CN113774113B - 一种富集突变基因序列的方法和应用 - Google Patents
一种富集突变基因序列的方法和应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN113774113B CN113774113B CN202111095001.5A CN202111095001A CN113774113B CN 113774113 B CN113774113 B CN 113774113B CN 202111095001 A CN202111095001 A CN 202111095001A CN 113774113 B CN113774113 B CN 113774113B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- sequence
- primer
- dna
- gene
- detection
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
- C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
- C40B50/00—Methods of creating libraries, e.g. combinatorial synthesis
- C40B50/06—Biochemical methods, e.g. using enzymes or whole viable microorganisms
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Abstract
本发明公开了一种富集突变基因序列的方法和应用,所述方法包括:S1:制备杂合DNA;S2:在杂合DNA序列两端连接接头1;S3:将修饰后的序列进行目标片段分离;S4:对分离后的序列进行标记;S5:在标记序列端添加接头2;S6:目标序列的分离和富集。本发明只对能有效的富集突变基因序列以增加突变基因检测的灵敏度,同时也保证了检测结果的特异性,可以用于高通量测序检测和荧光PCR检测。该发明增加了可用于突变基因检测的拷贝数,增加了检测的灵敏度,在40ng的血浆DNA中能检测到0.0078%极低突变频率,而对突变基因在1%的样本中,只需0.3125ng DNA即可检出突变基因,具有极高的灵敏度。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学检测技术领域,具体涉及一种富集突变基因序列的方法和应用。
背景技术
目前突变基因检测主要通过高通量测序和荧光PCR的方法进行检测。高通量测序价格昂贵,对低突变频率的样本检测缺乏灵敏度。荧光PCR广泛应用于已知突变基因检测,利用特异的引物和探针来检测突变基因。荧光PCR设计的探针、引物只能检测已知突变基因,而且检测突变位点数量小,难以满足现有的肿瘤突变基因多位点检测要求。通过多重PCR的方式虽然可以提升荧光PCR检测的位点数,但肿瘤患者血浆DNA的片段大小在160bp左右,一些检测位点在探针和引物的设计上具有一定的挑战,多重PCR也会降低检测结果的灵敏度和特异性。肿瘤基因样本中存在大量的正常序列,现有的荧光PCR检测方法对低突变频率的样本灵敏度很差。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供一种富集突变基因序列的方法。
本发明的第二个目的在于提供上述方法在文库构建或基因检测中的应用。
本发明的第三个目的在于一种文库构建方法。
本发明的第四个目的在于提供一种基因检测方法。
本发明所采取的技术方案是:
本发明的第一方面,提供一种富集突变基因序列的方法,包含以下步骤:
S1:制备杂合DNA;
S2:在DNA序列两端连接接头1;
S3:将修饰后的序列进行目标片段分离;
S4:对分离后的序列进行标记;
S5:在标记序列端添加接头2;
S6:目标序列的分离和富集。
在本发明的一些实施方式中,步骤S1具体为通过变性将双链DNA变成单链DNA,然后将变性的DNA进行复性,将突变的基因序列与对应的正常基因序列复性成杂合序列。
其中双链DNA变性和复性的条件为:95℃10min,95℃至85℃(-2.0℃/s),85℃1min,85℃至75℃(-0.3℃/s),75℃1min,75℃至65℃(-0.3℃/s),65℃1min,65℃至55℃(-0.3℃/s),55℃1min,55℃至45℃(-0.3℃/s),45℃1min,45℃至35℃(-0.3℃/s),35℃1min,35℃至25℃(-0.3℃/s),25℃1min,4℃保存。
在步骤S1中突变基因序列与对应正常基因序列形成杂合序列,例如肿瘤基因检测中存在大量的正常基因序列,占少数的突变基因序列更容易与正常序列形成杂合序列,利于后续Surveyor酶的识别剪切。
在本发明的一些实施方式中,所述接头1由引物制备而成。
在本发明的一些实施方式中,所述引物序列为:
引物1:5’-GTGAGTGAGGTGGTTGAGGT–3’(SEQ ID NO.1);
