JP2024517984A - 発がん突然変異遺伝子検出用ガイドｒｎａおよびその用途 - Google Patents
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Abstract
本発明は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を用いて野生型がん細胞遺伝子を切断することによって発がん突然変異遺伝子を検出するのに用いられるガイドＲＮＡおよびその用途に関する。本発明のガイドＲＮＡを用いてＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを用いてがん突然変異を検出する場合、野生型無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）のみを切断し、発がん突然変異ＤＮＡを切断しないので、既存ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムのガイドＲＮＡを用いる場合に比べて、発がん突然変異ＤＮＡのみを選択的に増幅するのに効果的に用いられ得る。
Description
本出願は、２０２１年０５月１１日に出願された韓国特許出願第１０－２０２１－００６１０３７号を優先権として主張し、前記明細書全体は本出願の参考文献である。
本発明は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを用いて野生型癌細胞遺伝子を切断することによって、発がん突然変異遺伝子を検出するのに用いられるガイドＲＮＡおよびその用途に関する。
この出願は、韓国保健福祉部から支援された（Ｎｏ．ＨＲ１４Ｃ０００５０２００２１（１４６５０３３５８６））。
シーケンシング技術の発展に基づいて、がんは、一般的に発がん突然変異によって誘発されることが知られている。様々な研究において腫瘍形成が特定型のがんにおいて体細胞突然変異の有病率と密接な関連があるという証拠を提供した。ＣＯＳＭＩＣ（Ｃａｔａｌｏｇｕｅ ｏｆ Ｓｏｍａｔｉｃ Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ）データベースには、腫瘍型および疾患別に分類された数十万個のヒトがん関連体細胞突然変異が含まれている。
これと共に、最近、液体生検は、既存の組織生検に対する有用な代案として浮上していて、血流で循環する腫瘍由来要素を探知し、モニタリングするための非侵襲的アプローチを提供し、がんバイオマーカーの根源として直接または間接に用いることができる。血液には、詳細な分子解析に脆弱な２つの型のがん由来成分が含まれている。１つは、完全な循環腫瘍細胞（ＣＴＣ，ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌｓ）と無細胞循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡまたは循環腫瘍ＤＮＡ；ｃｔＤＮＡ）である。腫瘍の体積が増加するにつれて、細胞死および壊死性断片を除去し、除去する食細胞の能力が超過してｃｆＤＮＡを血流に受動的に放出することができる。この液体生検は、腫瘍が一般的に血流に放出するＤＮＡを解析するのに役に立つ。腫瘍のサイズによって血流に放出するｃｆＤＮＡの量は、血漿に存在するすべてのＤＮＡの０．０１％から９０％まで多様である。したがって、液体生検は、腫瘍組織を確保せずとも、腫瘍分子プロファイリングに対する大規模の非侵襲的アプローチを提供する。
しかしながら、血漿のｃｆＤＮＡには、一般的に非常に少量の腫瘍ＤＮＡが含まれており、これは、腫瘍負担やがん段階によって変わることが知られている。したがって、特にがん初期段階では、ｃｔＤＮＡを検出して腫瘍を診断するために、非常に敏感かつ具体的な方法が必要である。原核生物の適応性免疫反応であるＣＲＩＳＰＲ（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ ｒｅｇｕｌａｒ ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ ｓｈｏｒｔ ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ ｒｅｐｅａｔｓ）およびＣａｓ（ＣＲＩＳＰＲ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ）タンパク質システムは、特定のＤＮＡ標的認識および切断としてよく知られている。ＣＲＩＳＰＲシステムの多様性は、我々と他のグループは、様々な有機体のゲノム編集だけでなく、試験管内でＤＮＡを切断するのに広範囲に活用する。ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼ（例えば、ＩＩ型Ｃａｓ９またはＶ型Ｃｐｆ１）は、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）に該当する標的ＤＮＡ配列それぞれのプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）ダウンストリームまたはアップストリームをそれぞれ認識し、標的ＤＮＡで二本鎖の破損を誘導する。がんの診断にｃｔＤＮＡを使用するには、比較的多量の野生型ｃｆＤＮＡのうち、ミスセンス突然変異（ｍｉｓｓｅｎｓｅ ｍｕｔａｔｉｏｎ）を有する少量のｃｔＤＮＡを非常に正確な方式で検出しなければならない。野生型ＤＮＡを特異的に切断することによって、腫瘍特異的対
野生型対立遺伝子を豊富にすることができ、Ｃａｓ９－ｓｇＲＮＡを用いて野生型標的ＤＮＡを切断するには、単一ガイドＲＮＡがＰＡＭ部位の配列を標的化するように設計されなければならない。しかしながら、ｃｆＤＮＡで標的化されたＤＮＡ ＰＡＭ部位は、発がん突然変異によって破壊されるので、ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼ（ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ）により認識されないため、検出しにくいという問題点が存在する。
野生型対立遺伝子を豊富にすることができ、Ｃａｓ９－ｓｇＲＮＡを用いて野生型標的ＤＮＡを切断するには、単一ガイドＲＮＡがＰＡＭ部位の配列を標的化するように設計されなければならない。しかしながら、ｃｆＤＮＡで標的化されたＤＮＡ ＰＡＭ部位は、発がん突然変異によって破壊されるので、ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼ（ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ）により認識されないため、検出しにくいという問題点が存在する。
これより、本発明者らは、ＰＡＭ配列が存在しないがん関連突然変異にも活用できるがん診断などのためのＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼおよびＣａｓ９（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９）を用いて検出するシステムを提供するために鋭意努力した結果、がん細胞の突然変異ＤＮＡでなく、野生型ＤＮＡのみを特異的に切断できるガイドＲＮＡを製作し、本発明を完成した。
したがって、本発明の目的は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムのガイドＲＮＡ（ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ）およびこれを含むがんの診断または予後予測用組成物およびキットを提供することにある。
本発明の他の目的は、患者の試料にＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムのガイドＲＮＡ（ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ）を処理する段階を含む含むがんの診断または予後予測のための情報提供方法を提供することにある。
本発明は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムに用いられるガイドＲＮＡ（ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ）であって、
前記ガイドＲＮＡは、野生型無細胞ＤＮＡを切断することを特徴とするガイドＲＮＡを提供する。
前記ガイドＲＮＡは、野生型無細胞ＤＮＡを切断することを特徴とするガイドＲＮＡを提供する。
本発明の好ましい一実施形態によれば、前記ガイドＲＮＡは、配列番号１～１７からなる群から選ばれるいずれか１つ以上のヌクレオチド配列を含んでもよい。
本発明の好ましい一実施形態によれば、前記ガイドＲＮＡは、ガイドＲＮＡのトランク（ｔｒｕｎｋ）領域、セミシード（ｓｅｍｉ－ｓｅｅｄ）領域およびシード（ｓｅｅｄ）領域から成る群から選ばれるいずれか１つ以上の領域でトランスバージョン突然変異（ｔｒａｎｓｖｅｒｓｉｏｎ ｍｕｔａｔｉｏｎ）が発生したものであってもよい。
本発明の好ましい一実施形態によれば、前記ガイドＲＮＡは、配列番号２、配列番号４、配列番号９および配列番号１３から成る群から選ばれるいずれか１つ以上のヌクレオチド配列を含んでもよい。
