CN102625838B - 用于生成rRNA除尽的样本或者用于从样本分离rRNA的方法、组合物和试剂盒 - Google Patents
用于生成rRNA除尽的样本或者用于从样本分离rRNA的方法、组合物和试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供用于生成rRNA除尽的样本以及用于从样本分离rRNA的方法、组合物和试剂盒。具体地,本发明提供组合物,所述组合物包含与至少一种rRNA分子(例如28S、26S、25S、18S、5.8S和5S真核细胞质rRNA分子,12S和16S真核线粒体rRNA分子,以及23S、16S和5S原核rRNA分子)的大体上所有的rRNA分子对应的亲和标记的反义rRNA分子,并提供方法,所述方法用于利用这类组合物以生成rRNA除尽的样本或者从样本分离rRNA分子。
Description
本申请要求2009年8月14日提交的序列号为61/234,044的美国临时申请的优先权,所述美国临时申请以引用方式全部并入本文。
发明领域
本发明涉及用于生成rRNA除尽的样本以及用于从样本分离rRNA的方法、组合物和试剂盒。具体地,本发明提供组合物,所述组合物包含亲和标记的反义rRNA分子,所述反义rRNA分子显示与rRNA基因编码的至少一种全长rRNA分子的大体上所有的分子互补的序列(例如包含亲和标记的反义rRNA分子的组合物,所述反义rRNA分子显示的序列单独或组合地与选自28S、26S、25S、18S、5.8S和5S真核细胞质rRNA分子,12S和16S真核线粒体rRNA分子以及23S、16S和5S原核rRNA分子的至少一种rRNA分子的大体上所有的分子或者完整序列互补),并提供方法,所述方法用于利用这类组合物以生成rRNA除尽的样本或者从样本分离rRNA。
发明背景
由于rRNA占细胞内RNA的约95%至约98%,它的存在会使得样本中其他相关RNA分子的各类分析(例如,通过阵列或者微阵列的基因表达分析、制自样本中一种或多种类型的RNA分子的标记cDNA分子的下一代测序(例如利用被称为“RNA-seq”的大规模并行数字测序方法),等等)复杂化。由rRNA所引起的诸多问题是对片段化的相关RNA分子进行分析的难题。例如,寻求用于从福尔马林固定的石蜡包埋(FFPE)的组织切片中去除降解rRNA的更好方法便是本领域一个重大的持续存在的问题。如果可得到更好的方法以从样本(例如得自FFPE的样本)去除降解的rRNA,认为大量的临床标本(针对其的各种疾病和各种治疗方法的医疗成果被记录在医病案中)将提供与识别多种疾病(如癌症)的病因、保健、响应、诊断或者预后中涉及的RNA相关的极有价值的信息。进一步地,用于从相关的非rRNARNA分子去除rRNA(包括降解的rRNA)的更好的方法将极大地改善包含故意降解RNA作为具体方法(如Ingolia等人的方法,Science324:218-23,2009,其以引用方式并入本文)的一部分的诸多方法的实用性和成功率。
发明概述
本发明提供用于生成rRNA除尽的样本或者用于从样本分离rRNA的方法、组合物和试剂盒。具体地,本发明提供用于生成包含亲和标记的反义rRNA分子的组合物的方法、包含这类组合物的试剂盒以及用于利用这类组合物以生成rRNA除尽的样本或者从样本分离rRNA(例如用于进一步的分析以及用途)的方法。
在某些实施方式中,本发明提供用于生成一种组合物的方法,所述组合物包含亲和标记的反义rRNA分子,所述反义rRNA分子显示的序列单独或组合地与选自28S、26S、25S、18S、5.8S和5S真核细胞质rRNA分子,12S和16S真核线粒体rRNA分子以及23S、16S和5S原核rRNA分子的至少一种rRNA分子的完整序列互补,其中所述组合物用于一种用于生成rRNA除尽的样本或者用于从样本分离rRNA的方法。在某些实施方式中,所述组合物包含亲和标记的反义rRNA分子,所述反义rRNA分子显示的序列单独或组合地与选自来自一种或者多种细胞或者生物体的28S、26S、25S、18S、5.8S和5S真核细胞质rRNA分子,12S和16S真核线粒体rRNA分子以及23S、16S和5S原核rRNA分子的多种不同的rRNA分子互补。在某些实施方式中,本发明提供用于将包含亲和标记的反义rRNA分子的组合物用于生成rRNA除尽的样本和/或用于从样本分离rRNA的方法。
在某些实施方式中,本发明提供一种包含亲和标记的反义rRNA分子的组合物,所述反义rRNA分子单独或组合地显示一种或多种序列,所述序列与选自28S、26S、25S、18S、5.8S和/或5S真核细胞质rRNA分子以及12S和16S真核线粒体rRNA分子的至少一种全长rRNA分子显示的大体上所有的序列互补。在某些实施方式中,本发明提供一种包含亲和标记的反义rRNA分子的组合物,所述反义rRNA分子单独或组合地显示一种或多种序列,所述序列与选自23S、16S和5S原核rRNA分子的所述至少一种全长rRNA分子显示的大体上所有的序列互补。在具体的实施方式中,所述至少一种全长细胞质rRNA分子包括来自一种或者多种真核细胞、组织、器官或者生物体的28SrRNA和18SrRNA两者(25SrRNA和18SrRNA两者或者26SrRNA和18SrRNA两者)。在某些实施方式中,所述至少一种全长rRNA分子包括来自一种或者多种原核生物体的23SrRNA和16SrRNA两者。在某些其中所述至少一种全长rRNA分子包括来自一种或者多种真核细胞、组织、器官或者生物体的28SrRNA和18SrRNA两者(25SrRNA和18SrRNA两者或者26SrRNA和18SrRNA两者)的实施方式中,所述亲和标记的反义rRNA分子也对应于来自所述一种或者多种真核细胞、组织、器官或者生物体的5.8SrRNA分子和5SrRNA分子。在某些实施方式中,所述亲和标记的反义rRNA分子也对应于至少一种全长rRNA分子,所述全长rRNA分子包括来自所述一种或者多种真核细胞、组织、器官或者生物体的12S和16S真核线粒体rRNA分子两者。在某些实施方式中,所述亲和标记的反义rRNA分子也对应于包括来自一种或者多种原核生物体的23SrRNA和16SrRNA两者的至少一种全长rRNA分子,以及在某些实施方式中,所述亲和标记的反义rRNA分子也对应于包括来自所述一种或者多种原核生物体的5SrRNA分子的至少一种全长rRNA分子。在任何包含亲和标记的反义rRNA分子的组合物的进一步的实施方式中,所述组合物大体上不含包含亲和标记物的非rRNARNA分子。在任何包含亲和标记的反义rRNA分子的组合物的进一步的实施方式中,所述组合物进一步包括包含亲和标记物结合分子的结合基质。
在某些其中所述包含亲和标记的反义rRNA分子的组合物对应于选自28S、26S、25S和18S真核细胞质rRNA分子,12S和16S真核线粒体rRNA分子以及原核23S和16SrRNA分子的至少一种rRNA分子的全部的实施方式中,所述亲和标记的反义rRNA分子被分成片段(例如通过受控核酸酶片段化或者通过利用二价金属阳离子(如Mg2+)和热量的受控片段化)。在某些实施方式中,所述包含片段化的亲和标记的反义rRNA分子的组合物包含的片段大小范围从约3,500核苷酸至约240核苷酸。
在某些实施方式中,本发明提供一种用于生成一种包含亲和标记的反义rRNA分子的组合物的方法,所述方法包括:a)生成包含RNA聚合酶启动子的双链DNA分子,所述RNA聚合酶启动子引导对应于选自25S、26S、28S、18S、5.8S和5S真核细胞质rRNA分子,12S和16S真核线粒体rRNA分子以及23S、16S和5S原核rRNA分子的至少一种rRNA分子的全部的反义RNA的RNA合成;以及b)使所述包含RNA聚合酶启动子的双链DNA分子接触RNA聚合酶和与全部核碱基互补的核糖核苷-5’-三磷酸接触,所述核糖核苷-5’-三磷酸包括至少一对与相同的核碱基互补的核糖核苷-5’-三磷酸,其中所述一对的一个包含亲和标记物以及所述一对的另一个不包含亲和标记物,并于其中生成对应于所述至少一种rRNA分子的序列大体上全部的亲和标记的反义rRNA分子的条件下进行孵育。
关于这类方法,本发明实施方式的发展过程中进行的工作证实了在所述至少一对与相同的核碱基互补的核糖核苷-5’-三磷酸中,包含亲和标记物的核糖核苷-5’-三磷酸分子的浓度相对于缺乏亲和标记物的核糖核苷-5’-三磷酸分子的浓度对于一种组合物的生成非常重要,所述组合物包含可用以从样本去除>95%的所述至少一种rRNA分子的亲和标记的反义rRNA分子,并证实了包含亲和标记物的核糖核苷-5’-三磷酸分子的相对浓度需要高于先前用于本领域的浓度。在本发明用于生成一种包含反义rRNA分子的组合物的方法的某些实施方式中,包含所述至少一对核糖核苷-5’-三磷酸的至少约35%的所述核糖核苷-5’-三磷酸分子包含亲和标记物以及包含所述对的约65%的所述核糖核苷-5’-三磷酸分子不具有亲和标记物。在本方法的某些实施方式中,包含所述至少一对核糖核苷-5’-三磷酸的至少约40%的所述核糖核苷-5’-三磷酸分子具有亲和标记物以及包含所述对的约60%的所述核糖核苷-5’-三磷酸分子不具有亲和标记物。在本方法的某些实施方式中,包含所述至少一对核糖核苷-5’-三磷酸的至少约50%的所述核糖核苷-5’-三磷酸分子具有亲和标记物以及包含所述对的约50%的所述核糖核苷-5’-三磷酸分子不具有亲和标记物。在本方法的某些实施方式中,包含所述至少一对核糖核苷-5’-三磷酸的至少约60%的所述核糖核苷-5’-三磷酸分子具有亲和标记物以及包含所述对的约40%的所述核糖核苷-5’-三磷酸分子不具有亲和标记物。在本方法的某些实施方式中,其中所述至少一种rRNA分子选自5.8S和5S真核细胞质rRNA,以及原核5SrRNA,包含所述至少一对核糖核苷-5’-三磷酸的至少约75%的所述核糖核苷-5’-三磷酸分子具有亲和标记物以及包含所述对的25%的所述核糖核苷-5’-三磷酸分子不具有亲和标记物。
在某些其他实施方式中,本发明提供一种用于生成一种包含亲和标记的反义rRNA分子的组合物的方法,所述方法包含:a)生成包含RNA聚合酶启动子的双链DNA分子,所述RNA聚合酶启动子引导对应于选自25S、26S、28S、18S、5.8S和5S真核细胞质rRNA分子,12S和16S真核线粒体rRNA分子以及23S、16S和5S原核rRNA分子的至少一种rRNA分子的全部的反义RNA的RNA合成;b)使所述包含RNA聚合酶启动子的双链DNA分子接触RNA聚合酶和与全部核碱基互补的核糖核苷-5’-三磷酸接触,所述核糖核苷-5’-三磷酸包括至少一种包含亲和标记反应部分(例如尿苷的位置5上的烯丙氨基团)的核糖核苷-5’-三磷酸,并于其中生成包含所述亲和标记反应部分的反义rRNA分子的条件下进行孵育,所述反义rRNA分子对应于所述至少一种rRNA分子的大体上全部的序列;以及c)在其中所述亲和标记试剂与包含所述亲和标记反应部分的所述反义rRNA分子中的所述亲和标记反应部分的至少部分反应并生成亲和标记的反义rRNA分子的条件下,使包含所述亲和标记反应部分的所述反义rRNA分子接触一些亲和标记试剂(例如威斯康星州麦迪逊的EPICENTREBiotechnologies的Biotin-X-X-NHS)。
本发明实施方式的发展过程中进行的工作发现了在所述亲和标记的反义rRNA分子中,给定的每单位数目的核碱基亲和标记物的相对数目对于一种组合物的生成非常重要,所述组合物包含可用以从样本去除>95%的所述至少一种rRNA分子的亲和标记的反义rRNA分子,并发现了在利用所述方法生成的所述亲和标记的反义rRNA分子中,给定的每单位数目的核碱基亲和标记物的数目基于步骤b)中生成的所述反义rRNA分子中存在的所述亲和标记反应部分的量、所述亲和标记试剂的性能和浓度、反应条件和反应时间而有所不同。因而,在本方法的某些实施方式中,包含一种特定核碱基的100%的核糖核苷-5’-三磷酸分子具有亲和标记反应部分。在本方法的某些其他实施方式中,所述核糖核苷-5’-三磷酸包括至少一对与相同的核碱基互补的核糖核苷-5’-三磷酸,所述一对的一个包含亲和标记反应部分(例如具有尿苷的位置5上的烯丙氨基反应基团的UTP或者“AA-UTP”)以及所述一对的另一个不包含亲和标记物。在本方法的某些实施方式中,包含所述至少一对核糖核苷-5’-三磷酸的至少约50%的所述核糖核苷-5’-三磷酸分子具有亲和标记反应部分以及包含所述对的约50%的所述核糖核苷-5’-三磷酸分子不具有亲和标记反应部分。在本方法的某些实施方式中,包含所述至少一对核糖核苷-5’-三磷酸的至少约75%的所述核糖核苷-5’-三磷酸分子具有亲和标记反应部分以及包含所述对的25%的所述核糖核苷-5’-三磷酸分子不具有亲和标记反应部分。在本方法的某些实施方式中,所述亲和标记试剂是生物素化试剂(例如生物素-X-X-NHS)以及所述亲和标记物包含生物素。在某些实施方式中,所述生物素通过间隔臂被连接至所述核碱基(例如,连接至尿苷的位置5上的烯丙氨基团的间隔臂,例如,自结合AA-UTP)。
在进一步的实施方式中,本发明提供一种用于生成一种包含反义rRNA分子的组合物的方法,所述方法包含:a)生成包含RNA聚合酶启动子的双链DNA分子,所述RNA聚合酶启动子引导对应于选自25S、26S、28S、18S、5.8S和5S真核细胞质rRNA分子,12S和16S真核线粒体rRNA分子以及23S、16S和5S原核rRNA分子的至少一种rRNA分子的全部的反义RNA的RNA合成;以及b)使所述包含RNA聚合酶启动子的双链DNA分子接触RNA聚合酶和与全部核碱基互补的核糖核苷-5’-三磷酸接触,所述核糖核苷-5’-三磷酸包括至少一对与相同的核碱基互补的核糖核苷-5’-三磷酸,其中所述一对的一个包含亲和标记物以及所述一对的另一个不包含亲和标记物,并于其中生成对应于所述至少一种rRNA分子的序列大体上全部的亲和标记的反义rRNA分子的条件下进行孵育,其中所述亲和标记物的存在比例为:根据制造商威斯康星州麦迪逊的EPICENTREBiotechnologies提供的RNA酶1文献,在36℃下用RNA酶1消化所述亲和标记的反义rRNA45分钟后,所述亲和标记的反义rRNA分子中每百个核碱基至少两个亲和标记物(例如,基于根据伊利诺斯州罗克福德的PierceBiotechnology的荧光生物素定量试剂盒提供的教导进行的亲和标记的反义rRNA的200ng的荧光定量;类别号为Thermo46610)。在本方法的某些其他实施方式中,所述亲和标记物的存在比例为:所述亲和标记的反义rRNA分子中每百个核碱基至少约三到五个亲和标记物(例如,基于利用Pierce荧光生物素定量试剂盒获得的荧光数据)。在本方法的某些其他实施方式中,所述亲和标记物的存在比例为:所述亲和标记的反义rRNA分子中每百个核碱基至少约四到六个亲和标记物(例如,基于利用Pierce荧光生物素定量试剂盒获得的荧光数据)。在本方法的某些其他实施方式中,所述亲和标记物的存在比例为:所述亲和标记的反义rRNA分子中每百个核碱基至少约六到八个亲和标记物(例如,基于利用Pierce荧光生物素定量试剂盒获得的荧光数据)。在本方法的某些实施方式中,其中所述至少一种rRNA分子选自28S、26S、25S和18S真核细胞质rRNA分子,12S和16S真核线粒体rRNA分子以及23S和16S原核rRNA分子,包含与相同核碱基互补的所述至少一对核糖核苷-5’-三磷酸的至少约35%至约50%的所述核糖核苷-5’-三磷酸包含亲和标记物(例如,包含生物素,例如生物素-16-UTP的亲和标记物)以及所述亲和标记物存在于所述亲和标记的反义rRNA分子中,所述亲和标记的反义rRNA分子以每百个核碱基至少约两到八个亲和标记物的比例而生成(例如,基于利用Pierce荧光生物素定量试剂盒获得的荧光数据)。在本方法其中所述至少一种rRNA分子选自5.8S和5S真核rRNA分子以及5S原核rRNA分子的某些实施方式中,包含所述至少一对与相同核碱基互补的核糖核苷-5’-三磷酸的至少约60%至约75%的核糖核苷-5’-三磷酸包含亲和标记物(例如,包含生物素,例如生物素-16-UTP的亲和标记物)以及所述亲和标记物存在于所述亲和标记的反义rRNA分子中,所述亲和标记的反义rRNA分子以每百个核碱基至少约两到八个亲和标记物的比例而生成(例如,基于利用Pierce荧光生物素定量试剂盒获得的荧光数据)。
在进一步的实施方式中,本发明提供一种用于生成一种包含反义rRNA分子的组合物的方法,所述方法包含:a)生成包含RNA聚合酶启动子的双链DNA分子,所述RNA聚合酶启动子引导对应于选自25S、26S、28S、18S、5.8S和5S真核细胞质rRNA分子,12S和16S真核线粒体rRNA分子以及23S、16S和5S原核rRNA分子的至少一种rRNA分子的全部的反义RNA的RNA合成;b)使所述包含RNA聚合酶启动子的双链DNA分子接触RNA聚合酶和与全部核碱基互补的核糖核苷-5’-三磷酸接触,所述核糖核苷-5’-三磷酸包括至少一种包含亲和标记反应部分(例如尿苷的位置5上的烯丙氨基团)的核糖核苷-5’-三磷酸,并于其中生成包含所述亲和标记反应部分的反义rRNA分子的条件下进行孵育,所述反义rRNA分子对应于所述至少一种rRNA分子的大体上全部的序列;以及c)在其中所述亲和标记试剂与包含所述亲和标记反应部分的所述反义rRNA分子中的所述亲和标记反应部分反应并生成亲和标记的反义rRNA分子的条件下,使包含所述亲和标记反应部分的所述反义rRNA分子接触一些亲和标记试剂(例如威斯康星州麦迪逊的EPICENTREBiotechnologies的Biotin-X-X-NHS),其中所述亲和标记物的存在比例为:所述亲和标记的反义rRNA分子中每百个核碱基至少约两个亲和标记物(例如,基于利用来自伊利诺斯州罗克福德的PierceBiotechnology的荧光生物素定量试剂盒进行的RNA酶1消化的亲和标记的反义rRNA分子(200ng)的荧光定量。在本方法的某些其他实施方式中,所述亲和标记物的存在比例为:所述亲和标记的反义rRNA分子中每百个核碱基至少约三到五个亲和标记物(例如,基于利用Pierce荧光生物素定量试剂盒获得的荧光数据)。在本方法的某些其他实施方式中,所述亲和标记物的存在比例为:所述亲和标记的反义rRNA分子中每百个核碱基至少约四到六个亲和标记物(例如,基于利用Pierce荧光生物素定量试剂盒获得的荧光数据)。在本方法的某些其他实施方式中,所述亲和标记物的存在比例为:所述亲和标记的反义rRNA分子中每百个核碱基至少约六到八个亲和标记物(例如,基于利用Pierce荧光生物素定量试剂盒获得的荧光数据)。
在本文任何所述的用于生成亲和标记的反义rRNA分子的方法的某些实施方式中,所述亲和标记物包含生物素。在某些实施方式中,所述生物素通过间隔臂连接至尿苷的位置5。在任何这些方法的某些实施方式中,所述RNA聚合酶选自T7RNA聚合酶、T3RNA聚合酶和SP6RNA聚合酶。在任何这些方法的某些实施方式中(其中所述至少一种rRNA分子选自真核细胞质25S、26S和28SrRNA分子),所述RNA聚合酶是SP6RNA聚合酶。在任何这些方法的某些实施方式中(其中所述至少一种rRNA分子是原核23SrRNA),所述RNA聚合酶是SP6RNA聚合酶。
在任何上述用于生成亲和标记的反义rRNA分子的方法的某些实施方式中,所述方法进一步包含生成所述反义rRNA分子后,在其中消化所述包含RNA聚合酶启动子的双链DNA分子的条件下,将所述包含RNA聚合酶启动子的双链DNA分子与DNase酶接触。
在任何所述的用于生成亲和标记的反义rRNA分子的方法的某些实施方式中,所述方法的步骤a)(包含“生成包含RNA聚合酶启动子的双链DNA分子,所述RNA聚合酶启动子引导对应于选自25S、26S、28S、18S、5.8S和5S真核细胞质rRNA分子,12S和16S真核线粒体rRNA分子以及23S、16S和5S原核rRNA分子的至少一种rRNA分子的全部的反义RNA的RNA合成”)或者包含:i)在如下条件下以DNA聚合酶和至少一种引物对孵育所述至少一种rRNA分子:其中生成包含RNA聚合酶启动子的双链DNA分子,所述RNA聚合酶启动子能够引导对应于所述至少一种rRNA分子的全部的反义RNA的RNA合成,其中每个所述至少一种引物对包含正向引物和反向引物,其中所述反向引物退火至所述至少一种rRNA分子并具有显示RNA聚合酶启动子一个链的序列的5′部分以及所述正向引物退火至生成自所述反向引物的DNA;或者包含ii)在如下条件下以DNA聚合酶和至少一种引物对孵育所述至少一种rRNA分子:其中生成双链DNA分子,其中每个所述至少一种引物对包含正向引物和反向引物,其中所述反向引物在退火至所述至少一种rRNA分子后引发DNA合成以及所述正向引物退火至生成自所述反向引物的DNA聚合酶延伸的DNA后引发DNA合成,然后将生成自每个至少一种引物对的所述双链DNA分子连接入包含RNA聚合酶启动子的DNA载体,其中RNA聚合酶启动子能够利用作为模板被连接入所述DNA载体的所述双链DNA来引导与所述至少一种rRNA分子互补的反义RNA的合成。
在任何所述的用于生成亲和标记的反义rRNA分子的方法的某些实施方式中,所述方法的步骤a)(包含“生成包含RNA聚合酶启动子的双链DNA分子,所述RNA聚合酶启动子引导对应于选自25S、26S、28S、18S、5.8S和5S真核细胞质rRNA分子,12S和16S真核线粒体rRNA分子以及23S、16S和5S原核rRNA分子的至少一种rRNA分子的全部的反义RNA的RNA合成”)包含获得编码所述至少一种rRNA分子的基因组DNA片段以及或者包含:i)使所述基因组DNA片段与DNA聚合酶和至少一种引物对接触,其中所述至少一种引物对的每个的第一引物具有5’部分(所述5’部分显示RNA聚合酶启动子的一个链的序列)和3’部分(所述3’部分与所述基因组DNA片段的第一链的部分互补)以及所述至少一种引物对的每个的第二引物与所述基因组DNA片段的第二链的部分互补,以及在如下条件下进行孵育:其中生成所述基因组DNA片段的至少部分的含RNA聚合酶启动子的双链DNA副本,其中所述RNA聚合酶启动子能够引导对应于所述至少一种rRNA分子的全部的反义RNA的RNA合成;或者包含:ii)将所述基因组DNA片段或者其PCR扩增产物连接入包含RNA聚合酶启动子的DNA载体以获得基因组克隆,其中所述基因组克隆中的所述RNA聚合酶启动子能够利用作为模板被连接入所述DNA载体的所述双链DNA来引导与所述至少一种rRNA分子互补的反义RNA的合成。
在所述用于生成亲和标记的反义rRNA分子的方法以及利用所述方法生成的组合物的某些实施方式中,所述亲和标记的反义rRNA分子未显示任何rRNA内部转录间隔序列。在某些其他实施方式中,所述亲和标记的反义rRNA分子显示选自如下的内部转录间隔序列:i)由ITS1rRNA间隔区域显示的序列,所述ITS1rRNA间隔区域位于真核18SrRNA基因和真核5.8SrRNA基因之间;ii)由ITS2rRNA间隔区域显示的序列,所述ITS2rRNA间隔区域位于真核5.8SrRNA基因和真核28SrRNA基因之间;iii)由原核16S-23SITS显示的序列;以及iv)由原核23S-5SrRNAITS显示的序列。
在某些实施方式中,本发明提供一种包含亲和标记的反义rRNA分子的组合物,所述亲和标记的反义rRNA分子被结合至包含亲和标记物结合分子的结合基质,其中所述亲和标记的反义rRNA分子单独或者组合地显示对应于选自25S、26S、28S、18S、5.8S和5S真核细胞质rRNA分子,12S和16S真核线粒体rRNA分子以及23S、16S和5S原核rRNA分子的至少一种全长rRNA分子的大体上全部分子的序列。
在结合条件下,其中所述亲和标记物结合至被附至基质或者固体载体(例如微粒)的亲和标记物结合分子以形成特异性结合对,通过以包含所述亲和标记物结合分子的结合基质孵育所述包含亲和标记的反义rRNA分子的组合物来生成一种包含亲和标记的反义rRNA分子的组合物,所述亲和标记的反义rRNA分子被结合至包含亲和标记物结合分子的结合基质。在某些实施方式中,本方法进一步包含在如下条件下清洗所述组合物的步骤:其中去除非特异性结合至所述结合基质的亲和标记的反义rRNA分子,从而生成一种纯化的组合物,所述组合物包含被结合至所述结合基质的亲和标记的反义rRNA分子。
