DNA，在对应RNA聚合酶的作用下，实现线性扩增，得到大量RNA产物。
以启动子序列为T7启动子、RNA聚合酶为T7RNA聚合酶为例。
当待测核酸为DNA时，待测核酸通过92℃加热变性，在一条引物和DNA酶的作用下，合成双链DNA；带有T7启动子的双链DNA在T7聚合酶的作用下转录生成大量的RNA产物。
当待测核酸为RNA时，按照NASBA所描述的方法，加入逆转录酶、RNaseH、T7RNA聚合酶和引物，在42℃下进行RNA分子的线性扩增，得到RNA产物。
本发明方法的应用多生物素分子对核酸信号放大过程，通过将线性扩增的RNA产物与放大桥分子、捕获桥分子一起加入到固相上进行杂交，通过捕获桥分子分别与RNA产物和包被于固相上的捕获分子的部分杂交，将RNA产物捕获到固相上，而放大桥分子的一端与RNA产物杂交识别，另一端与下一步加入的放大分子结合，放大分子上连接的多个生物素分子再与标记物如辣根过氧化物酶结合，最终实现核酸信号的放大过程。
所述的载体分子通过多核苷酸与2-100个生物素分子相连，载体可以通过化学合成或生物合成。
所述的多核苷酸可由15-50个一种或多种核苷酸组成。
所述的放大桥分子可以为多个不同DNA，使得在靶分子的不同区域连接多个放大桥分子，从而获得更大的放大效果。
根据链霉亲和素或亲和素上不同的标记物，使用不同的方法进行检测。以所述的标记物为辣根过氧化物酶为例，通过化学发光底物对辣根过氧化物酶进行显色反应。根据待检测样本的相对光单位测定值来对样本进行定性分析。
本发明中核酸信号双重放大的原理是：待测核酸分子通过模板的线性扩增得到核酸信号的第一次放大；再将扩增得到的RNA产物与放大桥分子、捕获桥分子一起加入到固相上进行杂交，将RNA产物捕获到固相上，而放大桥分子的一端与RNA产物杂交识别，另一端与下一步加入的放大分子结合，放大分子上连接的多个生物素分子再与标记物如辣根过氧化物酶结合，最终实现核酸信号的双重放大过程。
本发明的有益效果在于本发明是通过模板的扩增和信号放大而不是基于PCR的模板扩增技术来实现对核酸的检测，从而避免PCR固有的污染问题。
本发明的有益效果还在于将生物素与多核苷酸相连，而不是碱性磷酸酶。由于生物素体积小，生物素与多核苷酸连接形成的标记分子可以有效地杂交到载体分子上形成多生物素标记的放大分子，这使得检测更加灵敏。并且，用于生物素检测的亲和素或链霉亲和素可标记具有二次扩增能力的酶（辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶），进行信号的二次放大，使得本发明的检测核酸方法具有极高的灵敏度。
此外，本发明的技术可以直接利用裂解的样本，不需要提取或反转录，可完全并简单地进行自动化操作。这对于高通量筛选是必需的，并且对于诊断测定或常规实验室测定也是有利的。
附图说明
图1，本发明方法原理示意图，其中1：待测核酸分子，2：捕获桥分子，3：放大桥分子，4：载体分子，5：标记分子，6：标记物标记的链霉亲和素或亲和素，7：捕获分子，8：固相。
图2，实施例1待测核酸PCR后电泳结果。将裂解的样本经随机引物和AMV逆转录形成CDNA，然后用RSV特异性引物进行PCR，程序为95℃，5min；95℃，30s，55℃，30s,72s℃，30s，循环30次；72℃，10min。电泳结果：从左到右依次为，Marker，扩增空白，1号，2号，3号，4号，5号，6号。
具体实施方式
实施例1.人呼吸道合胞病毒RSV的检测
1.捕获分子、捕获桥分子、放大桥分子、标记分子和载体分子的设计和合成：
捕获分子：GTTGGGCTACGACTTAGAGGCC（SEQ ID No1）
标记分子1：Biotin-ACCCGATGGATAGGTCGGTGAA（SEQ ID No2）
标记分子2：Biotin-TAAGCATCGTGCCCTTTCGCAG（SEQ ID No3）
标记分子3：biotin-ACCACGTTCGCGTTCTCACATG（SEQ ID No4）
载体分子：
AGAAGGCGTCCGTCTTTGAGGCTTCACCGACCTATCCATCGGGTCTGCGAAAGGGCACGATGCTTACATGTGAGAACGCGAACGTGGT（SEQ ID No5）
根据genebank中RSV的F基因序列，设计引物、捕获桥分子和放大桥分子的序列，序列如下：
引物1：GTGGTAATTGTACTACATATGCTAAG（SEQ ID No6）
引物2：TAATACGACTCACTATAGGGAGAATGCAGGTGTAACTACACCTGTAAG（SEQID No7）
捕获桥分子：ATCATTGATTAATGATTTTTGGCCTCTAAGTCGTAGCCCAAC（SEQ ID No8）
放大桥分子1：TTAACATATAAGTGCTTTTTGCCTCAAAGACGGACGCCTTCT（SEQ IDNo9）