本発明の好ましい一実施形態によれば、前記ガイドＲＮＡは、ＥＧＦＲ、ＭＥＴ、ＫＲＡＳ、ＰＩＫ３ＣＡおよびＢＲＡＦからなる群から選ばれるいずれか１つ以上のがん関連突然変異を検出できるものであってもよい。
本発明の好ましい一実施形態によれば、前記ＥＧＦＲ突然変異を検出する場合、前記ガイドＲＮＡは、配列番号１～４、８、９および１１～１３から成る群から選ばれるいずれか１つ以上のヌクレオチド配列を含んでもよい。
本発明の好ましい一実施形態によれば、前記ＭＥＴ突然変異を検出する場合、前記ガイドＲＮＡは、配列番号５～７からなる群から選ばれるいずれか１つ以上のヌクレオチド配
列を含んでもよい。
列を含んでもよい。
本発明の好ましい一実施形態によれば、前記ＫＲＡＳ突然変異を検出する場合、前記ガイドＲＮＡは、配列番号１０のヌクレオチド配列を含んでもよい。
本発明の好ましい一実施形態によれば、前記ＰＩＫ３ＣＡ突然変異を検出する場合、前記ガイドＲＮＡは、配列番号１４～１６から成る群から選ばれるいずれか１つ以上のヌクレオチド配列を含んでもよい。
本発明の好ましい一実施形態によれば、前記ＢＲＡＦ突然変異を検出する場合、前記ガイドＲＮＡは、配列番号１７のヌクレオチド配列を含んでもよい。
本発明は、配列番号１～１７からなる群から選ばれるいずれか１つ以上のヌクレオチド配列を含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９のガイドＲＮＡを含むがんの診断または予後予測用組成物を提供する。
本発明の好ましい一実施形態によれば、前記ガイドＲＮＡは、ガイドＲＮＡのトランク（ｔｒｕｎｋ）領域、セミシード（ｓｅｍｉ－ｓｅｅｄ）領域およびシード（ｓｅｅｄ）領域から成る群から選ばれるいずれか１つ以上の領域でトランスバージョン突然変異（ｔｒａｎｓｖｅｒｓｉｏｎ ｍｕｔａｔｉｏｎ）が発生したものであってもよい。
本発明の好ましい一実施形態によれば、前記ガイドＲＮＡは、ＥＧＦＲ、ＭＥＴ、ＫＲＡＳ、ＰＩＫ３ＣＡおよびＢＲＡＦからなる群から選ばれるいずれか１つ以上のがん関連突然変異を検出できるものであってもよい。
本発明の好ましい一実施形態によれば、前記ガイドＲＮＡは、野生型無細胞ＤＮＡを切断するものであってもよい。
本発明は、また、前記本発明の好ましい一実施形態によれば、前記がんは、肺がん、膵がん、大腸がん、胃がん、乳がん、腎がん、肝がん、血液がん、膀胱がんおよび子宮がんから成る群から選ばれるいずれか１つ以上のがんであってもよい。
本発明は、また、前記組成物を含むがんの診断または予後予測用キットを提供する。
本発明は、また、患者の試料に前記組成物を処理する段階を含むがんの診断または予後予測のための情報提供方法を提供する。
上記に記載したように、既存ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを用いて無細胞ＤＮＡを用いた発がん突然変異遺伝子の検出は、３個のＰＡＭ配列（ＮＧＧ）ヌクレオチドの突然変異をターゲットとしてガイドＲＮＡで検出する確率が低いという点など発がん突然変異遺伝子を検出するのに限界が存在した。
上記のような限界点を克服するために、本発明のガイドＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを用いて発がん突然変異遺伝子でなく、野生型無細胞ＤＮＡをターゲットおよび切断し、特にガイドＲＮＡのトランク（ｔｒｕｎｋ）領域でトランスバージョン突然変異（ｔｒａｎｓｖｅｒｓｉｏｎ ｍｕｔａｔｉｏｎ）を起こしたガイドＲＮＡを用いることによって、発がん突然変異遺伝子のみを選択的にターゲットおよび増幅することができる。
したがって、本発明は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムに用いられるガイドＲＮＡ（
ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ）であって、前記ガイドＲＮＡは、野生型無細胞ＤＮＡを切断するものであってもよい。
ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ）であって、前記ガイドＲＮＡは、野生型無細胞ＤＮＡを切断するものであってもよい。
前記「ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システム」とは、Ｃａｓ９のような特定の塩基配列を認識して遺伝子を切ることができる酵素が当該塩基配列を含んでいる一本鎖ガイドＲＮＡ（ｓｉｎｇｌｅ ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ；ｓｇＲＮＡ）を認識して特定のＤＮＡを切ることができるシステムを意味する。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムは、ターゲットＤＮＡを正確に認識できるようにデザインされたｓｇＲＮＡと、これに基づいてターゲットＤＮＡを切ることができるＣａｓ９で構成され、ｓｇＲＮＡを認識したＣａｓ９は、ＤＮＡ二重螺旋を切断する。
本発明の好ましい一実施形態によれば、前記ガイドＲＮＡは、配列番号１～１７からなる群から選ばれるいずれか１つ以上のヌクレオチド配列を含んでもよい。
配列番号１のヌクレオチド配列を含むガイドＲＮＡは、ＥＧＦＲ（ｐ．Ｔ７９０Ｍ）突然変異を検出できる野生型ガイドＲＮＡ（ｗｉｌｄ ｓｇＲＮＡ）であって、ｉｎ ｖｉｔｒｏ切断解析に用いられる場合、配列番号１８をターゲット配列とすることができる。
配列番号２のヌクレオチド配列を含むガイドＲＮＡは、ＥＧＦＲ（ｐ．Ｔ７９０Ｍ）突然変異を検出できるトランスバージョン突然変異ガイドＲＮＡ（ｔｒａｎｓｖｅｒｓｉｏｎ ｓｇＲＮＡ）であって、ｉｎ ｖｉｔｒｏ切断解析に用いられる場合、配列番号１９をターゲット配列とすることができる。配列番号２のヌクレオチド配列を含むガイドＲＮＡを用いる場合、１％～３２％で突然変異配列を増幅させることができる。
配列番号３のヌクレオチド配列を含むガイドＲＮＡは、ＥＧＦＲ（ｐ．Ｃ７９７Ｓ）突然変異を検出できる野生型ガイドＲＮＡ（ｗｉｌｄ ｓｇＲＮＡ）であって、ｉｎ ｖｉｔｒｏ切断解析に用いられる場合、配列番号２０をターゲット配列とすることができる。
配列番号４のヌクレオチド配列を含むガイドＲＮＡは、ＥＧＦＲ（ｐ．Ｃ７９７Ｓ）突然変異を検出できるトランスバージョン突然変異ガイドＲＮＡ（ｔｒａｎｓｖｅｒｓｉｏｎ ｓｇＲＮＡ）であって、ｉｎ ｖｉｔｒｏ切断解析に用いられる場合、配列番号２１をターゲット配列とすることができる。配列番号４のヌクレオチド配列を含むガイドＲＮＡを用いる場合、１％～１３％で突然変異配列を増幅させることができる。
配列番号５のヌクレオチド配列を含むガイドＲＮＡは、ＭＥＴ ｃ．２８８８ Ｉｎｔ１３－Ｅｘｏｎ１４ Ａｃｃｅｐｔｏｒ（Ｅｘｏｎ－１４ Ｓｋｉｐｐｉｎｇ）突然変異を検出できる野生型ガイドＲＮＡ（ｗｉｌｄ ｓｇＲＮＡ）であって、ｉｎ ｖｉｔｒｏ切断解析に用いられる場合、配列番号２２または２３をターゲット配列とすることができる。
配列番号６のヌクレオチド配列を含むガイドＲＮＡは、ＭＥＴ ｃ．３０２８ Ｅｘｏｎ１４－Ｉｎｔ１４ Ｄｏｎｏｒ（Ｅｘｏｎ－１４ Ｓｋｉｐｐｉｎｇ）突然変異を検出できる野生型ガイドＲＮＡ（ｗｉｌｄ ｓｇＲＮＡ）であって、ｉｎ ｖｉｔｒｏ切断解析に用いられる場合、配列番号２４または２５をターゲット配列とすることができる。
配列番号７のヌクレオチド配列を含むガイドＲＮＡは、ＭＥＴ ’ＴＡＣ’ Ｙ１００３Ｘ（Ｅｘｏｎ－１４ Ｓｋｉｐｐｉｎｇ）突然変異を検出できる野生型ガイドＲＮＡ（ｗｉｌｄ ｓｇＲＮＡ）であって、ｉｎ ｖｉｔｒｏ切断解析に用いられる場合、配列番号２６または２７をターゲット配列とすることができる。
配列番号８のヌクレオチド配列を含むガイドＲＮＡは、ＥＧＦＲ（Ｌ７１８Ｑ）突然変異を検出できる野生型ガイドＲＮＡ（ｗｉｌｄ ｓｇＲＮＡ）であって、ｉｎ ｖｉｔｒｏ切断解析に用いられる場合、配列番号２８をターゲット配列とすることができる。
配列番号９のヌクレオチド配列を含むガイドＲＮＡは、ＥＧＦＲ（Ｌ７１８Ｑ）突然変異を検出できるトランスバージョン突然変異ガイドＲＮＡ（ｔｒａｎｓｖｅｒｓｉｏｎ ｓｇＲＮＡ）であって、ｉｎ ｖｉｔｒｏ切断解析に用いられる場合、配列番号２９をターゲット配列とすることができる。配列番号９のヌクレオチド配列を含むガイドＲＮＡを用いる場合、０．８％～２３．７％で突然変異配列を増幅させることができる。
配列番号１０のヌクレオチド配列を含むガイドＲＮＡは、ＫＲＡＳ（ｃ．３５Ｇ）突然変異を検出できる野生型ガイドＲＮＡ（ｗｉｌｄ ｓｇＲＮＡ）であって、ｉｎ ｖｉｔｒｏ切断解析に用いられる場合、配列番号３０または３１をターゲット配列とすることができる。配列番号１０のヌクレオチド配列を含むガイドＲＮＡを用いる場合、１．５％～５０％で突然変異配列を増幅させることができる。
配列番号１１のヌクレオチド配列を含むガイドＲＮＡは、ＥＧＦＲ、１５ｂｐ Ｄｅｌ
ｐ．（７２９＿７６１）突然変異を検出できる野生型ガイドＲＮＡ（ｗｉｌｄ ｓｇＲＮＡ）であって、ｉｎ ｖｉｔｒｏ切断解析に用いられる場合、配列番号３２または３３をターゲット配列とすることができる。配列番号１１のヌクレオチド配列を含むガイドＲＮＡを用いる場合、０．５％～２３％で突然変異配列を増幅させることができる。