引物2:3’-CACTCACTCCACCAACTCC–5’(SEQ ID NO.2)。
在本发明的一些实施方式中,所述接头1由引物1和引物2等摩尔比混合退火而成。
在本发明的一些实施方式中,所述反向引物序列(引物2)的3’端封闭阻断后续3’端序列的延伸。
在本发明的一些实施方式中,所述3’端的封闭方式为磷酸化修饰3'-PHO、环形接头或添加ddNTP封闭。
在本发明的一些实施方式中,所述接头1通过碱基互补配对连接将接头1加到序列两端,优选为TA配对。
在本发明的一些实施方式中,所述目标片段分离包括核酸酶识别突变位点序列;所述核酸酶优选为Surveyor酶或T7核酸内切酶。
在本发明的一些实施方式中,所述标记为生物素标记。
需要说明的是,生物素标记是本领域常规使用的标记方法,还可以采用其它的修饰基团。
在本发明的一些实施方式中,所述接头2由引物梯度退火而成。
在本发明的一些实施方式中,所述引物序列为:
引物3:5’-ACAACTCCACTCACCACCTC-3’(SEQ ID NO.3);
引物4:3’-GGGTGTTGAGGTGAGTGGTGGAG-5’(SEQ ID NO.4)。
在本发明的一些实施方式中,所述接头2由引物3和引物4等摩尔比混合梯度退火而成。
在本发明的一些实施方式中,所述接头2与标记物通过碱基互补配对连接;优选为CG配对。
通过生物素标记的Biotin-dCTP与接头粘性末端的dGTP通过CG配对将接头2连接到序列游离末端;若使用Biotin-dATP,则通过AT互补配对的方式连接接头2。
在本发明的一些实施方式中,所述步骤S6具体包括:利用亲和素修饰的磁珠将带有标记的突变序列分离富集。
本发明的第二方面,提供本发明第一方面所述的方法在文库构建或基因检测中的应用。
本发明的第三方面,提供一种文库构建方法,其特征在于:包括采用本发明第一方面所述的方法对目标DNA进行富集,对目标DNA进行富集后利用PCR扩增引物结合测序序列进行序列扩增构建文库。
在本发明的一些实施方式中,所述PCR扩增引物的序列为:
引物5:5’-GTGAGTGAGGTGGTTGAGGT-3’(SEQ ID NO.5);
引物6:5’-GAGGTGGTGAGTGGAGTTGT-3’(SEQ ID NO.6)。
本发明的第四方面,提供一种基因检测方法,通过检测本发明第一方面所述方法富集的突变基因或本发明第三方面所述的文库构建方法构建的文库。
在本发明的一些实施方式中,所述检测的方法为高通量测序、荧光定量PCR、数字PCR或质谱。
本发明的有益效果是:
1)本发明利用Surveyor核酸内切酶识别并特异性剪切不完全匹配碱基序列的特性,去除样本中正常DNA序列,只对突变基因序列富集并进行检测,能有效的富集突变基因序列以增加突变基因检测的灵敏度,同时也保证了检测结果的特异性,可以用于高通量测序检测和荧光PCR检测。该发明增加了突变基因检测的拷贝数,增加了检测的灵敏度。突变DNA与对应的正常DNA形成不完全匹配的双链DNA后被Surveyor酶识别剪切,在错配位点上剪切产生前后两段双链DNA序列,使一条突变DNA序列变成四条后续可用于突变DNA检测序列。
2)富集的突变基因可用于高通量测序检测,降低了野生型序列对测序结果影响同时可以增加检测结果的灵敏度和特异性。
3)本发明针对突变基因序列两端添加不同的接头序列,该序列可以用于后续引物的设计,并利用设计的引物进行后续突变基因扩增和检测,针对突变基因附件的正常DNA序列设计探针引物,一对引物和一条探针即可检测多种突变形式的基因,增加了荧光PCR检测突变基因数量。除检测已知的突变基因外,同时还可以检测已知突变附近的未知突变基因。避免了现有的荧光PCR检测不同突变位点需要设计不同特异性荧光探针。
附图说明
图1为突变基因检测流程图。
图2为杂合DNA制备。
图3为序列两端加接头1。
图4为Surveyor酶识别消化不完全匹配基因序列。
图5为生物素标记突变基因序列。
图6为游离末端加接头。
图7为链酶亲和素磁珠富集突变基因。
图8为高通量测序检测突变基因。
图9为多基因突变位点荧光PCR检测。
图10为一个拷贝的突变序列变成四个拷贝,增加检测灵敏度。
图11为富集前拷贝数,其中红色上蓝色圆点为检测到的突变基因拷贝数。
图12为富集后拷贝数,其中红色上蓝色圆点为检测到的突变基因拷贝数。
图13为一条探针检测同一位点复杂突变DNA,DNA相邻位置有多种突变形式。
图14为荧光PCR同一条探针检测EGFR基因19号外显子突变。其中图14A为扩增曲线;图14B为检测数据。
图15为实施例3中基因检测结果。
具体实施方式
以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述,以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然,所描述的实施例只是本发明的一部分实施例,而不是全部实施例,基于本发明的实施例,本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例,均属于本发明保护的范围。
实施例1
本实施例提供一种富集突变基因序列的方法,流程图见图1,包含以下步骤:
