CN106367476A - 人mir421及其在制备诊断及治疗前列腺癌的诊断制剂中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种新的前列腺癌分子标记物microRNA 421 (MIR421)在制备诊断及治疗前列腺癌诊断制剂及诊断试剂盒中的用途，包括前列腺癌高危人群的筛选，前列腺癌的诊断，前列腺癌药物靶标的设计，前列腺癌治疗状况的监测及前列腺癌预后检测等。使用该分子标记物及含有该分子标记物的诊断试剂盒诊断前列腺癌，操作简单、取材方便、安全无创伤，且具有较高的特异性和灵敏度及易于大量筛查的特点。

Description

人MIR421及其在制备诊断及治疗前列腺癌的诊断制剂中的 用途

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种新的前列腺癌分子标记物MIR421及其在制备诊断及治疗前列腺癌的诊断制剂中的用途，包括通过该生物分子标记物在前列腺癌高危人群的筛选、前列腺癌的诊断、前列腺癌药物靶标的设计、前列腺癌治疗状况的监测、前列腺癌指导用药的监测及前列腺癌预后检测等领域的应用。

背景技术

根据《ASCO年度报告：2015临床肿瘤学进展》中相关内容报道，液体活检技术被列为肿瘤治疗领域下一个十年趋势之一。研究显示，血液中的一些分子标志物已经被应用于一些疾病的诊断，如谷丙转氨酶用于肝炎的诊断，白细胞数目用于判断炎症。血液循环肿瘤DNA(circulating tumor DNA，ctDNA)是一种无细胞状态的胞外游离DNA，存在于血液、滑膜液和脑脊液等体液中，体细胞DNA经脱落或者当细胞凋亡后释放进入循环系统，其主要是由短的单链或双链DNA以及单链与双链DNA的混合物组成，以DNA蛋白质复合物或游离DNA两种形式存在。研究公开了ctDNA来自肿瘤细胞的体细胞突变，因此，ctDNA是一种特征性的新的肿瘤生物标记物，并且还可以被定性、定量和追踪，将成为临床肿瘤的早期诊断、预后判定及跟踪随访等提供一系列方便、快捷、特异、无创或微创和分子生物学检测手段，尤其对于一些不具有典型临床症状、检查无特异性和诊断困难的肿瘤可避免复杂的、具有创伤性的活检。结合新一代测序技术(NGS)将变成“液体活检”，并替代侵入组织性活检。

MIR421属于microRNA，是一类由內源基因编码的微小RNA，不编码蛋白，大小为20～24个核苷酸，广泛存在于植物、动物和各种病毒中，在RNA沉默和转录后翻译调控中发挥举足轻重的作用。研究显示，每个miRNA可以有多个靶基因，每个基因也可能受多个miRNA调控。这种复杂的调节网络既可以通过一个miRNA来调控多个基因的表达，也可以通过几个miRNA的组合来精细调控某个基因的表达。据推测，miRNA调节着人类三分之一的基因。MicroRNA因其高度的保守性、时空特异性、稳定性及组织特异性等特点使其优于蛋白质、DNA片段等其他生物标志物而在疾病发病机制研究、早期诊断、个体化治疗和预后等方面发挥日益重要的作用。

前列腺癌是是常见的男性生殖系统恶性肿瘤之一。据统计，世界范围内，前列腺癌发病率在男性所有恶性肿瘤中位居第二，在美国前列腺癌的发病率已经超过肺癌，成为第一位危害男性健康的肿瘤。亚洲前列腺癌的发病率远远低于欧美国家，但近年来呈现上升趋势，且增长比欧美发达国家更加迅速。前列腺癌患者主要是老年男性，一般在50岁以后发病，95%发生于60岁以上的老年男性，发生率持续地随着年龄增长而增加。前列腺癌早期多无任何症状，即使有所不适，也不足以引起病人的重视，当肿瘤增大压迫尿道时，又往往与前列腺增生相混淆。在我国约80%的病人首先发现远处转移病灶才发现前列腺癌。此时，病变已达晚期，预后不良。