ｐ．（７２９＿７６１）突然変異を検出できる野生型ガイドＲＮＡ（ｗｉｌｄ ｓｇＲＮＡ）であって、ｉｎ ｖｉｔｒｏ切断解析に用いられる場合、配列番号３２または３３をターゲット配列とすることができる。配列番号１１のヌクレオチド配列を含むガイドＲＮＡを用いる場合、０．５％～２３％で突然変異配列を増幅させることができる。
配列番号１２のヌクレオチド配列を含むガイドＲＮＡは、ＥＧＦＲ（ｐ．Ｌ８５８Ｒ）突然変異を検出できる野生型ガイドＲＮＡ（ｗｉｌｄ ｓｇＲＮＡ）であって、ｉｎ ｖｉｔｒｏ切断解析に用いられる場合、配列番号３４をターゲット配列とすることができる。
配列番号１３のヌクレオチド配列を含むガイドＲＮＡは、ＥＧＦＲ（ｐ．Ｌ８５８Ｒ）突然変異を検出できるトランスバージョン突然変異ガイドＲＮＡ（ｔｒａｎｓｖｅｒｓｉｏｎ ｓｇＲＮＡ）であって、ｉｎ ｖｉｔｒｏ切断解析に用いられる場合、配列番号３５をターゲット配列とすることができる。配列番号１３のヌクレオチド配列を含むガイドＲＮＡを用いる場合、１．７％～６３％で突然変異配列を増幅させることができる。
配列番号１４のヌクレオチド配列を含むガイドＲＮＡは、ＰＩＫ３ＣＡ（ｐ．Ｅ５４２Ｋまたはｃ．１６２４Ｇ＞Ａ）突然変異を検出できる野生型ガイドＲＮＡ（ｗｉｌｄ ｓｇＲＮＡ）であって、ｉｎ ｖｉｔｒｏ切断解析に用いられる場合、配列番号３６または３７をターゲット配列とすることができる。
配列番号１５のヌクレオチド配列を含むガイドＲＮＡは、ＰＩＫ３ＣＡ（ｐ．Ｅ５４５？またはｃ．１６３３Ｇ＞？）突然変異を検出できる野生型ガイドＲＮＡ（ｗｉｌｄ ｓｇＲＮＡ）であって、ｉｎ ｖｉｔｒｏ切断解析に用いられる場合、配列番号３８または３９をターゲット配列とすることができる。
配列番号１６のヌクレオチド配列を含むガイドＲＮＡは、ＰＩＫ３ＣＡ（ｐ．Ｈ１０４７？またはｃ．３１４０Ａ＞？）突然変異を検出できる野生型ガイドＲＮＡ（ｗｉｌｄ ｓｇＲＮＡ）であって、ｉｎ ｖｉｔｒｏ切断解析に用いられる場合、配列番号４０または４１をターゲット配列とすることができる。
配列番号１７のヌクレオチド配列を含むガイドＲＮＡは、ＰＩＫ３ＣＡ（ｐ．Ｖ６００Ｅまたはｃ．１７９９Ｔ＞Ａ）突然変異を検出できる野生型ガイドＲＮＡ（ｗｉｌｄ ｓ
ｇＲＮＡ）であって、ｉｎ ｖｉｔｒｏ切断解析に用いられる場合、配列番号４２または４３をターゲット配列とすることができる。
ｇＲＮＡ）であって、ｉｎ ｖｉｔｒｏ切断解析に用いられる場合、配列番号４２または４３をターゲット配列とすることができる。
前記ガイドＲＮＡは、ガイドＲＮＡのトランク（ｔｒｕｎｋ）領域、セミシード（ｓｅｍｉ－ｓｅｅｄ）領域およびシード（ｓｅｅｄ）領域から成る群から選ばれるいずれか１つ以上の領域でトランスバージョン突然変異（ｔｒａｎｓｖｅｒｓｉｏｎ ｍｕｔａｔｉｏｎ）が発生したことを特徴とするガイドＲＮＡであってもよい。
ＳｐＣａｓ９でＤＮＡ切断を標的化するには、主に標的配列の３’末端に隣接する３個のＰＡＭ配列（ＮＧＧ）ヌクレオチドとともに、標的プロトスペーサー配列の特定２０個のヌクレオチドが必要である。ＰＡＭ配列内突然変異（ｍｉｓｍａｔｃｈｅｄ ＰＡＭ－ＮＧＮまたは任意の発がん突然変異によって誘発される）は、Ｃａｓ９が無細胞ＤＮＡにおいて野生型標的対立遺伝子（ＰＡＭ－ＮＧＧ）で切断して、野生型ＤＮＡにおいて突然変異対立遺伝子を豊富にするための容易な最上の候補である。しかしながら、すべてのがん関連突然変異に対してこのように一致しないＰＡＭ標的配列を有することは不可能である。本発明者らは、前記問題点を解決し、すべての種類の突然変異を標的とするために、ガイドＲＮＡのトランク（ｔｒｕｎｋ）領域でトランスバージョン突然変異（ｔｒａｎｓｖｅｒｓｉｏｎ ｍｕｔａｔｉｏｎ、プリンからピリミジンへ）を製造した。ｓｇＲＮＡ活性に対する耐性によってガイドＲＮＡ内の１塩基ミスマッチ（ｍｉｓｍａｔｃｈ）は、セミシード（ｓｅｍｉ－ｓｅｅｄ）、シード（ｓｅｅｄ）、トランク（ｔｒｕｎｋ）および多重（ｐｒｏｍｉｓｃｕｏｕｓ）領域に区分される。位置４から７までのシード領域内１塩基ミスマッチに対するガイドＲＮＡ耐性は、当該ｓｇＲＮＡの最も低い耐性である。次に、位置１－３および８－１１においてシード領域の両側は、ミスマッチに対する中間許容誤差であり、セミシード領域と定義される。位置１２－１９において１塩基ミスマッチは、切断頻度を中間レベルに減らしたが、ｓｇＲＮＡ活性を維持し、この中間領域をトランク領域という。位置２０において、１塩基ミスマッチは、Ｃａｓ９ヌクレアーゼによって誘導された切断頻度を若干減少させ、この位置を多重領域と命名する。この戦略をベースにＣａｓ９ヌクレアーゼをトランスバージョン突然変異（ｔｒａｎｓｖｅｒｓｉｏｎ
ｍｕｔａｔｉｏｎ）ガイドＲＮＡで処理し、低頻度の突然変異対立遺伝子を強化した後、ＰＣＲ増幅を通じて野生型標的対立遺伝子を除去することができる。突然変異標的対立遺伝子は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼによって認識されなかったり切断されない。なぜなら、２個の突然変異に対する低耐性、すなわち一方は、ｓｇＲＮＡ内のトランスバージョン突然変異であり、他方は、発がん突然変異の標的突然変異であるからである（図３ａ、図３ｂ）。
ｍｕｔａｔｉｏｎ）ガイドＲＮＡで処理し、低頻度の突然変異対立遺伝子を強化した後、ＰＣＲ増幅を通じて野生型標的対立遺伝子を除去することができる。突然変異標的対立遺伝子は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼによって認識されなかったり切断されない。なぜなら、２個の突然変異に対する低耐性、すなわち一方は、ｓｇＲＮＡ内のトランスバージョン突然変異であり、他方は、発がん突然変異の標的突然変異であるからである（図３ａ、図３ｂ）。
前記Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、多様な変異体を含んでもよいし、Ｃａｓ９、ｅＣａｓ９またはＨＦＣａｓ９であってもよい。
本発明の好ましい一実施形態によれば、前記トランスバージョン突然変異（ｔｒａｎｓｖｅｒｓｉｏｎ ｍｕｔａｔｉｏｎ）が発生したガイドＲＮＡは、配列番号２、配列番号４、配列番号９および配列番号１３から成る群から選ばれるいずれか１つ以上のヌクレオチド配列を含んでもよい。
本発明の好ましい一実施形態によれば、前記ガイドＲＮＡは、ＥＧＦＲ、ＭＥＴ、ＫＲＡＳ、ＰＩＫ３ＣＡおよびＢＲＡＦからなる群から選ばれるいずれか１つ以上のがん関連突然変異を検出できるものであってもよい。
本発明の好ましい一実施形態によれば、前記ＥＧＦＲ突然変異を検出する場合、前記ガイドＲＮＡは、配列番号１～４、８、９および１１～１３から成る群から選ばれるいずれか１つ以上のヌクレオチド配列を含んでもよい。
本発明の好ましい一実施形態によれば、前記ＭＥＴ突然変異を検出する場合、前記ガイドＲＮＡは、配列番号５～７からなる群から選ばれるいずれか１つ以上のヌクレオチド配列を含んでもよい。
本発明の好ましい一実施形態によれば、前記ＫＲＡＳ突然変異を検出する場合、前記ガイドＲＮＡは、配列番号１０のヌクレオチド配列を含んでもよい。
本発明の好ましい一実施形態によれば、前記ＰＩＫ３ＣＡ突然変異を検出する場合、前記ガイドＲＮＡは、配列番号１４～１６から成る群から選ばれるいずれか１つ以上のヌクレオチド配列を含んでもよい。
本発明の好ましい一実施形態によれば、前記ＢＲＡＦ突然変異を検出する場合、前記ガイドＲＮＡは、配列番号１７のヌクレオチド配列を含んでもよい。
また、本発明は、配列番号１～１７からなる群から選ばれるいずれか１つ以上のヌクレオチド配列を含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９のガイドＲＮＡを提供することができる。前記ガイドＲＮＡは、野生型無細胞ＤＮＡを切断するものであってもよい。
本発明の好ましい一実施形態によれば、前記ガイドＲＮＡは、ガイドＲＮＡのトランク（ｔｒｕｎｋ）領域、セミシード（ｓｅｍｉ－ｓｅｅｄ）領域およびシード（ｓｅｅｄ）領域から成る群から選ばれるいずれか１つ以上の領域でトランスバージョン突然変異（ｔｒａｎｓｖｅｒｓｉｏｎ ｍｕｔａｔｉｏｎ）が発生したものであってもよい。
本発明は、また、前記ガイドＲＮＡを含むがんの診断または予後予測用組成物を提供することができる。
本発明の好ましい一実施形態によれば、前記がんは、肺がん、膵がん、大腸がん、胃がん、乳がん、腎がん、肝がん、血液がん、膀胱がんおよび子宮がんから成る群から選ばれるいずれか１つ以上のがんであってもよいが、ＥＧＦＲ、ＭＥＴ、ＫＲＡＳ、ＰＩＫ３ＣＡまたはＢＲＡＦ突然変異によって発生するがんであれば、制限なく該当することができる。
本発明は、また、前記組成物を含むがんの診断または予後予測用キットを提供することができる。
前記キットは、通常用いられる発現レベル解析方法に適した１種またはそれ以上の他の構成成分組成物、溶液または装置で構成されてもよい。例えば、タンパク質発現レベルを測定するためのキットは、抗体の免疫学的検出のために、基質、適当な緩衝溶液、発色酵素または蛍光物質で標識された二次抗体、発色基質などを含んでもよい。