S1:杂合DNA制备:血浆游离DNA(cfDNA)直接进行杂合序列的制备,组织基因组DNA需要用超声打断成200bp左右的序列后再进行杂合序列的制备。肿瘤DNA基因检测序列中含有突变序列,也含有大量的野生型正常序列。利用高温变性将双链DNA变成单链DNA,然后按照Surveyor酶说明书梯度降温的方式将变性的DNA进行复性,将突变的基因序列与对应的正常基因序列复性成杂合序列(图2)。
(1)双链DNA变性和复性的条件为:95℃10min,95℃至85℃(-2.0℃/s),85℃1min,85℃至75℃(-0.3℃/s),75℃1min,75℃至65℃(-0.3℃/s),65℃1min,65℃至55℃(-0.3℃/s),55℃1min,55℃至45℃(-0.3℃/s),45℃1min,45℃至35℃(-0.3℃/s),35℃1min,35℃至25℃(-0.3℃/s),25℃1min,4℃保存;
(2)突变基因序列与对应正常基因序列形成杂合序列:肿瘤基因检测中存在大量的正常基因序列,占少数的突变基因序列更容易与正常序列形成杂合序列,利于后续Surveyor酶的识别剪切。
S2:DNA序列两端加接头(接头1):合成两条互补引物制备接头,其中反向引物序列3’端进行磷酸化修饰封闭3’端序列延伸。将合成的两条引物按摩尔比1:1混合制备接头,将制备好的接头通过TA连接到序列两端(图3)。
(1)接头1的制备:合成两条引物,引物按摩尔比1:1混合,高温变性后梯度降温复性制备双链的接头1。
引物1:5’-GTGAGTGAGGTGGTTGAGGT-3’(SEQ ID NO.1);
引物2:(PHO)3’-CACTCACTCCACCAACTCC-5’(SEQ ID NO.2)。
(2)序列两端加接头:通过TA连接将接头1加到序列两端,接头下游序列3’端磷酸化修饰(PHO/P)的目的是阻断后续实验3’端序列的延伸。
S3:Surveyor酶剪切:Surveyor酶识别并剪切错配DNA序列,正常配对的野生型序列不会被Surveyor酶剪切。步骤1中制备的杂合DNA,由于突变序列与正常序列不完全配对位点会被Surveyor酶剪切,剪切后产生的新的3’末端由于没有被磷酸化可以通过末端转移酶进行末端添加碱基,而正常的DNA序列由于碱基完全互补配对而不会被Surveyor酶剪切(图4)。
S4:生物素标记突变DNA:利用末端转移酶将生物素标记的dCTP(Biotin-dCTP)加入到Surveyor酶剪切后的突变基因3’端,而接头1的3’端磷酸化修饰阻止了末端转移酶将Biotin-dCTP添加到正常DNA序列的3’端(图5)。
S5:生物素标记突变序列加接头(接头2):将粘性末端含dGTP碱基的接头连接到生物素标记的突变序列上。这是突变基因序列同时含有接头1序列,接头2序列,同时还有生物素标记的Biotin-dCTP(图6)。
(1)接头2的制备:同接头1的制备,合成两条引物,引物按摩尔比1:1混合,高温变性后梯度降温复性制备双链的接头2。
引物3:5’-ACAACTCCACTCACCACCTC-3’(SEQ ID NO.3);
引物4:3’-GGGTGTTGAGGTGAGTGGTGGAG-5’(SEQ ID NO.4)。
(2)Biotin-dCTP与接头2连接:Biotin-dCTP与接头粘性末端的dGTP通过CG配对将接头2连接到序列游离末端。
S6:链酶亲和素磁珠富集突变基因:链霉亲和素磁珠通过与Biotin-dCTP结合,富集突变基因序列,去除正常的DNA序列(图7)。
本实施例还提供一种文库构建方法,对链酶亲和素磁珠富集的基因利用PCR扩增引物进行序列扩增构建文库。
所述PCR扩增引物的序列为:
引物5:5’-GTGAGTGAGGTGGTTGAGGT-3’(SEQ ID NO.5);
引物6:5’-GAGGTGGTGAGTGGAGTTGT-3’(SEQ ID NO.6)。
PCR扩增的DNA序列可用于后续高通量测序(图8)和荧光PCR检测突变基因(图9)。若使用荧光PCR检测突变基因:富集的突变基因序列可以利用步骤S1中的引物和突变位点对应的探针直接检测突变基因信息,探针设计在突变基因附近正常基因序列上。若富集的突变基因序列用于多基因突变位点的检测,可以将富集的突变基因用扩增引物先扩增基因序列,再进行多基因突变基因检测。
本实施例中的富集方法增加了突变基因检测的拷贝数,增加了检测的灵敏度。突变DNA与对应的正常DNA形成不完全匹配的双链DNA后被Surveyor酶识别剪切,在错配位点上剪切产生前后两段双链DNA序列,使一条突变DNA序列变成四条后续可用于突变DNA检测序列(图10)。
实施例2
1)通过利用艾德生物游离核酸提取试剂盒提取肺癌患者血浆游离DNA,取20ng的cfDNA直接用于数字PCR检测突变基因拷贝数,同时20ng的cfDNA富集突变基因后在进行数字PCR检测突变基因拷贝数。
1.检测的突变位点是EGFR基因19号外显子E746-A750位点突变,数字PCR检测突变基因拷贝数的引物、探针信息为:
a.直接利用数字PCR检测突变基因的引物、探针信息为:
探针序列:
5’-VIC-AGGAATTAAGAGAAGCA-MGB-NFQ-3’(SEQ ID NO.7);
5’-FAM-CGCTATCAAAACATCTC-MGB-NFQ-3’(SEQ ID NO.8);
引物序列:
F:5’-TCTCTCTGTCATAGGGACTCTG-3’(SEQ ID NO.9);
R:5’-GAGGATTTCCTTGTTGGCTTTC-3’(SEQ ID NO.10);
b.富集后数字PCR检测突变基因的引物、探针信息为:
探针序列:
5’-FAM-TGAGAAAGTTAAAATTCCCGTC–MGB-NFQ-3’(SEQ ID NO.11);
引物序列:
F’:5’-GTGAGTGAGGTGGTTGAGGT-3’(SEQ ID NO.12);
R’:5’-GAGGTGGTGAGTGGAGTTGT-3’(SEQ ID NO.13)。
2.制备20μL的反应液:将引物、探针、20纳克cfDNA模板和2X ddPCR Supermix(nodUTP)混合配置成20μL的数字PCR反应液;将配置好的数字PCR反应液分别转移到八连管中,冰上保存备用。
3.数字PCR反应微滴的制备:将微滴发生卡放入微滴发生器中,先按顺序将八连管中的反应液转移到微滴发生卡中间的孔中,再按发生器的顺序在微滴发生卡最下面一排孔中加入70μL的微滴制备油,将微滴制备的塑胶条(Gaskets)两端的孔分别套在微滴发生器的两端。最后将微滴发生器放入到微滴生成仪中,自动生成数字PCR反应微滴。
4.PCR扩增:将制备好的微滴转移到96孔PCR板中,利用封膜仪将锡箔膜在180℃加热5秒进行封膜,封膜后将PCR板置于PCR扩增仪中进行PCR扩增。
5.突变基因拷贝数分析:PCR结束后,将96孔板置于数字PCR读数仪中进行突变基因拷贝数分析,读取的数据用仪器自带的软件进行分析,获得突变基因拷贝数。
可以看出,本实施例1的富集方法能有效的提升后续突变基因检测拷贝数,对相同的DNA模板量样本进行富集后处理并与富集前进行比较,数字PCR分析突变基因拷贝数,富集后(图12)的样本检测到的突变基因拷贝数比富集前(图11)检测到的突变基因拷贝数能显著提升。
2)荧光PCR检测针对突变基因附近的正常DNA序列设计探针引物,一对引物和一条探针即可检测多种突变形式的基因,除检测已知的突变基因外,同时还可以检测已知突变附近的未知突变基因。避免了现有的荧光PCR检测不同突变位点需要设计不同特异性荧光探针。如肺癌患者EGFR基因在19号外显子的突变在E746-A750位点附近已知多达20几种不同的碱基删除/插入等突变。肺癌患者中KRAS基因突变同样主要集中在G12X和G13X。将探针设计在突变位点附近的正常DNA序列上,利用一条探针即可检测肺癌患者EGFR基因在19号外显子所有的突变信息(E746-A750位点附近信息)(图13)。
具体实施方式如下:
利用一条探针即可检测基因序列相邻位置多种不同形式的复杂突变,同一条探针检测富集后EGFR基因19号外显子在E746_A750序列附近出现不同的突变形式;
探针序列:
5’-FAM-TGAGAAAGTTAAAATTCCCGTC–MGB-NFQ-3’;
引物:
F’:5’-GTGAGTGAGGTGGTTGAGGT-3’;
R’:5’-GAGGTGGTGAGTGGAGTTGT-3’。
对于EGFR基因19号外显子在E746_A750之间不同形式突变的肺癌病人的血浆DNA样本进行富集处理,利用上述相同的探针和引物对样本进行检测。
样本检测使用VIC-MGB标记的探针进行,荧光定量PCR扩增使用70μL的反应体系进行,包括:35μL 2X荧光PCR反应预混液,5μL富集的DNA模板,1.5μL(10mM的引物F),1.5μL(10mM的引物R),0.5μL(10mM的探针)和26.5μL的双蒸水。
在冰架上配置好反应液的八连管在振荡器上混匀15秒后,放于掌上离心机中离心10秒。将八连管反应液放入荧光定量PCR仪器中,并设置反应程序收集荧光检测信号。
对16个EGFR基因19号外显子不同形式突变样本检测结果(图14);每条曲线代表检测到EGFR基因19号外显子的一种突变点。
可以看出:本实施例利用同一条探针即可检测出EGFR基因19号外显子的多种突变位点:E746-A750,E746-T751,E746-A750(ins RP),E746-t751(ins A/I),E756-T751(insVA),E746-S752(ins A/V),L747-E749(A750P),L747-A750(ins P),L747-T751,L747-t751(ins P/S),L747-P753(delinsS)。
实施例3
将实施例1中的方法应用于肿瘤患者突变基因检测。
将1%突变频率的样本用正常人群血浆DNA按等体积混合的方式进行2倍梯度稀释,稀释前后的样本突变频率分别为:1%,0.5%,0.25%,0.125%,0.0625%,0.0313%,0.0156%,0.0078%;取40ng稀释成不同突变频率的样本加入等体积水的方式进行2倍梯度稀释,稀释前后的样本量分别为:40ng,20ng,10ng,5ng,2.5ng,1.25ng,0.625ng,0.313ng。将稀释好的样本按不同的DNA模板量和突变频率进行富集处理,富集处理后的样本溶解在30μL双蒸水中并进行荧光定量PCR检测,每个样本检测进行八个独立PCR管的检测,并计算检出率。检出率的计算为检测到的阳性管数量除以8并乘以100%。