目前，前列腺癌的临床诊断方式主要有直肠指检、血清前列腺特异性抗原（PSA）检测、直肠超声波检测、活组织病理检查等；其中，直肠指检是最简单、最经济实用的方法，主要通过医生的食指触摸前列腺，用以发现很多无症状的前列腺癌患者，有可能获得早期诊断及根治的机会，但以上的方法都存在局限性；例如直肠指检的局限性主要在下述4个方面：（1）患者前列腺肿块不大时，易漏诊；（2）部分患者前列腺癌肿大不明显，但已属于晚期，不易根治；（3）患者直肠有疾患时不能使用此检测；（4）医生经验不足时可能有漏诊或者误诊的可能。正常情况下血液中的PSA不高（不高于4 ng／ml），当处于前列腺癌及其他前列腺疾病患病状态时，PSA升高成为目前筛查前列腺癌最敏感的瘤标，但其也存在一定局限性：（1）需要取血检测，对患者有一定的损伤；（2）PSA增高也常见与非前列腺癌疾病，如前列腺炎症、前列腺肥大等，因此不易确诊；（3）PSA增高确诊前列腺癌时，往往患者已经属于中后期，达不到早期诊断的目的。前列腺超声波检测操作简单直观、无损伤，通过显示肿块的大小、数目、位置、密度、边缘、形体、有无钙化及钙化的形态、大小、数目、分布以及周围的晕环、皮肤改变等提供定位及定性征象并判断病变的性质；其局限性是：（1）对致密性的小癌灶容易漏诊；（2）有时候不能提供明确的定性诊断；（3）因其不能显示肿瘤的内部结构及周围组织所以诊断符合率很低；（4）对一些缺乏典型征象的实性良恶性肿块有较高的误诊率。活组织病理检查因其创伤性、复杂性不能作为初筛的手段，但它是前列腺癌确诊的金标准，一般与其他方法技术连用。

近年来的研究表明，miRNA与前列腺癌密切相关，它们可能参与肿瘤的发生、发展和转移，所以对肿瘤的发病机制、早期诊断、个体化治疗、转移的检测和预后等可能有相应的作用。

基于现状，本申请的发明人拟提供人MIR421在制备诊断及治疗前列腺癌的诊断制剂中的新的用途。

发明内容

本发明的目的在于，针对现有技术存在的缺陷，提供人MIR421及其在制备诊断及治疗前列腺癌的诊断制剂中的新的用途。

本申请经试验研究发现，MIR421在前列腺癌组织中的含量比前列腺正常组织中的含量低，提示MIR421与前列腺癌的肿瘤发生、发展存在着密切的相关性。

本发明基于上述研究基础，提供了一种与前列腺癌相关的新的前列腺癌分子标志物MIR421、诊断试剂盒、前列腺癌药物靶标的设计及该生物标志物在前列腺癌高危人群筛选、诊断、治疗状况监测、预后监测中的应用。

本发明所采用的技术方案如下：

MIR421作为前列腺癌标志物，是一种miRNA，其核苷酸序列是5‘－AUCAACAGACAUUAAUUGGGCGC－3’（SEQ ID NO.1） 。

所述的前列腺癌生物标志物MIR421可用于制备筛选、诊断、治疗状况监测、预后监测前列腺癌高危人群的试剂盒中，通过检测被试者组织样本、血液和尿液中的MIR421的含量，并与正常水平MIR421含量相比较以进行前列腺癌高危人群筛选、诊断、治疗状况监测、预后监测。

更具体的，本发明提供了所述的前列腺癌生物标志物MIR421在制备筛选、诊断、治疗状况监测、预后监测前列腺癌高危人群的诊断试剂盒中的应用。

所述的诊断前列腺癌的诊断试剂盒包括：

（1）组织样本、血液和尿液中总RNA提取试剂，

（2）反转录试剂，

（3）定量PCR试剂，

所述检测试剂盒所用对照为RNU6，其引物序列如下：

RNU6上游引物序列：5＇- CGCTTCGGCAGCACATATACTAA -3＇（SEQ ID NO.2）

RNU6下游引物序列：5＇- TATGGAACGCTTCACGAATTTGC -3＇（SEQ ID NO.3）

所述检测试剂盒所用MIR421检测引物序列为：

MIR421反转录引物序列：5＇-GTCTCCTCTGGTGGAGGGTCCGAGGTATTCCCACCAGAGGAGACGCGCCC-3＇（SEQ ID NO.4）

MIR421上游引物序列：5＇- GTGGAGGGTCCGAGGT -3＇（SEQ ID NO.5）

MIR421下游引物序列：5＇- ATCAACAGACATTAATTGGG -3＇（SEQ ID NO.6）

本发明中，进行了组织样本中MIR421水平诊断前列腺癌的实验，通过检测被试者组织样本、血液和尿液中的MIR421的含量，并与正常对照组织样本中MIR421的高含量相比较，结果显示，前列腺癌患者组织样本中的MIR421含量相对较低。且普遍低于正常组织样本的平均值，正常样本平均值约为肿瘤样本的平均值的1.5倍以上，差异有统计学意义。