本発明のキットは、評価対象体からサンプルを収得するためのサンプル抽出手段を含んでもよい。サンプル抽出手段は、針またはシリンジなどを含んでもよい。キットは、液体、気体または半固体であってもよい、抽出したサンプルを収容するためのサンプル収集容器を含んでもよい。キットは、使用指針をさらに含んでもよい。前記サンプルは、発がん突然変異遺伝子が存在したり、分泌できる任意の身体サンプルであってもよい。例えば、サンプルは、尿、便、毛髪、汗、唾液、体液、血液、細胞または組織であってもよい。身体サンプルにおいて発がん突然変異遺伝子の測定は、全体サンプルまたは加工されたサンプル上で行われ得る。
本発明は、また、患者の試料に請求項１のガイドＲＮＡを処理する段階を含むがんの診断または予後予測のための情報提供方法を提供することができる。
前記試料は、尿、便、毛髪、汗、唾液、体液、血液、細胞または組織であってもよい。
本発明のガイドＲＮＡを用いてＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを用いてがん突然変異を検出する場合、野生型無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）のみを切断し、発がん突然変異ＤＮＡを切断しないので、既存ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムのガイドＲＮＡを用いる場合に比べて、発がん突然変異ＤＮＡのみを選択的に増幅するのに効果的に用いられ得る。特に、本発明のガイドＲＮＡ（野生型ガイドＲＮＡ）とトランスバージョン突然変異ガイドＲＮＡ（ｔｒａｎｓｖｅｒｓｉｏｎ ｓｇＲＮＡ）を併用する場合、ｃｆ ＤＮＡのみを切断し、発がん突然変異ＤＮＡのみを選択的に増幅する効果が有意的に増加することができる。
［実施例１］
薬物耐性突然変異に対するガイドＲＮＡの製作
ＩＶＴ（Ｉｎ－ｖｉｔｒｏ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｃｌｅａｖａｇｅ）解析をテストするための選択された遺伝子の野生型および突然変異標的配列と、ガイドＲＮＡ配列を製作した。
薬物耐性突然変異に対するガイドＲＮＡの製作
ＩＶＴ（Ｉｎ－ｖｉｔｒｏ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｃｌｅａｖａｇｅ）解析をテストするための選択された遺伝子の野生型および突然変異標的配列と、ガイドＲＮＡ配列を製作した。
前記表１は、薬物耐性突然変異に対するガイドＲＮＡを示す。ＩＶＴ（Ｉｎ－ｖｉｔｒｏ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｃｌｅａｖａｇｅ）解析をテストするための選択された遺伝子の野生型および突然変異標的配列は、いずれも、ＩＶＴテストのためにＴ－ブラントクローニングベクターでサブクローニングし、野生型標的配列中の突然変異位置は、太字で強調表示し、当該ヌクレオチド突然変異は、赤色（小文字）で表示する。突然変異の「？」表示は、野生型ヌクレオチドでなく、任意のヌクレオチドを意味する。各標的に対する小さいガイドＲＮＡが設計され、ＰＡＭ配列は、青色（傾体）で表示する。Ｔｒａｎｓｖｅｒｓｉｏｎ突然変異は、緑色で表示する。ＩＶＴ解析を確認した後、サンプルをＰＣＲ増幅し、ＮＧＳを用いて解析した。
［実施例２］
野生型およびＫＲＡＳ突然変異（ｃ．３５Ｇ＞Ｃ）配列およびｓｇＲＮＡ活性結果を含むプラスミドを用いたｉｎ ｖｉｔｒｏ切断解析
野生型ＤＮＡを特異的に切断するために、ｓｇＲＮＡは、ＰＡＭ部位とともに２０個のヌクレオチドを標的とするように設計したが、ＫＲＡＳ突然変異（ＰＡＭ）の場合、発がん突然変異（ｃ．３５Ｇ＞Ｃ）により破壊した。Ｉｎ ｖｉｔｒｏ切断解析（ＩＶＴ）を用いてこの接近法をテストするために、標的配列をＴ－ブラントクローニングベクター（
野生型および突然変異ＫＲＡＳ配列）にサブクローニングし、ベクターの制限酵素でプラスミドを線状化した。線状化した生成物は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼおよび野生型配列特異的ｓｇＲＮＡで処理し、さらに切断した。野生型または突然変異ＤＮＡを０．８％ゲルで電気泳動した後、線状断片（切断しない）および切断断片（切断した）をサイズによって区分し、赤色矢印で表示した（図４ａおよび図４ｂ）。野生型で標的化したＤＮＡは、Ｃａｓ９／ｓｇＲＮＡにより完全に切断されるが、突然変異標的配列は、Ｃａｓ９およびｓｇＲＮＡにより切断されなかった。なぜなら、ＰＡＭ部位の突然変異と該突然変異対立遺伝子は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼにより認識されないからである。
野生型およびＫＲＡＳ突然変異（ｃ．３５Ｇ＞Ｃ）配列およびｓｇＲＮＡ活性結果を含むプラスミドを用いたｉｎ ｖｉｔｒｏ切断解析
野生型ＤＮＡを特異的に切断するために、ｓｇＲＮＡは、ＰＡＭ部位とともに２０個のヌクレオチドを標的とするように設計したが、ＫＲＡＳ突然変異（ＰＡＭ）の場合、発がん突然変異（ｃ．３５Ｇ＞Ｃ）により破壊した。Ｉｎ ｖｉｔｒｏ切断解析（ＩＶＴ）を用いてこの接近法をテストするために、標的配列をＴ－ブラントクローニングベクター（
野生型および突然変異ＫＲＡＳ配列）にサブクローニングし、ベクターの制限酵素でプラスミドを線状化した。線状化した生成物は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼおよび野生型配列特異的ｓｇＲＮＡで処理し、さらに切断した。野生型または突然変異ＤＮＡを０．８％ゲルで電気泳動した後、線状断片（切断しない）および切断断片（切断した）をサイズによって区分し、赤色矢印で表示した（図４ａおよび図４ｂ）。野生型で標的化したＤＮＡは、Ｃａｓ９／ｓｇＲＮＡにより完全に切断されるが、突然変異標的配列は、Ｃａｓ９およびｓｇＲＮＡにより切断されなかった。なぜなら、ＰＡＭ部位の突然変異と該突然変異対立遺伝子は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼにより認識されないからである。
［実施例３］
発がん遺伝子の野生型または突然変異配列を含むプラスミドを用いたｉｎ ｖｉｔｒｏ切断解析およびＣａｓ９変異体を用いたｓｇＲＮＡ活性解析
野生型標的ＤＮＡを特異的に切断するために、ｓｇＲＮＡは、ＰＡＭ部位を有す目２０個のヌクレオチドの配列を標的化するように設計したが、ＥＧＦＲ突然変異（ｃ．２３６９Ｃ＞Ｔまたはｐ．Ｔ７９０Ｍ）の場合、標的突然変異位置は、ｓｇＲＮＡ結合部位のトランク（ｔｒｕｎｋ）領域内で発見される。ｓｇＲＮＡ結合部位のスペーサーのトランク領域（１２－１９）内で１塩基ミスマッチ（ｍｉｓｍａｔｃｈ）、Ｃａｓ９切断活性は、若干または中間レベルに減少するが、切断活性は維持する。ｓｇＲＮＡを標的とする野生型のこのような活性は、また、無細胞ＤＮＡで突然変異標的対立遺伝子を切断することができる。この問題を克服し、突然変異標的対立遺伝子の切断を避けるために、ｓｇＲＮＡ（ＴｍＷＴ ｓｇＲＮＡ）のトランク領域にトランスバージョン突然変異（ｔｒａｎｓｖｅｒｓｉｏｎ ｍｕｔａｔｉｏｎ）を生成した。このＴｍＷＴ－ｓｇＲＮＡは、２つの突然変異に対する低耐性に起因して、突然変異対立遺伝子においてＣａｓ９ヌクレアーゼにより認識されたり切断されたりしない。Ｉｎ ｖｉｔｒｏ切断解析を用いてこの接近法をテストするために、標的配列をＴ－ブラントクローニングベクター（野生型および突然変異ＥＧＦＲ配列）にサブクローニングし、ベクターの制限酵素でプラスミドを線状化した。線状化した生成物は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ変異体と野生型配列特異的ｓｇＲＮＡ（ＷＴ ｓｇＲＮＡ）およびトランスバージョン突然変異ｓｇＲＮＡ（ＴｍＷＴ ｓｇＲＮＡ）の異なる組み合わせで処理し、さらに切断した。野生型または突然変異ＤＮＡを０．８％ゲルで電気泳動した後、線状断片（切断しない）および切断断片（切断した）をサイズによって区分し、赤色矢印で表示した。野生型で標的化したＤＮＡは、ＷＴ－ｓｇＲＮＡでＣａｓ９変異体により完全に切断され、さらには、突然変異標的配列においてもＣａｓ９およびＷＴ－ｓｇＲＮＡにより完全に切断された。しかしながら、トランスバージョン突然変異においてｓｇＲＮＡ（ＴｍＷＴ－ｓｇＲＮＡ）は、Ｃａｓ９変異体に対して互いに異なる切断パターンを示している。これは、ＴｍＷＴ－ｓｇＲＮＡが２つの突然変異に対して低耐性であり、突然変異標的対立遺伝子を完全に切断できないことを示す。
発がん遺伝子の野生型または突然変異配列を含むプラスミドを用いたｉｎ ｖｉｔｒｏ切断解析およびＣａｓ９変異体を用いたｓｇＲＮＡ活性解析