荧光定量PCR检测的方法是:样本使用VIC-MGB标记的探针进行检测,首先配置560μL的反应总体系,然后再将配置好的总反应液按每管70μL分装到8个独立的管中,总反应液的配置是:280μL 2X荧光PCR反应预混液,30μL富集的DNA模板,12μL(10mM的引物F),12μL(10mM的引物R),4μL(10mM的探针)和222μL的双蒸水。将配置好的反应液在振荡器上混匀15秒后,放入离心机中短暂离心10秒。荧光定量PCR仪进行检测并设置反应程序收集荧光检测信号。
结果发现在40ng的血浆DNA中能检测到0.0078%极低突变频率,而对突变基因在1%的样本中,只需0.3125ng DNA即可检出突变基因,具有极高的灵敏度(图15)。
上述具体实施方式对本发明作了详细说明,但是本发明不限于上述实施例,在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内,还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外,在不冲突的情况下,本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
SEQUENCE LISTING
<110> 广州医科大学附属第一医院(广州呼吸中心)
<120> 一种富集突变基因序列的方法和应用
<130>
<160> 13
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gtgagtgagg tggttgaggt 20
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
cactcactcc accaactcc 19
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
acaactccac tcaccacctc 20
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
gggtgttgag gtgagtggtg gag 23
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
gtgagtgagg tggttgaggt 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
gaggtggtga gtggagttgt 20
<210> 7
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
aggaattaag agaagca 17
<210> 8
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
cgctatcaaa acatctc 17
<210> 9
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
tctctctgtc atagggactc tg 22
<210> 10
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
gaggatttcc ttgttggctt tc 22
<210> 11
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
tgagaaagtt aaaattcccg tc 22
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
gtgagtgagg tggttgaggt 20
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
gaggtggtga gtggagttgt 20
Claims (9)
1.一种富集突变基因的方法,包含以下步骤:
S1:制备杂合DNA;
S2:在DNA序列两端连接接头1;
S3:将修饰后的序列进行目标片段分离;
S4:对分离后的序列进行标记;
S5:在标记序列端添加接头2;
S6:目标序列的分离和富集;所述接头1通过引物制备,所述引物序列为:
引物1:5’-GTGAGTGAGGTGGTTGAGGT–3’(SEQ ID NO.1);
引物2:3’-CACTCACTCCACCAACTCC–5’ (SEQ ID NO.2);
其中所述引物2的3’端封闭阻断后续3’端序列的延伸;
所述接头2通过引物制备,所述引物序列为:
引物3:5’-ACAACTCCACTCACCACCTC-3’(SEQ ID NO.3);
引物4:3’-GGGTGTTGAGGTGAGTGGTGGAG-5’(SEQ ID NO.4)。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述目标片段分离包括核酸酶识别突变位点序列。
