CN108330183A - 一种血浆miRNA的qRT-PCR检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种血浆miRNA的qRT‑PCR检测方法，包括如下步骤：标本收集、滴加miRNA提取液、滴加氯仿、第一次离心、移液、滴加miRNA提取液和异丙醇、第二次离心、滴加乙醇、第三次离心、滴加RNase‑free水、配置加尾及逆转录反应体系、配置荧光定量PCR反应体系、进行定量检测、读取和记录数据和数据分析；本发明可以检测处血浆中的miRNA的各项参数，目前对miRNA参与这些复杂的基因调控和多种疾病的传导通路的具体机制还不太清楚，因此准确预测miRNA的靶基因并且对靶基因的传导通路进行系统的生物学分析也是研究其作用机制的重要环节，生物信息学分析可以有效的对miRNA靶基因进行预测并对其调控网络进行构建，为miRNA用于疾病的诊断提供理论依据。
Description
技术领域
本发明涉及医疗检测技术领域，具体为一种血浆miRNA的qRT-PCR检测方法。
背景技术
结直肠癌在我国的发病率高居肿瘤排行榜第五位，其死亡率也一直居高不下，已成为威胁我国公众健康及生命的主要疾病之一，且目前有统计表明，近年来结直肠癌的发病率仍呈逐步升高的趋势，其早、晚期五年生存率存在巨大差距，转移性结直肠癌的五年生存率不足13％，而早期结直肠癌五年生存率可达90％以上，但由于缺乏有效的早期诊断指标和手段，其早期诊断率仍不足结直肠癌诊断的40％，大多数结直肠癌患者入院时已是晚期，错过了最佳治疗的黄金时期。
目前结直肠癌的诊断主要依靠结肠镜检查及活体组织病理检查，但由于其花费高并伴随一定的检查痛苦与风险以及由于检查医师技术问题，如肠道准备不全、退镜速度过快等，存在一定漏诊率，难以达到普查要求。CT、MRI等影像学检查由于对结直肠微小病变难以做到早期诊断，并不足以满足临床要求。目前临床常用的粪便隐血试验及肿瘤标志物如CEA等，由于敏感性和特异性不足，不能有效的对结直肠癌进行筛查与早期诊断。寻找一种可用于结直肠癌早期诊断的花费低、创伤小的新型肿瘤标志物已成为一大热点。越来越多研究证明miRNA与肿瘤的发生发展及预后等存在密切关系，有望成为临床肿瘤的一种新型标志物。
所以，如何设计一种血浆miRNA的qRT-PCR检测方法，成为我们当前要解决的问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种血浆miRNA的qRT-PCR检测方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种血浆miRNA的qRT-PCR检测方法，包括如下步骤：
1)标本收集：使用5mlEDTA真空采血管抽取空腹静脉血4ml，采血后轻轻颠倒试管，混合8-10次，不得剧烈震荡，采完血样后样本垂直放置，使用台式低俗低温离心机3500rpm离心10min分离得到血浆，样本无肉眼可见溶血，剔除所有溶血可能的血浆样本，每200μL分装到一个冻存管，随后存放于-80℃冰箱待用，尽量减少冻融次数，全程需在抽血后2小时内完成；
2)滴加miRNA提取液：100μl血浆里加入1ml miRNA提取液，反复吹打至析出物完全溶解；
3)滴加氯仿：加入200μl氯仿，盖紧EP管管盖，剧烈振荡20秒，室温静置5分钟；
4)第一次离心：冷冻离心机12000g，4℃条件下离心15分钟，此时匀浆液分为三层：上层为含miRNA上清液，中间为白色蛋白层，下层为有色有机相；
5)移液：吸取500μl上清液转移到新的EP管中；
6)滴加miRNA提取液和异丙醇：加入5μl miRNA提取液和等体积的异丙醇(505μl)，上下颠倒充分混匀，-20℃静置10分钟；
7)第二次离心：冷冻离心机13500g，4℃条件下离心10分钟；
8)滴加乙醇：弃上清，向沉淀加入1ml75％乙醇，轻缓颠倒清洗沉淀；
9)第三次离心：冷冻离心机13500g，4℃条件下离心5分钟，弃上清；
10)滴加RNase-free水：室温干燥2-3分钟，加入20μl RNase-free水溶解；