野生型標的ＤＮＡを特異的に切断するために、ｓｇＲＮＡは、ＰＡＭ部位を有す目２０個のヌクレオチドの配列を標的化するように設計したが、ＥＧＦＲ突然変異（ｃ．２３６９Ｃ＞Ｔまたはｐ．Ｔ７９０Ｍ）の場合、標的突然変異位置は、ｓｇＲＮＡ結合部位のトランク（ｔｒｕｎｋ）領域内で発見される。ｓｇＲＮＡ結合部位のスペーサーのトランク領域（１２－１９）内で１塩基ミスマッチ（ｍｉｓｍａｔｃｈ）、Ｃａｓ９切断活性は、若干または中間レベルに減少するが、切断活性は維持する。ｓｇＲＮＡを標的とする野生型のこのような活性は、また、無細胞ＤＮＡで突然変異標的対立遺伝子を切断することができる。この問題を克服し、突然変異標的対立遺伝子の切断を避けるために、ｓｇＲＮＡ（ＴｍＷＴ ｓｇＲＮＡ）のトランク領域にトランスバージョン突然変異（ｔｒａｎｓｖｅｒｓｉｏｎ ｍｕｔａｔｉｏｎ）を生成した。このＴｍＷＴ－ｓｇＲＮＡは、２つの突然変異に対する低耐性に起因して、突然変異対立遺伝子においてＣａｓ９ヌクレアーゼにより認識されたり切断されたりしない。Ｉｎ ｖｉｔｒｏ切断解析を用いてこの接近法をテストするために、標的配列をＴ－ブラントクローニングベクター（野生型および突然変異ＥＧＦＲ配列）にサブクローニングし、ベクターの制限酵素でプラスミドを線状化した。線状化した生成物は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ変異体と野生型配列特異的ｓｇＲＮＡ（ＷＴ ｓｇＲＮＡ）およびトランスバージョン突然変異ｓｇＲＮＡ（ＴｍＷＴ ｓｇＲＮＡ）の異なる組み合わせで処理し、さらに切断した。野生型または突然変異ＤＮＡを０．８％ゲルで電気泳動した後、線状断片（切断しない）および切断断片（切断した）をサイズによって区分し、赤色矢印で表示した。野生型で標的化したＤＮＡは、ＷＴ－ｓｇＲＮＡでＣａｓ９変異体により完全に切断され、さらには、突然変異標的配列においてもＣａｓ９およびＷＴ－ｓｇＲＮＡにより完全に切断された。しかしながら、トランスバージョン突然変異においてｓｇＲＮＡ（ＴｍＷＴ－ｓｇＲＮＡ）は、Ｃａｓ９変異体に対して互いに異なる切断パターンを示している。これは、ＴｍＷＴ－ｓｇＲＮＡが２つの突然変異に対して低耐性であり、突然変異標的対立遺伝子を完全に切断できないことを示す。
前記戦略をベースに野生型標的対立遺伝子を切断し除去し、ｃｆＤＮＡにおいて突然変異対立遺伝子（ＥＧＦＲ突然変異（ｃ．２３６９Ｃ＞Ｔまたはｐ．Ｔ７９０Ｍ；ｃ．２５７３ Ｔ＞Ｇまたはｐ．Ｌ８５８Ｒ；ｐ．Ｃ７９７Ｓ、Ｌ７１８Ｑまたはｐ．（７２９＿７６１）欠失）、ＭＥＴ突然変異（ｃ．２８８８、ｃ．３０２８または’ＴＡＣ’Ｙ１００３Ｘ）、ＢＲＡＦ突然変異（ｐ．Ｖ６００Ｅまたはｃ．１７９９Ｔ＞Ａ）またはＰＩＫ３ＣＡ突然変異（ｃ．１６２４Ｇ＞Ａまたはｐ．Ｅ５４２Ｋ；ｐ．Ｈ１０４７？またはｃ．３１４０Ａ＞？））を豊富にすることができた（図５～図１１）。ＥＧＦＲ ｐ．７２９－７６１欠失およびＭＥＴ遺伝子突然変異の場合、突然変異位置がｓｅｅｄ領域にあるので、Ｔｒａｎｓｖｅｒｓｉｏｎ突然変異ｓｇＲＮＡを設計しなかった。
［実施例４］
様々な割合の野生型および突然変異プラスミド混合物を用いたＥＧＦＲ突然変異のＣＵＴ－ＰＣＲベースのエンリッチメント解析
前記［実施例３］と同じ方法で様々なターゲット配列およびガイドＲＮＡを用いて解析した。野生型または突然変異ＥＧＦＲ（ｃ．２３６９Ｃ＞Ｔまたはｐ．Ｔ７９０Ｍ）配列を含む様々な割合のプラスミド混合物に対するＣＵＴ－ＰＣＲ実験を行った。野生型および突然変異配列を含むＤＮＡプラスミドを様々な割合で混合し、試験管内でＣａｓ９変異体切断を実施した。プラスミド混合物をＣａｓ９変異体とともに、Ｔｒａｎｓｖｅｒｓｉｏｎ突然変異ｓｇＲＮＡ（ＴｍＷＴ－ｓｇＲＮＡ）で処理し、野生型ＤＮＡを切断した。処理後、ＰＣＲ ｃｌｅａｎｕｐ ｋｉｔを用いて試料を精製した。標的特異的切断を定量化するために、標的配列の倍数増加と、処理しない対照群製品の倍数増加とを比較した。各レーンで処理しない対照群製品に対するＥＧＦＲ標的領域の量は、ＮＧＳ解析により計算した。ＥＧＦＲ（ｃ．２３６９Ｃ＞Ｔまたはｐ．Ｔ７９０Ｍ）突然変異の場合、突然変異プラスミドが存在するプラスミド混合物に対してＣＵＴ－ＰＣＲを処理した後（橙色またはピンク色棒）またはしない（紫色または青色棒）標的化した深いシーケンシングを行った。元々０．５～５％の割合で野生型プラスミドと混合した。生成されたＰＣＲアムプリコンは、ＭｉＳｅｑでペアードエンドシーケンシングに適用した。ＮＧＳ結果は、Ｃａｓ９およびｅＣａｓ９変異体の両方で突然変異ＤＮＡ断片のすべての混合割合に対する野生型および突然変異配列の倍数変化をＴｍＷＴ－ｓｇＲＮＡと比較して解析した。
様々な割合の野生型および突然変異プラスミド混合物を用いたＥＧＦＲ突然変異のＣＵＴ－ＰＣＲベースのエンリッチメント解析
前記［実施例３］と同じ方法で様々なターゲット配列およびガイドＲＮＡを用いて解析した。野生型または突然変異ＥＧＦＲ（ｃ．２３６９Ｃ＞Ｔまたはｐ．Ｔ７９０Ｍ）配列を含む様々な割合のプラスミド混合物に対するＣＵＴ－ＰＣＲ実験を行った。野生型および突然変異配列を含むＤＮＡプラスミドを様々な割合で混合し、試験管内でＣａｓ９変異体切断を実施した。プラスミド混合物をＣａｓ９変異体とともに、Ｔｒａｎｓｖｅｒｓｉｏｎ突然変異ｓｇＲＮＡ（ＴｍＷＴ－ｓｇＲＮＡ）で処理し、野生型ＤＮＡを切断した。処理後、ＰＣＲ ｃｌｅａｎｕｐ ｋｉｔを用いて試料を精製した。標的特異的切断を定量化するために、標的配列の倍数増加と、処理しない対照群製品の倍数増加とを比較した。各レーンで処理しない対照群製品に対するＥＧＦＲ標的領域の量は、ＮＧＳ解析により計算した。ＥＧＦＲ（ｃ．２３６９Ｃ＞Ｔまたはｐ．Ｔ７９０Ｍ）突然変異の場合、突然変異プラスミドが存在するプラスミド混合物に対してＣＵＴ－ＰＣＲを処理した後（橙色またはピンク色棒）またはしない（紫色または青色棒）標的化した深いシーケンシングを行った。元々０．５～５％の割合で野生型プラスミドと混合した。生成されたＰＣＲアムプリコンは、ＭｉＳｅｑでペアードエンドシーケンシングに適用した。ＮＧＳ結果は、Ｃａｓ９およびｅＣａｓ９変異体の両方で突然変異ＤＮＡ断片のすべての混合割合に対する野生型および突然変異配列の倍数変化をＴｍＷＴ－ｓｇＲＮＡと比較して解析した。
突然変異配列は、４．８～５．４倍に豊富であった（図１０、図１１）。
［実施例５］
様々な割合の野生型および突然変異プラスミド混合物を用いた多重遺伝子突然変異のＣＵＴ－ＰＣＲベースのエンリッチメント解析
前記［実施例３］と同じ方法で様々なターゲット配列およびガイドＲＮＡを用いて解析した。ＫＲＡＳ（ｃ．３５ Ｇ＞Ｃ）およびＥＧＦＲ（ｃ．２３６９ Ｃ＞Ｔ、ｃ．２３９０ Ｇ＞Ｃおよびｃ．２１５３ Ｔ＞Ａ）の野生型または突然変異配列を含む様々な割合のプラスミド混合物に対するＣＵＴ－ＰＣＲ実験を行った。多重遺伝子突然変異の野生型および突然変異配列を含むＤＮＡプラスミドを様々な割合で混合し、試験管内でＣａｓ９変異体切断を行った。プラスミド混合物は、野生型ＤＮＡを切断するために、Ｃａｓ９変異体を有する各遺伝子に該当する混合ｓｇＲＮＡで処理した。処理後、ＰＣＲ ｃｌｅａｎｕｐ ｋｉｔを用いて試料を精製した。多重標的特異的切断を定量化するために、標的配列の倍数増加と、処理しない対照群製品の倍数増加とを比較した。各レーンで処理しない対照群製品に対する各標的領域の量は、ＮＧＳ解析により計算した。ＮＧＳ結果は、Ｃａｓ９およびｅＣａｓ９変異体の両方で突然変異ＤＮＡ断片のすべての混合割合に対する野生型および突然変異配列百分率を多重ｓｇＲＮＡと比較して解析した。
様々な割合の野生型および突然変異プラスミド混合物を用いた多重遺伝子突然変異のＣＵＴ－ＰＣＲベースのエンリッチメント解析
前記［実施例３］と同じ方法で様々なターゲット配列およびガイドＲＮＡを用いて解析した。ＫＲＡＳ（ｃ．３５ Ｇ＞Ｃ）およびＥＧＦＲ（ｃ．２３６９ Ｃ＞Ｔ、ｃ．２３９０ Ｇ＞Ｃおよびｃ．２１５３ Ｔ＞Ａ）の野生型または突然変異配列を含む様々な割合のプラスミド混合物に対するＣＵＴ－ＰＣＲ実験を行った。多重遺伝子突然変異の野生型および突然変異配列を含むＤＮＡプラスミドを様々な割合で混合し、試験管内でＣａｓ９変異体切断を行った。プラスミド混合物は、野生型ＤＮＡを切断するために、Ｃａｓ９変異体を有する各遺伝子に該当する混合ｓｇＲＮＡで処理した。処理後、ＰＣＲ ｃｌｅａｎｕｐ ｋｉｔを用いて試料を精製した。多重標的特異的切断を定量化するために、標的配列の倍数増加と、処理しない対照群製品の倍数増加とを比較した。各レーンで処理しない対照群製品に対する各標的領域の量は、ＮＧＳ解析により計算した。ＮＧＳ結果は、Ｃａｓ９およびｅＣａｓ９変異体の両方で突然変異ＤＮＡ断片のすべての混合割合に対する野生型および突然変異配列百分率を多重ｓｇＲＮＡと比較して解析した。
突然変異配列は、０．６～４６．５％の範囲に豊富であった（図１２～図１５）。
［実施例６］
ｃｆＤＮＡ参照標準セットを用いた多重突然変異のＣＵＴ－ＰＣＲベースの強化
ｓｇＲＮＡ活性およびｃｆＤＮＡで突然変異対立遺伝子を強化するための実験方法を確認したり証明するために、市販の多重ｃｆＤＮＡサンプルを参照標準に活用し、３個のｓｇＲＮＡの活性を確認した。前記多重ｃｆＤＮＡ標準サンプルは、８個の異なる突然変異を有する４個の遺伝子を含み、各遺伝子の３つの割合を含む（図１６）。
ｃｆＤＮＡ参照標準セットを用いた多重突然変異のＣＵＴ－ＰＣＲベースの強化
ｓｇＲＮＡ活性およびｃｆＤＮＡで突然変異対立遺伝子を強化するための実験方法を確認したり証明するために、市販の多重ｃｆＤＮＡサンプルを参照標準に活用し、３個のｓｇＲＮＡの活性を確認した。前記多重ｃｆＤＮＡ標準サンプルは、８個の異なる突然変異を有する４個の遺伝子を含み、各遺伝子の３つの割合を含む（図１６）。
ｓｇＲＮＡ活性およびｃｆＤＮＡにおいて突然変異対立遺伝子を豊富にする実験方法を確認したり証明した。参照標準混合物は、野生型ＤＮＡを切断するために、ＳｐＣａｓ９で各遺伝子に相当するｓｇＲＮＡで処理した。処理後、ＰＣＲ ｃｌｅａｎｕｐ ｋｉｔを用いて試料を精製した。多重標的特異的切断を定量化するために、各標的配列の百分率と、処理しない対照群製品の百分率とを比較した。各レーンで処理しない対照群製品に対する各標的領域の量は、ＮＧＳ解析により計算した。ＮＧＳ結果は、ＳｐＣａｓ９および