3.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述标记为生物素标记。
4.根据权利要求3所述的方法,其特征在于,所述步骤S6具体包括:利用亲和素修饰的磁珠将带有标记的突变序列分离富集。
5.权利要求1-4任一项所述的方法在非诊断目的的文库构建或基因检测中的应用。
6.一种文库构建方法,其特征在于:包括采用权利要求1-4任一项所述的方法对目标DNA进行富集后利用PCR扩增引物进行序列扩增构建文库。
7.根据权利要求6所述的方法,其特征在于,所述PCR扩增引物的序列为:
引物5:5’-GTGAGTGAGGTGGTTGAGGT-3’(SEQ ID NO.5);
引物6:5’-GAGGTGGTGAGTGGAGTTGT-3’(SEQ ID NO.6)。
8.一种非诊断目的的基因检测方法,通过检测权利要求1-4任一项所述方法富集的突变基因或权利要求6-7任一项所述的文库构建方法构建的文库。
9.根据权利要求8所述的检测方法,其特征在于,所述检测的方法为高通量测序、荧光定量PCR、数字PCR或质谱。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202111095001.5A CN113774113B (zh) | 2021-09-17 | 2021-09-17 | 一种富集突变基因序列的方法和应用 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202111095001.5A CN113774113B (zh) | 2021-09-17 | 2021-09-17 | 一种富集突变基因序列的方法和应用 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN113774113A CN113774113A (zh) | 2021-12-10 |
CN113774113B true CN113774113B (zh) | 2023-07-04 |
Family
ID=78851925
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202111095001.5A Active CN113774113B (zh) | 2021-09-17 | 2021-09-17 | 一种富集突变基因序列的方法和应用 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN113774113B (zh) |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN105745336A (zh) * | 2013-11-27 | 2016-07-06 | 豪夫迈·罗氏有限公司 | 用于从混合物富集突变核酸的方法 |
CN107893109A (zh) * | 2017-11-08 | 2018-04-10 | 重庆邮电大学 | 一种基于移除野生型序列的低丰度基因突变富集方法 |
Family Cites Families (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20020132244A1 (en) * | 2000-09-27 | 2002-09-19 | Xiao-Cheng Li-Sucholeiki | Methods for detecting rare polymorphic variants in genomic DNA sequences |
US20180298430A1 (en) * | 2017-02-28 | 2018-10-18 | The Board Of Regents, The University Of Texas System | Genomic dna mutation assays and uses thereof |
-
2021
- 2021-09-17 CN CN202111095001.5A patent/CN113774113B/zh active Active
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN105745336A (zh) * | 2013-11-27 | 2016-07-06 | 豪夫迈·罗氏有限公司 | 用于从混合物富集突变核酸的方法 |
CN107893109A (zh) * | 2017-11-08 | 2018-04-10 | 重庆邮电大学 | 一种基于移除野生型序列的低丰度基因突变富集方法 |
Non-Patent Citations (4)
Title |
---|
A Sensitive PCR-Based Method for Somatic Mutations Enrichment and Screening;Yaming Xiong 等;《Cancer Management and Research》;20211027;第13卷;第8099–8107页 * |