11)配置加尾及逆转录反应体系：将0.001-1μg Total RNA，2.5μl 4×ReactionBuffer Mix，1μl PolyA/RT Enzyme Mix；1μl 10×miRNA RT primer**，6-10μl RNase-free Water和10μl Total volume混合均匀后，于37℃保温30min，42℃保温30min，75℃加热5min，冰上放置5min，制成加尾及逆转录反应体系；
12)配置荧光定量PCR反应体系：将5μl 4×PCR Buffer，0.4μl HS SM-Taq，0-0.2μl Rox Reference Dye(100×)，1μl 20×probe&miRNA PCR primer，Xμl cDNA，10-20μldH2O和20μl Total volume混合均匀后，制成荧光定量PCR反应体系；
13)进行定量检测：将处理后的血浆、加尾及逆转录反应体系和荧光定量PCR反应体系依次加入到八联管中，在95℃下反应3min，并循环反应1次，记录数据，接着再95℃下反应10s，并循环反应40次，记录数据，最后在60℃下反应30s，并循环反应40次，记录数据；
14)读取和记录数据：每个反应重复三次,读取和记录数据；
15)数据分析：对测试数据进行分析，确定测试结果。
根据上述技术方案，所述步骤12)中DNA加入量建议不要超过荧光定量PCR反应总体积的1/20(V/V)，如果需要单独加入cDNA，将cDNA稀释5-20倍，然后取5μl加入荧光定量PCR反应。
根据上述技术方案，所述步骤13)中miRNA成熟序列的GC含量较高，可将反应温度升高3-5℃。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明可以检测处血浆中的miRNA的各项参数，目前对miRNA参与这些复杂的基因调控和多种疾病的传导通路的具体机制还不太清楚，因此准确预测miRNA的靶基因并且对靶基因的传导通路进行系统的生物学分析也是研究其作用机制的重要环节，生物信息学分析可以有效的对miRNA靶基因进行预测并对其调控网络进行构建，为miRNA用于疾病的诊断提供理论依据，同时本发明，测试方法简单，快速，能有效提升测试的精确度。
附图说明
图1是本发明的血浆miRNA的qRT-PCR检测流程图；
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：请参阅图1，本发明提供一种血浆miRNA的qRT-PCR检测方法，包括如下步骤：
1)标本收集：使用5mlEDTA真空采血管抽取空腹静脉血4ml，采血后轻轻颠倒试管，混合8-10次，不得剧烈震荡，采完血样后样本垂直放置，使用台式低俗低温离心机3500rpm离心10min分离得到血浆，样本无肉眼可见溶血，剔除所有溶血可能的血浆样本，每200μL分装到一个冻存管，随后存放于-80℃冰箱待用，尽量减少冻融次数，全程需在抽血后2小时内完成；
2)滴加miRNA提取液：100μl血浆里加入1ml miRNA提取液，反复吹打至析出物完全溶解；
3)滴加氯仿：加入200μl氯仿，盖紧EP管管盖，剧烈振荡20秒，室温静置5分钟；
4)第一次离心：冷冻离心机12000g，4℃条件下离心15分钟，此时匀浆液分为三层：上层为含miRNA上清液，中间为白色蛋白层，下层为有色有机相；
5)移液：吸取500μl上清液转移到新的EP管中；
6)滴加miRNA提取液和异丙醇：加入5μl miRNA提取液和等体积的异丙醇(505μl)，上下颠倒充分混匀，-20℃静置10分钟；
7)第二次离心：冷冻离心机13500g，4℃条件下离心10分钟；
8)滴加乙醇：弃上清，向沉淀加入1ml75％乙醇，轻缓颠倒清洗沉淀；
9)第三次离心：冷冻离心机13500g，4℃条件下离心5分钟，弃上清；
10)滴加RNase-free水：室温干燥2-3分钟，加入20μl RNase-free水溶解；
11)配置加尾及逆转录反应体系：将0.001μg Total RNA，2.5μl 4×ReactionBuffer Mix，1μl PolyA/RT Enzyme Mix；1μl 10×miRNA RT primer**，6μl RNase-freeWater和10μl Total volume混合均匀后，于37℃保温30min，42℃保温30min，75℃加热5min，冰上放置5min，制成加尾及逆转录反应体系；
12)配置荧光定量PCR反应体系：将5μl 4×PCR Buffer，0.4μl HS SM-Taq，0μlRox Reference Dye(100×)，1μl 20×probe&miRNA PCR primer，Xμl cDNA，10μl dH2O和20μl Total volume混合均匀后，制成荧光定量PCR反应体系；
13)进行定量检测：将处理后的血浆、加尾及逆转录反应体系和荧光定量PCR反应体系依次加入到八联管中，在95℃下反应3min，并循环反应1次，记录数据，接着再95℃下反应10s，并循环反应40次，记录数据，最后在60℃下反应30s，并循环反应40次，记录数据；
14)读取和记录数据：每个反应重复三次,读取和记录数据；
15)数据分析：对测试数据进行分析，确定测试结果。
根据上述技术方案，步骤12)中DNA加入量建议不要超过荧光定量PCR反应总体积的1/20(V/V)，如果需要单独加入cDNA，将cDNA稀释5-20倍，然后取5μl加入荧光定量PCR反应。
根据上述技术方案，步骤13)中miRNA成熟序列的GC含量较高，可将反应温度升高3℃。
实施例2：请参阅图1，本发明提供一种血浆miRNA的qRT-PCR检测方法，包括如下步骤：
1)标本收集：使用5mlEDTA真空采血管抽取空腹静脉血4ml，采血后轻轻颠倒试管，混合8-10次，不得剧烈震荡，采完血样后样本垂直放置，使用台式低俗低温离心机3500rpm离心10min分离得到血浆，样本无肉眼可见溶血，剔除所有溶血可能的血浆样本，每200μL分装到一个冻存管，随后存放于-80℃冰箱待用，尽量减少冻融次数，全程需在抽血后2小时内完成；
2)滴加miRNA提取液：100μl血浆里加入1ml miRNA提取液，反复吹打至析出物完全溶解；
3)滴加氯仿：加入200μl氯仿，盖紧EP管管盖，剧烈振荡20秒，室温静置5分钟；
4)第一次离心：冷冻离心机12000g，4℃条件下离心15分钟，此时匀浆液分为三层：上层为含miRNA上清液，中间为白色蛋白层，下层为有色有机相；
5)移液：吸取500μl上清液转移到新的EP管中；
6)滴加miRNA提取液和异丙醇：加入5μl miRNA提取液和等体积的异丙醇(505μl)，上下颠倒充分混匀，-20℃静置10分钟；
7)第二次离心：冷冻离心机13500g，4℃条件下离心10分钟；
8)滴加乙醇：弃上清，向沉淀加入1ml75％乙醇，轻缓颠倒清洗沉淀；
9)第三次离心：冷冻离心机13500g，4℃条件下离心5分钟，弃上清；
10)滴加RNase-free水：室温干燥2-3分钟，加入20μl RNase-free水溶解；
11)配置加尾及逆转录反应体系：将1μg Total RNA，2.5μl 4×Reaction BufferMix，1μl PolyA/RT Enzyme Mix；1μl 10×miRNA RT primer**，10μl RNase-free Water和10μl Total volume混合均匀后，于37℃保温30min，42℃保温30min，75℃加热5min，冰上放置5min，制成加尾及逆转录反应体系；
12)配置荧光定量PCR反应体系：将5μl 4×PCR Buffer，0.4μl HS SM-Taq，0.2μlRox Reference Dye(100×)，1μl 20×probe&miRNA PCR primer，Xμl cDNA，20μl dH2O和20μl Total volume混合均匀后，制成荧光定量PCR反应体系；
13)进行定量检测：将处理后的血浆、加尾及逆转录反应体系和荧光定量PCR反应体系依次加入到八联管中，在95℃下反应3min，并循环反应1次，记录数据，接着再95℃下反应10s，并循环反应40次，记录数据，最后在60℃下反应30s，并循环反应40次，记录数据；
14)读取和记录数据：每个反应重复三次,读取和记录数据；
15)数据分析：对测试数据进行分析，确定测试结果。
根据上述技术方案，步骤12)中DNA加入量建议不要超过荧光定量PCR反应总体积的1/20(V/V)，如果需要单独加入cDNA，将cDNA稀释5-20倍，然后取5μl加入荧光定量PCR反应。
根据上述技术方案，步骤13)中miRNA成熟序列的GC含量较高，可将反应温度升高5℃。