ｍｕｌｔｉ－ｓｇＲＮＡと異なる割合でｃｆＤＮＡのすべての混合割合に対する未処理および処理したサンプル割合を比較して解析し、突然変異配列は、１．４４～９．３９％の範囲に豊富であった（図１７）。
ｍｕｌｔｉ－ｓｇＲＮＡと異なる割合でｃｆＤＮＡのすべての混合割合に対する未処理および処理したサンプル割合を比較して解析し、突然変異配列は、１．４４～９．３９％の範囲に豊富であった（図１７）。
また、混合したｓｇＲＮＡをＫＲＡＳ、ＥＧＦＲ－Ｔ７９０ＭまたはＥＧＦＲ ７２９－７６１ｂｐ ｄｅｌｅｔｉｏｎサンプルに処理した後、Ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｃｌｅａｖａｇｅ ａｓｓａｙを行った結果を下記［表２］に示した。
［実施例７］
患者サンプルの無細胞ＤＮＡにおいて突然変異標的の超感度の検出
突然変異を保有する肺がん患者の血液内で本願発明のガイドＲＮＡを用いて無細胞ＤＮＡ内突然変異ターゲットを検出しようとした（図１８）。
患者サンプルの無細胞ＤＮＡにおいて突然変異標的の超感度の検出
突然変異を保有する肺がん患者の血液内で本願発明のガイドＲＮＡを用いて無細胞ＤＮＡ内突然変異ターゲットを検出しようとした（図１８）。
下記表３は、Ｌ８５８Ｒ突然変異を保有する患者サンプルを、表４は、Ｔ７９０ＭおよびＥ１９ｄｅｌ突然変異を保有する患者サンプルを示す。
前記［実施例３］と同じ方法で様々なターゲット配列およびガイドＲＮＡを用いて解析した。ＮＧＳ結果は、患者ｃｆＤＮＡそれぞれに対する処理しないサンプル割合と、ＳｐＣａｓ９および該当ｓｇＲＮＡとを比較して解析し、突然変異シーケンスは、豊富に検出された（図１９～図２５）。
本発明のガイドＲＮＡを用いてＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを用いてがん突然変異を検出する場合、野生型無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）のみを切断し、発がん突然変異ＤＮＡを切断しないので、既存ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムのガイドＲＮＡを用いる場合に比べて、発がん突然変異ＤＮＡのみを選択的に増幅するのに効果的に用いられ得る。特に、本発明のガイドＲＮＡ（野生型ガイドＲＮＡ）とトランスバージョン突然変異ガイドＲＮＡ（ｔｒａｎｓｖｅｒｓｉｏｎ ｓｇＲＮＡ）を併用する場合、ｃｆＤＮＡのみを切断し、発がん突然変異ＤＮＡのみを選択的に増幅する効果が有意的に増加することができ、産業上の利用可能性がある。
［配列の説明］
配列番号１は、ＥＧＦＲ（ｐ．Ｔ７９０Ｍまたはｃ．２３６９Ｃ＞Ｔ）突然変異を検出できる野生型ガイドＲＮＡ（ｗｉｌｄ ｓｇＲＮＡ）であって、ｉｎ ｖｉｔｒｏ切断解析に用いられる場合、配列番号１８をターゲット配列とすることができる。
配列番号２は、ＥＧＦＲ（ｐ．Ｔ７９０Ｍまたはｃ．２３９０ Ｇ＞Ｃ）突然変異を検出できるトランスバージョン突然変異ガイドＲＮＡ（ｔｒａｎｓｖｅｒｓｉｏｎ ｓｇＲＮＡ）であって、ｉｎ ｖｉｔｒｏ切断解析に用いられる場合、配列番号１９をターゲット配列とすることができる。配列番号２のヌクレオチド配列を含むガイドＲＮＡを用いる場合、１％～３２％で突然変異配列を増幅させることができる。
配列番号３は、ＥＧＦＲ（ｐ．Ｃ７９７Ｓ）突然変異を検出できる野生型ガイドＲＮＡ（ｗｉｌｄ ｓｇＲＮＡ）であって、ｉｎ ｖｉｔｒｏ切断解析に用いられる場合、配列番号２０をターゲット配列とすることができる。
配列番号４は、ＥＧＦＲ（ｐ．Ｃ７９７Ｓ）突然変異を検出できるトランスバージョン突然変異ガイドＲＮＡ（ｔｒａｎｓｖｅｒｓｉｏｎ ｓｇＲＮＡ）であって、ｉｎ ｖｉｔｒｏ切断解析に用いられる場合、配列番号２１をターゲット配列とすることができる。配列番号４のヌクレオチド配列を含むガイドＲＮＡを用いる場合、１％～１３％で突然変異配列を増幅させることができる。
配列番号５は、ＭＥＴ ｃ．２８８８ Ｉｎｔ１３－Ｅｘｏｎ１４ Ａｃｃｅｐｔｏｒ（Ｅｘｏｎ－１４ Ｓｋｉｐｐｉｎｇ）突然変異を検出できる野生型ガイドＲＮＡ（ｗｉｌｄ ｓｇＲＮＡ）であって、ｉｎ ｖｉｔｒｏ切断解析に用いられる場合、配列番号２２または２３をターゲット配列とすることができる。
配列番号６は、ＭＥＴ ｃ．３０２８ Ｅｘｏｎ１４－Ｉｎｔ１４ Ｄｏｎｏｒ（Ｅｘｏｎ－１４ Ｓｋｉｐｐｉｎｇ）突然変異を検出できる野生型ガイドＲＮＡ（ｗｉｌｄ ｓｇＲＮＡ）であって、ｉｎ ｖｉｔｒｏ切断解析に用いられる場合、配列番号２４または２５をターゲット配列とすることができる。
配列番号７は、ＭＥＴ ’ＴＡＣ’ Ｙ１００３Ｘ（Ｅｘｏｎ－１４ Ｓｋｉｐｐｉｎｇ）突然変異を検出できる野生型ガイドＲＮＡ（ｗｉｌｄ ｓｇＲＮＡ）であって、ｉｎ
ｖｉｔｒｏ切断解析に用いられる場合、配列番号２６または２７をターゲット配列とすることができる。
配列番号８は、ＥＧＦＲ（Ｌ７１８Ｑまたはｃ．２１５３ Ｔ＞Ａ）突然変異を検出できる野生型ガイドＲＮＡ（ｗｉｌｄ ｓｇＲＮＡ）であって、ｉｎ ｖｉｔｒｏ切断解析に用いられる場合、配列番号２８をターゲット配列とすることができる。
配列番号９は、ＥＧＦＲ（Ｌ７１８Ｑ）突然変異を検出できるトランスバージョン突然変異ガイドＲＮＡ（ｔｒａｎｓｖｅｒｓｉｏｎ ｓｇＲＮＡ）であって、ｉｎ ｖｉｔｒ
ｏ切断解析に用いられる場合、配列番号２９をターゲット配列とすることができる。配列番号９のヌクレオチド配列を含むガイドＲＮＡを用いる場合、０．８％～２３．７％で突然変異配列を増幅させることができる。
配列番号１０は、ＫＲＡＳ（ｃ．３５Ｇ）突然変異を検出できる野生型ガイドＲＮＡ（ｗｉｌｄ ｓｇＲＮＡ）であって、ｉｎ ｖｉｔｒｏ切断解析に用いられる場合、配列番号３０または３１をターゲット配列とすることができる。配列番号１０のヌクレオチド配列を含むガイドＲＮＡを用いる場合、１．５％～５０％で突然変異配列を増幅させることができる。
配列番号１１は、ＥＧＦＲ、１５ｂｐ Ｄｅｌ ｐ．（７２９＿７６１）突然変異を検出できる野生型ガイドＲＮＡ（ｗｉｌｄ ｓｇＲＮＡ）であって、ｉｎ ｖｉｔｒｏ切断解析に用いられる場合、配列番号３２または３３をターゲット配列とすることができる。配列番号１１のヌクレオチド配列を含むガイドＲＮＡを用いる場合、０．５％～２３％で突然変異配列を増幅させることができる。
配列番号１２は、ＥＧＦＲ（ｐ．Ｌ８５８Ｒまたはｃ．２５７３ Ｔ＞Ｇ）突然変異を検出できる野生型ガイドＲＮＡ（ｗｉｌｄ ｓｇＲＮＡ）であって、ｉｎ ｖｉｔｒｏ切断解析に用いられる場合、配列番号３４をターゲット配列とすることができる。
配列番号１３は、ＥＧＦＲ（ｐ．Ｌ８５８Ｒ）突然変異を検出できるトランスバージョン突然変異ガイドＲＮＡ（ｔｒａｎｓｖｅｒｓｉｏｎ ｓｇＲＮＡ）であって、ｉｎ ｖｉｔｒｏ切断解析に用いられる場合、配列番号３５をターゲット配列とすることができる。配列番号１３のヌクレオチド配列を含むガイドＲＮＡを用いる場合、１．７％～６３％で突然変異配列を増幅させることができる。
配列番号１４は、ＰＩＫ３ＣＡ（ｐ．Ｅ５４２Ｋまたはｃ．１６２４Ｇ＞Ａ）突然変異を検出できる野生型ガイドＲＮＡ（ｗｉｌｄ ｓｇＲＮＡ）であって、ｉｎ ｖｉｔｒｏ切断解析に用いられる場合、配列番号３６または３７をターゲット配列とすることができる。
配列番号１５は、ＰＩＫ３ＣＡ（ｐ．Ｅ５４５？またはｃ．１６３３Ｇ＞？）突然変異を検出できる野生型ガイドＲＮＡ（ｗｉｌｄ ｓｇＲＮＡ）であって、ｉｎ ｖｉｔｒｏ切断解析に用いられる場合、配列番号３８または３９をターゲット配列とすることができる。
配列番号１６は、ＰＩＫ３ＣＡ（ｐ．Ｈ１０４７？またはｃ．３１４０Ａ＞？）突然変異を検出できる野生型ガイドＲＮＡ（ｗｉｌｄ ｓｇＲＮＡ）であって、ｉｎ ｖｉｔｒｏ切断解析に用いられる場合、配列番号４０または４１をターゲット配列とすることができる。
配列番号１７は、ＰＩＫ３ＣＡ（ｐ．Ｖ６００Ｅまたはｃ．１７９９Ｔ＞Ａ）突然変異を検出できる野生型ガイドＲＮＡ（ｗｉｌｄ ｓｇＲＮＡ）であって、ｉｎ ｖｉｔｒｏ切断解析に用いられる場合、配列番号４２または４３をターゲット配列とすることができる。
配列番号１８は、ＥＧＦＲ（ｐ．Ｔ７９０Ｍまたはｃ．２３６９Ｃ＞Ｔ）突然変異を検出できる配列番号１の野生型ガイドＲＮＡ（ｗｉｌｄ ｓｇＲＮＡ）のターゲット配列を示す。
配列番号１９は、ＥＧＦＲ（ｐ．Ｔ７９０Ｍまたはｃ．２３９０ Ｇ＞Ｃ）突然変異を検出できる配列番号２のトランスバージョン突然変異ガイドＲＮＡ（ｔｒａｎｓｖｅｒｓｉｏｎ ｓｇＲＮＡ）のターゲット配列を示す。
配列番号２０は、ＥＧＦＲ（ｐ．Ｃ７９７Ｓ）突然変異を検出できる配列番号３の野生型ガイドＲＮＡ（ｗｉｌｄ ｓｇＲＮＡ）のターゲット配列を示す。
配列番号２１は、ＥＧＦＲ（ｐ．Ｃ７９７Ｓ）突然変異を検出できる配列番号４のトランスバージョン突然変異ガイドＲＮＡ（ｔｒａｎｓｖｅｒｓｉｏｎ ｓｇＲＮＡ）のターゲット配列を示す。
配列番号２２は、ＭＥＴ ｃ．２８８８ Ｉｎｔ１３－Ｅｘｏｎ１４ Ａｃｃｅｐｔｏｒ（Ｅｘｏｎ－１４ Ｓｋｉｐｐｉｎｇ）突然変異を検出できる配列番号５の野生型ガイ
ドＲＮＡ（ｗｉｌｄ ｓｇＲＮＡ）のターゲット配列を示す。
配列番号２３は、ＭＥＴ ｃ．２８８８ Ｉｎｔ１３－Ｅｘｏｎ１４ Ａｃｃｅｐｔｏｒ（Ｅｘｏｎ－１４ Ｓｋｉｐｐｉｎｇ）突然変異を検出できる配列番号５の野生型ガイドＲＮＡ（ｗｉｌｄ ｓｇＲＮＡ）のターゲット配列を示す。
配列番号２４は、ＭＥＴ ｃ．３０２８ Ｅｘｏｎ１４－Ｉｎｔ１４ Ｄｏｎｏｒ（Ｅｘｏｎ－１４ Ｓｋｉｐｐｉｎｇ）突然変異を検出できる配列番号６の野生型ガイドＲＮＡ（ｗｉｌｄ ｓｇＲＮＡ）のターゲット配列を示す。
配列番号２５は、ＭＥＴ ｃ．３０２８ Ｅｘｏｎ１４－Ｉｎｔ１４ Ｄｏｎｏｒ（Ｅｘｏｎ－１４ Ｓｋｉｐｐｉｎｇ）突然変異を検出できる配列番号６の野生型ガイドＲＮＡ（ｗｉｌｄ ｓｇＲＮＡ）のターゲット配列を示す。
配列番号２６は、ＭＥＴ ’ＴＡＣ’ Ｙ１００３Ｘ（Ｅｘｏｎ－１４ Ｓｋｉｐｐｉｎｇ）突然変異を検出できる配列番号７の野生型ガイドＲＮＡ（ｗｉｌｄ ｓｇＲＮＡ）のターゲット配列を示す。
配列番号２７は、ＭＥＴ ’ＴＡＣ’ Ｙ１００３Ｘ（Ｅｘｏｎ－１４ Ｓｋｉｐｐｉｎｇ）突然変異を検出できる配列番号７の野生型ガイドＲＮＡ（ｗｉｌｄ ｓｇＲＮＡ）のターゲット配列を示す。
配列番号２８は、ＥＧＦＲ（Ｌ７１８Ｑまたはｃ．２１５３ Ｔ＞Ａ）突然変異を検出できる配列番号８の野生型ガイドＲＮＡ（ｗｉｌｄ ｓｇＲＮＡ）のターゲット配列を示す。
配列番号２９は、ＥＧＦＲ（Ｌ７１８Ｑ）突然変異を検出できる配列番号９のトランスバージョン突然変異ガイドＲＮＡ（ｔｒａｎｓｖｅｒｓｉｏｎ ｓｇＲＮＡ）のターゲット配列を示す。
配列番号３０は、ＫＲＡＳ（ｃ．３５Ｇ）突然変異を検出できる配列番号１０の野生型ガイドＲＮＡ（ｗｉｌｄ ｓｇＲＮＡ）のターゲット配列を示す。
配列番号３１は、ＫＲＡＳ（ｃ．３５Ｇ）突然変異を検出できる配列番号１０の野生型ガイドＲＮＡ（ｗｉｌｄ ｓｇＲＮＡ）のターゲット配列を示す。
配列番号３２は、ＥＧＦＲ、１５ｂｐ Ｄｅｌ ｐ．（７２９＿７６１）突然変異を検出できる配列番号１１の野生型ガイドＲＮＡ（ｗｉｌｄ ｓｇＲＮＡ）のターゲット配列を示す。
配列番号３３は、ＥＧＦＲ、１５ｂｐ Ｄｅｌ ｐ．（７２９＿７６１）突然変異を検出できる配列番号１１の野生型ガイドＲＮＡ（ｗｉｌｄ ｓｇＲＮＡ）のターゲット配列を示す。
配列番号３４は、ＥＧＦＲ（ｐ．Ｌ８５８Ｒまたはｃ．２５７３ Ｔ＞Ｇ）突然変異を検出できる配列番号１２の野生型ガイドＲＮＡ（ｗｉｌｄ ｓｇＲＮＡ）のターゲット配列を示す。
配列番号３５は、ＥＧＦＲ（ｐ．Ｌ８５８Ｒ）突然変異を検出できる配列番号１３のトランスバージョン突然変異ガイドＲＮＡ（ｔｒａｎｓｖｅｒｓｉｏｎ ｓｇＲＮＡ）のターゲット配列を示す。
配列番号３６は、ＰＩＫ３ＣＡ（ｐ．Ｅ５４２Ｋまたはｃ．１６２４Ｇ＞Ａ）突然変異を検出できる配列番号１４の野生型ガイドＲＮＡ（ｗｉｌｄ ｓｇＲＮＡ）のターゲット配列を示す。
配列番号３７は、ＰＩＫ３ＣＡ（ｐ．Ｅ５４２Ｋまたはｃ．１６２４Ｇ＞Ａ）突然変異を検出できる配列番号１４の野生型ガイドＲＮＡ（ｗｉｌｄ ｓｇＲＮＡ）のターゲット配列を示す。
配列番号３８は、ＰＩＫ３ＣＡ（ｐ．Ｅ５４５？またはｃ．１６３３Ｇ＞？）突然変異を検出できる配列番号１５の野生型ガイドＲＮＡ（ｗｉｌｄ ｓｇＲＮＡ）のターゲット配列を示す。
配列番号３９は、ＰＩＫ３ＣＡ（ｐ．Ｅ５４５？またはｃ．１６３３Ｇ＞？）突然変異を検出できる配列番号１５の野生型ガイドＲＮＡ（ｗｉｌｄ ｓｇＲＮＡ）のターゲット配列を示す。
配列番号４０は、ＰＩＫ３ＣＡ（ｐ．Ｈ１０４７？またはｃ．３１４０Ａ＞？）突然変異を検出できる配列番号１６の野生型ガイドＲＮＡ（ｗｉｌｄ ｓｇＲＮＡ）のターゲット配列を示す。
配列番号４１は、ＰＩＫ３ＣＡ（ｐ．Ｈ１０４７？またはｃ．３１４０Ａ＞？）突然変異を検出できる配列番号１６の野生型ガイドＲＮＡ（ｗｉｌｄ ｓｇＲＮＡ）のターゲット配列を示す。
配列番号４２は、ＰＩＫ３ＣＡ（ｐ．Ｖ６００Ｅまたはｃ．１７９９Ｔ＞Ａ）突然変異を検出できる配列番号１７の野生型ガイドＲＮＡ（ｗｉｌｄ ｓｇＲＮＡ）のターゲット配列を示す。
配列番号４３は、ＰＩＫ３ＣＡ（ｐ．Ｖ６００Ｅまたはｃ．１７９９Ｔ＞Ａ）突然変異を検出できる配列番号１７の野生型ガイドＲＮＡ（ｗｉｌｄ ｓｇＲＮＡ）のターゲット配列を示す。
配列番号１は、ＥＧＦＲ（ｐ．Ｔ７９０Ｍまたはｃ．２３６９Ｃ＞Ｔ）突然変異を検出できる野生型ガイドＲＮＡ（ｗｉｌｄ ｓｇＲＮＡ）であって、ｉｎ ｖｉｔｒｏ切断解析に用いられる場合、配列番号１８をターゲット配列とすることができる。
配列番号２は、ＥＧＦＲ（ｐ．Ｔ７９０Ｍまたはｃ．２３９０ Ｇ＞Ｃ）突然変異を検出できるトランスバージョン突然変異ガイドＲＮＡ（ｔｒａｎｓｖｅｒｓｉｏｎ ｓｇＲＮＡ）であって、ｉｎ ｖｉｔｒｏ切断解析に用いられる場合、配列番号１９をターゲット配列とすることができる。配列番号２のヌクレオチド配列を含むガイドＲＮＡを用いる場合、１％～３２％で突然変異配列を増幅させることができる。
配列番号３は、ＥＧＦＲ（ｐ．Ｃ７９７Ｓ）突然変異を検出できる野生型ガイドＲＮＡ（ｗｉｌｄ ｓｇＲＮＡ）であって、ｉｎ ｖｉｔｒｏ切断解析に用いられる場合、配列番号２０をターゲット配列とすることができる。
配列番号４は、ＥＧＦＲ（ｐ．Ｃ７９７Ｓ）突然変異を検出できるトランスバージョン突然変異ガイドＲＮＡ（ｔｒａｎｓｖｅｒｓｉｏｎ ｓｇＲＮＡ）であって、ｉｎ ｖｉｔｒｏ切断解析に用いられる場合、配列番号２１をターゲット配列とすることができる。配列番号４のヌクレオチド配列を含むガイドＲＮＡを用いる場合、１％～１３％で突然変異配列を増幅させることができる。
配列番号５は、ＭＥＴ ｃ．２８８８ Ｉｎｔ１３－Ｅｘｏｎ１４ Ａｃｃｅｐｔｏｒ（Ｅｘｏｎ－１４ Ｓｋｉｐｐｉｎｇ）突然変異を検出できる野生型ガイドＲＮＡ（ｗｉｌｄ ｓｇＲＮＡ）であって、ｉｎ ｖｉｔｒｏ切断解析に用いられる場合、配列番号２２または２３をターゲット配列とすることができる。
配列番号６は、ＭＥＴ ｃ．３０２８ Ｅｘｏｎ１４－Ｉｎｔ１４ Ｄｏｎｏｒ（Ｅｘｏｎ－１４ Ｓｋｉｐｐｉｎｇ）突然変異を検出できる野生型ガイドＲＮＡ（ｗｉｌｄ ｓｇＲＮＡ）であって、ｉｎ ｖｉｔｒｏ切断解析に用いられる場合、配列番号２４または２５をターゲット配列とすることができる。
配列番号７は、ＭＥＴ ’ＴＡＣ’ Ｙ１００３Ｘ（Ｅｘｏｎ－１４ Ｓｋｉｐｐｉｎｇ）突然変異を検出できる野生型ガイドＲＮＡ（ｗｉｌｄ ｓｇＲＮＡ）であって、ｉｎ
ｖｉｔｒｏ切断解析に用いられる場合、配列番号２６または２７をターゲット配列とすることができる。
配列番号８は、ＥＧＦＲ（Ｌ７１８Ｑまたはｃ．２１５３ Ｔ＞Ａ）突然変異を検出できる野生型ガイドＲＮＡ（ｗｉｌｄ ｓｇＲＮＡ）であって、ｉｎ ｖｉｔｒｏ切断解析に用いられる場合、配列番号２８をターゲット配列とすることができる。
配列番号９は、ＥＧＦＲ（Ｌ７１８Ｑ）突然変異を検出できるトランスバージョン突然変異ガイドＲＮＡ（ｔｒａｎｓｖｅｒｓｉｏｎ ｓｇＲＮＡ）であって、ｉｎ ｖｉｔｒ
ｏ切断解析に用いられる場合、配列番号２９をターゲット配列とすることができる。配列番号９のヌクレオチド配列を含むガイドＲＮＡを用いる場合、０．８％～２３．７％で突然変異配列を増幅させることができる。
配列番号１０は、ＫＲＡＳ（ｃ．３５Ｇ）突然変異を検出できる野生型ガイドＲＮＡ（ｗｉｌｄ ｓｇＲＮＡ）であって、ｉｎ ｖｉｔｒｏ切断解析に用いられる場合、配列番号３０または３１をターゲット配列とすることができる。配列番号１０のヌクレオチド配列を含むガイドＲＮＡを用いる場合、１．５％～５０％で突然変異配列を増幅させることができる。
配列番号１１は、ＥＧＦＲ、１５ｂｐ Ｄｅｌ ｐ．（７２９＿７６１）突然変異を検出できる野生型ガイドＲＮＡ（ｗｉｌｄ ｓｇＲＮＡ）であって、ｉｎ ｖｉｔｒｏ切断解析に用いられる場合、配列番号３２または３３をターゲット配列とすることができる。配列番号１１のヌクレオチド配列を含むガイドＲＮＡを用いる場合、０．５％～２３％で突然変異配列を増幅させることができる。
配列番号１２は、ＥＧＦＲ（ｐ．Ｌ８５８Ｒまたはｃ．２５７３ Ｔ＞Ｇ）突然変異を検出できる野生型ガイドＲＮＡ（ｗｉｌｄ ｓｇＲＮＡ）であって、ｉｎ ｖｉｔｒｏ切断解析に用いられる場合、配列番号３４をターゲット配列とすることができる。
配列番号１３は、ＥＧＦＲ（ｐ．Ｌ８５８Ｒ）突然変異を検出できるトランスバージョン突然変異ガイドＲＮＡ（ｔｒａｎｓｖｅｒｓｉｏｎ ｓｇＲＮＡ）であって、ｉｎ ｖｉｔｒｏ切断解析に用いられる場合、配列番号３５をターゲット配列とすることができる。配列番号１３のヌクレオチド配列を含むガイドＲＮＡを用いる場合、１．７％～６３％で突然変異配列を増幅させることができる。
配列番号１４は、ＰＩＫ３ＣＡ（ｐ．Ｅ５４２Ｋまたはｃ．１６２４Ｇ＞Ａ）突然変異を検出できる野生型ガイドＲＮＡ（ｗｉｌｄ ｓｇＲＮＡ）であって、ｉｎ ｖｉｔｒｏ切断解析に用いられる場合、配列番号３６または３７をターゲット配列とすることができる。
配列番号１５は、ＰＩＫ３ＣＡ（ｐ．Ｅ５４５？またはｃ．１６３３Ｇ＞？）突然変異を検出できる野生型ガイドＲＮＡ（ｗｉｌｄ ｓｇＲＮＡ）であって、ｉｎ ｖｉｔｒｏ切断解析に用いられる場合、配列番号３８または３９をターゲット配列とすることができる。
配列番号１６は、ＰＩＫ３ＣＡ（ｐ．Ｈ１０４７？またはｃ．３１４０Ａ＞？）突然変異を検出できる野生型ガイドＲＮＡ（ｗｉｌｄ ｓｇＲＮＡ）であって、ｉｎ ｖｉｔｒｏ切断解析に用いられる場合、配列番号４０または４１をターゲット配列とすることができる。