本发明的优点有：

本发明为前列腺癌的诊断提供了一种新的分子标志物MIR421，并将该分子标志物应用于制备诊断试剂盒中，使用该分子标志物及含有该分子标志物的诊断试剂盒诊断前列腺癌，操作简单、取材方便、安全无创伤，且具有较高的特异性、灵敏性和方便大量筛查的特点，该分子标志物适合应用于前列腺癌高危人群的筛选、前列腺癌的鉴定、前列腺癌治疗状况的监测、前列腺癌指导用药的监测和前列腺癌预后监测等领域。

具体实施方式

为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例进一步阐述本发明，但下述实施例仅用于说明本发明而不限制本发明的范围，下面实施例中未提及的具体实验方法，按照常规实验方法进行。

实施例1

本实施例中，主要步骤如下：

1.组织样本中总RNA的提取

获得前列腺癌根治术患者手术后的组织样本，同时获得淋巴结清扫术的患者切除的组织样本作为对照；提取前述组织样本的总RNA于无DNA和无RNA酶污染的1.5毫升离心管中；

组织样本中提取总RNA的试剂盒购自北京康为世纪生物科技有限公司，提取的总RNA通过使用Therm NanoDrop2000c分光光度计，测定260/280nm紫外波长的比值进行的浓度测定；

2.定量检测组织样本中的microRNA

1)反转录RNA得到cDNA单链

按照下表1配置反转录体系，配置过程在冰上进行，配置好的体系在PCR仪上进行反转录，反应条件为42摄氏度15分钟，85摄氏度5秒；

表1

表1中X表示加入的RNA体积由RNA浓度来确定，本实验中为X＝500钠克/RNA浓度，前述反转录试剂盒购自大连宝生物有限公司(Takara)；

2)QPCR定量检测

以cDNA稀释液为实时定量PCR模板，引物终浓度为200nM，反应总体积为10μl，实时定量PCR仪器使用ABI 7900HT sequence Detection System，用384孔板完成，每个样本重复二到三次，在溶解曲线基本符合要求无非特异性扩增的情况下，参考操作手册，采用threshold cycle(Ct)方法获得相对表达量，以RNU6为内参；具体程序参看表2；

表2

3.采用Array Tool s4.1.0进行数据分析

用前述方法测得样品中目标miRNA和参照miRNA的Ct值水平求得目标miRNA在组织中的相对含量，用RNU6为参照矫正miRNA的量，通过QPCR检测中经典的2^-ΔCt的方法表示组织样本中miRNA的水平(-ΔCt为目标miRNA与对照的Ct值之差)；

4.组织样本中MIR421水平诊断前列腺癌

与正常对照组织样本中MIR421的高含量相比，前列腺癌患者组织样本中的MIR421含量相对较低，且普遍低于正常组织样本的平均值，正常样本平均值约为肿瘤样本的平均值的1.5倍以上，差异有统计学意义。

以上实验显示和描述了本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内；本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

SEQUENCE LISTING

<110> 复旦大学；上海济远生物科技有限公司

<120>人MIR421及其在制备诊断及治疗前列腺癌的诊断制剂中的用途

<130> 2

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 23

<212> RNA

<213> Homo sapiens

<400> 1

aucaacagac auuaauuggg cgc 23

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

cgcttcggca gcacatatac taa 23

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tatggaacgc ttcacgaatt tgc 23

<210> 4

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gtctcctctg gtggagggtc cgaggtattc ccaccagagg agacgcgccc 50

<210> 5

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gtggagggtc cgaggt 16

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

atcaacagac attaattggg 20

Claims (5)

1.一种前列腺癌生物标志物MIR421，其特征在于：所述的MIR421是一种miRNA，MIR421的核苷酸序列为：SEQ ID NO.1：5‘－AUCAACAGACAUUAAUUGGGCGC－3’。

2.权利要求1所述的前列腺癌生物标志物MIR421在制备前列腺癌高危人群筛选、诊断、药物靶标设计、治疗状况监测、预后监测的试剂盒中及药物治疗靶标中的用途。

3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于：通过所述的试剂盒检测被试者血清、尿液和组织样本中MIR421的含量，并与正常水平MIR421含量相比较，进行前列腺癌高危人群筛选、诊断、治疗状况监测和预后监测。

4.根据权利要求2所述的用途，其特征在于：所述的试剂盒包括：

⑴ 组织样本、血液和尿液中总RNA提取试剂，

⑵ 反转录试剂，

⑶ 定量PCR试剂，所述的定量PCR试剂包括RNU6的特异性正反向引物，分别为SEQ IDNO.2的RNU6上游引物序列：5＇- CGCTTCGGCAGCACATATACTAA -3＇和SEQ ID NO.3的RNU6下游引物序列：5＇- TATGGAACGCTTCACGAATTTGC -3＇。

5.根据权利要求3所述的用途，其特征在于：所述被试者血清、尿液和组织样本中MIR421的含量通过总RNA提取、反转录、定量PCR进行检测。