基于上述，本发明的优点在于，本发明可以检测处血浆中的miRNA的各项参数，目前对miRNA参与这些复杂的基因调控和多种疾病的传导通路的具体机制还不太清楚，因此准确预测miRNA的靶基因并且对靶基因的传导通路进行系统的生物学分析也是研究其作用机制的重要环节，生物信息学分析可以有效的对miRNA靶基因进行预测并对其调控网络进行构建，为miRNA用于疾病的诊断提供理论依据，同时本发明，测试方法简单，快速，能有效提升测试的精确度。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
Claims (3)
1.一种血浆miRNA的qRT-PCR检测方法，其特征在于：包括如下步骤：
1)标本收集：使用5mlEDTA真空采血管抽取空腹静脉血4ml，采血后轻轻颠倒试管，混合8-10次，不得剧烈震荡，采完血样后样本垂直放置，使用台式低俗低温离心机3500rpm离心10min分离得到血浆，样本无肉眼可见溶血，剔除所有溶血可能的血浆样本，每200μL分装到一个冻存管，随后存放于-80℃冰箱待用，尽量减少冻融次数，全程需在抽血后2小时内完成；
2)滴加miRNA提取液：100μl血浆里加入1ml miRNA提取液，反复吹打至析出物完全溶解；
3)滴加氯仿：加入200μl氯仿，盖紧EP管管盖，剧烈振荡20秒，室温静置5分钟；
4)第一次离心：冷冻离心机12000g，4℃条件下离心15分钟，此时匀浆液分为三层：上层为含miRNA上清液，中间为白色蛋白层，下层为有色有机相；
5)移液：吸取500μl上清液转移到新的EP管中；
6)滴加miRNA提取液和异丙醇：加入5μl miRNA提取液和等体积的异丙醇(505μl)，上下颠倒充分混匀，-20℃静置10分钟；
7)第二次离心：冷冻离心机13500g，4℃条件下离心10分钟；
8)滴加乙醇：弃上清，向沉淀加入1ml75％乙醇，轻缓颠倒清洗沉淀；
9)第三次离心：冷冻离心机13500g，4℃条件下离心5分钟，弃上清；
10)滴加RNase-free水：室温干燥2-3分钟，加入20μl RNase-free水溶解；
11)配置加尾及逆转录反应体系：将0.001-1μg Total RNA，2.5μl 4×ReactionBuffer Mix，1μl PolyA/RT Enzyme Mix；1μl 10×miRNA RT primer**，6-10μl RNase-free Water和10μl Total volume混合均匀后，于37℃保温30min，42℃保温30min，75℃加热5min，冰上放置5min，制成加尾及逆转录反应体系；
12)配置荧光定量PCR反应体系：将5μl 4×PCR Buffer，0.4μl HS SM-Taq，0-0.2μlRox Reference Dye(100×)，1μl 20×probe&miRNA PCR primer，Xμl cDNA，10-20μl dH2O和20μl Total volume混合均匀后，制成荧光定量PCR反应体系；
13)进行定量检测：将处理后的血浆、加尾及逆转录反应体系和荧光定量PCR反应体系依次加入到八联管中，在95℃下反应3min，并循环反应1次，记录数据，接着再95℃下反应10s，并循环反应40次，记录数据，最后在60℃下反应30s，并循环反应40次，记录数据；
14)读取和记录数据：每个反应重复三次,读取和记录数据；
15)数据分析：对测试数据进行分析，确定测试结果。
2.根据权利要求1的一种血浆miRNA的qRT-PCR检测方法，其特征在于：所述步骤12)中DNA加入量建议不要超过荧光定量PCR反应总体积的1/20(V/V)，如果需要单独加入cDNA，将cDNA稀释5-20倍，然后取5μl加入荧光定量PCR反应。
3.根据权利要求1的一种血浆miRNA的qRT-PCR检测方法，其特征在于：所述步骤13)中miRNA成熟序列的GC含量较高，可将反应温度升高3-5℃。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20180727 |
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