配列番号１７は、ＰＩＫ３ＣＡ（ｐ．Ｖ６００Ｅまたはｃ．１７９９Ｔ＞Ａ）突然変異を検出できる野生型ガイドＲＮＡ（ｗｉｌｄ ｓｇＲＮＡ）であって、ｉｎ ｖｉｔｒｏ切断解析に用いられる場合、配列番号４２または４３をターゲット配列とすることができる。
配列番号１８は、ＥＧＦＲ（ｐ．Ｔ７９０Ｍまたはｃ．２３６９Ｃ＞Ｔ）突然変異を検出できる配列番号１の野生型ガイドＲＮＡ（ｗｉｌｄ ｓｇＲＮＡ）のターゲット配列を示す。
配列番号１９は、ＥＧＦＲ（ｐ．Ｔ７９０Ｍまたはｃ．２３９０ Ｇ＞Ｃ）突然変異を検出できる配列番号２のトランスバージョン突然変異ガイドＲＮＡ（ｔｒａｎｓｖｅｒｓｉｏｎ ｓｇＲＮＡ）のターゲット配列を示す。
配列番号２０は、ＥＧＦＲ（ｐ．Ｃ７９７Ｓ）突然変異を検出できる配列番号３の野生型ガイドＲＮＡ（ｗｉｌｄ ｓｇＲＮＡ）のターゲット配列を示す。
配列番号２１は、ＥＧＦＲ（ｐ．Ｃ７９７Ｓ）突然変異を検出できる配列番号４のトランスバージョン突然変異ガイドＲＮＡ（ｔｒａｎｓｖｅｒｓｉｏｎ ｓｇＲＮＡ）のターゲット配列を示す。
配列番号２２は、ＭＥＴ ｃ．２８８８ Ｉｎｔ１３－Ｅｘｏｎ１４ Ａｃｃｅｐｔｏｒ（Ｅｘｏｎ－１４ Ｓｋｉｐｐｉｎｇ）突然変異を検出できる配列番号５の野生型ガイ
ドＲＮＡ（ｗｉｌｄ ｓｇＲＮＡ）のターゲット配列を示す。
配列番号２３は、ＭＥＴ ｃ．２８８８ Ｉｎｔ１３－Ｅｘｏｎ１４ Ａｃｃｅｐｔｏｒ（Ｅｘｏｎ－１４ Ｓｋｉｐｐｉｎｇ）突然変異を検出できる配列番号５の野生型ガイドＲＮＡ（ｗｉｌｄ ｓｇＲＮＡ）のターゲット配列を示す。
配列番号２４は、ＭＥＴ ｃ．３０２８ Ｅｘｏｎ１４－Ｉｎｔ１４ Ｄｏｎｏｒ（Ｅｘｏｎ－１４ Ｓｋｉｐｐｉｎｇ）突然変異を検出できる配列番号６の野生型ガイドＲＮＡ（ｗｉｌｄ ｓｇＲＮＡ）のターゲット配列を示す。
配列番号２５は、ＭＥＴ ｃ．３０２８ Ｅｘｏｎ１４－Ｉｎｔ１４ Ｄｏｎｏｒ（Ｅｘｏｎ－１４ Ｓｋｉｐｐｉｎｇ）突然変異を検出できる配列番号６の野生型ガイドＲＮＡ（ｗｉｌｄ ｓｇＲＮＡ）のターゲット配列を示す。
配列番号２６は、ＭＥＴ ’ＴＡＣ’ Ｙ１００３Ｘ（Ｅｘｏｎ－１４ Ｓｋｉｐｐｉｎｇ）突然変異を検出できる配列番号７の野生型ガイドＲＮＡ（ｗｉｌｄ ｓｇＲＮＡ）のターゲット配列を示す。
配列番号２７は、ＭＥＴ ’ＴＡＣ’ Ｙ１００３Ｘ（Ｅｘｏｎ－１４ Ｓｋｉｐｐｉｎｇ）突然変異を検出できる配列番号７の野生型ガイドＲＮＡ（ｗｉｌｄ ｓｇＲＮＡ）のターゲット配列を示す。
配列番号２８は、ＥＧＦＲ（Ｌ７１８Ｑまたはｃ．２１５３ Ｔ＞Ａ）突然変異を検出できる配列番号８の野生型ガイドＲＮＡ（ｗｉｌｄ ｓｇＲＮＡ）のターゲット配列を示す。
配列番号２９は、ＥＧＦＲ（Ｌ７１８Ｑ）突然変異を検出できる配列番号９のトランスバージョン突然変異ガイドＲＮＡ（ｔｒａｎｓｖｅｒｓｉｏｎ ｓｇＲＮＡ）のターゲット配列を示す。
配列番号３０は、ＫＲＡＳ（ｃ．３５Ｇ）突然変異を検出できる配列番号１０の野生型ガイドＲＮＡ（ｗｉｌｄ ｓｇＲＮＡ）のターゲット配列を示す。
配列番号３１は、ＫＲＡＳ（ｃ．３５Ｇ）突然変異を検出できる配列番号１０の野生型ガイドＲＮＡ（ｗｉｌｄ ｓｇＲＮＡ）のターゲット配列を示す。
配列番号３２は、ＥＧＦＲ、１５ｂｐ Ｄｅｌ ｐ．（７２９＿７６１）突然変異を検出できる配列番号１１の野生型ガイドＲＮＡ（ｗｉｌｄ ｓｇＲＮＡ）のターゲット配列を示す。
配列番号３３は、ＥＧＦＲ、１５ｂｐ Ｄｅｌ ｐ．（７２９＿７６１）突然変異を検出できる配列番号１１の野生型ガイドＲＮＡ（ｗｉｌｄ ｓｇＲＮＡ）のターゲット配列を示す。
配列番号３４は、ＥＧＦＲ（ｐ．Ｌ８５８Ｒまたはｃ．２５７３ Ｔ＞Ｇ）突然変異を検出できる配列番号１２の野生型ガイドＲＮＡ（ｗｉｌｄ ｓｇＲＮＡ）のターゲット配列を示す。
配列番号３５は、ＥＧＦＲ（ｐ．Ｌ８５８Ｒ）突然変異を検出できる配列番号１３のトランスバージョン突然変異ガイドＲＮＡ（ｔｒａｎｓｖｅｒｓｉｏｎ ｓｇＲＮＡ）のターゲット配列を示す。
配列番号３６は、ＰＩＫ３ＣＡ（ｐ．Ｅ５４２Ｋまたはｃ．１６２４Ｇ＞Ａ）突然変異を検出できる配列番号１４の野生型ガイドＲＮＡ（ｗｉｌｄ ｓｇＲＮＡ）のターゲット配列を示す。
配列番号３７は、ＰＩＫ３ＣＡ（ｐ．Ｅ５４２Ｋまたはｃ．１６２４Ｇ＞Ａ）突然変異を検出できる配列番号１４の野生型ガイドＲＮＡ（ｗｉｌｄ ｓｇＲＮＡ）のターゲット配列を示す。
配列番号３８は、ＰＩＫ３ＣＡ（ｐ．Ｅ５４５？またはｃ．１６３３Ｇ＞？）突然変異を検出できる配列番号１５の野生型ガイドＲＮＡ（ｗｉｌｄ ｓｇＲＮＡ）のターゲット配列を示す。
配列番号３９は、ＰＩＫ３ＣＡ（ｐ．Ｅ５４５？またはｃ．１６３３Ｇ＞？）突然変異を検出できる配列番号１５の野生型ガイドＲＮＡ（ｗｉｌｄ ｓｇＲＮＡ）のターゲット配列を示す。
配列番号４０は、ＰＩＫ３ＣＡ（ｐ．Ｈ１０４７？またはｃ．３１４０Ａ＞？）突然変異を検出できる配列番号１６の野生型ガイドＲＮＡ（ｗｉｌｄ ｓｇＲＮＡ）のターゲット配列を示す。
配列番号４１は、ＰＩＫ３ＣＡ（ｐ．Ｈ１０４７？またはｃ．３１４０Ａ＞？）突然変異を検出できる配列番号１６の野生型ガイドＲＮＡ（ｗｉｌｄ ｓｇＲＮＡ）のターゲット配列を示す。
配列番号４２は、ＰＩＫ３ＣＡ（ｐ．Ｖ６００Ｅまたはｃ．１７９９Ｔ＞Ａ）突然変異を検出できる配列番号１７の野生型ガイドＲＮＡ（ｗｉｌｄ ｓｇＲＮＡ）のターゲット配列を示す。
配列番号４３は、ＰＩＫ３ＣＡ（ｐ．Ｖ６００Ｅまたはｃ．１７９９Ｔ＞Ａ）突然変異を検出できる配列番号１７の野生型ガイドＲＮＡ（ｗｉｌｄ ｓｇＲＮＡ）のターゲット配列を示す。
Claims (17)
- ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムに利用されるガイドＲＮＡ（ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ）であって、
前記ガイドＲＮＡは、野生型無細胞ＤＮＡを切断することを特徴とするガイドＲＮＡ。 - 前記ガイドＲＮＡは、配列番号１～１７からなる群から選ばれるいずれか１つ以上のヌクレオチド配列を含むことを特徴とする請求項１に記載のガイドＲＮＡ。
- 前記ガイドＲＮＡは、ガイドＲＮＡのトランク（ｔｒｕｎｋ）領域、セミシード（ｓｅｍｉ－ｓｅｅｄ）領域およびシード（ｓｅｅｄ）領域から成る群から選ばれるいずれか１つ以上の領域でトランスバージョン突然変異（ｔｒａｎｓｖｅｒｓｉｏｎ ｍｕｔａｔｉｏｎ）が発生したことを特徴とする請求項１に記載のガイドＲＮＡ。
- 前記ガイドＲＮＡは、配列番号２、配列番号４、配列番号９および配列番号１３から成る群から選ばれるいずれか１つ以上のヌクレオチド配列を含むことを特徴とする請求項３に記載のガイドＲＮＡ。
- 前記ガイドＲＮＡは、ＥＧＦＲ、ＭＥＴ、ＫＲＡＳ、ＰＩＫ３ＣＡおよびＢＲＡＦからなる群から選ばれるいずれか１つ以上のがん関連突然変異を検出できることを特徴とする請求項１に記載のガイドＲＮＡ。
- 前記ＥＧＦＲ突然変異を検出する場合、前記ガイドＲＮＡは、配列番号１～４、８、９および１１～１３から成る群から選ばれるいずれか１つ以上のヌクレオチド配列を含むことを特徴とする請求項５に記載のガイドＲＮＡ。
- 前記ＭＥＴ突然変異を検出する場合、前記ガイドＲＮＡは、配列番号５～７からなる群から選ばれるいずれか１つ以上のヌクレオチド配列を含むことを特徴とする請求項５に記載のガイドＲＮＡ。
- 前記ＫＲＡＳ突然変異を検出する場合、前記ガイドＲＮＡは、配列番号１０のヌクレオチド配列を含むことを特徴とする請求項５に記載のガイドＲＮＡ。
- 前記ＰＩＫ３ＣＡ突然変異を検出する場合、前記ガイドＲＮＡは、配列番号１４～１６から成る群から選ばれるいずれか１つ以上のヌクレオチド配列を含むことを特徴とする請求項５に記載のガイドＲＮＡ。
- 前記ＢＲＡＦ突然変異を検出する場合、前記ガイドＲＮＡは、配列番号１７のヌクレオチド配列を含むことを特徴とする請求項５に記載のガイドＲＮＡ。
- 配列番号１～１７からなる群から選ばれるいずれか１つ以上のヌクレオチド配列を含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９のガイドＲＮＡを含むがんの診断または予後予測用組成物。
- 前記ガイドＲＮＡは、ガイドＲＮＡのトランク（ｔｒｕｎｋ）領域、セミシード（ｓｅｍｉ－ｓｅｅｄ）領域およびシード（ｓｅｅｄ）領域から成る群から選ばれるいずれか１つ以上の領域でトランスバージョン突然変異（ｔｒａｎｓｖｅｒｓｉｏｎ ｍｕｔａｔｉｏｎ）が発生したことを特徴とする請求項１１に記載の組成物。
- 前記ガイドＲＮＡは、ＥＧＦＲ、ＭＥＴ、ＫＲＡＳ、ＰＩＫ３ＣＡおよびＢＲＡＦからなる群から選ばれるいずれか１つ以上のがん関連突然変異を検出できることを特徴とする
請求項１１に記載の組成物。 - 前記ガイドＲＮＡは、野生型無細胞ＤＮＡを切断することを特徴とする請求項１１に記載の組成物。
- 前記がんは、肺がん、膵がん、大腸がん、胃がん、乳がん、腎がん、肝がん、血液がん、膀胱がんおよび子宮がんから成る群から選ばれるいずれか１つ以上のがんであることを特徴とする請求項１１に記載の組成物。
- 請求項１１に記載の組成物を含むがんの診断または予後予測用キット。
- 患者の試料に請求項１１に記載の組成物を処理する段階を含むがんの診断または予後予測のための情報提供方法。
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