在本发明这方面的具体实施方式中,所述包含被结合至结合基质的亲和标记的反义rRNA分子的组合物可以是本文所述的亲和标记的反义rRNA分子的任何组合物并可以利用任何用于生成一种包含本文所述的反义rRNA分子的组合物的方法生成。
在该类组合物的一个具体实施方式中,所述亲和标记的反义rRNA分子包含生物素作为所述亲和标记物,其中所述生物素被连接至所述反义rRNA分子的每百个核碱基中至少约两个核碱基,以及所述结合基质包含微粒,包含链酶亲和素或者亲和素的亲和标记物结合分子附至所述微粒。在该类组合物的某些其他实施方式中,所述亲和标记的反义rRNA分子包含生物素作为所述亲和标记物,其中所述生物素被连接至所述反义rRNA分子的每百个核碱基中至少约两至四个核碱基,或者连接至所述反义rRNA分子的每百个核碱基中至少约三至五个核碱基,或者连接至所述反义rRNA分子的每百个核碱基中至少约四至六个核碱基,或者连接至所述反义rRNA分子的每百个核碱基中至少约六至八个核碱基。
在本发明的某些实施方式中,任何所述包含亲和标记的反义rRNA分子的组合物(包括任何所述包含被结合至结合基质的亲和标记的反义rRNA分子的组合物)被用于本发明的一种用于生成rRNA除尽的样本或者用于分离单独或组合地显示至少一种全长rRNA分子的序列的大体上所有RNA分子的方法。
在某些实施方式中,本发明提供用于从初始样本生成rRNA除尽的样本的方法,所述方法包含:a)提供i)包含RNA分子的初始样本,其中所述RNA分子包含rRNA分子和至少一种相关的非rRNARNA分子;ii)包含亲和标记的反义rRNA分子的组合物,所述亲和标记的反义rRNA分子单独或者组合地显示对应于选自25S、26S、28S、18S、5.8S和5S真核细胞质rRNA分子,12S和16S真核线粒体rRNA分子以及23S、16S和5S原核rRNA分子的至少一种全长rRNA分子的大体上全部分子的序列;以及iii)包含亲和标记物结合分子的结合基质(例如微粒);b)在一定条件下使所述初始样本接触所述组合物,以便至少部分所述亲和标记的反义rRNA分子和至少部分所述rRNA分子形成双链rRNA杂交体,从而生成处理后的样本;c)在一定条件下使所述处理后的样本接触所述结合基质,以便所述双链rRNA杂交体的至少部分结合至所述结合基质并得以从所述处理后的样本去除,从而生成rRNA除尽的样本,其中所述rRNA除尽的样本大体上不含所述至少一种rRNA分子显示的rRNA序列以及包含存在于所述初始样本的大体上全部的所述至少一种相关的非rRNARNA分子(例如存在于所述初始样本的至少>90%……,>95%……,>98%……,>99%……,>99.8%……或者>99.9%的所述至少一种相关的非rRNARNA分子)。
在某些实施方式中,重复一个或多个步骤和/或执行其他的方法以生成所述rRNA除尽的样本。在具体的实施方式中,所述方法以削减的重复循环(repeatedroundsofsubtraction)方式执行以生成所述rRNA除尽的样本。在具体的实施方式中,所述初始样本中所述RNA分子的至少部分被高度片段化,以及其中所述rRNA除尽的样本至少50%……60%……70%……80%……90.0%……95%……98%……99%……或者100%不含所述至少一种rRNA分子显示的rRNA序列。
在某些实施方式中,本发明提供用于从初始样本生成rRNA除尽的样本的方法,所述方法包含:a)提供i)包含RNA分子的初始样本,其中所述RNA分子包含rRNA分子和至少一种相关的非rRNARNA分子;ii)包含亲和标记的反义rRNA分子的组合物,所述亲和标记的反义rRNA分子单独或者组合地与选自25S、26S、28S、18S、5.8S和5S真核细胞质rRNA分子,12S和16S真核线粒体rRNA分子以及23S、16S和5S原核rRNA分子的所述至少一种rRNA分子显示的大体上全部的序列互补;以及iii)包含亲和标记物结合分子的结合基质(例如微粒);b)在一定条件下使所述初始样本接触所述组合物,以便至少部分所述亲和标记的反义rRNA分子和至少部分所述rRNA分子形成双链rRNA杂交体,从而生成处理后的样本;c)在一定条件下使所述处理后的样本接触所述结合基质,以便所述双链rRNA杂交体的至少部分结合至所述结合基质并得以从所述处理后的样本去除,从而生成rRNA除尽的样本,其中所述rRNA除尽的样本包含存在于所述初始样本的大体上全部(例如>90%……,>95%……,>98%……,>99%……,>99.8%……或者>99.9%)的所述至少一种相关的非rRNARNA分子以及大体上不含(例如>95%……,>98%……,>99%……,>99.8%……或者>99.9%不含)存在于所述初始样本的所述至少一种rRNA分子显示的rRNA序列。
在其他的实施方式中,本发明提供用于从初始样本生成rRNA除尽的样本的方法,所述方法包含:a)提供i)包含RNA分子的初始样本,其中所述RNA分子包含rRNA分子和至少一种相关的非rRNARNA分子;ii)包含亲和标记的反义rRNA分子的组合物,所述亲和标记的反义rRNA分子与选自25S、26S、28S、18S、5.8S和5S真核细胞质rRNA分子,12S和16S真核线粒体rRNA分子以及23S、16S和5S原核rRNA分子的所述至少一种rRNA分子显示的大体上全部的序列互补,其中所述亲和标记物以所述反义rRNA分子中每百个核碱基至少约两个到至少四个亲和标记物的比例存在于所述反义rRNA分子上;以及iii)包含亲和标记物结合分子的结合基质;b)在一定条件下使所述初始样本接触所述组合物,以便至少部分所述亲和标记的反义rRNA分子和至少部分所述rRNA分子形成双链rRNA杂交体,从而生成处理后的样本;c)在如下条件下使所述处理后的样本接触所述结合基质:其中所述双链rRNA杂交体的至少部分结合至所述结合基质并得以从所述处理后的样本去除,从而生成rRNA除尽的样本,其中所述rRNA除尽的样本包含存在于所述初始样本的大体上全部(例如>90%……,>95%……,>98%……,>99%……,>99.8%……或者>99.9%)的所述至少一种相关的非rRNARNA分子以及大体上不含(例如>95%……,>98%……,>99%……,>99.8%……或者>99.9%不含)单独或者组合地显示存在于所述初始样本的所述至少一种rRNA分子内的序列的分子。
在某些实施方式中,本发明提供用于从初始样本生成rRNA除尽的样本的方法,所述方法包含:a)提供i)包含RNA分子的初始样本,其中所述RNA分子包含rRNA分子和至少一种相关的非rRNARNA分子;ii)包含亲和标记的反义rRNA分子的组合物,所述亲和标记的反义rRNA分子与选自25S、26S、28S、18S、5.8S和5S真核细胞质rRNA分子,12S和16S真核线粒体rRNA分子以及23S、16S和5S原核rRNA分子的所述至少一种rRNA分子显示的大体上全部的序列互补;以及iii)包含亲和标记物结合分子的结合基质(例如微粒);b)在一定条件下使所述初始样本接触所述组合物,以便至少部分所述亲和标记的反义rRNA分子和至少部分所述rRNA分子形成双链rRNA杂交体,从而生成处理后的样本;c)在一定条件下使所述处理后的样本接触所述结合基质,以便所述双链rRNA杂交体的至少部分结合至所述结合基质并得以从所述处理后的样本去除,从而生成rRNA除尽的样本,其中所述rRNA除尽的样本包含存在于所述初始样本的大体上全部(例如>90%……,>95%……,>98%……,>99%……,>99.8%……或者>99.9%)的所述至少一种相关的非rRNARNA分子以及其中,所述rRNA除尽的样本或者是:i)≥99.0%不含(例如>99.0%、99.1%,、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、99.9%、99.95%或者99.99%不含)单独或者组合地显示存在于所述初始样本的所述至少一种rRNA分子内的序列的RNA分子,或者是:ii)包含如利用琼脂糖凝胶电泳和溴化乙锭染色进行测量,来自所述初始样本的水平检测不出的所述至少一种rRNA分子。
在某些实施方式中,本发明提供用于从初始样本生成rRNA除尽的样本的方法,所述方法包含:a)提供i)包含RNA分子的初始样本,其中所述RNA分子包含rRNA分子和至少一种相关的非rRNARNA分子;ii)包含亲和标记的反义rRNA分子的组合物,所述亲和标记的反义rRNA分子被结合至结合基质(例如包含亲和标记物结合分子的微粒),其中所述亲和标记的反义rRNA分子单独或者组合地显示对应于选自25S、26S、28S、18S、5.8S和5S真核细胞质rRNA分子,12S和16S真核线粒体rRNA分子以及23S、16S和5S原核rRNA分子的至少一种全长rRNA分子的大体上全部分子的序列;b)在一定条件下使所述初始样本接触所述组合物,以便所述组合物中的至少部分所述亲和标记的反义rRNA分子和至少部分所述rRNA分子形成被结合至所述结合基质的双链rRNA杂交体,从而生成处理后的样本;c)去除结合有所述双链rRNA杂交体的所述结合基质,从而生成rRNA除尽的样本,其中所述rRNA除尽的样本:i)大体上不含所述至少一种rRNA分子显示的rRNA序列以及包含存在于所述初始样本的大体上全部的所述至少一种相关的非rRNARNA分子(例如存在于所述初始样本的至少>90%……,>95%……,>98%……,>99%……,>99.8%……或者>99.9%的所述至少一种相关的非rRNARNA分子)以及ii)或者大体上不含(例如>95%……,>98%……,>99%……,>99.8%……或者>99.9%不含)由存在于所述初始样本的所述至少一种rRNA分子显示的rRNA序列,或者包含如利用琼脂糖凝胶电泳和溴化乙锭染色进行测量,来自所述初始样本的水平检测不出的所述至少一种rRNA分子。在本发明本方法的具体实施方式中,所述包含被结合至结合基质的亲和标记的反义rRNA分子的组合物可以是本文所述的亲和标记的反义rRNA分子的任何组合物和/或通过利用任何用于生成一种包含本文所述的反义rRNA分子的组合物的方法得以生成。
在任何所述用于生成rRNA除尽的样本的方法的具体实施方式中,所述rRNA除尽的样本98.0%不含显示所述至少一种rRNA分子内的序列的rRNA分子(例如,98.0%不含、98.5%不含、99.0%不含、99.5%不含、99.7%不含、99.9%不含、99.99%不含或者100%不含)。在其他实施方式中,所述至少一种rRNA分子包括所述28SrRNA和所述18SrRNA两者,以及其中所述rRNA除尽的样本99.0%不含(例如99.5%不含)显示所述28SrRNA基因和所述18SrRNA基因内的序列的rRNA分子。在其他实施方式中,所述rRNA除尽的样本包含显示所述至少一种rRNA分子内的序列的水平检测不出的rRNA分子(例如利用琼脂糖凝胶电泳和溴化乙锭染色进行测量检测不出)。在所述方法的某些实施方式中,所述包含亲和标记的反义rRNA分子的组合物未显示任何rRNA内部转录间隔序列。在所述方法的某些其他实施方式中,所述包含反义rRNA分子的组合物显示选自如下的内部转录间隔序列:i)由所述ITS1rRNA间隔区域显示的序列,所述ITS1rRNA间隔区域位于真核18SrRNA基因和真核5.8SrRNA基因之间;ii)由所述ITS2rRNA间隔区域显示的序列,所述ITS2rRNA间隔区域位于真核5.8SrRNA基因和真核28SrRNA基因之间;iii)由原核16S-23SITS显示的序列;以及iv)由原核23S-5SrRNAITS显示的序列。在所述用于生成rRNA除尽的样本或者用于从样本分离rRNA的方法的具体实施方式中,利用一种包含未显示任何rRNA内部转录间隔序列的反义rRNA分子的组合物来执行步骤b),然而,在其他实施方式中,利用一种包含显示一种或多种所述内部转录间隔序列的亲和标记的反义rRNA分子的组合物来执行步骤b)。
在任何所述用于从初始样本生成rRNA除尽的样本的方法的某些实施方式中,其中所述初始样本包含RNA分子,所述RNA分子包含rRNA分子和至少一种相关的非rRNARNA分子,所述初始样本中的所述RNA分子被片段化(例如,在提供入所述初始样本之前片段化自FFPE或者其他包含降解RNA分子的样本,或者自这样的样本:其中所述RNA分子被刻意降解(例如在热和Mg2+的存在下通过孵育)。在本发明的任何所述用于生成rRNA除尽的样本的方法的某些实施方式中,所述至少一种相关的非rRNARNA分子包含多种相关的非rRNA分子。在某些实施方式中,所述至少一种相关的非rRNARNA分子包含存在于所述初始样本中的大体上所有的所述非rRNARNA分子(例如,包括存在于所述初始样本中的全段和片段化的非rRNARNA分子两类)。在某些实施方式中,所述至少一种相关的非rRNARNA分子包含存在于所述初始样本中的大体上所有的所述真核mRNA分子。在某些实施方式中,所述至少一种相关的非rRNARNA分子包含大体上所有的非rRNARNA分子,所述非rRNARNA分子包含来自一种或者多种真核细胞、组织、器官或者生物体的转录组(减掉所述至少一种rRNA分子)(例如,用于制作例如用于分别通过数字表达分析或者微阵列分析来分析所述至少一种相关的非rRNARNA分子的表达或者相对表达的测序模板或者标记的靶核酸)。在某些实施方式中,所述至少一种相关的非rRNARNA分子包含非rRNARNA分子,所述非rRNARNA分子包含一种或者多种真核细胞、组织、器官或者生物体的转录组(减掉所述至少一种rRNA分子)(例如,用于制作例如用于分别通过数字表达分析或者微阵列分析来分析所有的所述非rRNARNA分子的表达或者相对表达的测序模板或者标记的靶核酸,例如,用于医学或者农业分析)。在某些实施方式中,所述至少一种相关的非rRNARNA分子包含一个分支的非rRNARNA分子,所述非rRNARNA分子包含一种或者多种细胞、组织、器官或者生物体的转录组(减掉所述至少一种rRNA分子)(例如,选自mRNA分子、miRNA分子、ncRNA分子、piwiRNA、snRNA等等的分支)(例如,用于制作例如用于分别通过数字表达分析或者微阵列分析来分析所述分支的非rRNARNA分子的表达或者相对表达的测序模板或者标记的靶核酸,例如,用于医学或者农业分析)。在某些实施方式中,所述至少一种相关的非rRNARNA分子包含大体上所有的非rRNARNA分子,所述非rRNARNA分子包含一种或者多种原核细胞或者一种或者多种细胞(包含真核和原核细胞)的转录组(减掉所述至少一种rRNA分子)。在某些实施方式中,所述至少一种相关的非rRNARNA分子包含如下或者由如下组成:显示特异性核酸序列的一种或者多种RNA分子(例如,其中所述显示特异性核酸序列的一种或者多种RNA分子的存在或者缺乏或者其量被用以检测病原体或者医学病症,例如,用于筛选(例如,用以对水中、表面上(如医院表面)等等的病原体的存在进行筛选),或者例如,用于诊断或者治疗诊断检定(例如,用于诊断或者监测病原体的数量,或者疾病或者医学病症的状态,以选定疗法或者治疗方法)。
在本发明任何所述用于生成rRNA除尽的样本的方法的某些实施方式中,所述方法进一步包含将所述rRNA除尽的样本或者包含在其中的所述至少一种相关的非rRNARNA分子用于进一步的分析或者用途。在某些实施方式中,所述方法进一步包含将所述至少一种相关的非rRNARNA分子作为一种用于生成用于下一代DNA测序(例如,用于数字表达分析或者RNA-Seq、miRNA图谱等等)的模板的方法的一部分。在所述用于生成rRNA除尽的样本的方法的某些实施方式中,所述方法进一步包含将所述至少一种相关的非rRNARNA分子作为一种用于生成用以杂交至多孔或者无孔表面上阵列或者微阵列探针(例如,杂交至阵列或者微阵列上的探针、斑点印迹等等)的标记靶核酸分子的方法的一部分。在所述用于生成rRNA除尽的样本的方法的某些实施方式中,所述方法进一步包含将所述rRNA除尽的样本用于执行诊断或者治疗诊断检定,以对所述至少一种相关的非rRNARNA分子的存在进行检测(例如,其中所述至少一种相关的非rRNARNA分子的存在或者量指示健康或者疾病的存在或者状态)。在所述用于生成rRNA除尽的样本的方法的某些实施方式中,所述方法进一步包含扩增所述至少一种相关的非rRNARNA分子用于进一步的分析或者用途。在所述用于生成rRNA除尽的样本的方法的某些实施方式中,所述方法进一步包含将所述至少一种相关的非rRNARNA分子或者其扩增产物用于真核细胞(例如抗原呈递细胞(APC),如树突细胞、巨噬细胞或者用于免疫疗法用途的人造APC)的转染。在某些实施方式中,所述至少一种相关的非rRNARNA分子或者其扩增产物被用于转染人类或者动物细胞,所述人类或者动物细胞来源的个体与获得所述至少一种相关的非rRNARNA分子的个体相同(例如,制作用于免疫疗法用途的包含所述APC-转染的细胞的疫苗,以治疗人类或者动物个体内的疾病,例如癌症)。在某些实施方式中,所述至少一种相关的非rRNARNA分子或者其扩增产物被用于转染细胞,所述细胞来源的人类或者动物与获得所述至少一种相关的非rRNARNA分子的人类或者动物不同(例如,制作用于免疫疗法用途的包含所述APC-转染的细胞的疫苗,以治疗人类或者动物个体内的疾病,例如癌症)。在某些实施方式中,所述RNA疫苗通过利用来自第一个体的所述至少一种相关的非rRNARNA制成以及所述RNA疫苗用以接种第二个体。在所述用于生成rRNA除尽的样本的方法的某些实施方式中,所述方法进一步包含利用所述至少一种相关的非rRNARNA分子或者其扩增产物以制造用于治疗用途的RNA疫苗。在所述方法的某些实施方式中,所述至少一种相关的非rRNARNA分子或者其正义RNA扩增产物用以制造RNA疫苗,所述RNA疫苗为治疗用途用来直接接种患者。在某些实施方式中,所述RNA疫苗通过利用来自第一个体的细胞、组织或者器官的所述至少一种相关的非rRNARNA制成以及所述RNA疫苗作为一种免疫疗法被施用至所述第一个体。在某些实施方式中,所述RNA疫苗通过利用来自第一个体的所述至少一种相关的非rRNARNA制成以及所述RNA疫苗用以接种第二个体。
在仍然其他的实施方式中,本发明提供用于利用所述包含亲和标记的反义rRNA分子的组合物分离RNA分子的大体上全部的方法,所述RNA分子单独或组合地显示至少一种全长rRNA分子内的序列,所述全长rRNA分子选自25S、26S、28S、18S、5.8S和5S真核细胞质rRNA分子,12S和16S真核线粒体rRNA分子以及23S、16S和5S原核rRNA分子。
因而,在某些实施方式中,本发明提供用于分离大体上所有的所述单独或组合地显示至少一种全长rRNA分子内的序列的RNA分子的方法,所述方法包含:a)提供i)包含RNA分子的初始样本,其中所述RNA分子包含rRNA分子和非rRNARNA分子;ii)包含亲和标记的反义rRNA分子的组合物,所述亲和标记的反义rRNA分子显示序列,所述序列与选自25S、26S、28S、18S、5.8S和5S真核细胞质rRNA分子,12S和16S真核线粒体rRNA分子以及23S、16S和5S原核rRNA分子的大体上全部的所述至少一种全长rRNA分子互补;以及iii)包含亲和标记物结合分子的结合基质(例如微粒);b)在一定条件下使所述初始样本接触所述组合物,以便至少部分所述亲和标记的反义rRNA分子和至少部分所述rRNA分子形成双链rRNA杂交体,从而生成处理后的样本;c)在一定条件下使所述处理后的样本接触所述结合基质,以便所述双链rRNA杂交体的至少部分结合至所述结合基质;d)从所述处理后的样本去除结合有包含所述亲和标记的反义rRNA分子和所述至少部分所述rRNA分子的所述双链rRNA杂交体的所述结合基质;以及e)在如下条件下于溶液中孵育所述结合基质:其中将来自所述处理后的样本的所述至少部分rRNA分子释放入所述溶液,从而分离大体上所有的RNA分子,所述RNA分子单独或组合地显示存在于所述初始样本中的至少一种全长rRNA分子内的序列(例如,存在于所述初始样本中的至少>95%……,>98%……,>99%……,>99.8%…或者>99.9%的所述至少一种全长rRNA分子)。
在某些实施方式中,本发明提供用于分离大体上所有的所述单独或组合地显示至少一种全长rRNA分子内的序列的RNA分子的方法,所述方法包含:a)提供i)包含RNA分子的初始样本,其中所述RNA分子包含rRNA分子和非rRNARNA分子;ii)包含亲和标记的反义rRNA分子的组合物,所述亲和标记的反义rRNA分子显示序列,所述序列与选自25S、26S、28S、18S、5.8S和5S真核细胞质rRNA分子,12S和16S真核线粒体rRNA分子以及23S、16S和5S原核rRNA分子的大体上全部的所述至少一种全长rRNA分子互补;以及iii)包含亲和标记物结合分子的结合基质(例如微粒);b)在一定条件下使所述初始样本接触所述组合物,以便至少部分所述亲和标记的反义rRNA分子和至少部分所述rRNA分子形成双链rRNA杂交体,从而生成处理后的样本;c)在一定条件下使所述处理后的样本接触所述结合基质,以便所述双链rRNA杂交体的至少部分结合至所述结合基质;d)从所述处理后的样本去除结合有包含所述亲和标记的反义rRNA分子和所述至少部分所述rRNA分子的所述双链rRNA杂交体的所述结合基质;以及e)在如下条件下于溶液中孵育所述结合基质:其中将来自所述处理后的样本的所述至少部分rRNA分子释放入所述溶液,从而生成分离的rRNA样本,所述分离的rRNA样本包含大体上所有的RNA分子,所述RNA分子单独或组合地显示存在于所述初始样本中的至少一种全长rRNA分子内的序列(例如,存在于所述初始样本中的至少>90%……,>95%……,>98%……,>99%……,>99.8%……或者>99.9%的所述至少一种全长rRNA分子)以及其中所述分离的rRNA样本大体上不含(例如,至少>90%……,>95%……,>98%……,>99%……,>99.8%……或者>99.9%不含)存在于所述初始样本中的所述非rRNARNA分子。
在某些实施方式中,本发明提供用于分离大体上所有的所述单独或组合地显示至少一种全长rRNA分子内的序列的RNA分子的方法,所述方法包含:a)提供i)包含RNA分子的初始样本,其中所述RNA分子包含rRNA分子和非rRNARNA分子;ii)包含亲和标记的反义rRNA分子的组合物,所述亲和标记的反义rRNA分子显示序列,所述序列与选自25S、26S、28S、18S、5.8S和5S真核细胞质rRNA分子,12S和16S真核线粒体rRNA分子以及23S、16S和5S原核rRNA分子的大体上全部的所述至少一种全长rRNA分子互补;以及iii)包含亲和标记物结合分子的结合基质(例如微粒);b)在一定条件下使所述初始样本接触所述组合物,以便至少部分所述亲和标记的反义rRNA分子和至少部分所述rRNA分子形成双链rRNA杂交体,从而生成处理后的样本;c)在一定条件下使所述处理后的样本接触所述结合基质,以便所述双链rRNA杂交体的至少部分结合至所述结合基质;d)从所述处理后的样本去除结合有包含所述亲和标记的反义rRNA分子和所述至少部分所述rRNA分子的所述双链rRNA杂交体的所述结合基质;以及e)在如下条件下于溶液中孵育所述结合基质:其中将来自所述处理后的样本的所述至少部分rRNA分子释放入所述溶液,从而生成分离的rRNA样本,所述分离的rRNA样本包含大体上所有的RNA分子,所述RNA分子单独或组合地显示存在于所述初始样本中的至少一种全长rRNA分子内的序列(例如,存在于所述初始样本中的至少>90%……,>95%……,>98%……,>99%……,>99.8%……或者>99.9%的所述至少一种全长rRNA分子)以及其中,或者i)所述分离的rRNA样本大体上不含(例如,至少>90%……,>95%……,>98%……,>99%……,>99.8%……或者>99.9%不含)存在于所述初始样本中的所述非rRNARNA分子,或者ii)包含如利用琼脂糖凝胶电泳和溴化乙锭染色进行测量,来自所述初始样本的水平检测不出的非rRNARNA。
