CN114317692A

CN114317692A - 人45s核糖体dna拷贝数检测试剂盒及检测方法

Info

Publication number: CN114317692A
Application number: CN202111679613.9A
Authority: CN
Inventors: 王艳华; 段化伟; 王婷; 林杨
Original assignee: Institute Of Occupational Health And Poisoning Control China Center For Disease Control And Prevention
Current assignee: Institute Of Occupational Health And Poisoning Control China Center For Disease Control And Prevention
Priority date: 2021-12-31
Filing date: 2021-12-31
Publication date: 2022-04-12

Abstract

本发明提供一种人45S核糖体DNA拷贝数检测方法，包括：提取待测样本基因组DNA，对待测样本基因组DNA和参考标准品分别利用荧光定量PCR方法进行检测，并通过PCR反应收集核糖体基因荧光信号(R)和单拷贝基因荧光信号(S)，基于所述标准曲线和待测样本基因组DNA检测得到的R/S比值计算得到待测样本的人核糖体DNA拷贝数相对量；PCR反应中以白蛋白基因作为内参基因并使用合适的引物，控制每10μL的反应体系中含有10μM的上游引物0.5μL、10μM的下游引物0.5μL和1μL的待测样本DNA或参考标准品DNA。本发明还提供用于检测人45S核糖体DNA拷贝数的试剂盒。本发明的检测方法和试剂盒检测准确性高、操作简便、需样量低，适用于大样本量的人群检测。

Description

人45S核糖体DNA拷贝数检测试剂盒及检测方法

技术领域

本发明涉及分子生物学和医学检测技术领域，特别涉及一种45S核糖体DNA拷贝数检测试剂盒，及利用该试剂盒检测人45S核糖体DNA拷贝数的检测方法。

背景技术

核糖体DNA(rDNA)是细胞中最丰富也最重要的管家基因，其主要作用是编码核糖体RNA，从而完成后续的核糖体装配和蛋白质加工。核糖体DNA由于其重复序列的特性，在维持基因组稳定性方面起着重要的作用，并且是真核细胞基因组中最脆弱的区域之一，会影响如衰老等细胞功能。越来越多的研究表明核糖体生物合成的异常，包括核糖体数量的增加，与肿瘤的发生发展密切相关。45S rDNA由18S、5.8S和28S rDNA组成，分布在13、14、15、21和22号染色体上。胃癌患者肿瘤组织中45S rDNA拷贝数明显高于癌旁正常组织。前瞻性队列研究中发现，18S和5.8S rDNA拷贝数的增加与肺癌风险有关。因此，建立一种高通量的45S核糖体DNA拷贝数检测方法对预防衰老和癌症的筛查、诊断及预后会起到很大的帮助。目前，测定45S核糖体DNA拷贝数的高通量检测方法较少，且检测方法未覆盖18S、5.8S和28SrDNA全部基因组成部分。PCR定量法因操作便捷、测定时间短，可广泛应用于人群研究。

发明内容

鉴于上述背景，本发明一方面的目的在于：提供一种优化的人45S核糖体DNA拷贝数检测方法。

本发明另一方面的目的在于：提供一种可以用于本发明上述人45S核糖体DNA拷贝数检测方法的试剂盒。

本发明的上述目的通过以下技术方案实现：

首先，提供一种45S核糖体DNA拷贝数检测方法，包括：提取待测样本基因组DNA，以来自不少于3000个人的全血DNA混合样品作为参考标准品，待测样本基因组DNA和标准品分别利用荧光定量PCR方法进行检测，通过PCR反应收集核糖体基因荧光信号(R)和单拷贝基因荧光信号(S)；其中，参考标准品以涵盖所述待测样本基因组DNA浓度的标准系列浓度进行检测，得到R/S比值标准曲线，基于所述标准曲线和待测样本基因组DNA检测得到的R/S比值计算得到待测样本的人核糖体DNA拷贝数相对量；

其中，PCR方法检测的单拷贝基因为白蛋白(albumin)基因，作为内参基因；所述的PCR反应使用的引物序列如下：

本发明所述的检测方法中，所述参考标准品的标准系列浓度来自一个可涵盖所述待测样本基因组DNA浓度的浓度值范围。为了提高标准曲线的参考性，所述的标准品的标准系列浓度取值由不少于5个数的等比数列构成，且大于和小于所述待测样本基因组DNA浓度的数值均不少于2个。

本发明优选的所述检测方法中，在所述的PCR反应中，将待测样本基因组DNA和不同浓度的标准品分别与扩增反应试剂混合形成反应体系进行扩增反应；其中，按体积百分比计，待测样本基因组DNA和标准品加入量占所述反应体系的5％～10％；所述的扩增反应试剂包括实时定量PCR扩增的预混合溶液、参比染料、上游引物、下游引物及无酶水；并控制每10μL的所述5.8S基因反应体系中含有10μM的5.8S-F引物0.5μL、10μM的5.8S-R引物0.5μL和1μL的待测样本DNA或参考标准品DNA；每10μL的所述18S基因反应体系中含有10μM的18S-F引物0.5μL、10μM的18S-R引物0.5μL和1μL的待测样本DNA或参考标准品DNA；每10μL的所述28S基因反应体系中含有10μM的28S-F引物0.5μL、10μM的28S-R引物0.5μL和1μL的待测样本DNA或参考标准品DNA；每10μL的所述单拷贝基因反应体系中含有10μM的albumin-F引物0.5μL、10μM的albumin-R引物0.5μL和1μL的待测样本DNA或参考标准品DNA。

本发明优选的检测方法中，所述的PCR反应程序设置如下：

Stage 1(hold stage)：1cycle：95℃30s；

Stage 2(PCR stage)：40cycle:95℃3s；60℃30s-收集荧光。

本发明的检测方法中，所述的参考标准品来源的人群年龄跨度为20～60岁。

此外，本发明还提供一种用于检测人45S核糖体DNA拷贝数的试剂盒，其中的试剂由参考标准品、引物、实时定量PCR扩增的预混合溶液、参比染料和去酶水组成；所述的参考标准品是来自不少于3000个人的全血DNA混合样品；所述的引物由第一引物、第二引物、第三引物、第四引物、第五引物、第六引物、第七引物和第八引物组成；所述的第一引物为10μM的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的5.8S核糖体基因的上游引物，所述的第二引物为10μM的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的5.8S核糖体基因的下游引物，所述的第三引物为10μM的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的18S核糖体基因的上游引物，所述的第四引物为10μM的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的18S核糖体基因的下游引物，所述的第五引物为10μM的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示的28S核糖体基因的上游引物，所述的第六引物为10μM的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示的28S核糖体基因的下游引物，所述的第七引物为10μM的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示的单拷贝基因(白蛋白)的上游引物，所述的第八引物为10μM的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示的单拷贝基因(白蛋白)的下游引物。

本发明优选的试剂盒中，所述的实时定量PCR扩增的预混合溶液是内含反应缓冲液、

GreenⅠ、dNTPs、Mg²⁺、rTaq DNA聚合酶及抗DNA聚合酶抗体的2×预混液。

本发明优选的试剂盒中，所述的参比染料是ROX reference dye。

本发明优选的试剂盒中，所述的实时定量PCR扩增的预混合溶液体积是所述的参比染料体积的至少100倍，优选500倍。

本发明所述的试剂盒用于人45S核糖体DNA拷贝数检测时，可先根据待测样本DNA的浓度将所述标准品稀释配置成一系列浓度的标准品试剂，形成标准系列浓度梯度，使待测样本DNA的浓度包含于标准系列浓度梯度范围内，然后根据既定的加样量将引物、实时定量PCR扩增的预混合溶液、参比染料及无酶水与各浓度的标准品和待测样本分别混合形成扩增反应体系，进行PCR反应。

与现有技术相比，本发明的人45S核糖体DNA拷贝数检测方法具有以下几方面有益效果：

1.标准品出峰稳定，无非特异性扩增产物

18S、5.8S、28S和单拷贝基因(白蛋白)的标准系列出峰稳定，熔解曲线光滑，无明显非特异性扩增产物。

2.通过优化引物的配比，扩增效率良好。

本发明检测方法提出过程中，发明人经过大量实验筛选得到了优化的引物浓度和引物PCR上样量，使得引物在反应体系中最终达到了特定的配比，实验结果表明，一方面，在本发明特定的引物配比条件下，PCR反应能够使扩增效率保持在90.00％～110.00％的同时获得更加理想的(>0.990的)标准曲线线性R²。

3.少量DNA待测样品得到稳定扩增

待测样品DNA浓度2～10ng/uL，每个检测孔上样待测样本DNA 1μL即可获得稳定检测结果。

总之，本发明的人45S核糖体DNA拷贝数检测方法和试剂盒准确性高，而且检测过程操作简单、系统误差小，需要的待测样本加样量和试剂量低(每10～20μL的反应体系仅需10μM的待测样本DNA1μL)，因此适用于大样本数量、大年龄跨度人群的快速检测。

附图说明

图1是实施例1检测方法中标准品的标准系列中单拷贝基因(白蛋白)的扩增曲线图。

图2是实施例1检测方法中标准品的标准系列中单拷贝基因(白蛋白)的熔解曲线图。

图3是实施例1检测方法中标准品的标准系列中5.8S核糖体基因的扩增曲线图。

图4是实施例1检测方法中标准品的标准系列中5.8S核糖体基因的熔解曲线图。

图5是实施例1检测方法中标准品的标准系列中18S核糖体基因的扩增曲线图。

图6是实施例1检测方法中标准品的标准系列中18S核糖体基因的熔解曲线图。

图7是实施例1检测方法中标准品的标准系列中28S核糖体基因的扩增曲线图。

图8是实施例1检测方法中标准品的标准系列中28S核糖体基因的熔解曲线图。

具体实施方式

以下通过列举实施例的方式进一步详细说明本发明，但本发明的方案不限于以下实施例。

实施例1

一种用于检测人45S核糖体DNA拷贝数的试剂盒

本试剂盒内共有12支产品，具体包括：

1、标准品1支

DNA浓度为90ng/μL，样本来自于3000人份的全血DNA混样(年龄20～60岁)。

2、引物8支

分别包括45S核糖体基因和单拷贝基因(白蛋白)的上、下游引物(按管身提示加入相应体积的ddH₂O后浓度为100μM)。具体引物序列如下

3、SYBR qPCR mix 1支

内含反应缓冲液、

GreenⅠ、dNTPs、Mg₂₊rTaq DNA聚合酶及抗DNA聚合酶抗体的2×预混液。

4、5×ROX reference dye 1支

5、ddH₂O 1支。

实施例2.

一种人45S核糖体DNA拷贝数检测方法，使用实施例1所述的试剂盒，包括以下步骤：

1.提取待测基因组DNA，配制浓度为5ng/μL的待测样品；

2.取试剂盒中的标准品，根据待测DNA样品的浓度配制标准系列梯度，使样本DNA浓度包含于标准系列浓度中(例如配制20，10，5，2.5，1.25，0.625ng/ul组成的标准系列梯度)。

3.将待测基因组DNA和标准品分别利用实时荧光定量PCR(RT-PCR)方法进行检测，以白蛋白(ALB)基因作为内参基因，使用所述试剂盒中的引物；加样方法具体是根据下表1的加样量将待测样品/标准品和试剂盒中的各试剂加入同一反应孔内进行反应。

表1

上述PCR反应程序的设置如下：

Stage 1(hold stage)：1cycle：95℃30s；

Stage 2(PCR stage)：40cycle:95℃3s；60℃30s-收集荧光。

通过上述PCR反应收集得到待测样品DNA及各浓度标准品的和核糖体基因荧光信号(R)和单拷贝基因荧光信号(S)；

4.基于所得的标准品核糖体基因荧光信号(R)和单拷贝基因荧光信号(S)得到R/S比值标准曲线，基于所述标准曲线和待测样本基因组DNA检测得到的R/S比值计算得到待测样本的人45S核糖体DNA拷贝数。

检测效果

本实施例检测结果显示，使用实施例1的试剂盒、采用本实施例的检测方法，得到的标准品单拷贝基因(白蛋白)和45S核糖体基因(5.8S、18S、28S)的标准系列出峰稳定(参见图1、图3、图5、图7)，熔解曲线光滑且双峰差异不大(参见图2、图4、图6、图8)，无明显非特异性扩增产物。

序列表

<110> 中国疾病预防控制中心职业卫生与中毒控制所

<120> 人45S核糖体DNA拷贝数检测试剂盒及检测方法

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

cgactcttag cggtggatca 20

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gatcaatgtg tcctgcaatt c 21

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cgcgctctac cttacctacc 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ggccgtgcgt acttagacat 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gcgggtggta aactccatct 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

cacgccctct tgaactctct 20

<210> 7

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

cggcggcggg cggcgcgggc tgggcggaaa tgctgcacag aatccttg 48

<210> 8

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gcccggcccg ccgcgcccgt cccgccggca tggtcgcctg ttcac 45

Claims

1.一种非诊断目的的人45S核糖体DNA拷贝数检测方法，包括：提取待测样本基因组DNA，对待测样本基因组DNA和参考标准品分别利用荧光定量PCR方法进行检测，并通过PCR反应收集核糖体基因荧光信号(R)和单拷贝基因荧光信号(S)；其特征在于：

所述的参考标准品是来自不少于3000个人的全血DNA混合样品；

将所述的参考标准品以涵盖所述待测样本基因组DNA浓度的标准系列浓度进行检测，得到R/S比值标准曲线，基于所述标准曲线和待测样本基因组DNA检测得到的R/S比值计算得到待测样本的人核糖体DNA拷贝数相对量；

其中，PCR方法检测的单拷贝基因为白蛋白(ALB)基因，作为内参基因；所述的PCR反应使用的引物序列如下：

2.在所述的PCR反应中，将待测样本基因组DNA和不同浓度的参考标准品分别与扩增反应试剂混合形成反应体系进行扩增反应；其中，按体积百分比计，待测样本基因组DNA和参考标准品加入量分别占所述反应体系的5％～10％；所述的扩增反应试剂包括实时定量PCR扩增的预混合溶液、参比染料、上游引物、下游引物及无酶水；所述的扩增反应试剂包括实时定量PCR扩增的预混合溶液、参比染料、上游引物、下游引物及无酶水；并控制每10μL的所述5.8S基因反应体系中含有10μM的5.8S-F引物0.5μL、10μM的5.8S-R引物0.5μL和1μL的待测样本DNA或参考标准品DNA；每10μL的所述18S基因反应体系中含有10μM的18S-F引物0.5μL、10μM的18S-R引物0.5μL和1μL的待测样本DNA或参考标准品DNA；每10μL的所述28S基因反应体系中含有10μM的28S-F引物0.5μL、10μM的28S-R引物0.5μL和1μL的待测样本DNA或参考标准品DNA；每10μL的所述单拷贝基因反应体系中含有10μM的albumin-F引物0.5μL、10μM的albumin-R引物0.5μL和1μL的待测样本DNA或参考标准品DNA。权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述的标准系列浓度取值由不少于5个数的等比数列构成，且大于和小于所述待测样本基因组DNA浓度的数值均不少于2个。

3.权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述的PCR反应程序设置如下：

Stage 1(hold stage)：1cycle：95℃ 30s；

Stage 2(PCR stage)：40cycle:95℃ 3s；60℃ 30s-收集荧光。

4.权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述的参考标准品来源的人群年龄跨度为20～60岁。

5.一种用于检测人45S核糖体DNA拷贝数的试剂盒，其中的试剂由参考标准品、引物、实时定量PCR扩增的预混合溶液、参比染料和去酶水组成；所述的参考标准品是来自不少于3000个人的全血DNA混合样品；所述的引物由第一引物、第二引物、第三引物、第四引物、第五引物、第六引物、第七引物和第八引物组成；所述的第一引物为10μM的核苷酸序列如SEQID NO.1所示的5.8S核糖体基因的上游引物，所述的第二引物为10μM的核苷酸序列如SEQID NO.2所示的5.8S核糖体基因的下游引物，所述的第三引物为10μM的核苷酸序列如SEQID NO.3所示的18S核糖体基因的上游引物，所述的第四引物为10μM的核苷酸序列如SEQ IDNO.4所示的18S核糖体基因的下游引物，所述的第五引物为10μM的核苷酸序列如SEQ IDNO.5所示的28S核糖体基因的上游引物，所述的第六引物为10μM的核苷酸序列如SEQ IDNO.6所示的28S核糖体基因的下游引物，所述的第七引物为10μM的核苷酸序列如SEQ IDNO.7所示的单拷贝基因(白蛋白)的上游引物，所述的第八引物为10μM的核苷酸序列如SEQID NO.8所示的单拷贝基因(白蛋白)的下游引物。

6.权利要求5所述的试剂盒，其特征在于：所述的实时定量PCR扩增的预混合溶液是内含反应缓冲液、

Green Ⅰ、dNTPs、Mg²⁺、rTaq DNA聚合酶及抗DNA聚合酶抗体的2×预混液。

7.权利要求5或6任意一项所述的试剂盒，其特征在于：所述的参比染料是5×ROXreference dye。

8.权利要求5或6任意一项所述的试剂盒，其特征在于：所述的实时定量PCR扩增的预混合溶液体积是所述的参比染料体积的至少100倍，优选500倍。