放大桥分子2：TACAGGTGTAGTTACATTTTGCCTCAAAGACGGACGCCTTCT（SEQ IDNo10）
2.预包被：将捕获分子包被到微孔板上，加入固定液，固定2小时后室温风干。
3.样本收集及前处理：
1）收集病人鼻咽拭子样本：让病人头部扬起约45度并尽量保持不动，将拭子贴鼻孔壁轻轻插入病人鼻腔，至鼻腭处，然后边擦拭边旋转2-3周以收集脱落细胞，之后慢慢取出拭子，置采样管（15ml离心管）折断手接触部位的塑料柄，使拭子浸泡于采样液（2-3ml）中，旋紧管盖。
2）样本处理：采样管2500rpm离心10分钟，弃去1-2ml上清液；管内保留1ml左右的上清液与细胞沉淀重悬后，全部转入干净的1.5ml离心管内，3000rpm再次离心5min；弃去全部上清液后收集细胞沉淀。
3）样本裂解：用细胞裂解液裂解收集到的细胞沉淀，释放核酸分子。
4.RNA扩增：向PCR管中加入下述试剂，置于PCR仪或恒温水浴锅中95℃孵育2分钟。
待温度降到42℃，加入1ul扩增酶；42℃温育90分钟。
5.RNA扩增产物和放大桥分子、捕获桥分子温育：
将RNA扩增产物与放大桥分子、捕获桥分子共同稀释到100uL预热的杂交液中，加入到微孔板中。用铝箔膜封住反应孔，42-50℃温育2个小时。
6.与放大分子温育：
去除封膜，弃去孔内液体并在干净的吸水纸上拍干。每孔加入200μL预热的杂交洗液，静止片刻后弃去液体并在干净的吸水纸上拍干，重复洗涤2次，共3次洗涤。按1:500的比例，用杂交液稀释放大分子，每孔加入稀释后的100μL放大分子，封膜。42-50℃温育1小时。
7.与链霉亲和素-辣根酶温育：
去除封膜，弃去孔内液体并在干净的吸水纸上拍干。每孔加入200μL预热的杂交洗液，静止片刻后弃去液体并在干净的吸水纸上拍干，重复洗涤2次，共3次洗涤。每孔加入200μL封闭液，室温振荡15分钟。弃去孔内液体，每孔加入100μL链霉亲和素-HRP酶联物，室温震荡30分钟。
8.显色
弃去孔内液体并在干净的吸水纸上拍干。每孔加入200μL预热的检测洗涤液，室温振荡5分钟后，弃去液体并在干净的吸水纸上拍干，重复洗涤2次，共3次洗涤。配制底物溶液，每孔加入95μL底物溶液，孵育1分钟后，置于化学发光检测仪上进行测定。
9.结果
| 样本编号 | RLUS |
| 1号 | 168045 |
| 2号 | 520562 |
| 3号 | 1617336 |
| 4号 | 3430 |
| 5号 | 1809836 |
| 6号 | 34 |
| 空白对照 | 20 |
附PCR结果见图2。使用本发明方法的检测结果与PCR结果全部一致。
实施例2：八项呼吸道病原体核酸检测
同时检测待测样本（鼻咽拭子等）中八项呼吸道病原体，包括甲型流感病毒（FLUA）、乙型流感病毒（FLUB）、人副流感病毒（PIV）、腺病毒（AdV）、人鼻病毒（HRV）、呼吸道合胞病毒（RSV）、肺炎支原体（MP）、肺炎衣原体（Cpn）。扩增缓冲液中含有8种病原体的引物，可通过一次反应实现对一个样本中可能存在的8种病原体进行同时扩增，检测时将样本分为8份进行杂交，分别用单个病原体对应的捕获桥分子和放大桥分子进行杂交识别，最终实现对单个样本中病原体的高通量检测。
1、引物、捕获分子、捕获桥分子、放大桥分子、标记分子和载体分子的设计和合成：
捕获分子：GTTGGGCTACGACTTAGAGGCC（SEQ ID No1）
标记分子1：Biotin-ACCCGATGGATAGGTCGGTGAA（SEQ ID No2）
标记分子2：Biotin-TAAGCATCGTGCCCTTTCGCAG（SEQ ID No3）
标记分子3：biotin-ACCACGTTCGCGTTCTCACATG（SEQ ID No4）
载体分子：
AGAAGGCGTCCGTCTTTGAGGCTTCACCGACCTATCCATCGGGTCTGCGAAAGGGCACGATGCTTACATGTGAGAACGCGAACGTGGT（SEQ ID No5）
根据genebank中八种呼吸道病原体的特异基因序列，设计引物、捕获桥分子和放大桥分子的序列，序列如下：
2、样品预处理：以鼻咽拭子样本为例
（1）带有取样后鼻咽拭子的采集管在旋涡混合器震荡混匀，使鼻咽拭子收集的细胞进入到收集液中。
（2）弃去采集管中的鼻咽拭子到含有消毒剂的废物桶中。
（3）采集管放入离心机中，2500rpm离心10分钟。
（4）弃去上清液到含有消毒剂的废物桶中，此时，隐约可见采集管底部的白色细胞沉淀。
（5）直接进行检验或冻存，注意：冻存温度不同，储存的时限有差异，-20℃保存不超过2周；-80℃保存不超过三个月。
3、预包被：将捕获分子包被到微孔板上，加入固定液，固定2小时后室温风干。
4、检验方法及操作步骤
（1）向装有细胞沉淀的采集管中加入1mL1×PBS重悬沉淀。
（2）取0.5mL～1mL重悬液加入到一新的离心管，12,000rpm离心1分钟。
（3）去上清，加入20μL预冷的细胞裂解液，悬浮细胞，可选择放入低温冷冻数分钟。
（4）该细胞裂解物即可进行RNA扩增实验或者-80℃储存待用。
（5）RNA扩增：向PCR管中加入下述试剂，置于PCR仪或恒温水浴锅中95℃孵育2分钟。
待温度降到42℃，加入1ul扩增酶（T7聚合酶、AMV和RNaseH混合物）；42℃温育90分钟。
（6）将上述样本RNA扩增产物20μL稀释到850μL预热的杂交液中，混匀，每孔100μL加入到到微孔杂交板的一纵列共8孔中。（微孔杂交板每一纵列为一个样本）
（7）将一种病原体相对应的一对捕获桥分子与放大桥分子按比例1：1在离心管中混匀，共8管，分别对应不同的病原体，每孔4μL依次加入到微孔杂交板的一纵列8个微孔中，建议顺序：FluA、FluB、PIV、AdV、HRV、RSV、MP、Cpn。（一纵列的8个微孔检测一个样本的8种病原体）
（8）将微孔杂交板上使用到的微孔进行封膜，并用力将铝箔膜压紧，以致微孔杂交板上的数字编号清晰可见。
（9）42-50℃孵育2小时。
（10）去除封膜，弃去孔内液体并在干净的吸水纸上拍干。每孔加入200μL预热的杂交洗涤液，静止片刻后弃去液体并在干净的吸水纸上拍干，重复洗涤2次，共3次洗涤。
（11）按1:500的比例，用杂交液稀释放大分子，每孔加入稀释后的100μL放大分子，封膜。42-50℃温育1小时。
（12）重复步骤（10）。
（13）每孔加入200μL封闭液，室温振荡1分钟。
（14）弃去孔内液体，每孔加入100μL链霉亲和素-HRP酶联物，室温震荡30分钟。
（15）弃去孔内液体并在干净的吸水纸上拍干。每孔加入200μL预热的检测洗涤液，室温振荡5分钟后，弃去液体并在干净的吸水纸上拍干，重复洗涤2次，共3次洗涤。
（16）配制底物溶液，底物A、底物B、底物稀释液按比例1：1：8混匀。
（17）每孔加入95μL底物溶液，孵育5分钟后，置于化学发光检测仪上进行相对光单位（RLU）测定。
5.结果
结果显示，8种病原体扩增之间不存在交叉反应，特异性较好。可用于同一样本中8种病原体同时检测。
SEQUENCE LISTING
<110> 武汉中帜生物科技有限公司
<120> 一种模板扩增和信号放大结合检测核酸的方法
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<170> PatentIn version 3.3
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taatacgact cactataggg agagtattca ccgcgacata gctgat 46
<210> 38
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 38
cgtcagctcg tgtcgttttt ggcctctaag tcgtagccca ac 42
<210> 39
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 39
tcccgcaacg agcgcatttt gcctcaaaga cggacgcctt ct 42
<210> 40
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 40
acccttatcg ttagttttgc ctcaaagacg gacgccttct 40
<210> 41
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 41
ctgagaattt gatcttggtt cagat 25
<210> 42
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 42
taatacgact cactataggg agaacactac attcggtatt agcgatc 47
<210> 43
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 43
ctgagaattt gatctttttt ggcctctaag tcgtagccca ac 42
<210> 44
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 44
gaataatgac ttcggttttt gcctcaaaga cggacgcctt ct 42
<210> 45
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 45
aagggttagt aatacatttt gcctcaaaga cggacgcctt ct 42
Claims (7)
1.一种线性扩增与信号放大相结合的检测核酸的方法，其特征在于包括以下步骤： 1）用商品化的试剂盒从样本中抽提出待测核酸或者直接裂解样本释放出待测核酸；
2）核酸的线性扩增
将待测核酸转化为带有启动子的双链DNA，再通过针对启动子的RNA聚合酶进行RNA扩增，得到RNA产物；
3）应用多生物素分子对核酸信号放大
a)涉及的功能分子的设计和合成
捕获分子为寡核苷酸，包被于固相上；捕获桥分子为DNA，一端能与捕获分子部分杂交，另一端能与线性扩增的RNA产物部分杂交；放大分子包括载体分子和标记分子，所述载体分子为DNA或RNA，所述标记分子为生物素标记的多核苷酸，一个载体分子通过多核苷酸与多个生物素分子相连；放大桥分子为DNA，一端能与线性扩增的RNA产物部分杂交，另一端能与载体分子部分杂交；
b)将RNA产物与放大桥分子、捕获桥分子一起加入到固相上进行杂交，42-50℃孵育1-16小时，RNA产物通过捕获桥分子与预包被在固相上的捕获分子的特异识别而捕获到固相上；
c)洗去未结合于固相上的RNA产物和放大桥分子、捕获桥分子，将放大分子加入到固相上，42-50℃孵育0.5-1小时；
d)将标记物标记的链霉亲和素或亲和素加入到固相上，室温孵育；
e)通过链霉亲和素或亲和素上的标记物的特征反应，实现核酸信号的放大和检测。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2）核酸的线性扩增中，启动子序列为T7、T3或SP6。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2）核酸的线性扩增中，所用的RNA聚合酶为T7、T3或SP6聚合酶。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3）中，所述的载体分子通过多核苷酸与2-100个生物素分子相连。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3）中，所述的多核苷酸由15-50个一种或多种核苷酸组成。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3）中，所述的放大桥分子为多个不同DNA。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3）中，所述的链霉亲和素或亲和素上的标记物为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶。
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Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104450920A (zh) * | 2014-12-11 | 2015-03-25 | 华南师范大学 | 基于指数级非酶扩增及电化学发光原理的microRNA痕量检测方法 |
| CN108179176A (zh) * | 2018-02-08 | 2018-06-19 | 斯格特生物 | 一种基于miRNA搭桥对两个互不重叠的扩增引物进行双向延伸检测miRNA的方法 |
| CN110923344A (zh) * | 2019-12-19 | 2020-03-27 | 武汉中帜生物科技股份有限公司 | 金黄色葡萄球菌及耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药基因mecA检测试剂盒及其应用 |
| CN111304295A (zh) * | 2019-12-19 | 2020-06-19 | 武汉中帜生物科技股份有限公司 | 同时检测淋病奈瑟菌、沙眼衣原体及解脲脲原体核酸的试剂盒及其应用 |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2003106637A2 (en) * | 2002-06-12 | 2003-12-24 | Datascope Investment Corp. | Polymeric label molecules |
| WO2004007755A2 (en) * | 2002-07-15 | 2004-01-22 | Illumina, Inc. | Multiplex nucleic acid reactions |
| US20090181389A1 (en) * | 2008-01-11 | 2009-07-16 | Signosis, Inc., A California Corporation | Quantitative measurement of nucleic acid via ligation-based linear amplification |
| CN101792800A (zh) * | 2010-01-19 | 2010-08-04 | 深圳市宏信生物技术有限公司 | 多生物素信号放大方法 |
| CN102485906A (zh) * | 2010-12-03 | 2012-06-06 | 武汉中帜生物科技有限公司 | 模板线性扩增和多生物素信号的双重放大方法 |
-
2013
- 2013-07-30 CN CN201310325786.XA patent/CN103361438B/zh active Active
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2003106637A2 (en) * | 2002-06-12 | 2003-12-24 | Datascope Investment Corp. | Polymeric label molecules |
| WO2004007755A2 (en) * | 2002-07-15 | 2004-01-22 | Illumina, Inc. | Multiplex nucleic acid reactions |
| WO2004007755A3 (en) * | 2002-07-15 | 2004-07-29 | Illumina Inc | Multiplex nucleic acid reactions |
| US20090181389A1 (en) * | 2008-01-11 | 2009-07-16 | Signosis, Inc., A California Corporation | Quantitative measurement of nucleic acid via ligation-based linear amplification |
| CN101792800A (zh) * | 2010-01-19 | 2010-08-04 | 深圳市宏信生物技术有限公司 | 多生物素信号放大方法 |
| CN102485906A (zh) * | 2010-12-03 | 2012-06-06 | 武汉中帜生物科技有限公司 | 模板线性扩增和多生物素信号的双重放大方法 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 杨永等: "基于生物信号纳米放大技术的戊肝病毒检测基因芯片", 《武汉大学学报(理学版)》 * |
Cited By (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104450920A (zh) * | 2014-12-11 | 2015-03-25 | 华南师范大学 | 基于指数级非酶扩增及电化学发光原理的microRNA痕量检测方法 |
| CN104450920B (zh) * | 2014-12-11 | 2016-09-21 | 华南师范大学 | 基于指数级非酶扩增及电化学发光原理的microRNA痕量检测方法 |
| CN108179176A (zh) * | 2018-02-08 | 2018-06-19 | 斯格特生物 | 一种基于miRNA搭桥对两个互不重叠的扩增引物进行双向延伸检测miRNA的方法 |
| CN108179176B (zh) * | 2018-02-08 | 2021-08-03 | 斯格特生物 | 一种基于miRNA搭桥对两个互不重叠的扩增引物进行双向延伸检测miRNA的方法 |
| CN110923344A (zh) * | 2019-12-19 | 2020-03-27 | 武汉中帜生物科技股份有限公司 | 金黄色葡萄球菌及耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药基因mecA检测试剂盒及其应用 |
| CN111304295A (zh) * | 2019-12-19 | 2020-06-19 | 武汉中帜生物科技股份有限公司 | 同时检测淋病奈瑟菌、沙眼衣原体及解脲脲原体核酸的试剂盒及其应用 |
| CN111304295B (zh) * | 2019-12-19 | 2022-08-05 | 武汉中帜生物科技股份有限公司 | 同时检测淋病奈瑟菌、沙眼衣原体及解脲脲原体核酸的试剂盒及其应用 |
| CN110923344B (zh) * | 2019-12-19 | 2023-06-27 | 武汉中帜生物科技股份有限公司 | 金黄色葡萄球菌及耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药基因mecA检测试剂盒及其应用 |
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