在所述用于分离单独或组合地显示至少一种全长rRNA分子内的序列的所述RNA分子的大体上全部的方法的某些实施方式中,所述分离的rRNA样本来自初始样本(例如,包含生物标本,包括医学标本,如唾液、痰液、粪便、尿或者细胞、组织,或者器官样本,环境样本,宏基因组样本,或者任何其他类型可包含相关RNA的样本),无论所述样本未经制备或者已制备好(例如,利用溶液(例如福尔马林或者乙醇)固定;玻片上封固;或者利用本领域其他已知的程序制备),以及所述分离的rRNA经分析以确定源属、种或者株,从而指示存在于所述初始样本中的特定的属、种或者株,并因此,指示收集所述样本的具体的标本或者环境。例如,在某些实施方式中,所述方法用以确定并研究存在于人类或者动物或者植物“微生物组”中的生物体,例如,用于研究、医学或者农业应用。在某些实施方式中,所述分离的rRNA样本来自初始样本,所述初始样本包含来自人类、动物或者植物标本的样本,其被提供以用于医学诊断或者治疗诊断测试或者分析(例如,以检测与疾病病症相关或者是其成因或者可能与疾病病症相关或者是其成因的病原体微生物(如真菌或者细菌病原体),例如,可以基于对至少一种rRNA分子的分析检测或者诊断的病原体细菌,例如,如Chakravorty,S等人,J.Microbiol.Methods69:330-339,2007所述以及如Millar,BC等人.在CurrentIssuesMol.Biol.9:21-40,2007中所述,两者以引用方式并入本文。)在某些实施方式中,所述分离的rRNA样本利用本领域已知的许多下一代测序方法的任何方法得以分析(例如,对所述分离的rRNA分子的3′端或者3′和5′端做标记并将它们逆转录以制成标记的或者双标记的线性ssDNA模板或者环状ssDNA模板,用于下一代测序(例如,利用Roche454TM,IlluminaSolexaTM,LifeTechnologiesSOLIDTM,PacificBiosciences,IntelligentBiosystems,Helicos,Qiagen或者其他下一代测序平台)之后)。在仍然其他的实施方式中,所述分离的rRNA样本通过实时PCR得以分析。
在某些实施方式中,本发明提供用于分离单独或组合地显示至少一种全长rRNA分子内的序列的所述RNA分子的大体上全部的方法,所述方法包含:a)提供i)包含RNA分子的初始样本,其中所述RNA分子包含rRNA分子和非rRNARNA分子;ii)包含亲和标记的反义rRNA分子的组合物,所述亲和标记的反义rRNA分子被结合至结合基质(例如包含亲和标记物结合分子的微粒),其中所述亲和标记的反义rRNA分子单独或者组合地显示对应于选自25S、26S、28S、18S、5.8S和5S真核细胞质rRNA分子,12S和16S真核线粒体rRNA分子以及23S、16S和5S原核rRNA分子的至少一种全长rRNA分子的大体上全部分子的序列;b)在一定条件下使所述初始样本接触所述组合物,以便所述组合物中的至少部分所述亲和标记的反义rRNA分子和至少部分所述rRNA分子形成被结合至所述结合基质的双链rRNA杂交体,从而生成处理后的样本;c)去除结合有所述双链rRNA杂交体的所述结合基质,从而分离大体上所有的RNA分子,所述RNA分子单独或组合地显示所述至少一种全长rRNA分子内的序列。在本方法的某些实施方式中,所述方法进一步包含清洗结合有所述双链rRNA杂交体的所述结合基质的步骤,以从所述样本去除非特异性的非rRNARNA分子。在某些实施方式中,所述处理后的样本存储在所述结合基质上,用于以后的分析或者应用。在某些实施方式中,所述方法进一步包含在如下条件下于溶液中孵育所述结合基质:其中将来自所述处理后的样本的所述至少部分rRNA分子释放入所述溶液,从而生成分离的rRNA样本的溶液,所述分离的rRNA样本包含大体上所有的RNA分子,所述RNA分子单独或组合地显示存在于所述初始样本中的至少一种全长rRNA分子内的序列(例如,单独或组合地显示存在于所述初始样本中的至少一种全长rRNA分子内的序列的至少>90%……,>95%…,>98%……,>99%……,>99.8%……或者>99.9%的所述RNA分子)以及其中,或者i)所述分离的rRNA样本大体上不含(例如,至少>90%……,>95%……,>98%……,>99%……,>99.8%……或者>99.9%不含)存在于所述初始样本中的所述非rRNARNA分子,或者ii)包含如利用琼脂糖凝胶电泳和溴化乙锭染色进行测量,来自所述初始样本的水平检测不出的所述至少一种rRNA分子。在某些实施方式中,所述分离的rRNA样本来自环境或者宏基因组样本以及所述分离的rRNA经分析以确定存在于所述样本中的属、种或者株,以及因此,确定收集所述样本的具体环境。在某些实施方式中,对所述分离的rRNA样本进行分析(例如,通过下一代测序、实时逆转录PCR,或者一种其他方法,如本文他处所述的方法)。
在本发明任何所述的用于生成rRNA除尽的样本或者用于分离单独或组合地显示至少一种全长rRNA分子的序列的RNA分子的大体上全部的方法的某些实施方式中,所述方法使用任何包含亲和标记的反义rRNA分子的组合物,所述亲和标记的反义rRNA分子利用本文所述的任何用于生成亲和标记的反义rRNA分子的方法获得。
在任何所述的用于生成rRNA除尽的样本或者用于分离单独或组合地显示来自初始样本的至少一种全长rRNA分子内的序列的大体上所有的rRNA的方法的某些实施方式中,所述包含结合至结合基质的亲和标记的反义rRNA分子的组合物包含生物素作为亲和标记物,其中所述生物素被连接至所述反义rRNA分子的每百个核碱基中至少约两至八个核碱基,以及所述结合基质包含微粒,链酶亲和素或者亲和素作为亲和标记物结合分子附至所述微粒。在该方法的某些其他实施方式中,所述亲和标记的反义rRNA分子包含生物素作为所述亲和标记物,其中所述生物素被连接至所述反义rRNA分子的每百个核碱基中至少约两至四个核碱基,或者连接至所述反义rRNA分子的每百个核碱基中至少约三至五个核碱基,或者连接至所述反义rRNA分子的每百个核碱基中至少约四至六个核碱基,或者连接至所述反义rRNA分子的每百个核碱基中至少约六至八个核碱基。
在本发明任何所述的用于生成rRNA除尽的样本或者用于分离单独或组合地显示来自初始样本的至少一种全长rRNA分子内的序列的rRNA的大体上全部的方法的某些实施方式中,所述初始样本包含降解的RNA以及所述方法被用于生成rRNA除尽的样本,以用于进一步的分析和用途。例如,在某些实施方式中,所述初始样本是包含降解的RNA的FFPE样本,以及所述方法被用于生成包含至少一种相关的非rRNARNA分子的rRNA除尽的样本,其中所述rRNA除尽的样本用于分析一种或多种RNA分子的表达或者相对表达,所述RNA分子选自包含来自一种或者多种细胞、组织、器官或者生物体的整体转录组(减掉所述rRNA)的mRNA、miRNA、ncRNA、piwiRNA和RNA,其中所述分析方法选自微阵列分析(例如,Affymetrix,NimbleGenSystems,AgilentSystems)、下一代测序(或者所谓的“数字”分析)(尤其包括下一代RNA测序方法以及技术,术语称为如“RNA-Seq”、“数字mRNA图谱”、“转录组图谱”和“核糖体图谱″(例如,Ingolia等人,Science324:218-223,2009))、筛选分析以及利用诊断或者治疗诊断检定(包括包含逆转录qPCR的诊断或者治疗诊断检定和包含利用标记探针的RNA扩增和/或测序检测的诊断或者治疗诊断检定)进行的分析。
在本发明任何所述的将包含亲和标记的反义rRNA分子的组合物用于生成rRNA除尽的样本或者用于分离单独或组合地显示至少一种全长rRNA分子的序列的RNA分子的大体上全部的方法的某些实施方式中,亲和标记的反义rRNA分子的所述组合物生成自第一物种或者生物体,并用于生成rRNA除尽的样本或者用于分离单独或组合地显示来自第二物种或者生物体的至少一种全长rRNA分子的大体上全部,所述第二物种或者生物体不同于所述第一物种或者生物体(例如,所述第一物种或者生物体是小鼠或者大鼠而所述第二物种或者生物体是人类)。在某些实施方式中,所述亲和标记的反义rRNA分子生成自来自所述第一物种的生物体的任何至少一种rRNA分子,其中在所述的用于生成rRNA除尽的样本或者用于分离来自所述初始样本的至少一种rRNA分子的方法使用的条件下,所述亲和标记的反义rRNA分子与来自所述第二物种或者生物体的所述初始样本内存在的所述至少一种rRNA分子的全部杂交。在进一步的实施方式中,所述第一物种或者生物体是非人类哺乳动物(例如,猫、狗、羊、小鼠、大鼠、猴子等等)以及所述第二物种或者生物体是智人。在具体的实施方式中,所述第一物种或者生物体包含非大肠杆菌细菌,以及所述第二物种或者生物体是大肠杆菌。在某些实施方式中,所述用于生成rRNA除尽的样本或者用于分离单独或组合地显示至少一种全长rRNA分子内的序列的RNA分子的大体上全部的方法通过利用包含多种物种或者生物体的宏基因组或者环境样本得以执行。因而,在某些实施方式中,其中所述包含亲和标记的反义rRNA分子的组合物对应于至少一种全长原核rRNA分子(例如,生成自来自大肠杆菌的至少一种全长rRNA分子),所述组合物被用于生成rRNA除尽的样本或者用于分离单独或组合地显示来自多种物种或者生物体包含多种rRNA分子的至少一种全长rRNA分子内的序列的RNA分子的大体上全部。
在本发明任何所述的用于生成rRNA除尽的样本或者用于分离单独或组合地显示至少一种全长rRNA分子的序列的RNA分子的大体上全部的方法的某些实施方式中,所述方法不利用所述包含亲和标记的反义rRNA分子的组合物,而利用包含亲和标记的单链DNA分子的组合物,所述亲和标记的单链DNA分子单独或者组合地与由选自25S、26S、28S、18S、5.8S和5S真核细胞质rRNA分子,12S和16S真核线粒体rRNA分子以及23S、16S和5S原核rRNA分子的所述至少一种全长rRNA分子显示的大体上所有的序列互补,其中所述亲和标记物的存在比例为:所述亲和标记的单链DNA分子中每百个核碱基至少约两个到至少四个亲和标记物。
本发明的发展过程中进行的工作发现了所述方法的执行可以利用这样的样本:其中所述初始样本一般包含总RNA分子的任何量。在一个实施方式中,存在于所述初始样本中的总RNA分子的所述量在约10皮克和50纳克之间。在其他的实施方式中,存在于所述初始样本中的总RNA分子的所述量在约50纳克和一微克之间。在仍然其他的实施方式中,存在于所述初始样本中的总RNA分子的所述量在约一微克和五微克之间。在这些方法的某些实施方式中,所述初始样本中的所述RNA分子至少部分被高度片段化(例如,先前用RNA酶消化或者从较老的RNA样本消化得到)。在这些方法的某些实施方式中,所述初始样本中的所述RNA分子来自石蜡包埋的样本(例如石蜡包埋福尔马林固定的样本)。在这些方法的进一步实施方式中,所述亲和标记的反义RNA分子对应于来自相同物种或者生物体的所述至少一种rRNA分子(例如,所述亲和标记的反义RNA分子对应于来自人类细胞的所述至少一种rRNA分子或者所述亲和标记的反义RNA分子对应于来自大肠杆菌细胞的所述至少一种rRNA分子)。在这些方法的某些实施方式中,其中所述亲和标记的反义RNA分子对应于来自人类细胞的所述至少一种rRNA分子,所述至少一种rRNA分子是人类28SrRNA。
在本发明任何所述的用于生成rRNA除尽的样本或者用于分离单独或组合地显示至少一种全长rRNA分子的序列的RNA分子的大体上全部的方法的某些实施方式中,步骤b)中所述的接触过程中所述亲和标记物结合分子与所述亲和标记物的比例为至少2比1(例如,2∶1、3∶1、4∶1、5∶1……或者10∶1)。
在本发明任何所述的用于生成rRNA除尽的样本或者用于分离单独或组合地显示至少一种全长rRNA分子的序列的RNA分子的大体上全部的方法的某些实施方式中,所述包含RNA分子的初始样本显示分离自细胞或者组织样本或者自环境样本(例如,自细胞系、组织活检样本、体液样本、来自医院表面的拭子、水样等等)的总RNA。在这些方法的某些实施方式中,所述方法进一步包含提供来自细胞或者组织样本的RNA的对照样本(例如包含总RNA),以及还包含利用所述对照样本执行所述方法。在某些实施方式中,所述对照样本包含来自HeLa细胞和/或来自大肠杆菌细胞的总RNA。
在本发明任何所述的用于生成rRNA除尽的样本或者用于分离单独或组合地显示至少一种全长rRNA分子的序列的RNA分子的大体上全部的方法的其他实施方式中,所述初始样本大体上不含盐类和/或有机液体。在这些实施方式的其他实施方式中,所述初始样本包含不含RNA酶的水和/或TE缓冲液。在具体的实施方式中,所述方法进一步包含在一定条件下处理所述rRNA除尽的样本或者所述分离的rRNA样本以便存在于所述样本中的所述RNA分子被进一步纯化(例如,通过利用乙醇异丙醇或者乙酸铵沉淀进一步纯化)。在具体的实施方式中,所述rRNA除尽的样本或者所述分离的rRNA样本被用于方法中,用于进一步的分析(如用于通过下一代测序进行的分析)、用于制备用于微阵列分析的标记的靶、用于筛选或者诊断或者治疗诊断分析(例如,利用植物、人类或者动物,筛选、诊断或者治疗诊断试剂盒)。在某些实施方式中,所述rRNA除尽的样本或者所述分离的rRNA样本中的核酸被扩增,然后用于进一步的分析。在这些方法的其他实施方式中,步骤b)中的所述接触在RNA酶抑制剂的存在下进行。在某些实施方式中,所述方法中所用的所述组合物进一步包含不含RNA酶的水。
在本发明任何所述的用于生成rRNA除尽的样本或者用于分离单独或组合地显示至少一种全长rRNA分子的序列的RNA分子的大体上全部的方法的进一步实施方式中,步骤b)中的所述条件包含在约60-75℃的温度下孵育第一时间段(例如5-15分钟)以及在约室温下孵育第二时间段(例如10-25分钟)。在这些方法的某些实施方式中,步骤b)中的所述条件包括杂交缓冲液的存在。在这些方法的具体实施方式中,步骤c)中的所述条件包括在室温下和/或在35-60℃或者25-70℃或者约50℃下至少不时地混合。在这些方法的进一步实施方式中,所述结合基质包含多个个体颗粒(例如纳米颗粒、磁粉、大孔珠等等)。在这些方法的进一步实施方式中,所述结合基质包含结合柱或者膜。在这些方法的某些实施方式中,所述亲和标记物选自生物素、亲和素或者链酶亲和素、地高辛配基、抗体(或者抗体片段)以及其他有用的结合分子。在这些方法的某些实施方式中,所述亲和标记物结合分子选自生物素、亲和素或者链酶亲和素、地高辛配基、抗体(或者抗体片段)以及其他有用的结合分子。
在本发明的某些实施方式中,对存在于所述初始样本中的所述至少一种rRNA分子中、一种或多种所述非rRNARNA分子或者一种或多种其他核酸分子中的一种或多种所述序列进行扩增(例如,利用本领域已知的任何合适的用于RNA和/或DNA扩增的方法,例如实时PCR或者逆转录PCR、转录介导扩增、利用威斯康星州麦迪逊的EpicentreBiotechnologies的RiboMultiplierTM试剂盒的RNA扩增、链置换扩增、LAMP、ICANTM、UCANTM(TAKARA)、滚环扩增等等),所述扩增在如下步骤之前或者之后:利用本发明所述的用于生成rRNA除尽的样本或者用于分离单独或组合地显示至少一种全长rRNA分子内的序列的RNA分子的大体上全部的多种方法的一种分别生成所述rRNA除尽的样本或者分离所述至少一种rRNA分子。在这些实施方式的某些实施方式中,所述包含非rRNARNA分子或者rRNA分子和/或其他核酸分子的各自的一种或多种扩增的序列的样本被用于进一步的分析。
在其他实施方式中,本发明提供一种包含反义rRNA分子的组合物,所述反义rRNA分子对应于选自25S、26S、28S、18S、5.8S和5S真核细胞质rRNA分子,12S和16S真核线粒体rRNA分子以及23S、16S和5S原核rRNA分子的至少一种rRNA分子的大体上全部,其中所述反义rRNA分子包含亲和标记物,其中所述组合物是大体上不含包含所述亲和标记物的非rRNARNA分子。在某些实施方式,所述组合物进一步包含结合基质,其中所述结合基质包含亲和标记物结合分子(例如微粒)。在具体的实施方式中,所述反义rRNA分子通过所述亲和标记物-亲和标记物结合分子交互作用被结合至所述结合基质。
在某些实施方式中,本发明提供组合物,所述组合物包含:a)一种包含反义rRNA分子的组合物,所述反义rRNA分子对应于选自25S、26S、28S、18S、5.8S和5S真核细胞质rRNA分子,12S和16S真核线粒体rRNA分子以及23S、16S和5S原核rRNA分子的至少一种rRNA分子的大体上全部,其中所述反义rRNA分子包含亲和标记物,以及b)不含亲和标记物的非rRNARNA分子。在某些实施方式中,所述组合物进一步包含结合基质,所述结合基质包含亲和标记物结合分子。
在具体的实施方式中,本发明提供包含rRNA除尽的样本的组合物,所述rRNA除尽的样本包含非rRNARNA分子,其中所述组合物大体上不含由选自25S、26S、28S、18S、5.8S和5S真核细胞质rRNA分子,12S和16S真核线粒体rRNA分子以及23S、16S和5S原核rRNA分子的至少一种rRNA分子显示的rRNA序列。
在进一步的实施方式中,本发明提供包含反义rRNA分子的组合物,所述反义rRNA分子对应于选自:25S、26S、28S、18S、5.8S和5S真核细胞质rRNA分子,12S和16S真核线粒体rRNA分子以及23S、16S和5S原核rRNA分子的至少一种rRNA分子的大体上全部,其中所述反义rRNA分子包含亲和标记物,以及其中所述组合物大体上不含包含所述亲和标记物的非rRNARNA分子。
在其他实施方式中,本发明提供组合物,所述组合物包含:a)包含反义rRNA分子的组合物,所述反义rRNA分子对应于选自25S、26S、28S、18S、5.8S和5S真核细胞质rRNA分子,12S和16S真核线粒体rRNA分子以及23S、16S和5S原核rRNA分子的至少一种rRNA分子的大体上全部,其中所述反义rRNA分子包含亲和标记物,以及b)不含亲和标记物的非rRNARNA分子。在进一步的实施方式中,所述组合物进一步包含结合基质,所述结合基质包含亲和标记物结合分子。
在某些实施方式中,本发明提供组合物,所述组合物包含:包含非rRNARNA分子的rRNA除尽的样本,其中所述组合物大体上不含rRNA序列,所述rRNA序列由选自25S、26S、28S、18S、5.8S和5S真核细胞质rRNA分子,12S和16S真核线粒体rRNA分子以及23S、16S和5S原核rRNA分子的至少一种rRNA分子显示。在某些具体的实施方式中,所述组合物大体上不含由选自25S、26S、28S、18S、5.8S和5S真核细胞质rRNA分子的两个、三个或者四个rRNA分子显示的rRNA序列。在某些具体的实施方式中,所述组合物大体上不含由12S和16S真核线粒体rRNA分子显示的rRNA序列。
在某些实施方式,本发明提供组合物,所述组合物包含:a)包含反义rRNA分子的组合物,所述反义rRNA分子对应于选自25S、26S、28S、18S、5.8S和5S真核细胞质rRNA分子,12S和16S真核线粒体rRNA分子以及23S、16S和5S原核rRNA分子的至少一种rRNA分子的大体上全部,其中所述反义rRNA分子包含亲和标记物,以及其中所述反义rRNA分子来自第一物种或者生物体,以及b)不含亲和标记物的非rRNARNA分子,其中所述非rRNARNA分子来自不同于所述第一物种或者生物体的第二物种或者生物体。在其他实施方式中,所述组合物进一步包含结合基质,所述结合基质包含亲和标记物结合分子。
在某些实施方式中,本发明提供组合物,所述组合物包含:a)亲和标记的反义rRNA分子,所述亲和标记的反义rRNA分子对应于选自25S、26S、28S、18S、5.8S和5S真核细胞质rRNA分子,12S和16S真核线粒体rRNA分子以及23S、16S和5S原核rRNA分子的至少一种rRNA分子的大体上全部,其中所述亲和标记物以所述反义rRNA分子中每百个核碱基至少约两个到八个亲和标记物的比例存在于所述反义rRNA分子上,以及b)不含亲和标记物的非rRNARNA分子。在某些实施方式中,组合物包含来自第一物种或者生物体的亲和标记的反义rRNA分子和不含亲和标记物的来自第二物种或者生物体的非rRNARNA分子。在某些实施方式中,所述组合物进一步包含结合基质,所述结合基质包含亲和标记物结合分子。
在其他的实施方式,本发明提供组合物,所述组合物包含:包含非rRNARNA分子的rRNA除尽的样本,其中所述组合物至少约99.0%不含由选自:25S、26S、28S、18S、5.8S和5S真核细胞质rRNA分子,12S和16S真核线粒体rRNA分子以及23S、16S和5S原核rRNA分子的至少一种rRNA分子显示的rRNA序列。
本发明提供用于执行本发明的任何所述方法(所述方法的任何步骤)的试剂盒或者系统。
例如,在某些进一步实施方式中,本发明提供试剂盒和系统,所述试剂盒和系统包含:a)第一组分,所述第一组分包括包含反义rRNA分子的组合物,所述反义rRNA分子与由选自25S、26S、28S、18S、5.8S和5S真核细胞质rRNA分子,12S和16S真核线粒体rRNA分子以及23S、16S和5S原核rRNA分子的所述至少一种rRNA分子显示的大体上全部的序列互补,其中所述反义rRNA分子包含亲和标记物,以及其中所述组合物大体上不含包含所述亲和标记物的非rRNARNA分子;以及b)至少一种第二组分,所述第二组分选自:i)包含亲和标记物结合分子的结合基质;ii)包含来自细胞或者组织样本的总RNA的对照样本;iii)包含RNA酶抑制剂的溶液;iv)不含RNA酶的结合基质洗液;v)大量不含RNA酶的水;vi)杂交缓冲液;vii)总RNA纯化试剂;以及viii)结合基质重悬浮溶液,其中所述溶液不含RNA酶。在某些实施方式中,所述第二组分是所述结合基质。在进一步的实施方式中,所述第二组分是所述对照样本。在某些实施方式中,所述第二组分是所述包含RNA酶抑制剂的溶液。
在某些实施方式中,本发明提供试剂盒和系统,所述试剂盒和系统包含:a)第一组分,所述第一组分包括包含反义rRNA分子的组合物,所述反义rRNA分子与由选自25S、26S、28S、18S、5.8S和5S真核细胞质rRNA分子,12S和16S真核线粒体rRNA分子以及23S、16S和5S原核rRNA分子的所述至少一种rRNA分子显示的大体上全部的序列互补,其中所述反义rRNA分子包含亲和标记物,以及其中所述组合物大体上不含包含所述亲和标记物的非rRNARNA分子;以及b)至少一种第二组分,所述第二组分选自:i)包含亲和标记物结合分子的结合基质;ii)包含来自细胞或者组织样本的总RNA的对照样本;iii)包含RNA酶抑制剂的溶液;iv)不含RNA酶的结合基质洗液;v)大量不含RNA酶的水;vi)杂交缓冲液;以及vii)总RNA纯化试剂。
在其他的实施方式中,本发明提供试剂盒和系统,所述试剂盒和系统包含:a)第一组分,所述第一组分包括包含亲和标记的反义rRNA分子的组合物,所述亲和标记的反义rRNA分子与由选自25S、26S、28S、18S、5.8S和5S真核细胞质rRNA分子,12S和16S真核线粒体rRNA分子以及23S、16S和5S原核rRNA分子的所述至少一种rRNA分子显示的大体上全部的序列互补,其中所述反义rRNA分子包含亲和标记物,其中所述亲和标记物以所述反义rRNA分子中每百个核碱基至少约两个到八个亲和标记物的比例存在于所述反义rRNA分子上,以及其中所述组合物大体上不含包含所述亲和标记物的非rRNARNA分子;以及b)至少一种第二组分,所述第二组分选自:i)包含亲和标记物结合分子的结合基质;ii)包含来自细胞或者组织样本的总RNA的对照样本;iii)包含RNA酶抑制剂的溶液;iv)不含RNA酶的结合基质洗液;v)大量不含RNA酶的水;vi)杂交缓冲液;以及vii)总RNA纯化试剂。
在试剂盒或者系统的某些实施方式中,所述亲和标记物以所述反义rRNA分子的每100个核碱基至少约两个到约八个亲和标记的比例存在于亲和标记的反义rRNA分子的组合物中(例如,至少2∶100、3∶100、4∶100、5∶100、6∶100、7∶100或者8∶100)。在某些实施方式中,所述亲和标记物与所述反义rRNA分子的仅仅一个核碱基相关联。在这些实施方式的某些中,所述亲和标记物与选自如下的仅仅一种类型的核碱基相关联:腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)和尿嘧啶(U)。
在试剂盒或者系统的其他实施方式中,所述包含亲和标记的反义rRNA分子的组合物对应于所有所述至少一种rRNA序列的至少95.0%(例如,所述至少一种rRNA分子的95.0%……95.5%……96.0%……96.5%……97.0%……97.5%……98%……98.5%……99.0%……99.5%……99.9……或者100%(例如,其中所述组合物包含单独或者组合地显示序列的反义rRNA分子,所述序列对应于具体的rRNA分子的所有的所述全长rRNA序列)。
附图说明
当结合以举例形式而非限制形式包含在内的附图进行阅读时,才能更好地理解前文的概述和说明。
图1A示出包含如下PCR扩增子的溴化乙锭染色的琼脂糖凝胶:泳道M-DNA分子量标准;泳道1-人类18SrRNAPCR扩增子300ng;泳道2-人类5.8SrRNAPCR扩增子300ng;泳道3-人类5SrRNAPCR扩增子300ng;泳道4-大肠杆菌23SrRNA5′片段PCR扩增子300;泳道5-大肠杆菌23SrRNA3′片段PCR扩增子300ng;泳道6-大肠杆菌16SrRNAPCR扩增子300ng;以及泳道7-大肠杆菌5SSrRNAPCR扩增子300ng。
图1B示出包含如下反义序列的溴化乙锭染色的琼脂糖凝胶:泳道M-DNA分子量标准;泳道1-300ng人类反义18SrRNA;泳道2-300ng人类反义5.8SrRNA;泳道3-300ng人类反义5SrRNA;泳道4-300ng大肠杆菌反义23SrRNA5′片段;泳道5-300ng大肠杆菌反义23SrRNA3′片段;泳道6-300ng大肠杆菌反义16SrRNA;以及泳道7-300ng大肠杆菌反义5SrRNA。
图1C示出包含如下泳道的溴化乙锭染色的琼脂糖凝胶:泳道M-DNA分子量标准;泳道1-300ng基于T7的28S生物素化的反义rRNA;以及泳道2-300ng基于SP6的28S生物素化的反义rRNA。
图2A示出如下:泳道M-DNA分子量标准;泳道1-用微球体直接在柱上进行纯化后的生物素化的反义rRNA;泳道2-除去微球体后上清液纯化后的生物素化的反义rRNA;以及泳道3-生物素化的反义rRNA对照物。
图2B示出如下:泳道M-DNA分子量标准;泳道1-生物素化的反义rRNA对照物;泳道2-经过20μl微球体进行纯化后的生物素化的反义rRNA;泳道3-经过2x20μl微球体进行纯化后的生物素化的反义rRNA;以及泳道4-经过40μl微球体进行纯化后的生物素化的反义rRNA。
图3A示出如下:泳道M-DNA分子量标准;泳道1-减掉微球体的10%生物素化的反义rRNA;泳道2-加上20μl微球体的10%生物素化的反义rRNA;泳道3-加上40μl微球体的10%生物素化的反义rRNA;泳道4-减掉微球体的20%生物素化的反义rRNA;泳道5-加上20μl微球体的20%生物素化的反义rRNA;以及泳道6-加上40μl微球体的20%生物素化的反义rRNA。
图3B示出如下:泳道M-DNA分子量标准;泳道1-减掉链酶亲和素微球体的35%生物素化的反义rRNA;泳道2-加上链酶亲和素微球体的35%生物素化的反义rRNA;泳道3-减掉链酶亲和素微球体的50%生物素化的反义rRNA;泳道4-加上链酶亲和素微球体的50%生物素化的反义rRNA;泳道5-减掉链酶亲和素微球体的60%生物素化的反义rRNA;以及泳道6-加上链酶亲和素微球体的60%生物素化的反义rRNA。
图3C示出如下:泳道M-DNA分子量标准;泳道1-减掉链酶亲和素微球体的35%生物素化的反义rRNA的PCR;泳道2-加上链酶亲和素微球体的35%生物素化的反义rRNA的PCR;泳道3-减掉链酶亲和素微球体的50%生物素化的反义rRNA的PCR;泳道4-加上链酶亲和素微球体的50%生物素化的反义rRNA的PCR;泳道5-减掉链酶亲和素微球体的60%生物素化的反义rRNA的PCR;以及泳道6-加上链酶亲和素微球体的60%生物素化的反义rRNA的PCR。小图1示出5′-23SrRNA引物。小图2示出3′-23SrRNA引物。小图3示出5′-16SrRNA引物。小图4示出3′-16SrRNA引物。
图4示出如下:泳道M-DNA分子量标准;泳道1-植物乳杆菌总RNA加上大肠杆菌生物素化的反义rRNA混合物削减;以及泳道2-植物乳杆菌总RNA减掉大肠杆菌生物素化的反义rRNA混合物削减。
图5,小图A-D示出如下:泳道M-DNA分子量标准;泳道1、2-50ng投入的大肠杆菌总RNA加上削减的PCR结果;泳道3、4-100ng投入的大肠杆菌总RNA加上削减的PCR结果;泳道5、6-500ng投入的大肠杆菌总RNA加上削减的PCR结果;泳道7、8-1000ng投入的大肠杆菌总RNA加上削减的PCR结果;泳道9、10-2500ng投入的大肠杆菌总RNA加上削减的PCR结果;泳道11、12-5000ng投入的大肠杆菌总RNA加上削减的PCR结果;泳道13、14-500ng投入的大肠杆菌总RNA减掉削减的PCR结果;以及泳道15-无模板对照反应的PCR成果。小图5A示出5′-23SrRNART-PCR。小图5B示出5′-16SrRNART-PCR。小图5C示出5SrRNART-PCR。小图5D示出ompAmRNART-PCR。
图6A示出如下:泳道M-DNA分子量标准;泳道1-300ng全段大肠杆菌总RNA;以及泳道2-300ng片段化的大肠杆菌总RNA。
图6B示出如下:泳道M-DNA分子量标准;泳道1-全段大肠杆菌总RNA减掉削减;泳道2-全段大肠杆菌总RNA加上削减;泳道3-片段化的大肠杆菌总RNA减掉削减;以及泳道4-片段化的大肠杆菌总RNA加上削减。小图1示出溴化乙锭染色的琼脂糖凝胶。小图2示出ompAmRNANorthern印迹。小图3示出23SrRNANorthern印迹。小图4示出16SrRNANorthern印迹。小图5示出5SrRNANorthern印迹。
图6C示出如下:泳道M-DNA分子量标准;泳道1-全段大肠杆菌总RNA减掉削减;泳道2-全段大肠杆菌总RNA加上削减;泳道3-片段化的大肠杆菌总RNA减掉削减;以及泳道4-片段化的大肠杆菌总RNA加上削减。小图1示出ompART-PCR。小图2示出23SrRNA5′RT-PCR。小图3示出16SrRNA5′RT-PCR。小图4示出5SrRNART-PCR。
图7A示出如下:泳道M-DNA分子量标准;泳道1-生物素化的反义28SrRNA;泳道2-生物素化的反义18SrRNA;泳道3-人类总RNA;泳道4-人类总RNA加上生物素化的反义28SrRNA;泳道5-人类总RNA加上生物素化的反义18SrRNA;泳道6-小鼠总RNA;泳道7-小鼠总RNA加上生物素化的反义28SrRNA;泳道8-小鼠总RNA加上生物素化的反义18SrRNA;泳道9-大鼠总RNA;泳道10-大鼠总RNA加上生物素化的反义28SrRNA;以及泳道11-大鼠总RNA加上生物素化的反义18SrRNA。
图7B示出如下:泳道M-DNA分子量标准;泳道1-人类总RNA(HeLa)减掉削减;泳道2-人类总RNA(HeLa)加上削减;泳道3-小鼠总RNA(3T3)减掉削减;泳道4-小鼠总RNA(3T3)减掉削减;泳道5-大鼠总RNA(NRK)减掉削减;以及泳道6-大鼠总RNA(NRK)加上削减。
图8示出如下:泳道M-DNA分子量标准;泳道1-100ng投入的人类总RNA加上削减的PCR结果;泳道2-500ng投入的人类总RNA加上削减的PCR结果;泳道3-5.0μg投入的人类总RNA加上削减的PCR结果;泳道4-500ng投入的人类总RNA减掉削减的PCR结果;以及泳道5-无模板对照反应的PCR成果。小图A示出5′28SrRNART-PCR。小图B示出3′28SrRNART-PCR。小图C示出5′18SrRNART-PCR。小图D示出3′18SrRNART-PCR。小图E示出5.8SrRNART-PCR。小图F示出5SrRNART-PCR。小图G示出5′GAPDHmRNART-PCR。
图9A示出如下:泳道M-DNA分子量标准;泳道1-全段Hela总RNA减掉削减;泳道2-全段HeLa总RNA加上削减;泳道3-片段化的(1分钟)Hela总RNA减掉削减;泳道4-片段化的(1分钟)Hela总RNA加上削减;泳道5-片段化的(2分钟)Hela总RNA减掉削减;泳道6-片段化的(2分钟)Hela总RNA加上削减;泳道7-片段化的(3分钟)Hela总RNA减掉削减;以及泳道8-片段化的(3分钟)Hela总RNA加上削减。
图9B示出如下:泳道1-全段HeLa总RNA减掉削减的PCR结果;泳道2-全段HeLa总RNA加上削减的PCR结果;泳道3-片段化的(1分钟)HeLa总RNA减掉削减的PCR结果;泳道4-片段化的(1分钟)HeLa总RNA加上削减的PCR结果;泳道5-片段化的(2分钟)HeLa总RNA减掉削减的PCR结果;泳道6-片段化的(2分钟)HeLa总RNA加上削减的PCR结果;泳道7-片段化的(3分钟)HeLa总RNA减掉削减的PCR结果;泳道8-片段化的(3分钟)HeLa总RNA加上削减的PCR结果;以及泳道9-无模板对照反应的PCR成果。小图1示出5′28SrRNA。小图2示出5′18SrRNA。小图3示出5.8SrRNA。小图4示出5SrRNA。小图5示出5′GAPDHmRNA。
图10A示出如下:泳道M-DNA分子量标准;泳道1-全段大肠杆菌总RNA减掉削减;泳道2-全段大肠杆菌总RNA加上削减;泳道3-片段化的大肠杆菌总RNA减掉削减;以及泳道4-片段化的大肠杆菌总RNA加上削减。小图1示出ompAmRNA。小图2示出23SrRNA。小图3示出16SrRNA。小图4示出5SrRNA。
图10B示出如下:泳道M-DNA分子量标准;泳道1-全段大肠杆菌总RNA减掉削减的PCR结果;泳道2-全段大肠杆菌总RNA加上削减的PCR结果;泳道3-片段化的大肠杆菌总RNA减掉削减的PCR结果;以及泳道4-片段化的大肠杆菌总RNA加上削减的PCR结果。小图1示出ompAmRNA。小图2示出23SrRNA。小图3示出16SrRNA。小图4示出5SrRNA。
图11A示出如下:泳道M-DNA分子量标准;泳道1-全段HeLa总RNA减掉削减;泳道2-全段HeLa总RNA加上削减;泳道3-片段化的HeLa总RNA减掉削减;以及泳道4-片段化的HeLa总RNA加上削减。小图1示出本发明的示例性方法的成果。小图2示出OLIGOTEX方法的成果。
图11B示出如下:泳道M-DNA分子量标准;泳道1-全段HeLa总RNA减掉削减的PCR结果;泳道2-全段HeLa总RNA加上削减的PCR结果;泳道3-片段化的HeLa总RNA减掉削减的PCR结果;以及泳道4-片段化的HeLa总RNA加上削减的PCR结果。小图1示出5′-28SrRNA。小图2示出3’-28SrRNA。小图3示出5’-18SrRNA。小图4示出3’-18SrRNA。小图5示出5.8SrRNA。小图6示出5SrRNA。
图11C示出如下:泳道M-DNA分子量标准;泳道1-全段HeLa总RNA减掉削减的PCR结果;泳道2-全段HeLa总RNA加上削减的PCR结果;泳道3-片段化的HeLa总RNA减掉削减的PCR结果;以及泳道4-片段化的HeLa总RNA加上削减的PCR结果。小图1示出5′-3.小图2示出3′-GAPDH.小图3示出5′-PGKl.小图4示出3′-PGKl。
图11D示出如下:泳道M-DNA分子量标准;泳道1-全段HeLa总RNA减掉削减的PCR结果;泳道2-全段HeLa总RNA加上削减的PCR结果;泳道3-片段化的HeLa总RNA减掉削减的PCR结果;以及泳道4-片段化的HeLa总RNA加上削减的PCR结果。小图1示出PolyA-RNA#1。小图2示出PolyA-RNA#3。小图3示出PolyA-RNA#15。小图4示出双形(bimorphic)RNA#5。
图12A示出如下:泳道M-DNA分子量标准;泳道1-全段HeLa总RNA减掉削减;泳道2-全段HeLa总RNA加上削减;泳道3-片段化的HeLa总RNA减掉削减;以及泳道4-片段化的HeLa总RNA加上削减。
图12B示出泳道M-DNA分子量标准;泳道1-全段HeLa总RNA减掉削减的PCR结果;泳道2-全段HeLa总RNA加上削减的PCR结果;泳道3-片段化的HeLa总RNA减掉削减的PCR结果;以及泳道4-片段化的HeLa总RNA加上削减的PCR结果;小图1-5′-28SrRNA;小图2-3′-28SrRNA;小图3-5′-18SrRNA;小图4-3′-18SrRNA;小图5-5.8SrRNA;以及小图6-5SrRNA。
图12C示出泳道M-DNA分子量标准;泳道1-全段HeLa总RNA减掉削减的PCR结果;泳道2-全段HeLa总RNA加上削减的PCR结果;泳道3-片段化的HeLa总RNA减掉削减的PCR结果;泳道4-片段化的HeLa总RNA加上削减的PCR结果;小图1-5’-GAPDH;以及小图2-3’GAPDH。
定义
可以理解,本文所用术语的目的仅仅在于描述具体的实施方式,而非进行限制。进一步的,除非另有限定,本文所用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域的普通技术人员所普遍理解的相同的含义。将根据下文阐述的定义,使用如下术语和语法变体以描述和要求保护本发明。
当术语“例如”、“如”、“包括”、“包含”或者其变体用于本文时,这些术语将不被视为限制性术语,而将被诠释为“但不仅限于”或者“无限制性”。
如本文所用,“一种包含亲和标记的反义rRNA分子的组合物”指“一种包含单独或组合地显示与由所述至少一种全长rRNA分子显示的大体上全部的序列互补的一种或多种序列的RNA分子的组合物,其中在所述RNA分子中的所述核苷酸的至少部分连接至亲和标记物”。
如本文所用,短语“一种包含对应于大体上全部的至少一种rRNA分子的反义rRNA分子的组合物”或者“一种包含对应于‘至少一种rRNA分子’的大体上全部的分子(或者由‘至少一种rRNA分子’显示的全部的序列)的反义rRNA分子的组合物”或者“一种包含单独或者组合地与至少一种全长rRNA分子的大体上全部的分子(或者“全部序列”)互补的反义rRNA分子的组合物”指一种包含亲和标记的反义rRNA分子的组合物,所述亲和标记的反义rRNA分子显示显示具体的全长rRNA分子的序列的至少95%的所述RNA分子或者RNA分子的片段、会与显示具体的全长rRNA分子的序列的至少95%的所述RNA分子或者RNA分子的片段进行特异性杂交或者退火或者复合。优选地,所述组合物中的所述反义rRNA分子会与样本中特定的rRNA分子的至少95%分子或者其片段进行特异性杂交,使得当被亲和标记时,所述反义rRNA分子可以与结合基质联用,以从所述样本去除显示所述特定的rRNA分子的序列的至少约95%的所述RNA分子或者RNA分子片段。所述组合物中显示的反义核酸序列不必要具有与特定rRNA分子的补体相比95%的序列一致度,但是,唯一必要的是,所述反义核酸序列能够与显示所述特定的rRNA分子的序列的至少95%的所述RNA分子或者RNA分子片段进行特异性杂交、退火或者复合。所述组合物中的所述反义核酸序列不需要存在于单链核酸中(虽然他们可以),但是所述包含反义rRNA分子的组合物可以由反义rRNA片段组成,所述反义rRNA片段会共同地与显示特定的rRNA分子的序列的至少95%的所述RNA分子或者RNA分子片段杂交。在某些实施方式中,所述反义核酸序列会与显示特定的rRNA分子的序列的至少95%……96%……97%……98%……98.5%……99.0%……99.3%……99.5%……99.8%,99.0%…99.5%……99.9……或者100%的所述RNA分子或者RNA分子片段进行特异性杂交。
如本文所用,短语“一种包含存在于所述初始样本中的大体上全部的所述至少一种相关的非rRNARNA分子的rRNA除尽的样本”指最初包含了rRNA分子和第一量的所述至少一种相关的非rRNARNA分子以及通过去除某些量的rRNA分子同时保留至少90%的所述第一量的所述至少一种相关的非rRNARNA分子进行纯化了的纯化样本。在某些实施方式中,至少91%……93%……96%……97%……98%……98.5%……99.0%……99.3%……99.5%……99.8%……或者99.9%的所述第一量的所述至少一种相关的非rRNARNA分子存在于所述rRNA除尽的样本中。具有本领域知识的人员会知道或者容易地发现用于检定所述初始样本中的所述第一量的所述至少一种相关的非rRNARNA分子的方法、用于检定保留在所述rRNA除尽的样本中的所述量的所述至少一种相关的非rRNARNA分子的方法以及用于利用所述信息计算存在于所述rRNA除尽的样本中的所述第一量的所述至少一种相关的非rRNARNA分子的百分比的方法。例如,在一个实施方式中,保留在所述rRNA除尽的样本中的所述至少一种相关的非rRNARNA分子的百分比基于所述初始样本中和所述rRNA除尽的样本中的所述量的所述至少一种相关的非rRNARNA分子,如利用逆转录实时PCR(也就是所谓的“RT-qPCR”)予以测定。
如本文所用,短语“一种大体上不含存在于所述初始样本中的所述非rRNARNA分子的分离的rRNA样本”指最初包含了非rRNARNA分子和第一量的所述至少一种rRNA分子以及通过去除某些量的所述非rRNARNA分子同时保留至少90%的所述第一量的所述至少一种rRNA分子进行纯化了的纯化样本。在某些实施方式中,至少>90%……,>95%……,>98%……,>99%……,>99.8%……或者>99.9%的所述第一量的所述至少一种rRNA分子存在于所述分离的rRNA样本中。在某些实施方式中,曾存在于所述初始样本中的至少>90%……,>95%……,>98%……,>99%……,>99.8%……或者>99.9%的所述非rRNARNA分子不存在于所述分离的rRNA样本中(例如,其中所述量的所述至少一种rRNA分子和/或所述量的所述非rRNA分子利用上文所述的RT-qPCR予以测定)。
如本文所用,短语“大体上不含显示所述至少一种rRNA分子的序列的RNA分子”指纯化的样本,其中存在于所述初始样本中的显示了来自所述至少一种rRNA分子的核酸序列的所有分子的5%或者更少仍然存在于所述rRNA除尽的样本中。在某些实施方式中,存在于所述初始样本中的显示了来自特定的rRNA分子的核酸序列的所有分子的5%……4%……3%……2%……1.5%……1.0%……0.5%…或者0.1%或者更少仍然存在于所述纯化的样本中。具有本领域知识的人员会知道或者容易地发现用于检定存在于所述初始样本和所述rRNA除尽的样本中的所述量的显示所述至少一种rRNA分子的序列的RNA分子的方法。例如,在一个实施方式中,显示所述至少一种rRNA分子的序列的RNA分子的百分比基于所述初始样本和所述rRNA除尽的样本中的所述量的显示所述至少一种rRNA分子的序列的RNA分子,如利用逆转录实时PCR(也就是所谓的“RT-qPCR”)予以测定。
如本文所用,短语“大体上不含包含亲和标记物的非rRNARNA分子”指一种组合物,其中存在的所有所述的亲和标记的核酸序列的2%或者更少是具有亲和标记物的非rRNARNA分子。在某些实施方式中,存在的所有所述的亲和标记的核酸分子的2%……1.5%……1.0%……0.5%……0.1%或者更少是具有亲和标记物的非rRNARNA分子。
如本文所用,术语“rRNA除尽的样本”或者“大体上不含rRNA分子的样本”在本文中有时指“rRNA削减的样本”或者“削减的样本”以及所述“用于生成rRNA除尽的样本的方法”或者所述“用于从样本分离rRNA的方法”在本文中有时指“用于rRNA削减的方法”或者,更简单地,指“rRNA削减”。本文的术语“rRNA削减”将意指“用于生成rRNA除尽的样本的方法或者用于从样本中分离rRNA的方法”。类似地,当动词形式“削减”用于本文时,它将意指“一种执行用于生成rRNA除尽样本或者用于从样本分离rRNA的方法的方法或工艺”以及本文中的术语“削减的”将意指“经过执行所述方法或工艺所述样本的rRNA除尽的状态”。
如本文所用,短语“结合基质”指任何类型的底物(不论多孔或者无孔),所述底物会结合亲和标记的核酸分子以便亲和标记的核酸分子和杂交有所述亲和标记的核酸分子的序列可以优选地从样本中去除。亲和标记物结合分子与所述结合基质相关联以允许所述结合基质结合亲和标记的核酸分子。这类结合基质的例子包括但不仅限于尼龙膜或者颗粒、二氧化硅膜或者颗粒、醋酸纤维素膜或者颗粒、由二氧化硅和Fe2O3组成的膜或者颗粒以及其他类似的膜、纤维、涂覆板、固体支撑物以及颗粒。
如本文所用,“特异性结合对”指在某些条件(被称为“结合条件”)下对彼此具有亲和性并且彼此“结合”的两个分子。生物素和链酶亲和素或者亲和素是“特异性结合对”或者“亲和结合分子”的例子,但是本发明不限于使用这类特定的特异性结合对。在本发明的许多实施方式中,一个特定的特异性结合对的一员被称为“亲和标记物分子”或者“亲和标记物”以及另一个被称为“亲和标记物结合分子”或者“亲和标记物结合分子”。例如,但不仅限于,在某些实施方式中,生物素被称为所述亲和标记物或者亲和标记物分子,以及链酶亲和素或者亲和素分子,无论其是游离状态、附至表面、附至另一分子或者用可检测的分子(如染剂)标记,被称为亲和标记物结合分子。在其他实施方式中,链酶亲和素是所述亲和标记物而生物素是所述亲和标记物结合分子,因为链酶亲和素和生物素一起作为特异性结合对或者作为亲和结合分子起作用。多种多样的其他特异性结合对或者亲和结合分子(包括亲和标记物分子和亲和标记物结合分子两者)为本领域所知(例如,参见美国专利号6,562,575,其以引用方式并入本文),其可以用于本发明。例如,抗原(其自身可以是抗体)和结合所述抗原的抗体(包括单克隆抗体)是特异性结合对。此外,抗体和结合抗体的蛋白(如金黄色葡萄球菌蛋白A)可以用作特异性结合对。特异性结合对的其他例子包括但不仅限于由植物凝血素特异性结合的碳水化合物部分和所述植物凝血素;荷尔蒙和所述荷尔蒙的受体;以及酶和所述酶的抑制剂。通常,包含特异性结合对的分子通过非共价键如氢键、疏水性交互作用(包括芳香族分子的堆积)、范德瓦尔斯力和盐桥彼此相互作用。不限于理论,本领域认为,这些类型的非共价键导致结合,在某种程度上是由于所述结合对中涉及的分子的互补形状或结构。根据本发明,术语“结合”指由非共价键(例如但不仅限于氢键、疏水性交互作用、范德瓦尔斯键和离子键)导致的亲和结合分子或者特异性结合对之间(例如,作为亲和标记物分子的生物素和作为亲和标记物结合分子的链酶亲和素之间)的交互作用。基于结合的定义,以及所述多种多样的亲和结合分子或者特异性结合对,显然,“结合条件”因不同的特异性结合对而不同。本领域的技术人员可以容易地确定样本中亲和结合分子之间发生结合的条件。具体地,本领域的技术人员可以容易地确定可以使亲和结合分子之间的在本领域被认为是“特异性结合”的结合的条件发生。如本领域所理解的是,这种特异性通常是由于亲和结合分子之间的高于针对样本中其他物质和组分(例如,器壁、固体支撑物)的亲和性。在某些情况下,所述特异性也可能涉及或者可能由于亲和结合分子相关联的速度比与样本中其他物质和组分相关联的速度快得多。
在本发明的某些实施方式中,用了“亲和标记试剂”或者/以及“具有活性部分的亲和标记物”,在本文中我们借此意指包含亲和标记物和活性化学基团或者部分两者的分子,所述活性化学基团或者部分能够与与其反应的分子的一种或多种原子或者基团反应,以在包含所述亲和标记物的分子和与其反应的分子之间形成一种或多种共价化学键。作为非限制性的范例,在某些实施方式中,所述亲和标记试剂是酰化试剂(例如N-羟基琥珀酰亚胺酯),其中所述亲和标记物通过酰基键化学连接至与其反应的分子中的原子。在其他实施方式中,所述亲和标记试剂是烷基化试剂、基团,其中所述亲和标记物通过烷基键化学连接至与其反应的分子中的原子。在其他实施方式中,所述亲和标记试剂通过电环化类型的化学反应,如1,3-偶极环加成(例如,用叠氮化物的炔环加成)反应。因而,术语“活性”部分(关于,例如“亲和标记试剂”或者“具有活性部分的亲和标记物”)用以指化学反应涉及或者导致化学反应的部分或者基团,借此包含所述亲和标记物的分子发生化学反应,与与其反应的分子中的一种或多种原子形成共价化学键,而非指由于非共价力和键发生于亲和结合分子之间的结合。
当我们提及将所述“亲和标记物结合分子”或者所述“亲和标记物结合分子”(如链酶亲和素或者亲和素)直接附至表面或者固体支撑物时,这通常但是并非总是指,所述亲和标记物结合分子通过被连接至所述表面以及至所述亲和标记物结合分子的化学接头(linker)共价附至所述表面。当我们提及将所述“亲和标记物结合分子”或者所述“亲和标记物结合分子”(如链酶亲和素或者亲和素)间接附至表面时,这是指所述亲和标记物结合分子结合至对其具有亲和性的另一分子(例如抗链酶亲和素的抗体),所述另一分子反过来结合至表面。在某些实施方式中,所述亲和标记物结合分子(如链酶亲和素或者亲和素)并非附至表面,而是由另一分子(如抗体或者蛋白A)结合,以及所述生物素化的修饰的核苷酸封端的RNA利用本领域已知的方法和组合物通过沉淀或者通过结合至第二抗体或者其他分子予以回收。
如本文所用,术语“约”指涵盖小于25%和大于25%之间的范围。例如,“约200核苷酸”指涵盖150和250核苷酸之间的范围。
如本文所用,术语“杂交”用以指互补核酸的配对。杂交以及杂交强度(即核酸之间的关联强度)受许多因素影响,例如核酸之间的互补程度、所涉及条件的严谨度、所形成的杂交体的解链温度(Tm)以及核酸内的G∶C比率。其结构内包含互补核酸配对的单分子被称为“自交”的分子。核杂交的丰富指导资料可见于Tijssen,LaboratoryTechniquesinBiochemistryandMolecularBiology-HybridizationwithNucleicAcidProbes,第I部分,第2章,″Overviewofprinciplesofhybridizationandthestrategyofnucleicacidprobeassays,″Elsevier(1993),其以引用方式并入本文。
发明详述
本发明提供用于生成rRNA除尽的样本和用于从样本中分离rRNA的方法、组合物和试剂盒。具体地,本发明提供组合物,所述组合物包含对应于至少一种rRNA分子(例如真核28S、26S、25S、18S、5.8S和/或5SrRNA和/或原核23S、16S和/或5SrRNA)的大体上全部的序列的亲和标记的反义rRNA分子,以及利用这类组合物生成rRNA除尽的样本的方法。
核糖体RNA构成细胞的RNA含量的绝大部分,并因此在含量较少但经常具有更多相关性的转录物的研究中成为巨大的背景污染负担。现有的减少rRNA的方法严重受限,因为例如,它们只需要“高质量全段RNA”样本,用以很好地去除rRNA。所述样本中无互补共有序列的rRNA片段利用本领域的方法无法去除,因而,仍然造成所述样本的严重的rRNA污染,这限制了下游转录物分析的成效并极大地提高了所用的非必需的消耗品和人力导致的成本负担。进一步地,甚至在最好的情况(其中所述样本中的所述RNA包含所谓的“全段总RNA”)下,所述样本仍然可以包含一群片段化的rRNA,这利用本领域的所述方法仍然会导致rRNA背景。仍然进一步地,本领域的所述方法未去除由所述rRNA分子显示的所有序列的足够量,因此,当所述样本被用于现代分析方法(例如用于从RNA生成用于下一代测序的标记的测序模板的方法(例如,用于所谓的“数字”基因表达方法))时,所述rRNA背景是高的。例如,据报道,甚至在利用本领域已知的商业方法(例如利用加利福尼亚卡尔斯巴德LifeTechnologies的R1BoMinusTM)进行一轮或者多轮rRNA去除后,超过半数的序列读段数(reads)是针对rRNA序列的。这些现有方法的另一需求是需要相对大的样本尺寸(其常常是受抑制的)。通常情况下,提取自尤其长期储存的细胞/组织样本的总RNA总是非常片段化的而且在数量方面受限。因而,需要一种同时去除片段化rRNA和全段rRNA两者以及从小的样本尺寸进行所述去除的方法。
本发明解决了这种需要,因为它提供例如,用于高效去除完全片段的或者可变片段化的rRNA分子,而通常不扰动非rRNARNA转录物的方法。进一步地,所述方法的操作独立于非核糖体RNA转录物的任何“特色”,例如在真核mRNA情况下的poly(A)尾以及因而,在所有非核糖体RNA转录物的回收中不会有选择偏倚。在实现这些目标的某些实施方式中,合成一种或多种全部或部分地代表每个rRNA(例如真核28S、26S、25S、18S、5.8S和/或5Ss和/或原核23S、16S和5S)的大体上全部的所述全长序列的亲和标记的反义rRNA并将其杂交至处理后的样本中他们各自的互补rRNA序列,以及然后利用亲和标记物结合分子(例如,连接至结合基质)物理上去除所述杂交体以及任何残余的未杂交的亲和标记的反义rRNA分子,而不扰动所述非rRNARNA转录物。由于至少一个以及优选地每个rRNA的大体上全部的(或者全部的)序列被示于所述包含亲和标记的反义rRNA分子的组合物中,包含在所述样本中的原生rRNA的任何尺寸的片段也能够在相同杂交条件下形成杂交体以及连同也存在的任何全段rRNA序列被高效去除。
在具体的实施方式中,为了实现有效的rRNA去除,在杂交反应中使用摩尔过量的所述亲和标记的反义rRNA分子,这驱使杂交体形成过程完结。过量亲和标记的反义rRNA分子也可被去除,因为这些分子自身可在不同的下游方法或者分析中导致各类背景。要达成这个,所述亲和标记的反义rRNA分子优选地包含最佳量的亲和标记物分子,以及合适量的包含所述亲和标记物结合分子的所述结合基质被用于去除杂交的和未杂交的亲和标记的反义rRNA分子。如实施例中所述,发展多种条件,以允许所述方法利用包含比现有方法更宽的动态范围的总RNA的样本(包括利用包含亚微克量的总RNA的样本)得以执行。
示例性rRNA序列和引物
本发明包括包含对应于大体上全部的至少一种rRNA分子的亲和标记的反义rRNA分子的组合物。本发明不限于包含显示与样本中特定的rRNA分子恰好互补的序列的反义rRNA分子的组合物,而是包括包含反义rRNA分子的组合物,所述反义rRNA分子与样本中任何rRNA分子杂交或者退火或者复合,不论所述rRNA分子是否来自相同的生物体。
示例性实施方式
下文描述了一个示例性的实施方式,该实施方式可用以利用连接有亲和标记物结合分子的微球体(下文称“结合微球体”或者“微球体”)生成rRNA除尽的样本。该实施方式并非意在限制本发明,而只不过是一个示例性的实施方式。
清洗所述结合微球体并悬浮在溶液(20mMTris-HClpH7.5、1MNaCl、1mMEDTA和0.0005%不含RNA酶的Triton-X100)中。允许所述结合微球体达到室温。用力旋转所述微球体20秒,以产生均质的悬浮液。针对每个反应,将25ul的重悬浮过的微球体吸移进入微球体清洗管。在台式微量离心机中以10,000rpm离心分离所分散的微球体达3分钟。小心将上清液吸移出去并丢掉,而不搅乱微球体丸。通过向所述管加入等于微球体原始体积的1体积的洗液(20mMTris-HClpH7.5、1MNaCl和1mMEDTA)清洗所述微球体(例如,针对每25μl的微球体加入25μl的洗液)。通过有力的涡旋搅拌重悬浮所述微球体。在台式微量离心机中以10,000rpm离心分离所述管达3分钟。小心将上清液吸移出去并丢掉,而不搅乱微球体丸。重复所述清洗、重悬浮、离心分离和吸移步骤。
在1体积的重悬浮溶液中重悬浮所述微球体。例如,针对最初使用的每25μl的微球体加入25μl的重悬浮溶液。通过有力的涡旋搅拌重悬浮所述微球体,以产生均质的悬浮液。针对每25μl的重悬浮过的微球体向所述管加入0.25μl的ScriptGuardTMRNA酶抑制剂(威斯康星州麦迪逊的EPICENTRE)并将它们于室温下储存。
针对在0.2ml薄壁微量离心管中的一个包含例如,50ng-1ug至总RNA(例如人类、小鼠或者大鼠)的样本,进行如下合并:10X反应缓冲液(0.5MTris-HClpH7.5和1MNaCl)、总RNA样本、rRNA清除溶液(对应于28S、18S、5.8S和5S人类rRNA分子的每个亲和标记的反义rRNA分子1.2皮摩尔)以及不含RNA酶的水。轻轻地搅拌反应并在68℃下孵育达10分钟。将所述反应管移至室温并孵育达至少15分钟。
通过往复吸移(pipetteupanddown),重悬浮自上文得到的所清洗的微球体。针对每个样本,将25μl的所述微球体吸移入新的不含RNA酶的1.5ml微量离心管。将室温的总RNA样本加入包含所述微球体的合适的管。通过往复吸移所述管的内容物对每个进行彻底混合。在室温下孵育每个管达15分钟,通过柔和的涡旋(低设置)不时地(每3-4分钟)混合5秒钟。将所述管置于37℃达5分钟。紧接着,室温下在微量离心机中以14,000rpm离心分离所述管达5分钟。小心将每份包含所述rRNA除尽的样本的上清液吸移出去,进入不含RNA酶的1.5ml微量离心管。如果所述样本中仍然可见微球体,需要使用乙醇沉淀,重复上述步骤。所述rRNA除尽的样本可以例如,通过乙醇沉淀或者柱式法被纯化。
对于乙醇沉淀,利用不含RNA酶的水将每个样本的体积调整至180μl。向每个管加入18μl的3M醋酸钠。向每个管加入2μl的Glycogen(10mg/ml)并通过柔和的涡旋进行混合。向每个管加入3体积(600μl)的冰冷的100%乙醇并通过柔和的涡旋进行混合。将所述管置于-20℃达至少1小时。在微量离心机中以>10,000xg离心分离所述管达30分钟。小心移除并丢弃上清液。用冰冷的70%乙醇清洗所述丸并以>10,000xg离心分离达5分钟。小心移除并丢弃上清液。重复所述乙醇和离心分离步骤。简单地进行离心分离以收集任何残余的上清液。小心移除并丢弃上清液并允许所述丸在室温风干达5分钟。在所需体积的不含RNA酶的水或者缓冲液中溶解所述丸。
对于柱式纯化,可使用RNAClean&ConcentratorTM-5柱(ZymoResearch;CatalogNumbersRl015,Rl016),以纯化所述rRNA除尽RNA样本。如果使用所述RNAClean&ConcentratorTM-5柱,请遵循制造商的步骤,标题为“TorecovertotalRNAincludingsmallRNAs”。洗脱的RNA可立即使用或者于-70℃至-80℃下储存。
测序技术
根据本发明生成的纯化的RNA样本可以利用任何类型的适当的测序技术进行测序。所采用的类型的测序方法不对本发明形成限制。下文对示例性的测序方法进行描述。
核酸测序技术的描述性的非限制性的例子包括但不仅限于链终止子(Sanger)测序以及染料终止子测序(dyeterminatorsequencing)。链终止子测序通过采用修饰的核苷酸底物使用DNA合成反应的序列-特异性终止。在模板DNA上的特异性位点上引发延伸,手段是利用与那个区域的所述模板互补的短放射物或者其他标记的寡核苷酸引物。利用DNA聚合酶、四种标准的脱氧核苷酸碱基和一种低浓度的链终止核苷酸(最常见的双脱氧核苷酸)延伸所述寡核苷酸引物。在四个独立的管中重复该反应,其中所述碱基的每个轮流作为双脱氧核苷酸。所述DNA聚合酶结合的链终止核苷酸有限,这导致一系列相关的DNA片段仅仅在使用具体双脱氧核苷酸的位置被终止。对于每个反应管,在平板聚丙烯酰胺凝胶或者填充有粘性聚合物的毛细管中通过电泳将所述片段按大小分离(size-separated)。在对凝胶从顶部到底部进行扫描时,通过读取哪个泳道产生标记引物的可视标志来测定序列。
替代地,染料终止子测序标记终止子。在单个反应中,可以通过用单独的荧光染料(荧光发射波长不同)标记双脱氧核苷酸链终止子的每个执行完整的测序。
被称为“下一代测序”技术的一套方法已经作为Sanger和染料终止子测序方法的替代性方法出现(Voelkerding等人,ClinicalChem.,55:641-658,2009;MacLean等人,NatureRev.Microbiol.,7:287-296;每个以引用方式整体并入本文)。多数现有方法描述了将下一代测序技术用于整体基因组的从头测序,以确定生物体的基本核酸序列。此外,靶向重测序(深度测序)考虑到了野生型序列群体内部的敏感性突变检测。某些例子包括目前的工作成果,其描述了识别HIV抗药性变体以及EGFR突变,以确定对抗TK治疗药物的反应。对条形码引物序列的用途进行描述的当前出版物使得在通常的测序运行(typicalsequencingrun)中同时对多种样本进行测序成为可能,包括,例如:Margulies,M.等人.″GenomeSequencinginMicrofabricatedHigh-DensityPicolitreReactors″,Nature,437,376-80(2005);Mikkelsen,T.等人.″Genome-WideMapsofChromatinStateinPluripotentandLineage-CommittedCells″,Nature,448,553-60(2007);McLaughlin,S.等人.″Whole-GenomeResequencingwithShortReads:AccurateMutationDiscoverywithMatePairsandQualityValues″,ASHGAnnualMeeting(2007);ShendureJ.等人.″AccurateMultiplexPolonySequencingofanEvolvedBacterialGenome″,Science,309,1728-32(2005);Harris,T.等人.″Single-MoleculeDNASequencingofaViralGenome″,Science,320,106-9(2008);Simen,B.等人.″PrevalenceofLowAbundanceDrugResistantVariantsbyUltraDeepSequencinginChronicallyHIV-infectedAntiretroviral(ARV)PatientsandtheImpactonVirologicOutcomes″,16thInternationalHIVDrugResistanceWorkshop,Barbados(2007);Thomas,R.等人.″SensitiveMutationDetectioninHeterogeneousCancerSpecimensbyMassivelyParallelPicoliterReactorSequencing″,NatureMed.,12,852-855(2006);Mitsuya,Y.等人.″MinorityHumanImmunodeficiencyVirusType1VariantsinPersonswithReverseTranscriptaseCodon215RevertantMutations″,J.Vir.,82,10747-10755(2008);Binladen,J.等人.″TheUseofCodedPCRPrimersEnablesHigh-ThroughputSequencingofMultipleHomologAmplificationProductsby454ParallelSequencing″,PLoSONE,2,el97(2007);以及Hoffmann,C.等人.″DNABarCodingandPyrosequencingtoIdentifyRareHIVDrugResistanceMutations″,Nuc.AcidsRes.,35,e91(2007),全部以引用方式并入本文。
与传统的Sanger测序相比,下一代测序技术产生大量的测序数据点。一个通常的测序运行每次可以容易地生成数十到数百兆碱基,其日产量可能达到千兆碱基的范围。这变换为比标准的96孔板高出多个数量级,所述标准的96孔板在通常的多重测序运行中可以生成数百个数据点。即使当存在来自相关物种或者生物体的多种靶时,也可以容易地区别与一种核苷酸区别很小的靶扩增子。这极大地提高了进行准确的基因分型的能力。用以产生共有序列的下一代序列比对软件程序可以容易地确定新型点突变,这会产生具有相关抗药性的新株。引物条形编码的使用也使得单个测序运行内不同患者样本的多重操作成为可能。
下一代测序(NGS)方法与大规模平行、高通量的策略具有共同的特点,其目标在于与较早的测序方法相比成本更低。NGS方法可以大概分为需要模板扩增的一类和不需要模板扩增的一类。需要扩增的方法包括被Roche以454技术平台(例如GS20和GSFLX)商业化的焦磷酸测序、被Illumina商业化的Solexa平台以及被AppliedBiosystems商业化的支持寡核苷酸连接和检测(SOLiD)平台。非扩增途径(也称为单分子测序)的例子是被HelicosBioSciences商业化的HeliScope平台以及分别被VisiGen和PacificBiosciences商业化的新兴平台。
在焦磷酸测序(Voelkerding等人,ClinicalChem.,55:641-658,2009;MacLean等人,NatureRev.Microbiol.,7:287-296;美国专利号6,210,891;美国专利号6,258,568;每个以引用方式整体并入本文)中,通过用泳道有与接头互补的寡核苷酸的微球捕获单个模板分子将模板DNA分成片段、进行末端修复、连接至所述接头并以克隆方式进行原位扩增。将泳道有单个模板类型的每个微球划分入油包水微泡,以及利用被称为乳化PCR的技术以克隆方式扩增所述模板。扩增后中断乳化并将微球沉积入在测序反应过程中用作流动池的picotitre板的单个孔中。在测序酶和荧光报告子(如萤光素酶)的存在下,在流动池中有序、迭代地引入四种dNTP试剂的每个。倘若在测序引物的3′端加入适当的dNTP,所产生的ATP会在所述池内导致荧光爆发,这利用CCD相机记录下来。可能获得大于或者等于400碱基的读段长度(readlength),以及能够获得1x106序列读段数,产生多达500百万的序列碱基对(Mb)。
在Solexa/Illumina平台(Voelkerding等人,ClinicalChem.,55:641-658,2009;MacLean等人,NatureRev.Microbiol.,7:287-296;美国专利号6,833,246;美国专利号7,115,400;美国专利号6,969,488;每个以引用方式整体并入本文)中,测序数据以长度较短的读段的形式产生。在本方法中,对单链片段化的DNA进行末端修复以生成5′-磷酸化的平整末端,接着以Klenow为介导将单个A碱基加至片段的3′端。A的添加便于添加T-突出端接头寡核苷酸,其接着用以捕获嵌有寡核苷酸锚的流动池表面上的模板-接头分子。所述锚被用作PCR引物,但是由于模板的长度及其接近其他附近的锚寡核苷酸,通过PCR进行的延伸导致所述分子“上弓起”(archingover)与相邻的锚寡核苷酸杂交在所述流动池的表面上形成桥结构。将这些DNA环区变性并裂解。然后用可逆的染料终止子对正向链进行测序。通过检测结合后的荧光确定结合的核苷酸的序列,在下一轮dNTP添加之前,去除每个荧光剂和模块。序列读取长度范围从36个核苷酸至超过50个核苷酸,每一分析运行的总产出超过十亿核苷酸对。
利用SOLiD技术对核酸分子的测序(Voelkerding等人,ClinicalChem.,55:641-658,2009;MacLean等人,NatureRev.Microbiol.,7:287-296;美国专利号5,912,148;美国专利号6,130,073;每个以引用方式整体并入本文)还涉及模板的片段化、连接至寡核苷酸接头、附至微球以及通过乳化PCR的克隆扩增。在此之后,将泳道有模板的微球固定化在玻璃流动池的衍生化表面上以及对与接头寡核苷酸互补的引物进行退火。然而,该引物并非用于3′延伸,而是用以提供5′磷酸基团,用于连接至包含两种探针特异性碱基的问询探针(interrogationprobe),接着是6个简并碱基和四种荧光标记中的一种。在所述SOLiD系统中,问询探针在每个探针的3′端具有所述两种碱基的16种可能的组合,以及在5′端具有四种荧光剂的一种。荧光剂颜色以及每个探针由此产生的一致度对应于指定的颜色-空间编码方案。多轮(通常7)的探针退火、连接以及荧光剂检测之后是变性,然后是第二轮利用通过相对于初始引物的一种碱基补偿的引物的测序。以这种方式,估计可以重新构建模板序列,以及对模板碱基问询两次,这提高了准确性。序列读取长度平均为35个核苷酸以及每次测序运行的总产出超过40亿碱基。
在某些实施方式中,采用纳米孔测序(参见例如,Astier等人,JAmChemSoc.2006Feb8;128(5):1705-10,以引用方式并入本文)。纳米孔测序背后的理论与将纳米孔浸入传导流体中以及在其两端施加电势(电压)时所发生的事情有点关联:在这些条件下,可以观测到由于离子传导通过纳米孔的微量电流,以及电流的量对纳米孔的尺寸极度敏感。如果DNA分子穿过(或者部分DNA分子穿过)纳米孔,这可以改变穿过纳米孔的电流的幅值,从而允许测定DNA分子的序列。
HelicosBioSciences的HeliScope(Voelkerding等人,ClinicalChem.,55:641-658,2009;MacLean等人,NatureRev.Microbiol.,7:287-296;美国专利号7,169,560;美国专利号7,282,337;美国专利号7,482,120;美国专利号7,501,245;美国专利号6,818,395;美国专利号6,911,345;美国专利号7,501,245;每个以引用方式整体并入本文)是第一个商业化的单分子测序平台。该方法不要求克隆扩增。将模板DNA片段化以及在3′端进行多聚腺苷酸化,最后的腺苷泳道有荧光标记。将变性的多聚腺苷酸化的模板片段连接至流动池表面上的聚(dT)寡核苷酸。通过CCD相机记录捕获的模板分子的初始物理位置,然后裂解并洗掉标记。通过聚合酶的添加以及荧光标记的dNTP试剂的连续添加实现测序。结合事件(incorporationevents)导致对应于dNTP的荧光剂信号,以及在每轮dNTP添加之前通过CCD相机捕获信号。序列读段长度的范围为25-50个核苷酸,每次分析运行的总产出超过十亿核苷酸。其他新兴的单分子测序方法是利用VisiGen平台的实时边合成边测序(Voelkerding等人,ClinicalChem.,55:641-658,2009;美国专利号7,329,492;美国专利申请序列号11/671956;美国专利申请序列号11/781166;每个以引用方式整体并入本文),其中利用荧光修饰的聚合酶和荧光受体分子对固定化的引物DNA模板进行链延伸,这导致一旦添加核苷酸之后可检测的荧光共振能量转移(FRET)。由PacificBiosciences开发的另一实时单分子测序系统(Voelkerding等人,ClinicalChem.,55:641-658,2009;MacLean等人,NatureRev.Microbiol.,7:287-296;美国专利号7,170,050;美国专利号7,302,146;美国专利号7,313,308;美国专利号7,476,503;所有这些以引用方式并入本文)利用直径为50-100nm以及反应容积为大约20公升(10x10-21L)的反应孔。利用固定化的模板、修饰的phi29DNA聚合酶以及高局部浓度的荧光标记的dNTP执行测序反应。高局部浓度和连续的反应条件允许利用激光激发、光波导管和CCD相机,通过荧光剂信号检测实时捕获结合事件。
结合基质固体支撑物
本发明采用的结合基质可以是任何能够附有亲和标记物结合分子以及不显示所述亲和标记的反义rRNA分子的牢固的非特异性结合的表面或者固体载体。本发明不限于任何一种固体支撑物。在某些实施方式中,采用包含96孔或者384孔的聚苯乙烯板。在某些实施方式中,涂覆有链酶亲和素(SA)的96孔或者384孔微量滴定板(印第安纳州印第安纳波利斯的BoehringerMannheimBiochemicals)被用作固体支撑物。在某些实施方式中,采用颗粒或者微球。所述颗粒可以任何适当的材料制成,包括但不仅限于乳胶。在某些实施方式中,采用微型柱。柱可包含亲和标记物结合分子。在其他实施方式中,采用BEADARRAY(加利福尼亚圣地亚哥的Illumina)。考虑到各种各样的其他固体支撑物,包括但不仅限于玻璃显微镜载片、玻璃晶圆、金、硅、微芯片以及其他塑料、金属、陶瓷或者生物表面。
实施例
理解的是,本文所述的实施例和实施方式仅仅用于说明性目的,非限制所要求保护的发明的范围。还可理解的是,可建议本领域的技术人员依照本文所述的实施例和实施方式进行各种修改或者改变,且依照本文所述的实施例和实施方式进行的各种修改或者改变将被包含在本申请的精神和范围以及所附的权利要求书的范围之内。
实施例1
代表真核细胞和原核细胞的核糖体RNA(rRNA)分子的全长序列的生物素化的反义rRNA分子的合成
为了合成对应于每个rRNA分子的完整序列的反义rRNA,制成了如下包含噬菌体启动子序列的PCR模板。
用于反义rRNA的体外合成的人类18S、5.8S和5SrRNAPCR模板
合成了代表全长18S(登录号NR_003286)、5.8S(登录号U13369REGION:6623-6779)和5S(登录号NR_023363)rRNA序列的PCR扩增子。每个100μlPCR反应包含了20皮摩尔的正向引物、20皮摩尔的反向引物(其包含T7RNA聚合酶噬菌体启动子序列(以斜体显示)和在如制造商(EPICENTREBiotechnologies)所述的FailSafePCR反应条件下由UniversalHumanReferencetotalRNA(Stratagene)制成的5ng随机引物第一链cDNA)。依照引物对以及对应于全长18S、5.8S和5SrRNA序列的PCR扩增子执行PCR扩增反应25个循环至30个循环,以及利用制造商(Qiagen)推荐的QiaquickPCR纯化试剂盒纯化了PCR产物。如下列出所用的各自的正向和反向引物:
18SrRNA
正向引物(SEQIDNO:1:5’-CCTACCTACCTGGTTGATCC)和
反向引物(SEQIDNO:2:5’-AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAGATCCTTCCGCAGGTTCACCTAC)。
5.8SrRNA
正向引物(SEQIDNO:3:5’-CGACTCTTAGCGGTGGATCACTC)和反向引物(SEQIDNO:4:5’-AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAGATCCTTCCGCAGGTTCACCTAC)
5SrRNA
正向引物(SEQIDNO:5:5’-GTCTACGGCCATACCACCCTGAA)和反向引物(SEQIDNO:6:5’-AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAAAGCCTACAGCACCCGGTATTC)
用于反义rRNA的体外合成的大肠杆菌23S、16S和5SrRNAPCR模板
合成了代表全长23S(登录号EG30077)、16S(登录号EG30084)和5S(登录号EG30070)rRNA序列的PCR扩增子。每个100μlPCR反应包含了20皮摩尔的正向引物、20皮摩尔的反向引物(其包含T7RNA聚合酶噬菌体启动子序列(以斜体显示)和在如制造商(EPICENTREBiotechnologies)所述的FailSafePCR反应条件下由大肠杆菌K-12总RNA制成的5ng随机引物第一链cDNA)。依照引物对以及对应于全长23S、16S和5SrRNA序列的PCR扩增子执行PCR扩增反应25个循环至30个循环,以及利用制造商(Qiagen)推荐的QiaquickPCR纯化试剂盒纯化了PCR产物。如下列出所用的各自的正向和反向引物:
23SrRNA
为了高效地扩增完整的23SrRNA序列,用了两对引物,借以将全长23SrRNA序列分成大概两个相等的片段。5′23SrRNA片段包含正向引物(SEQIDNO:7:5’-AAGCGACTAAGCGTACACGGTGGA)和反向引物(SEQIDNO:8:5′-AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGATTCCTGGAAGCAGGGCATTTGTTG)以及3′23SrRNA片段包含正向引物(SEQIDNO:9:5′-CAACAAATGCCCTGCTTCCAGGAA)和反向引物(SEQIDNO:10:5′-AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGACACGGTTCATTAGTACCGGTTAGCT)。
16SrRNA
正向引物(SEQIDNO:11:5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG)和反向引物(SEQIDNO:12:5′-AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAGGAGGTGATCCAACCGCAGGTT)。
5SrRNA
正向引物(SEQIDNO:13:5’-TGCCTGGCGGCAGTAGCGCGGT)和反向引物(SEQIDNO:14:5’-AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGATGCCTGGCAGTTCCCTACTCTC)。
通过溴化乙锭染色的琼脂糖凝胶电泳对各自代表人类或者大肠杆菌rRNA序列的每个PCR扩增子(300ng)进行了分析,如图1A所示。
人类28S核糖体RNA克隆
发现完整的28SrRNA(登录号NR003287)序列的PCR扩增不是非常高效,尤其是对于约1200nt的5’端序列,即使将全长序列分为1Kb至2Kb范围的片段后。因而,为了生成用于28S反义rRNA的体外合成所需的模板,利用标准的克隆方法和策略(Maniatis等人.(1982)MolecularCloning,ALaboratoryManual.ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,NewYork)和Maden等人(1987)Biochem.J.246:519-527所述的信息将28SrRNA序列克隆为含有T7噬菌体启动子的质体(pSP73;PromegaCorporation)和含有SP6噬菌体启动子的质体(pSP64;PromegaCorporation)两者。
从人类18S、5.8S和5S和大肠杆菌23S、16S和5SrRNA序列的各自的PCR
模板到生物素化的反义rRNA分子的体外合成
AmpliScriBeTMT7高收率转录试剂盒或者AmpliScriBeTMT7-FLASH转录试剂盒(威斯康星州麦迪逊的EPICENTRE)被用于体外转录(IVT)反应,以及如制造商(EPICENTREBiotechnologies)所述执行各自包含500ng至1000ng模板(人类18S、5.8S和5S_以及大肠杆菌23S、16S和5S)的反应,并做如下修改:用生物素-16-三磷酸尿苷(UTP)和包含10%、20%、35%、50%或者60%生物素-16-UTP的UTP的混合物取代UTP。在37℃孵育IVT反应物达4至6小时,然后用制造商推荐的DNaseI消化每个反应中所用的DNA模板。利用制造商(GEHealthcare)推荐的illustraRNAspinMini柱依次纯化每个生物素化的反义rRNA并在不含RNA酶的水中洗脱。用制造商(EPICENTREBiotechnologies)推荐的Baseline-ZeroTMDNaseI处理每个纯化的反义rRNA,以去除所有痕量的用于转录的DNA模板。再次利用illustraRNAspinMini柱纯化以及在不含RNA酶的水中洗脱所述生物素化的反义rRNA,以及通过用分光光度计测量260nm的吸收率来测定RNA浓度。(备注:后来的实验表明了在体外转录反应中利用至少约75%生物素-16-UTP获得了相对5.8S和5S真核rRNA或者5S原核rRNA生成rRNA除尽的样本的最好的结果。)
如通过溴化乙锭染色的琼脂糖凝胶电泳分析,代表整体人类或者大肠杆菌rRNA序列的每个纯化的反义RNA(300ng)示于图1B中。
从人类28SrRNA序列的质体模板到生物素化的反义rRNA的体外合成
最初,如制造商(EPICENTREBiotechnologies)所述,在用于体外转录(IVT)的AmpliScriBeTMT7HighYield转录试剂盒中使用1μg线性化的T7-28SrRNA质体克隆物,并做如下修改:bio-UTP∶UTP的1∶1混合物代替100%UTP。在37℃孵育4小时,然后通过利用制造商(EPICENTREBiotechnologies)推荐的DNaseI进行的消化,去除了DNA模板。通过凝胶电泳分析了等份处理后的样本(300ng)的纯化的转录反应产物。从结果(图1C,泳道1)明显看出,在所述IVT反应中产生的期望的全长反义28SrRNA微乎其微(若有)。反而,观察到尺寸范围从低到高分子量的RNA分子。因而,看起来,所述T7RNA聚合酶不能有效地转录28SDNA模板。
接下来,如制造商(EPICENTREBiotechnologies)所述,在用于体外转录(IVT)的标准AmpliScriBeTMSP6HighYield转录试剂盒中检测1μg线性化的SP6-28SrRNA质体克隆物,并类似地采用bio-UTP和UTP的1∶1混合物。在37℃孵育4小时,然后通过利用制造商(EPICENTREBiotechnologies)推荐的DNaseI进行的消化,去除了DNA模板。利用制造商(GEHealthcare)推荐的illustraRNAspinMini柱依次纯化生物素化的反义rRNA并在不含RNA酶的水中洗脱。之后,用制造商(EPICENTREBiotechnologies)推荐的Baseline-ZeroTMDNaseI处理纯化的反义28SrRNA,以去除所有痕量的用于转录的DNA模板。再次利用illustraRNAspinMini柱纯化以及在不含RNA酶的水中洗脱所述生物素化的反义rRNA,以及通过用分光光度计测量260nm的吸收率来测定RNA浓度。通过凝胶电泳分析了等份处理后的样本(300ng)的转录反应物以及从结果明显看出,在所述SP6-IVT反应中产生了期望的反义28SrRNA(图1C,泳道2)。
实施例2
利用涂覆链酶亲和素的微球体去除生物素化的反义rRNA和利用大肠杆菌总RNA形成的所得ds-rRNA杂交体
将大肠杆菌rRNA作为模型,检测从溶液去除定量生物素化的反义rRNA所需的ProActive涂覆链酶亲和素的微球体(BangsLaboratories)的量。清洗所述涂覆链酶亲和素的微球体并将其重悬浮于制造商(BangsLaboratories)推荐的结合/清洗缓冲液中。如实施例1所述,利用35%生物素-UTP合成的大肠杆菌生物素化的反义rRNA材料被用以制备包含含于4μl体积不含RNA酶的水的一微克23SrRNA5′片段、23SrRNA3′片段以及全长16SrRNA的每个的混合物。每个4μl生物素化的反义rRNA混合物将表示,当与一微克的原生大肠杆菌总RNA混合时至少>2倍的摩尔过量,该浓度被选定以促使混合在一起时,正义和反义rRNA完全杂交或者接近完全杂交。
测定有效地去除加入到杂交反应的生物素化的反义rRNA所需的涂覆链酶亲和素的微球体的量。在0.2ml微量离心管中将三个4μl等份处理后的样本的大肠杆菌生物素化的反义rRNA混合物制备成包含1x杂交缓冲液(50mMTris-HCl,pH7.5和100mMNaCl)的最终反应体积20μl。在68℃下孵育反应物5分钟,然后在室温下孵育15分钟。然后将反应物#1和反应物#2每个加入新鲜的包含20μl清洗和重悬浮的涂覆链酶亲和素的微球体的1.5ml微量离心管。将对照反应物#3加入到仅泳道有20μl的结合/清洗缓冲液的新鲜的1.5ml微量离心管。进一步在室温下孵育所有的反应物15分钟,不时地轻轻混合(3-4分钟)以允许形成生物素-链酶亲和素复合物。然后利用制造商(ZYMOResearch)推荐的RNAClean-up试剂盒TM-5柱纯化通过所述微球体捕获之后残留在溶液中的生物素化的反义rRNA。将反应物#1和反应物#3直接加入ZYMORNAClean-up步骤,然而,对于反应物#2,首先利用台式离心机以12,000rpm旋转5分钟以使微球体成丸,去除上清液,然后加入ZYMORNAClean-up步骤。在10μl不含RNA酶的水中洗脱每个RNA样本以及通过溴化乙锭染色的琼脂糖凝胶电泳分析5μl等份处理后的样本,如图2A所示。
图2A泳道1和2示出与对照(泳道3)相比,结合至涂覆链酶亲和素的微球体之后残余的生物素化的反义rRNA。残余的反义RNA的量在泳道2中较为明显,其中在ZYMORNAclean-up步骤前去除微球体。不清楚时,可能是,将泳道有微球体的杂交反应混合物直接加入RNA纯化柱降低了所述柱的结合能力,导致了所述生物素化的反义RNA的进一步减少。
然而,从本实验明显看出,20μl的涂覆链酶亲和素的微球体不足以去除所用的全部量的生物素化的反义rRNA。
因而,对另外的20μl清洗的微球体进行了检测,以确定其是否足以去除4μl生物素化的反义rRNA。将含于1x杂交缓冲液的四种反应物(每种包含4μl的大肠杆菌生物素化的反义rRNA)制备成最终体积20μl。在68℃下孵育反应物5分钟,然后在室温下孵育15分钟。然后将反应物#1和反应物#2每个加入新鲜的包含20μl清洗和重悬浮的涂覆链酶亲和素的微球体的1.5ml微量离心管。将反应物#4加入包含40μl的清洗和重悬浮的涂覆链酶亲和素的微球体的新鲜的1.5ml微量离心管。将对照反应物#1加入仅泳道有结合/清洗缓冲液的新鲜的1.5ml微量离心管。进一步在室温下孵育所述反应物15分钟,不时地轻轻混合(3-4分钟)以允许形成生物素-链酶亲和素复合物。利用台式离心机以12,000rpm旋转所述反应物5分钟以使微球体成丸,以及将每个的上清液转移至新鲜的1.5ml微量离心管。向反应物#3的上清液加入另外20μl清洗的涂覆链酶亲和素的微球体,在室温下再次孵育,不时地轻轻混合(3-4分钟)。再次以12,000rpm离心分离混合反应物#3达5分钟并将上清液转移至新鲜的1.5ml微量离心管。利用ZYMORNAClean-up步骤纯化包含在所述四种反应物的每个中的生物素化的反义RNA并在10μl不含RNA酶的水中洗脱。通过溴化乙锭染色的琼脂糖凝胶电泳分析针对每个的整体洗脱液,如图2B所示。
图2B泳道2再次示出当仅仅使用20μl的微球体时,并未完全去除生物素化的反义rRNA。然而,当使用20μl微球体加第二20μl的微球体或者使用40μl微球体时,看起来实现了加入的生物素化的反义rRNA(分别是泳道3和泳道4)的完全去除。因而,一般优选采用40μl微球体的处理方法,因为它需要的步骤较少。
接下来,对如图2B中描述所用的微球体的量进行检测,以确定其是否也足以有效地去除退火生物素化的反义rRNA和包含在总RNA中的原生rRNA后形成的双链核糖体RNA(ds-rRNA)杂交体。首先,为了验证所述ds-rRNA杂交体的形成,在包含1x杂交缓冲液、最终体积20μl的反应物中混合500ng大肠杆菌总RNA和4μl大肠杆菌生物素化的反义rRNA。在68℃下孵育所述反应物5分钟,然后在室温下孵育15分钟,利用ZYMORNACleanup步骤纯化以及在10μl不含RNA酶的水中洗脱。通过溴化乙锭染色的琼脂糖凝胶电泳分析5μl等份处理后的样本连同等量的个体大肠杆菌总RNA和生物素化的反义rRNA,如图2C所示。图2C泳道3示出与个体正义和反义RNA样本(分别是泳道1和2)相比ds-rRNA杂交体的有效形成。
接下来,如图2B所述利用大量清洗的微球体对所述ds-rRNA杂交体的去除情况进行检测。制备含于1x杂交缓冲液、最终体积为20μl的三种反应物(#1、#2和#3)(每种包含500ng大肠杆菌总RNA和4μl大肠杆菌生物素化的反义rRNA)连同两种对照反应物-一种仅仅包含大肠杆菌生物素化的反义rRNA(#4)而另一种仅仅包含大肠杆菌总RNA(#5)。在68℃下孵育所述反应物5分钟,然后在室温下孵育15分钟。将反应物#1和反应物#3的每个加入到包含20μl清洗和重悬浮的涂覆链酶亲和素的微球体的新鲜的1.5ml微量离心管。将反应物#2和反应物#4的每个加入到包含40μl清洗和重悬浮的涂覆链酶亲和素的微球体的新鲜的1.5ml微量离心管。将对照反应物#5加入到仅包含结合/清洗缓冲液的新鲜的1.5ml微量离心管。进一步在室温下孵育所述反应物15分钟,不时地轻轻混合(3-4分钟)以允许形成生物素-链酶亲和素复合物。利用台式离心机以12,000rpm旋转所述反应物5分钟以使得微球体成丸,以及将每个的上清液转移至新鲜的1.5ml微量离心管。向反应物#3的上清液中加入另外20μl清洗的涂覆链酶亲和素的微球体并在室温下孵育,不时地轻轻混合(3-4分钟)。再次以12,000rpm离心分离反应物#3达5分钟以及将上清液转移至新鲜的1.5ml微量离心管。利用ZYMORNAClean-up步骤纯化五种反应物的每种中包含的RNA并在10μl不含RNA酶的水中洗脱。通过溴化乙锭染色的琼脂糖凝胶电泳分析每个的5μl等份处理后的样本,如图2D所示。此外,将250ng未处理的大肠杆菌总RNA作为对照物运行。
图2D泳道1示出当仅使用20μl微球体时残余的ds-rRNA。然而,用2x20μl(泳道2)或者1x40μl(泳道3)的微球体时,ds-rRNA杂交体不再可见,这表明生物素化的反义rRNA有能力退火结合至其互补正义rRNA序列并便于通过链酶亲和素微球体去除所述序列。当与类似量的未处理的大肠杆菌总RNA(泳道6)相比时,大肠杆菌总RNA的量看起来未受到添加40μl微球体(泳道5)的影响。因而,显然,40μl微球体足以去除所添加的生物素化的反义rRNA或者所述生物素化的反义rRNA杂交至rRNA之后形成所得的ds-rRNA杂交体。
实施例3
利用不同水平的生物素-UTP合成生物素化的反义rRNA以及用涂覆链酶亲和素的微球体去除生物素化的反义rRNA的效果
上文实施例2中所述的实验使用利用包含35%生物素-UTP的UTP:生物素-UTP混合物合成的生物素化的反义rRNA。对于杂交反应中所用量的反义rRNA,其有效的去除需要40μl链酶亲和素微球体。因而,认为,用较少量的生物素-UTP制成的反义rRNA其定量的去除应当需要更少的链酶亲和素微球体,这将整体降低与所需的生物素-UTP和微球体相关联的成本。如上文实施例1所述,利用10%或者20%生物素-UTP溶液制备生物素化的反义16S和23SrRNA,然后制成各自生物素化的反义rRNA的标准4μl混合物。在体外转录反应中用于其合成的生物素-UTP的百分比被用以指生物素化的反义rRNA产物;例如,如果在体外转录反应中所用的生物素-UTP的百分比是10%,剩下的90%是UTP,此处将产物称为10%生物素化的反义rRNA,即使结合产物的生物素-UTP核苷酸的百分比与结合产物的UTP核苷酸相比可能少于10%。
将含于1x杂交缓冲液的两组三种反应物(每种包含4μl的10%(反应物#1、反应物#2和反应物#3)或者20%(反应物#4、反应物#5和反应物#6)生物素化的反义rRNA混合物)制备成最终体积20μl。在68℃下孵育所述反应物5分钟,然后在室温下孵育15分钟。将反应物#2和反应物#5的每个转移至包含20μl清洗的链酶亲和素微球体的新鲜的1.5ml微量离心管以及将反应物#3和反应物#6的每个转移至包含40μl清洗的链酶亲和素微球体的新鲜的1.5ml微量离心管。将反应物#1和反应物#4的每个转移至包含40μl结合/清洗缓冲液的新鲜的1.5ml微量离心管。进一步在室温下孵育所述反应物15分钟,不时地轻轻混合(3-4分钟)以允许形成生物素-链酶亲和素复合物。在台式离心机上以12,000rpm旋转所述反应物5分钟并将上清液转移至新鲜的1.5ml微量离心管。利用ZYMORNAClean-up步骤纯化保留在上清液中的任何生物素化的反义rRNA并在10μl不含RNA酶的水中洗脱。通过溴化乙锭染色的琼脂糖凝胶电泳分析每个纯化样本的全部量,如图3A所示。
图3A泳道1和泳道4分别示出未用微球体处理的10%和20%生物素化的反义rRNA。泳道2和泳道3示出分别用20μl和40μl的微球体处理的10%生物素化的反义rRNA。泳道5和泳道6示出分别用20μl和40μl的微球体处理的20%生物素化的反义rRNA。显然地,大量的10%和20%生物素化的反义rRNA均不受所用的20μl或者40μl的微球体支配(泳道2、3、5和6)。然而,20%的情况(泳道5和6)显然比10%的情况(泳道2和3)好。因而,看起来,利用这些低水平的生物素-UTP合成生物素化的rRNA时,合成的反义rRNA产物的至少部分或许不包含足够的生物素分子以便于通过链酶亲和素微球体的所述产物的去除。
因而,产生的问题是实施例2中所用的35%生物素-UTP是否是确保所有合成的反义rRNA包含足够的用于后续通过链酶亲和素微球去除所述反义rRNA的生物素分子的最佳浓度。为回答这个问题,如下实验利用50%或者60%的生物素-UTP溶液检测如实施例1所述制成的生物素化的反义rRNAs。然后制成利用50%和60%水平的生物素-UTP合成的各自生物素化的反义16S和23SrRNA的标准4μl混合物。包括作为对照物的35%生物素化的反义rRNA的标准4μl混合物。
将含于1x杂交缓冲液的三组两种反应物(每种包含4μl35%(反应物#1和反应物#2)或者50%(反应物#3和反应物#4)或者60%(反应物#5和反应物#6)生物素化的反义rRNA混合物)制备成最终体积20μl。在68℃下孵育所述反应物5分钟,然后在室温下孵育15分钟。将反应物#2、反应物#4和反应物#6的每个转移至包含40μl清洗的链酶亲和素微球体的新鲜的1.5ml微量离心管以及将反应物#1、反应物#3和反应物#5的每个转移至包含40μl结合/清洗缓冲液的新鲜的1.5ml微量离心管。进一步在室温下孵育所有反应物15分钟,不时地轻轻混合(3-4分钟)以允许形成生物素-链酶亲和素复合物。在台式离心机上以12,000rpm旋转所述反应物5分钟并将上清液转移至新鲜的1.5ml微量离心管。利用ZYMORNAClean-up步骤纯化保留在上清液中的任何生物素化的反义rRNA以及在13.5μl不含RNA酶的水中洗脱。通过溴化乙锭染色的琼脂糖凝胶电泳分析每个纯化样本的50%,如图3B所示。
图3B泳道1、泳道3和泳道5分别示出在35%、50%和60%的生物素-UTP样本没有任何微球体的情况下残留的生物素化的反义rRNA。在添加40μl链酶亲和素微球体的情况下,任何相应的反应物(泳道2、泳道4和泳道6)中未残留任何可见的生物素化的反义rRNA。用40μl链酶亲和素微球体处理之后,通过琼脂糖凝胶分析不可能观察到35%、50%和60%生物素化的反义rRNA样本在性能方面的任何不同。
为了进一步确定35%、50%和60%生物素化的反义rRNA用途之间是否存在不同,将每种反应物剩下的一半在包含随机六聚物的标准逆转录酶反应中转化成第一链cDNA并利用制造商(Qiagen)推荐的QiaquickPCR纯化试剂盒进行纯化。然后将每个的5μl等份处理后的样本用于单独的PCR扩增反应中进行20个PCR循环,所述PCR扩增反应包含对如下rRNA的终端5’和3′区域具有特异性的引物:23S(SEQIDNO:15:5′-GACGTGCTAATCTGCGATAAGC;SEQIDNO:16:5′-ATGGATTCAGTTAATGATAGTGTGTCG;SEQIDNO:17:5′-CTGAAAGCATCTAAGCACGAAACTTGC和SEQIDNO:18:5′-CCTATCAACGTCGTCGTCTTCAAC)和16S(SEQIDNO:19:5′-GCCTAACACATGCAAGTCGAAC;SEQIDNO:20:5′-AGCTACCGTTTCCAGTAGTTATCC;SEQIDNO:21:5′-CGGAATCGCTAGTAATCGTGGAT和SEQIDNO:22:5′-TCCCGAAGGTTAAGCTACCTACTT)rRNA。很显然,PCR扩增比溴化乙锭琼脂糖凝胶分析更具敏感性以及因此应当更好地显示通过微球体对35%、50%和60%生物素化的反义rRNA的除去效率之间的任何差异。结果如图3C所示。
图3C泳道1、泳道3和泳道5分别示出泳道有35%、50%和60%生物素化的反义rRNA混合物的5′23SrRNA(小图1)、3′23SrRNA(小图2)、5′16SrRNA(小图3)和3′16SrRNA(小图4)的期望的PCR扩增子。泳道2、泳道4和泳道6示出使用链酶亲和素微球体之后相应的PCR反应产物。如泳道2(小图2和小图4)中所示,35%生物素化的反义rRNA的残余携泳道仍然产生了一些特异性PCR扩增产物,而这些产物在50%和60%生物素化的反义rRNA材料中均未观察到。50%和60%生物素化的反义rRNA材料表现类似,因而,选定50%的情况。
实施例4
利用大肠杆菌生物素化的反义23S和16SrRNA混合物从另一原核物种(植物乳杆菌)去除23S和16SrRNA
为了检测大肠杆菌生物素化的反义rRNA混合物是否有能力去除由相对多样的原核物种显示的23S和16SrRNA序列,采用了来自植物乳杆菌的总RNA,其具有与大肠杆菌16S和23SrRNA大约80%的同源性。在一种反应物中,将含于1x杂交缓冲液的500ng植物乳杆菌总RNA与上文实施例2所述的4μl大肠杆菌生物素化的反义rRNA混合物混合成最终体积20μl。作为对照物的第二反应物包含所述第一反应物减掉所述大肠杆菌生物素化的反义rRNA混合物之后的全部内容物。在68℃下孵育所述反应物10分钟,然后在室温下孵育15分钟。然后将每种反应物加入到包含50μl清洗和重悬浮的涂覆链酶亲和素的微球体的新鲜的1.5ml微量离心管。进一步在室温下孵育所述反应物15分钟,不时地轻轻混合(3-4分钟)以允许形成生物素-链酶亲和素复合物。然后利用台式离心机以12,000rpm旋转所述反应物5分钟以使得微球体成丸,去除上清液以及利用ZYMORNAClean-up步骤纯化RNA。在13.5μl不含RNA酶的水中洗脱每个RNA样本以及通过溴化乙锭染色的琼脂糖凝胶电泳分析每个的50%,如图4所示。
图4中泳道1与泳道2相比示出削减大肠杆菌生物素化的反义rRNA混合物之后,植物乳杆菌的16S和23SrRNA泳道均不再是可见的,这表明即使所述rRNA序列仅具有80%的同源性,它们也被有效地削减了。
实施例5
利用大肠杆菌生物素化的反义rRNA混合物从一系列大肠杆菌总RNAinput去除23S、16S和5SrRNA
制备现包含23S、16S和5S反义rRNA的大肠杆菌生物素化的反义rRNA混合物,准备如下用于生成rRNA除尽的样本的反应以及对照反应(如表1所示)以及在1x杂交缓冲液以最终体积20μl以一式两份的方式执行:
表1:
在68℃下孵育所述反应物10分钟,然后在室温下孵育15分钟。然后将每种反应物加入到包含适当量的清洗和重悬浮的涂覆链酶亲和素的微球体的新鲜的1.5ml微量离心管。进一步在室温下孵育所述反应物15分钟,不时地轻轻混合(3-4分钟)以允许形成生物素-链酶亲和素复合物。然后利用台式离心机以12,000rpm旋转所述反应物5分钟以使得所述微球体成丸,去除上清液以及利用ZYMORNAClean-up步骤纯化RNA。在13.5μl不含RNA酶的水中洗脱每个RNA样本。然后将每个的全部RNA样本在包含随机六聚物的标准逆转录酶反应中转化为第一链cDNA并利用制造商(Qiagen)推荐的QiaquickPCR纯化试剂盒进行纯化。将每个第一链cDNA样本的5μl等份处理后的样本用于单独的PCR扩增反应中进行20个循环,所述PCR扩增反应包含对如下rRNA的终端5’区域具有特异性的引物:23S(SEQIDNO:15和SEQIDNO:16)和16SrRNA(SEQIDNO:19和SEQIDNO:20)、完整的5SrRNA(SEQIDNO:13和SEQIDNO:23:5′-TGCCTGGCAGTTCCCTACTCTC)以及ompAmRNA(SEQIDNO:24:5′-ACCAGGTTAACCCGTATGTTGGCT和SEQIDNO:25:5′-ACCGATGTTGTTGGTCCACTGGTA)。对于每个引物对还执行减掉模板的对照反应。通过溴化乙锭染色的琼脂糖凝胶电泳分析每种PCR反应物的5μl等份处理后的样本,如图5所示。
图5泳道1-12示出包含在一式两份的大肠杆菌总RNA的不同input中的23S(小图A)、16S(小图B)和5S(小图C)rRNA序列量的显著减少。然而,ompAmRNA(小图D)转录物仍然在所有样本中被明显地检测到了以及与相应的未作削减的样本(泳道7和泳道8对泳道13和泳道14)相比,其看起来并未受干扰。明显地,用于rRNA削减的本方法看起来适用于本实施例中至少100倍动态范围的一大批总RNAinput。
实施例6
利用大肠杆菌生物素化的反义rRNA混合物削减片段化的大肠杆菌23S、16S和5SrRNA序列
在65℃下于1x片段化缓冲液(Ambion)中对10微克大肠杆菌总RNA进行片段化达3分钟。利用ZYMORNAClean-up步骤纯化所片段化的RNA、在20μl不含RNA酶的水中洗脱以及通过用分光光度计测量260nm的吸收率来测定浓度。通过溴化乙锭染色的琼脂糖凝胶电泳对比全段RNA,分析所片段化的RNA的300ng等份处理后的样本,如图6A所示。
图6A中,泳道1示出全段大肠杆菌总RNA以及泳道2示出相应的片段化的总RNA。包含在泳道2中的片段化的样本内,全段23S和16SrRNA泳道不再可见。
接下来,核糖体RNA削减被应用于片段化的大肠杆菌总RNA样本的2.5μg样本,与之对比的是类似量的全段大肠杆菌总RNA。收集如下四种反应物-反应物#1和反应物#2每种包含2.5μg全段大肠杆菌总RNA和反应物#3和反应物#4每种包含2.5μg片段化的大肠杆菌总RNA。接下来,向反应物#2和反应物#4的每种加入8μl大肠杆菌生物素化的反义rRNA混合物以及将最终反应体积调整至含于1x杂交缓冲液的40μl。在68℃下孵育所述反应物10分钟,然后在室温下孵育15分钟。将每种反应物转移至包含50μl清洗的链酶亲和素微球体的新鲜的1.5ml微量离心管。进一步在室温下孵育所述反应物15分钟,不时地轻轻混合(3-4分钟)以允许形成生物素-链酶亲和素复合物。在台式离心机上以12,000rpm旋转所述反应物5分钟并将每份上清液转移至新鲜的1.5ml微量离心管。利用ZYMORNAClean-up步骤纯化包含在上清液中的RNA并在13.5μl不含RNA酶的水中洗脱。通过溴化乙锭染色的琼脂糖凝胶电泳和Northern印迹分析法分析每个纯化样本的50%,如图6B所示。
图6B小图1(泳道2和泳道4)示出rRNA削减之后残余的RNA。在全段总RNA的情况下,很明显地是23S和16SrRNA泳道被去除了(泳道2对泳道1)。然而,对于片段化的总RNA,正如rRNA片段也被削减情况下所预期的那样,削减之后RNA的量存在整体下降(泳道4对泳道3)。针对ompAmRNA(小图2)和23S(小图3)、16S(小图4)和5S(小图5)rRNA的Northern印迹分析明显地示出,与各自未作削减的样本(小图3、4和5-泳道1和3)相比,全段总RNA(小图3、4和5-泳道2)和片段化的总RNA(小图3、4和5-泳道4)内的不同rRNA序列的类似的和显著的削减。同时,对于全段总RNA(小图2-泳道2对泳道1)以及片段化的总RNA(小图2-泳道4对泳道3),ompAmRNA序列的量看起来未受削减过程的干扰。
此外,将每个纯化的RNA样本的剩下的50%在包含随机六聚物的标准逆转录酶反应中转化为第一链cDNA并利用制造商(Qiagen)推荐的QiaquickPCR纯化试剂盒进行纯化。然后将每个的5μl等份处理后的样本用于单独的PCR扩增反应中进行20个循环,所述PCR扩增反应包含对如下rRNA的终端5’区域具有特异性的引物:23S(SEQIDNO:15和SEQIDNO:16)和16SrRNA(SEQIDNO:19和SEQIDNO:20)、完整的5SrRNA(SEQIDNO:13和SEQIDNO:23)以及ompAmRNA(SEQIDNO:24和SEQIDNO:25)。通过溴化乙锭染色的琼脂糖凝胶电泳分析每种PCR反应物的5μl等份处理后的样本,如图6C所示。
图6C示出通过RT-PCR分析,对于全段(泳道2对泳道1)以及片段化的(泳道4对泳道3)大肠杆菌总RNA,23S(小图2)、16S(小图3)和5SrRNA(小图4)均存在显著的削减。然而,削减前后两者中的ompAmRNA得到了同等地保持(小图1)。
实施例7
人类、小鼠和大鼠28S和18SrRNA特异性杂交至人类生物素化的反义28S和18SrRNA,以及利用链酶亲和素微球体的去除
将人类(反应物#4和反应物#5)、小鼠(反应物#7和反应物#8)和大鼠(反应物#10和#11)的全段总RNA(500ng)样本与含于1x杂交缓冲液的2.1μg生物素化的反义28SrRNA或者1.0μg生物素化的反义18SrRNA混合成最终体积20μl。包括作为对照物的相应的全段总RNA样本(反应物#3、反应物#6和反应物#9)和单独的生物素化的反义rRNA(#1和#2)。在68℃下孵育所有反应物10分钟,接着在室温下孵育15分钟。然后利用ZYMORNAClean-up步骤纯化包含在每种样本中的RNA并在13.5μl不含RNA酶的水中洗脱。通过溴化乙锭染色的琼脂糖凝胶电泳分析每个的整体样本,如图7A所示。
图7A泳道1和泳道2分别示出个体生物素化的反义23S和18SrRNA。泳道3、泳道6和泳道9分别示出对应于人类、小鼠和大鼠的个体全段总RNA。泳道4、泳道7和泳道10分别示出杂交至生物素化的反义28SrRNA之后的人类、小鼠和大鼠总RNA样本。显然地,不同总RNA样本内的28SrRNA泳道已经杂交至其互补的反义rRNA,因为其现迁移时泳道有更高的分子量,而18SrRNA仍旧不受干扰。当不同总RNA样本然后杂交至生物素化的反义18SrRNA时,显然18SrRNA泳道现迁移时泳道有更高的分子量(泳道5、泳道8和泳道11)以及现在28S泳道则不受干扰。从这些结果明显看出,每种生物素化的反义rRNA特异性杂交至其互补靶以及对于具有至少99%序列同源性的人类、小鼠和大鼠,其效果等同。
接下来,利用如实施例1所述制法体外合成的RNA制备包含含于最终体积4μl的不含RNA酶的水中28S和18S反义rRNA的每种大约1.2皮摩尔的人类生物素化的反义rRNA混合物。将含于1x杂交缓冲液的来自人类(HeLa)、小鼠(3T3)和大鼠(NRK)的全段总RNA(2.5μg)的每个与8μl生物素化的反义rRNA溶液混合成最终体积40μl。还包括包含仅2.5μg相应全段总RNA的对照反应物。在68℃下孵育所述反应物10分钟,接着在室温下孵育15分钟。分别将每种反应物转移至包含100μl清洗的链酶亲和素微球体的新鲜的1.5ml微量离心管。进一步在室温下孵育所述反应物15分钟,不时地轻轻混合(3-4分钟)以允许形成生物素-链酶亲和素复合物,然后在37℃下孵育5分钟。在台式离心机上以14,000rpm旋转所述反应物5分钟并将每份上清液转移至新鲜的1.5ml微量离心管。利用ZYMORNACleanup步骤纯化包含在上清液中的RNA并在13.5μl不含RNA酶的水中洗脱。通过溴化乙锭染色的琼脂糖凝胶电泳分析每个纯化RNA样本的50%,如图7B所示。
图7B泳道1、泳道3和泳道5示出无任何28S和18SrRNA削减的个体总RNA,而泳道2、泳道4和泳道6示出28S和18SrRNA削减之后残留的相应RNA。从这些结果明显看出,如所述的削减步骤之后去除了所述28S和18SrRNA泳道的大部分。
实施例8
利用人类生物素化的反义rRNA混合物从不同量的全段人类总RNA削减28S、18S、5.8S和5SrRNA
利用如实施例1所述制法体外合成的RNA制备包含含于最终体积4μl的不含RNA酶的水的28S、18S、5.8S和5S反义rRNA每种大约1.2皮摩尔的人类生物素化的反义rRNA混合物。将含于1x杂交缓冲液,包含100ng(反应物#1)、500ng(反应物#2)和5.0μg(反应物#3)以及分别具有2μl、4μl和8μl生物素化的人类反义rRNA混合物的全段HeLa总RNA的核糖体RNA削减反应物制备成最终体积20μl。还包括仅具有500ng全段HeLa总RNA的对照反应物(反应物#4)。在68℃下孵育所述反应物10分钟,接着在室温下孵育15分钟。分别将每种反应物转移至包含25μl、50μl、125μl和50μl清洗的链酶亲和素微球体的新鲜的1.5ml微量离心管。进一步在室温下孵育所述反应物15分钟,不时地轻轻混合(3-4分钟)以允许形成生物素-链酶亲和素复合物,然后在37℃下孵育5分钟。在台式离心机上以14,000rpm旋转所述反应物5分钟并将每份上清液转移至新鲜的1.5ml微量离心管。利用ZYMORNAClean-up步骤纯化包含在上清液中的RNA并在13.5μl不含RNA酶的水中洗脱。接下来,将每个纯化RNA样本在包含随机六聚物的标准逆转录酶反应中转化为第一链cDNA并利用制造商(Qiagen)推荐的QiaquickPCR纯化试剂盒进行纯化。然后将每个的5μl等份处理后的样本用于单独的PCR扩增反应中进行20个循环,所述PCR扩增反应包含对如下rRNA的终端5′和3′区域具有特异性的引物:28S(SEQIDNO:26:5’-CTCAGTAACGGCGAGTGAAC;SEQIDNO:27:5′-GCCTCGATCAGAAGGACTTG;SEQIDNO:28:5′-TACCACAGGGATAACTGGCT和SEQIDNO:29:5′-TAGGAAGAGCCGACATCGAA)和18SrRNA(SEQIDNO:30:5′-CCTACCTGGTTGATCCTGCC;SEQIDNO:31:5′-CCAAGTAGGAGAGGAGCGAG;SEQ.ID.NO.32:5′-CCCAGTAAGTGCGGGTCATA和SEQIDNO:33:5′-TCACTAAACCATCCAATCGGTAGTA);完整的5.8SrRNA(SEQIDNO:3和SEQIDNO:34:5′-GATCCTTCCGCAGGTTCACCTAC);完整的5SrRNA(SEQIDNO:5和SEQIDNO:35:5’-AAGCCTACAGCACCCGGTATTC)和5′GAPDHmRNA(SEQIDNO:36:5’-TCGACAGTCAGCCGCATCTTCTTT和SEQIDNO:37:5′-ACCAAATCCGTTGACTCCGACCTT)。对于每个引物对还执行减掉模板的对照反应。通过溴化乙锭染色的琼脂糖凝胶电泳分析每种PCR反应物的5μl等份处理后的样本,如图8所示。
图8泳道1、泳道2和泳道3分别示出用生物素化的人类反义rRNA混合物削减的100ng、500ng和5.0μg总RNAinput的28SrRNA(小图A)、18SrRNA(小图B)、5.8SrRNA(小图C)、5SrRNA(小图D)和GAPDHmRNA(小图E)的RT-PCR结果。泳道4示出500ng未作削减的总RNAinput的PCR。从这些结果明显看出,利用生物素化的反义rRNA混合物显著削减了不同核糖体RNA序列的一大批总RNAinput(泳道1、泳道2和泳道3对泳道4)。
实施例9
各种水平的片段化人类总RNA显示的人类rRNA序列的削减
在1x片段化缓冲液(Ambion)中将HeLa全段总RNA片段化达1、2和3分钟。利用ZYMORNAClean-up步骤纯化RNA样本、在不含RNA酶的水中洗脱以及利用分光光度计测量260nm的吸收率来测定浓度。
制备含于1x杂交缓冲液的包含2.5μg全段(反应物#1和反应物#2)或者片段化的(反应物#3、反应物#4、反应物#5、反应物#6、反应物#7和反应物#8)总RNA样本的副本反应物。向每种副本反应物(反应物#2、反应物#4、反应物#6和反应物#8)的一个加入8μl生物素化的人类反义rRNA混合物以及将每种反应物的最终体积调整至40μl。在68℃下孵育所述反应物10分钟,接着在室温下孵育15分钟。将每种反应物转移至包含100μl清洗的链酶亲和素微球体的新鲜的1.5ml微量离心管。进一步在室温下孵育所述反应物15分钟,不时地轻轻混合(3-4分钟)以允许形成生物素-链酶亲和素复合物,然后在37℃下孵育5分钟。在台式离心机上以14,000rpm旋转所述反应物5分钟并将每份上清液转移至新鲜的1.5ml微量离心管。利用ZYMORNAClean-up步骤纯化包含在上清液中的RNA并在13.5μl不含RNA酶的水中洗脱。通过溴化乙锭染色的凝胶电泳分析每个纯化RNA样本的50%,如图9A所示。
图9A中,包含片段化的总RNA和生物素化的反义rRNA的泳道4、泳道6和泳道8示出与各自对照物(泳道3、泳道5和泳道7)相比,削减导致的RNA量的显著减少。相比泳道有全段总RNA的泳道1,泳道2中全长rRNA泳道不再可见。
接下来,将每个纯化RNA样本的剩余50%在包含随机六聚物的标准逆转录酶反应中转化为第一链cDNA以及利用制造商(Qiagen)推荐的QiaquickPCR纯化试剂盒进行纯化。然后将每个的5μl等份处理后的样本用于单独的PCR扩增反应中进行20个循环,所述PCR扩增反应包含对如下rRNA的终端5’区域具有特异性的引物:28S(SEQIDNO:26和SEQIDNO:27)和18SrRNA(SEQIDNO:30和SEQIDNO:31)、完整的5.8SrRNA(SEQIDNO:3和SEQIDNO:34)、完整的5SrRNA(SEQIDNO:5和SEQIDNO:35)和5′GAPDHmRNA(SEQIDNO:36和SEQIDNO:37)。对于每个引物对还执行减掉模板的对照反应。通过溴化乙锭染色的琼脂糖凝胶电泳分析每种PCR反应物的5μl等份处理后的样本,如图9B所示。
图9B泳道2、泳道4、泳道6和泳道8分别示出削减之后,针对全段和片段化的(1、2和3分钟)总RNA的28SrRNA(小图1)、18SrRNA(小图2)、5.8SrRNA(小图3)、5SrRNA(小图4)和GAPDHmRNA(小图5)的PCR结果。相应的未作削减的对照反应物示于泳道1、泳道3、泳道5和泳道7。从这些结果明显看出,利用生物素化的反义rRNA混合物显著削减了不同的核糖体RNA序列的一大批片段化的总RNAinput(与全段总RNA类似)。
实施例10
利用本发明的方法以及MICROBExpressTM方法削减大肠杆菌rRNA的对比
从Ambion购买利用保藏的rRNA(23S和16S)寡核苷酸序列从来自原核总RNA的2μg-10μginput削减相应的rRNA的试剂盒,用于与这些实施例中的示例性方法形成对比。首先在65℃下将MICROBExpressTM试剂盒中提供的全段对照大肠杆菌总RNA的15μg等份处理后的样本在1x片段化缓冲液(Ambion)中进行片段化达2分钟,利用ZYMORNAClean-up步骤纯化,在不含RNA酶的水中洗脱以及利用分光光度计测量260nm的吸收率来测定浓度。然后遵循实施例9(“示例性方法”)所述的用于适当RNA样本的示例性方法或者遵循正如制造商(Ambion)所述的MICROBExpressTM方法,将全段或者片段化的大肠杆菌总RNA的相等的等份处理后的样本(2.5μg)用于削减反应。两种方法均包括代表非rRNA削减的对照反应物。然后如针对MICROBExpressTM步骤所述,通过EtOH沉淀纯化每个RNA样本以及在12μl不含RNA酶的水中重悬浮。通过溴化乙锭染色的琼脂糖凝胶电泳和Northern印迹法分析每个纯化RNA样本的50%,如图10A所示。
图10A泳道1、2和泳道3、4示出利用示例性方法以及MICROBExpressTM方法针对23SrRNA(小图2)、16SrRNA(小图3)和5SrRNA(小图4)从全段和片段化的总RNA所作的相对的rRNA削减。显然地,对于全段和片段化的总RNA样本,利用本发明示例性方法(示例性方法-泳道2和4)削减不同的rRNA序列的效果均比利用MICROBExpress方法(MICROBExpressTM板-泳道2和4)显著。看起来,甚至MICROBExpressTM提供的对照全段RNA包含一定水平的片段化rRNA序列,所述片段化rRNA序列通过MicrobExpress方法(MICROBExpressTM板-泳道2)显然未被去除但利用本文所述的示例性方法(示例性方法,板-泳道2)显然去除。此外,小图1示出对于两种方法,削减前后ompAmRNA序列均不受干扰。
接下来,将每个纯化RNA样本剩余的50%在包含随机六聚物的标准逆转录酶反应中转化为第一链cDNA以及利用制造商(Qiagen)推荐的QiaquickPCR纯化试剂盒进行纯化。
然后将每个的5μl等份处理后的样本用于单独的PCR扩增反应中进行20个循环,所述PCR扩增反应包含对如下rRNA的终端5’区域具有特异性的引物:23S(SEQIDNO:15和SEQIDNO:16)和16SrRNA(SEQIDNO:19和SEQIDNO:20)、完整的5SrRNA(SEQIDNO:13和SEQIDNO:23)和ompAmRNA(SEQIDNO:24和SEQIDNO:25)。通过溴化乙锭染色的琼脂糖凝胶电泳分析每种PCR反应物的5μl等份处理后的样本,如图10B所示。
图10B泳道2和泳道4分别示出利用示例性方法以及MICROBExpressTM方法进行削减之后,全段和片段化的大肠杆菌总RNA的23SrRNA(小图2)、16SrRNA(小图3)、5SrRNA(小图4)和ompAmRNA(小图1)的PCR结果。相应的未作削减的对照反应物示于泳道1和泳道3。从这些结果明显看出,利用示例性方法(示例性方法小图)削减由全段和片段化的总RNA样本显示的不同的rRNA序列的效果与利用MICROBExpressTM方法(MicroExpress小图)相比显著。但是在这两种情况下,ompAmRNA得到了类似的保持。
实施例11
利用示例性方法与利用OLIGOTEXpolyA+mRNA纯化方法削减人类rRNA的对比
从Qiagen购买用寡核苷酸dT从真核总RNA分离mRNA的试剂盒,用于与上文实施例9中所述的示例性方法形成对比。当使用片段化的RNA时,首先在65℃下将所述RNA在1x片段化缓冲液(Ambion)中进行片段化达2分钟。利用ZYMORNAClean-up步骤纯化全段或者片段化的RNA,在不含RNA酶的水中洗脱以及利用分光光度计测量260nm的吸收率来测定浓度。然后将全段或者片段化的大肠杆菌总RNA的相等等份处理后的样本(2.5μg)用于利用针对适当RNA样本的示例性方法或者正如制造商(Qiagen)所述的OligotexpolyA+mRNA纯化方法的rRNA削减反应中。两种方法均包括代表非rRNA削减的对照反应物。然后通过乙醇沉淀纯化每个RNA样本并在12μl不含RNA酶的水中重悬浮。通过溴化乙锭染色的琼脂糖凝胶电泳分析每个纯化RNA样本的50%,如图11A所示。
图11A泳道1、2和泳道3、4示出利用示例性方法以及OLIGOTEXpolyA+mRNA纯化方法针对全段和片段化的总RNA所作的相对的rRNA去除。显然地,对于全段和片段化的总RNA样本,与各自的对照物(小图1-泳道1和3和小图2-泳道1和3)相比,利用示例性方法(小图1-泳道2和4)以及OLIGOTEX方法(小图2-泳道2和4)均明显地去除了不同的rRNA序列。此外,看起来,OLIGOTEX方法之后明显残留的mRNA是极少的,以及所有类型的小RNA分子(tRNA、miRNA等等)看起来也已被消除(小图2-泳道2和4)。
接下来,将每个纯化RNA样本的剩余50%在包含随机六聚物的标准逆转录酶反应中转化为第一链cDNA并利用制造商(Qiagen)推荐的QiaquickPCR纯化试剂盒进行纯化。然后将每个的5μl等份处理后的样本用于独立的PCR扩增反应中进行20个循环,所述PCR扩增反应包含对如下rRNA的终端5′和3′区域具有特异性的引物:28S(SEQIDNO:26;SEQIDNO:27;SEQIDNO:28和SEQIDNO:29)和18SrRNA(SEQSEQIDNO:30;SEQIDNO:31;SEQIDNO:32和SEQIDNO:33)、完整的5.8SrRNA(SEQIDNO:3和SEQIDNO:34)以及完整的5SrRNA(SEQIDNO:5和SEQIDNO:35)。通过溴化乙锭染色的琼脂糖凝胶电泳分析每种PCR反应物的5μl等份处理后的样本,如图11B所示。
图11B泳道2和泳道4分别示出利用示例性方法以及OLIGOTEX方法削减rRNA之后,针对全段和片段化的HeLa总RNA的28SrRNA(小图1和2)、18SrRNA(小图3和4)、5.8SrRNA(小图5)和5SrRNA(小图6)的PCR结果。相应的未作削减的对照反应物示于泳道1和泳道3。从这些结果明显看出,利用示例性方法(示例性方法小图)和OLIGOTEX方法(OLIGOTEX小图)削减由全段和片段化的总RNA样本显示的不同的rRNA序列的整体效果均显著。事实上,对于28S和18SrRNA序列(小图1-4),示例性方法看起来比OLIGOTEX方法均好一点,然而,对于5.8S和5SrRNA序列,OLIGOTEX方法看起来稍微好些(分别见小图E和小图F)。
此外,在具有随机引物cDNA模板的PCR(GAPDH:22个循环和PGKl:26个循环)中使用对如下mRNA的终端5’和3’区域具有特异性的PCR引物:GAPDH(SEQIDNO:36;SEQIDNO:37;SEQIDNO:38:5′-CACAAGAGGAAGAGAGAGACCCTCA和SEQIDNO:39:5′-TTGATGGTACATGACAAGGTGCGG)和PGKl(SEQIDNO:40:5′-GAATCACCGACCTCTCTCCC;SEQ.ID.NO.41:5′-CGACTCTCATAACGACCCGC;SEQIDNO:42:5′-CCAGAGGTGACCACTTTCAA和SEQIDNO:43:5′-ATGTGGAACAGAGCCTTCCTC)mRNA,以及通过溴化乙锭染色的琼脂糖凝胶电泳分析每种PCR反应物的5μl等份处理后的样本,如图11C所示。从PCR结果很明显地看出,与利用示例性方法(示例性方法板,泳道2和4)的非rRNA-削减样本(分别是OLIGOTEX板,泳道1和3)相比,在针对全段和片段化的总RNA(分别是OLIGOTEX板,泳道2和4)的OLIGOTEX方法中,GAPDH(小图1和小图2)和PGK1(小图3和小图4)的mRNA量均减少。进一步地,示例性方法未显示与非rRNA削减的样本(分别是示例性方法板,泳道1和3)相比,全段和片段化的总RNA(分别是示例性方法板,泳道2和4)的相同mRNA序列的任何显著减损。此外,对于片段化的总RNA样本,GAPDH(小图1,泳道4)和PGKl(小图3,泳道4)的5′区域均用OLIGOTEX方法(OLIGOtex小图)减损,因为polyA尾巴不再存在,但是对于示例性方法(分别是示例性方法板,泳道4(小图1和3))并非如此。总的来说,这些结果证实示例性方法与OLIGOTEX方法相比具有明显的优势。
接下来,将对PolyA转录物和双形转录物(bimorphictranscript)具有特异性的PCR引物(针对转录物#1的SEQIDNO:44:5′-CACGTTTTCTCAGCTGCTTG和SEQIDNO:45:5′-TTCACCTTTTCATCCAAGGC;针对转录物#3的SEQIDNO:46:5′-GTGTGGTGGTGTGTGCCTAT和SEQIDNO:47:5′-GAGACATGGTCTTGCTCCGT;针对转录物#15的SEQIDNO:48:5′-TAGCTCAGTGGTAGAGCGCA和SEQIDNO:49:5′-GATTTGCTCAGCAGCACGTA和针对双形转录物#5的SEQIDNO:50:5′-CACTTGGGGACACTTTCCAG和SEQIDNO:51:5′-TCAGGGAAAATGAGCCAATC(PolyA-TranscriptsExpressedinHeLaCellsQingfaWu等人(July2008).PLoSOne(http://www.plosone.org/article/info:doi/10.1371/journal.pone.0002803)用于具有随机引物cDNA模板的PCR中(分别进行36个、22个、28个和38个循环),以及通过溴化乙锭染色的琼脂糖凝胶电泳分析每种PCR反应物的5μl等份处理后的样本,如图11D所示。从PCR结果很明显地看出,对全段和片段化的总RNA采用OLIGOTEXmRNA纯化方法(分别是OLIGOTEX板,泳道2和4)之后,polyA转录物和双形转录物均不再存在,然而,利用示例性方法对全段和片段化的总RNA进行rRNA削减之后这些序列仍被保留(分别是示例性方法板,泳道2和4)。这些结果表明本申请所述的rRNA削减方法具有的另一明显优势,即保持更宽幅的转录物,使得可以更好地表现细胞内容物。
实施例12
利用本发明示例性方法与利用用于RNA-Seq的RiboMinusTM真核细胞试剂盒削减人类rRNA的比较
从InVitrogen(安大略省伯灵顿)购买试剂盒(用于RNA-Seq的RiboMinusTM真核细胞试剂盒),所述试剂盒利用28S、18S、5.8S和5SrRNA每种的两种保藏寡核苷酸序列来削减来自真核总RNA的2μg-10μginput的相应rRNA,用于与本发明的示例性方法形成对比。当使用片段化的总RNA时,首先在65℃下将初始总RNA在1x片段化缓冲液(得克萨斯州奥斯汀的Ambion)中进行片段化达2分钟。利用ZYMORNAClean-up步骤纯化全段或者片段化的总RNA,在不含RNA酶的水中洗脱以及利用分光光度计测量260nm的吸收率来测定浓度。然后将全段或者片段化的HeLa总RNA的相等等份处理后的样本(2.5μg)用于利用针对适当RNA样本的示例性方法或者正如制造商(InVitrogen)所述的用于RNA-Seq方法的RiboMinusTM真核细胞试剂盒的rRNA削减反应中。两种方法均包括代表非rRNA削减的对照反应物。然后通过乙醇沉淀纯化每个RNA样本并在12μl不含RNA酶的水中重悬浮。通过溴化乙锭染色的琼脂糖凝胶电泳分析每个纯化RNA样本的50%,如图12A所示。
图12A泳道1、2和泳道3、4示出利用示例性方法以及用于RNA-Seq方法的RiboMinusTM真核细胞试剂盒针对全段和片段化的总RNA所作的相对的rRNA去除。显然地,对于全段和片段化的总RNA样本,与各自的非rRNA-削减样本(示例性方法-泳道1和3和RiboMinusTM方法-泳道1)相比,利用示例性方法(示例性方法-泳道2和4)明显地去除了不同的rRNA序列,而对于用于RNA-Seq方法的RiboMinusTM真核细胞试剂盒,只有全段总RNA显示出rRNA序列的减少(RiboMinusTM方法-泳道2)。与非rRNA-削减样本(RiboMinusTM方法-泳道3)相比,通过溴化乙锭染色的强度所作的判断(RiboMinusTM方法-泳道4),看起来利用用于RNA-Seq的RiboMinusTM真核细胞试剂盒仅仅以最低水平去除了rRNA-削减的片段化的总RNA样本,这很可能是由于那些并非由试剂盒中的共有寡核苷酸序列代表的核糖片段因此未被去除。
接下来,将每个纯化RNA样本的剩余50%在包含随机六聚物的标准逆转录酶反应中转化为第一链cDNA并利用制造商(Qiagen)推荐的QiaquickPCR纯化试剂盒进行纯化。然后将每个的5μl等份处理后的样本用于单独的PCR扩增反应中进行20个循环,所述PCR扩增反应包含对如下rRNA的终端5′和3′区域具有特异性的引物:28S(SEQIDNO:26;SEQIDNO:27;SEQIDNO:28和SEQIDNO:29)和18SrRNA(SEQSEQIDNO:30;SEQIDNO:31;SEQIDNO:32和SEQIDNO:33)、完整的5.8SrRNA(SEQIDNO:3和SEQIDNO:34)以及完整的5SrRNA(SEQIDNO:5和SEQIDNO:35)。通过溴化乙锭染色的琼脂糖凝胶电泳分析每种PCR反应物的5μl等份处理后的样本,如图12B所示。
图12B泳道2和泳道4分别示出利用示例性方法以及用于RNA-Seq方法的RiboMinusTM真核细胞试剂盒削减rRNA之后,针对全段和片段化的HeLa总RNA的28SrRNA(小图1和小图2)、18SrRNA(小图3和小图4)、5.8SrRNA(小图5)和5SrRNA(小图6)的PCR结果。相应的非rRNA-削减对照反应物示于泳道1和泳道3。从这些结果明显看出,包含在全段和片段化的总RNA样本两者中的28SrRNA(小图1和小图2)和18SrRNA(小图3和小图4)序列的整体显著削减效果是利用示例性方法(示例性方法小图)而非用于RNA-Seq方法的RiboMinusTM真核细胞试剂盒(RiboMinusTM小图)。然而,这两种方法显示了类似的对5.8S(小图5)和5SrRNA序列(小图6)的去除效果。
此外,在具有随机引物cDNA模板的PCR(GAPDH:24个循环)中使用对如下mRNA的终端5’和3’区域具有特异性的PCR引物:GAPDH(SEQIDNO:36;SEQIDNO:37;SEQIDNO:38:5′-CACAAGAGGAAGAGAGAGACCCTCA和SEQIDNO:39:5′-TTGATGGTACATGACAAGGTGCGG)mRNA,以及通过溴化乙锭染色的琼脂糖凝胶电泳分析每种PCR反应物的5μl等份处理后的样本,如图12C所示。从PCR结果很明显地看出,分别与非rRNA-削减样本(泳道1和泳道3)相比,对于针对全段或者片段化的HeLa总RNA(泳道2和泳道4)的两种方法,GAPDH(小图1和小图2)的mRNA的量无明显的减少。总的而言,这些成果证实在18S和28SrRNA序列的去除中,示例性方法明显比用于RNA-Seq方法的RiboMinusTM真核细胞试剂盒有优势,这不受总RNA样本状态(全段或者片段化)的支配。事实上,甚至对于全段总RNA样本,所述示例性方法看起来在去除18S和28SrRNA序列方面更加有效,这很可能至少在某种程度上是由于在甚至在最完整的总RNA样本中不能通过RiboMinusTM方法去除的某种程度的片段化的rRNA是不可见的。事实上,用于RNA-Seq方法的RiboMinusTM真核细胞试剂盒明确说明,该方法要求仅使用高质量的总RNA样本。
接下来,通过QPCR对所述随机引物cDNA样本作如下分析:根据起始量,将所述cDNA样本稀释至2倍to10倍的任何程度。然后,将每种稀释物的1μl加入到25μl包含1xFSPremixE(GREEN)、12.5皮摩尔的正向和反向PCR引物和1单位的FSEnzymeMix的qPCR反应物中。循环条件为:利用Bio-RadiCycler(加利福尼亚赫拉克勒斯的Bio-Rad)98℃达2分钟,之后是40-45个循环的98℃达5秒、60℃达15秒以及72℃达30秒。如下QPCR引物对被用于18S(SEQ.ID.No.30:SEQ.ID.No.31;SEQ.ID.No.52:5′-CTTAGAGGGACAAGTGGCG;SEQ.ID.NO.53:5′-GTAGGGTAGGCACACGCTGA;SEQ.ID.NO.54:5′-GAAACTTAAAGGAATTGACGGAAG;SEQ.ID.NO.55:5′-GAATCGAGAAAGAGCTATCAATC;SEQ.ID.NO.56:5′-CGATTGGATGGTTTAGTGAGG和SEQ.ID.No.57:5′-CCTTGTTACGACTTTTACTTCCTCTAG)、28S(SEQ.ID.No.58:5′-GCCGAAACGATCTCAACCTA;SEQ.ID.NO.59:5′-CGCCAGTTCTGCTTACCAAA;SEQ.ID.NO.60:5′-CGGACCAAGGAGTCTAACA;SEQ.ID.No.61:5′-CAGGCATAGTTCACCATCTTTCG;SEQ.ID.NO.62:5′-GGAGAGGGTGTAAATCTCGC;SEQ.ID.NO.63:5′-GCCGACTTCCCTTACCTACA;SEQ.ID.NO.64:5′-GTGTCAGAAAAGTTACCACAGG;SEQ.ID.NO.65:5′-GGCGAATTCTGCTTCACAATGATAG;SEQ.ID.NO.66:5′-GGGAGTAACTATGACTCTCTTAAGGT;SEQ.ID.NO.67:5′-TTGGCTGTGGTTTCGCTGGAT;SEQ.ID.NO.68:5′-GTGAACAGCAGTTGAACATGG和SEQ.ID.No.69:5′-CTTCACAAAGAAAAGAGAACTCTCCC)、5.8S(SEQ.ID.No.70:5′-CGACTCTTAGCGGTGGATCA和SEQ.ID.No.71:5′-AAGCGACGCTCAGACAG)和5S(SEQ.ID.NO.5和SEQ.ID.No.72:5′-AAAGCCTACAGCACCCGGTATTC)rRNA序列。
QPCR结果示于如下表2中:
表2
从表2中的结果明显看出,对于全段或者片段化的总RNA,示例性方法对所有核糖体RNA序列的去除效率明显得多,这不受用于28S和18SrRNA序列的引物集的支配。然而,对于针对片段化的RNA的RiboMinusTM方法,根据用于28S和18SrRNA序列的不同引物集的位置,削减的核糖体微乎其微甚或没有。
实施例13
与RiboMinusTM方法相比,利用本文披露的rRNA除去方法对rRNA背景的显著减少和对独特地可映射的读段的改善
用上文实施例9所述的方法或者用于RNA-SeqrRNA除去试剂盒的RiboMinusTM真核细胞试剂盒处理全段和部分地片段化的UniversalHumanReferencetotalRNA(UHRR)(每种2x2.5μg)。汇集(pool)各自的rRNA除尽的样本,以及为每种样本,利用rRNA除尽RNA从1μg当量的总RNA制备IlluminaRNA-Seq库一式三份。汇集各自RNA-Seq库的副本并利用IlluminaGAIIx下一代测序仪对36-nt读段执行测序。利用Illumina的PipelineElandrna模块和CASAVA软件以及用于映射剪接点的TopHat软件(参见http://www.tophat.cbcb.umd.edu/index.html)分析数据。映射结果显示与RiboMinusTM方法相比,实施例9所述的方法对rRNA背景的去除显著(参见下文表3)。此外,与RiboMinusTM相比,用实施例9所述的方法处理的样本中不包括rRNA序列的独特地可映射的序列得到显著的增加(表3)。进一步地,对于片段化的样本,从去除rRNA背景以及改善独特地可映射的序列方面来讲,实施例9的方法比作比较的试剂盒要奏效得多(表3)。
表3
表3示出实施例9所述的rRNA去除方法显著地减少了rRNA背景以及改善了RNA-Seq结果。用实施例9所述的方法或者可购得的试剂盒(RiboMinusTM方法)处理全段和部分地片段化的UniversalHumanReferenceRNA(UHRR)。然后将rRNA除尽RNA用于制备RNA-Seq库,以及在IlluminaGAIIx测序仪上对所述RNA-Seq库进行测序。
实施例14
去除植物rRNA的预测实施例
植物一般包含对应于叶绿体、线粒体以及核起源的rRNA序列。用于叶绿体起源,rRNA包含23S、16S、5S和4.5S序列(例如拟南芥;登录号AP000423.1);对于线粒体起源,rRNA包含18S和5S序列(例如拟南芥;登录号Y08501.2)以及对于核起源,rRNA包含25/26S、17/18S和5.8S序列(例如拟南芥;AC006837.16)。可以(整体或者部分地)合成对应于所述植物rRNA序列每种的PCR模板,以及各自的生物素化的rRNA序列,如实施例1中针对大肠杆菌所做的描述。
然后将各自的生物素化的反义以单一比率或者几个不同的比率混合,以有效地从不同的植物组织(例如叶、根、茎等等)去除所有rRNA序列,其中已知的是,不同rRNA的表现形式以变化的量而存在,尤其依赖叶绿体含量。设想一下,各种植物rRNA序列的去除与本文实施例5-12中针对人类和大肠杆菌rRNA序列所做的描述类似,也将是高效的。
除本文所述的那些之外,对本发明所做的各种修改,通过前述说明对本领域的技术人员而言都将是显而易见的。而且,这类修改意在落入所附的权利要求的范围之内。本申请引用的每个参考资料(包括但不仅限于期刊论文;美国和非美国专利、专利申请公开文本;国际专利申请公开文本;Genbank登录号;互联网网站等等)均以引用方式整体并入本文。
Claims (19)
1.一种从初始样本生成rRNA除尽的样本的方法,所述方法包含:
a)提供:
i)包含衍生自至少一种真核生物体或者物种的RNA分子的初始样本,其中所述RNA分子包含rRNA分子和非rRNARNA分子;
ii)包含与选自25S、26S、28S、18S、5.8S和5S真核细胞质rRNA分子以及12S和16S真核线粒体rRNA分子的至少一种rRNA分子的大体上全部的序列互补的反义rRNA分子的组合物,其中所述反义rRNA分子包含亲和标记物,所述亲和标记物以所述反义rRNA分子的每10个核碱基至少一个亲和标记物的比例存在;以及
iii)包含亲和标记物结合分子的结合基质;
b)在一定条件下使所述初始样本接触所述包含反义rRNA分子的组合物,以便至少部分所述亲和标记的反义rRNA分子和至少部分所述rRNA分子形成双链rRNA杂交体,从而生成处理后的样本;
c)在一定条件下使所述处理后的样本接触所述结合基质,其中所述亲和标记物结合分子与用于步骤b)的所述反义rRNA分子中存在的所述亲和标记物的比例是至少8比1,以便所述双链rRNA杂交体的至少部分结合至所述结合基质并得以从所述处理后的样本去除,从而生成rRNA除尽的样本,其中所述rRNA除尽的样本包含存在于所述初始样本中的所述非rRNARNA分子的至少部分并大体上除尽或者不含显示由所述至少一种rRNA分子显示的序列的rRNA分子。
2.权利要求1的方法,其中所述至少一种真核生物体或者物种选自人类、动物、植物以及真菌生物体或者物种。
3.权利要求2的方法,其中所述初始样本中的所述RNA分子和所述至少一种rRNA分子衍生自相同的真核生物体或者物种。
4.权利要求1的方法,其中所述RNA分子来自第一真核生物体或者物种,以及其中所述至少一种rRNA分子来自第二真核生物体或者物种。
5.权利要求4的方法,其中所述第一或者第二生物体或者物种的一个是智人,以及其中所述第一或者第二生物体或者物种的另一个是非人类哺乳动物。
6.权利要求1-5的任何一项的方法,其中所述亲和标记物与选自如下的至少一种核碱基相关联:腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)和尿嘧啶(U);以及
其中所述亲和标记物以所述反义rRNA分子的每8个核碱基至少一个亲和标记物的比例存在于所述反义rRNA分子上;以及/或者
其中步骤b)中的所述接触过程中,所述亲和标记物结合分子与所述亲和标记物的比例是至少10比1。
7.权利要求1-5的任何一项的方法,其中所述rRNA除尽的样本中显示所述至少一种rRNA分子的序列的分子的数目相对于所述初始样本中显示所述至少一种rRNA分子的序列的分子的数目被除尽了99.0%。
8.权利要求1-5的任何一项的方法,其中所述至少一种rRNA分子包括所述28SrRNA分子和所述18SrRNA分子两者,或者包括所述25S或者26SrRNA分子和所述16SrRNA分子两者。
9.权利要求1-5的任何一项的方法,其中所述至少一种rRNA分子包括所述5.8SrRNA和所述5SrRNA分子两者,以及/或者
其中所述至少一种rRNA分子包括所述12S和所述16S真核线粒体rRNA分子两者,以及/或者
其中所述至少一种rRNA分子选自16S、23S、4.5S和5S真核叶绿体rRNA分子。
10.权利要求1-5的任何一项的方法,其中所述包含衍生自真核生物体或者物种的RNA分子的初始样本另外包含衍生自至少一种原核物种的RNA分子,其中所述原核RNA分子包含rRNA分子和非rRNARNA分子,以及其中所述方法包括:
提供另外包含与选自23S、16S和5S原核rRNA分子的至少一种rRNA分子的大体上全部的序列互补的亲和标记的反义rRNA分子的组合物;以及
在一定条件下使所述初始样本与所述另外包含原核亲和标记的反义rRNA分子的组合物接触,以便至少部分所述亲和标记的反义rRNA分子和至少部分所述原核rRNA分子形成双链rRNA杂交体,从而生成处理后的样本;以及
在步骤c)中在一定条件下使所述处理后的样本接触所述结合基质,其中所述rRNA除尽的样本还包含存在于所述初始样本中的所述非rRNA原核RNA分子的至少部分以及大体上除尽或者不含显示由所述至少一种原核rRNA分子显示的序列的原核rRNA分子。
11.权利要求1-5的任何一项的方法,其中所述初始样本中所述RNA分子的至少部分被片段化。
12.权利要求1-5的任何一项的方法,其中所述初始样本中的所述RNA分子包含提取、分离或者纯化自选自如下的来源的RNA:组织样本、细胞样本、石蜡包埋的样本、石蜡包埋福尔马林固定(FFPE)的样本和由土壤、水、生长培养基或者生物流体或者标本组成的环境样本。
13.权利要求1-5的任何一项的方法,其中步骤b)中的所述条件包含在杂交缓冲液的存在下于60-75℃的温度下孵育第一时间段以及在约室温下孵育第二时间段,以及其中步骤c)中的所述结合基质包含多个个体颗粒或者结合柱,以及其中步骤c)中的所述条件包括于室温和/或35-60℃下至少不时地混合。
14.权利要求1-5的任何一项的方法,其中所述亲和标记物包含生物素。
15.一种包含与由选自如下的至少一种rRNA分子显示的大体上全部的序列互补的反义rRNA分子的组合物:25S、26S、28S、18S、5.8S和5S真核细胞质rRNA分子,12S和16S真核线粒体rRNA分子,16S、23S、4.5S和5S真核叶绿体rRNA分子以及23S、16S和5S原核rRNA分子,其中所述反义rRNA分子包含以所述反义rRNA分子的每10个核碱基至少一个亲和标记物的比例存在的亲和标记物,或者其中所述反义rRNA分子包含以所述反义rRNA分子的每8个核碱基至少一个亲和标记物的比例存在的亲和标记物。
16.权利要求15的组合物,其中所述反义rRNA分子包含与选自如下的rRNA分子互补的多种不同的反义rRNA分子:选自25S、26S、28S、18S、5.8S和5S真核细胞质rRNA分子的至少四种rRNA分子;由12S和16S真核线粒体rRNA分子组成的两种rRNA分子;由16S、23S、4.5S和5S真核叶绿体rRNA分子组成的四种rRNA分子;以及由23S、16S和5S原核rRNA分子组成的三种rRNA分子。
17.权利要求15或16的任何一项的组合物,所述组合物另外包含衍生自至少一种生物体或者物种的RNA分子,其中所述RNA分子包含rRNA分子和非rRNRNA分子,其中所述组合物中至少部分所述亲和标记的反义rRNA分子以与至少部分所述rRNA分子形成的双链杂交体而存在。
18.权利要求17的组合物,其中该所述RNA分子包含衍生自多种生物体或者物种的RNA分子。
19.权利要求17的组合物,所述组合物进一步包括包含亲和标记物结合分子的结合基质,其中所述亲和标记物结合分子与用于步骤b)的所述反义rRNA分子中存在的所述亲和标记物的比例是至少8比1,或者其中所述亲和标记物结合分子与用于步骤b)的所述反义rRNA分子中存在的所述亲和标记物的比例是至少10比1。
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