Diff-seq: A high throughput sequencing-based mismatch detection assay for DNA variant enrichment and discovery;Dimitra Aggeli等;《Nucleic Acids Research》;20180119;第46卷(第7期);第2页左栏第3段、第3页右栏第3段、第4页方法说明部分第1段、图1、第4页左栏第4段 * |
Dimitra Aggeli等.Diff-seq: A high throughput sequencing-based mismatch detection assay for DNA variant enrichment and discovery.《Nucleic Acids Research》.2018,第46卷(第7期),第1-11页. * |
核酸内切酶Surveyor酶切法快速检测MTB对吡嗪酰胺耐药性方法的建立及评估;胡严杰 等;《中国防痨杂志》;20210831;第43卷(第8期);第813-816页 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN113774113A (zh) | 2021-12-10 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US11725241B2 (en) | Compositions and methods for identification of a duplicate sequencing read | |
WO2022037623A1 (zh) | SARS-CoV-2病毒核酸等温快速检测试剂盒及检测方法 | |
US9745614B2 (en) | Reduced representation bisulfite sequencing with diversity adaptors | |
KR102451174B1 (ko) | 핵산의 다중 검출 | |
US9249460B2 (en) | Methods for obtaining a sequence | |
CN106715713B (zh) | 试剂盒及其在核酸测序中的用途 | |
JP2019216734A (ja) | 核酸プローブ及びゲノム断片検出方法 | |
US11047001B2 (en) | Methods of linearly amplifying whole genome of a single cell | |
WO2017054302A1 (zh) | 测序文库及其制备和应用 | |
EA027558B1 (ru) | Способ обнаружения мультиплексных нуклеиновых кислот | |
CN112195521A (zh) | 一种基于转座酶的dna/rna共建库方法、试剂盒及应用 | |
TW201018731A (en) | Methods for accurate sequence data and modified base position determination | |
CN110117574B (zh) | 一种基于多重pcr富集循环肿瘤dna的方法和试剂盒 | |
CN105567681B (zh) | 一种基于高通量基因测序无创活检病毒的方法及标签接头 | |
JP2020536525A (ja) | プローブ及びこれをハイスループットシーケンシングに適用するターゲット領域の濃縮方法 | |
WO2020223250A1 (en) | Methods for library preparation to enrich informative dna fragments using enzymatic digestion | |
CN116926194A (zh) | 一种检测dna样本甲基化状态的方法 | |
KR20220130592A (ko) | 핵산의 정확한 병렬 정량분석을 위한 고감도 방법 | |
CN113774113B (zh) | 一种富集突变基因序列的方法和应用 | |
CN112011595A (zh) | 一种针对SARS-CoV-2病毒的全基因组扩增方法及应用及测序方法及试剂盒 | |
CN114686561B (zh) | 用于核酸样本扩增的组合物、试剂盒、方法及系统 | |
CN114686580B (zh) | 用于核酸样本扩增的组合物、试剂盒、方法及系统 | |
CN114686579B (zh) | 用于核酸样本扩增的组合物、试剂盒、方法及系统 | |
CN114686562B (zh) | 用于核酸样本扩增的组合物、试剂盒、方法及系统 | |
WO2020259455A1 (zh) | 一种构建PacBio测序文库的方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |