CN116516012B - Pole基因分型检测的复合扩增体系及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本申请属于分子检测技术领域,具体涉及一种基于多重荧光PCR结合毛细管电泳的POLE基因分型检测方法及试剂盒,具有检测灵敏度高、分辨率高、通量高且易于操作等优势。
Description
技术领域
本申请属于分子检测技术领域,具体涉及一种POLE基因分型检测的复合扩增体系及试剂盒。
背景技术
子宫内膜癌是一种发生于子宫内膜的一组上皮性恶性肿瘤,好发于围绝经期和绝经后女性。子宫内膜癌(EC)2020版NCCN指南依据POLE、MSI和P53三种指标,将EC分为四种具有不同预后的分子亚型,作为形态学分型的补充。2020ESGO指南推荐所有的EC患者进行分子分型,其中POLE突变型与G3内膜样癌相关,预后最好,且I~II期POLE超突变型EC可以不用考虑任何其他因素,省略辅助化疗,2021中国《子宫内膜癌诊断与治疗指南》亦推荐了POLE基因分型检测。
POLE突变临床检测需求强烈,但缺乏中国人群数据及热点突变位点频率,需建立一套完整的POLE检测解决方案。结合CE平台多重荧光PCR技术优势,建立准确度高、成本低、操作简便和大规模的检测体系,可准确检测热点突变,用于临床初步筛查。
有鉴于此,提出本申请。
发明内容
本申请的目的是寻求一种通量高、特异性强、灵敏度高、成本低且操作简单的POLE基因突变检测的复合扩增体系及其方法。为实现上述目的,本申请提供如下技术方案。
本申请首先提供一种检测POLE基因分型的引物组合物,该引物组合物在同一PCR体系中能同时对12个POLE突变进行多重扩增;
进一步的,所述引物组合物对POLE基因外显子上SNP位点进行扩增;优选的,所述外显子包括9号外显子、11号外显子、13号外显子和14号外显子。
更进一步的,所述SNP包括如下:
9号外显子:c.857C>G(P286R)、c.884T>G(M295R)、c.890C>T(S297F);
11号外显子:c.1100T>C(F367S)、c.1102G>T(D368Y);
13号外显子:c.1231G>T(V411L)、c.1270C>A(L424I)、c.1270C>G(L424V)、c.1307C>G(P436R)、c.1331T>A(M444K);
14号外显子:c.1366G>C(A456P)、c.1376C>T(S459F)。
进一步的,所述引物包括如下特异性引物和荧光引物序列:
P286R位点:
正向突变型引物:
反向共用引物:5’-ACTAACAGTGGGGCAGATGCTG-3’;
M295R位点:
正向突变型引物:5’-GATGCTGAGACAGACCAGATTAGGAG-3’,
反向共用引物:5’-ACTAACAGTGGGGCAGATGCTG-3’;
S297F位点:
正向突变型引物:
反向共用引物:5’-ATACTAACAGTGGGGCAGATGCTG-3’;
F367S位点:
正向突变型引物:5’-GTCACCTACAACGGGGACTGTTC-3’,
反向共用引物:5’-GCAACGCCCTCCCTCTCAAAT-3’;
L424V位点:
正向突变型引物:
反向共用引物:5’-GTCCGTGGCCATCTGGATGCGT-3’;
P436R位点:
正向突变型引物:5’-GGGCAAGCTAGGCTATGAGTG-3’,
反向共用引物:5’-GTCCGTGGCCATCTGGATGCGT-3’;
M444K位点:
正向突变型引物:
反向共用引物:5’-GTCCGTGGCCATCTGGATGCGT-3’;
S459F位点:
正向突变型引物:5’-CCTCAGACTCTGGCCACGTAGTT-3’,
反向共用引物:5’-GTGCACAGAGCAAAGATGAATGGG-3’;
A456P位点:
正向突变型引物:5’-GCGTTCTCTCCTCAGACTCCGC-3’,
反向共用引物:5’-GTGCACAGAGCAAAGATGAATGGG-3’;
L424I位点:
正向突变型引物:5’-ACCTTCCTGTGGGCAGTCATAATGA-3’,
反向共用引物:5’-GTCCGTGGCCATCTGGATGCGT-3’;
D368Y位点:
正向突变型引物:5’-GTCACCTACAACGGGGACTCTGCTC-3’,
反向共用引物:5’-GCAACGCCCTCCCTCTCAAAT-3’;
V411L位点:
正向突变型引物:
反向共用引物:5’-GTCCGTGGCCATCTGGATGCGT-3’。
所述“▂”粗下划线代表各引物在相应位置进行锁核酸修饰。
进一步的,所述PCR体系中加入半巢式引物,用于提高突变检测的灵敏度和特异性,并在设定阳性判断值时提供稳定的参照峰,序列如下:
F367S/D368Y半巢式引物:
5’-GTTTGAACACGTCCAGGAGACCA-3’;
P286R/M295R/S297半巢式引物:
5’-GTTAGTGGTTTTGGCATTTGACATTGAGAC-3’;
A456P/S459F半巢式引物:
5’-GTTTCTTTGCTCTTGATTTTTGATGGCCCTGC-3’;
V411L/L424I/L424V/P436R/M444K半巢式引物:
5’-ATTCGCATGTTAGAATCATCCTGGCTTCT-3’。
进一步的,所述引物进一步包含修饰或标记;
优选的,所述修饰或标记为荧光基团修饰、锁核酸修饰。
在一些实施方式中,所述12个SNP位点分别由两种颜色的荧光标记,相同荧光标记视为同一组(如下表)。
注:其中所述两组位点从上往下的顺序均为实际检测结果图中从小到大的片段排列顺序。
进一步的,所述第一组为FAM荧光标记,第二组为HEX荧光标记。
进一步的,所述12个SNP位点的荧光标记位于共用下游引物的5’端。
本申请还提供一种检测POLE基因分型的复合扩增体系,所述复合扩增体系包含上述所述的引物组合物,该复合扩增体系是多重荧光ARMS PCR结合毛细管电泳检测的体系。具体的,在该体系中,所述检测采用毛细管电泳检测,所述扩增采用多重特异性PCR扩增。
本申请还提供一种POLE基因突变检测试剂盒,所述试剂盒中包括上述引物组合物或复合扩增体系;
更进一步的,本申请所述的检测试剂盒,采用的是半巢式PCR的方法对目的位点进行扩增,通过毛细管电泳进行扩增产物的检测,完成对目的位点分型的检测。常规ARMS-PCR由于针对目标SNP位点设计两条高度相似并引入错配的等位基因引物,两者存在竞争性结合,因此在对突变丰度较低或者质量较差的模板进行扩增时,灵敏度可能会无法满足检测需求。为提高PCR扩增的特异性和灵敏度,我们在常规ARMS-PCR的基础上发明了半巢式PCR。
进一步的,上述检测试剂盒还包括热启动DNA Taq酶、UDG酶、2×PCR扩增缓冲液等,在一些实施方式中,还包括质控品和毛细管检测所需相关试剂,如内标等。
本申请还提供一种上述引物组合或复合扩增体系在POLE基因分型检测试剂中的用途。
本申请还提供一种检测POLE基因分型的方法,包括利用上述引物组合物或复合扩增体系对样本进行扩增的步骤。
本申请还提供上述检测体系或试剂盒的使用方法,主要包括以下步骤:PCR扩增、遗传分析仪检测扩增产物、数据分析、检测结果的判断。
与现有技术相比,本申请至少具有如下优势:
1)本申请的产物检测,具有检测灵敏度高、检测分辨率高、通量高、简单易于操作、便于自动化对结果进行判读等特点;本申请通过多重引物扩增体系的优化(包括扩增区域选择、扩增片段(特异性片段和内控片段)大小选择、内控引物位置选择、引物序列的优化(错配碱基位置选择、错配碱基类型选择、5’端碱基序列设计),内控引物/荧光引物的通用性或兼容性设计等);同时基于毛细管电泳平台进行产物检测,检测结果具有灵敏度高、分辨率高、通量高、简单易于操作、便于自动化以及有专业的软件对结果进行判读等优势。
2)本申请在常规ARMS-PCR基础上建立半巢式PCR,根据目标SNP位点设计一对只检测突变型等位基因的常规ARMS引物,再在3'端为突变位点的那条引物(即内引物)外侧紧邻位置设计一条普通扩增引物(即外引物),内引物扩增片段略短于外引物扩增片段,这样外引物针对性地富集目标所在序列,内引物扩增目标位点,由于目标所在序列的短片段远小于基因组模板,因此检测的特异性、灵敏度提高,并且能够为每个目标位点提供稳定的参照峰。此类半巢式PCR与巢式PCR不同,只进行一轮反应,不会延长实验流程。
3)本申请能够大大增加等位基因特异性引物PCR区分不同等位基因位点的能力,使不同位点间的非特异性交叉扩增的可能性降到最低,不仅有很好的特异性,也具有非常好的灵敏度,能够检出40ng石蜡包埋组织DNA样本中低至1%的基因突变,即一管式扩增12种POLE突变,检测灵敏度最高可达到1.0%(上样量40ng DNA),优于传统检测技术及需要的样本量。
4)本申请的检测技术方法相对于市面上其它检测方法极大降低了操作强度,可实现3小时内出结果,并且大大降低成本,涵盖众多位点,为临床医生提供了更多的患者基因信息,为子宫内膜癌患者提供更完善的个性化用药参考,使患者受益。
附图说明
为了更清楚地说明本申请具体实施方式或现有技术中的技术方案,下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图是本申请的一些实施方式,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1、TCGA数据库统计的各位点突变频率;
图2、P286R位点在引物优化前的检测结果;
图3、P286R位点在引物优化后的检测结果;
图4、体系中添加半巢式引物前后的位点P286R+S297F的测试结果;
图5、体系中添加半巢式引物前后的位点M295R的测试结果;
图6、体系中添加半巢式引物前后的位点S367S的测试结果;
图7、体系中添加半巢式引物前后的位点S368Y的测试结果;
图8、体系中添加半巢式引物前后的多位点M444K+P436R+L424V+V411L+A456P的测试结果;
图9、体系中添加半巢式引物前后的多位点M444K+L424I+V411L+S459F的测试结果;
图10、P286R位点突变丰度与核酸浓度交叉实验所测定的最低检出限上下的检测结果图;
图11、试剂盒扩增临床样本毛细管电泳检测的结果图。
具体实施方式
下面将结合附图对本申请的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例是本申请一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本申请保护的范围。
实施例1、POLE基因检测位点及引物组合的筛选
本实施例在综合美国国立综合癌症网络(NCCN)发布的《子宫内膜癌临床实践指南》以及TCGA数据库基础上,结合检测难以筛选确定进行POLE基因检测的位点。
本实施例初筛了7个突变频率最高的POLE基因突变位点,根据TCGA数据库统计的各位点突变频率如图1。
进一步,综合检测效果和体系的容量,本申请加入了更多检测位点,最终体系包含位点如下:
编号 | 氨基酸变化 | 碱基变化 |
1 | D368Y | c.1102G>T |
2 | F367S | c.1100T>C |
3 | M444K | c.1331T>A |
4 | P436R | c.1307C>G |
5 | L424I | c.1270C>A |
6 | L424V | c.1270C>G |
7 | V411L | c.1231G>T |
8 | S459F | c.1376C>T |
9 | A456P | c.1366G>C |
10 | S297F | c.890C>T |
11 | M295R | c.884T>G |
12 | P286R | c.857C>G |
针对上述位点进行引物的初步设计,根据等位基因特异性PCR原理,每条特异引物只能与对应基因型的DNA模板结合并进行扩增,初步设计引物序列如下:
P286R位点:
正向突变型引物:5’-GACCAAACTGCCCCTCAAGTTTCG-3’,
反向共用引物:5’-ACTAACAGTGGGGCAGATGCTG-3’;
M295R位点:
正向突变型引物:5’-GATGCTGAGACAGACCAGATTATGAG-3’,
反向共用引物:5’-ACTAACAGTGGGGCAGATGCTG-3’;
S297F位点:
正向突变型引物:5’-CTGAGACAGACCAGATTATGATGATTTT-3’,
反向共用引物:5’-ATACTAACAGTGGGGCAGATGCTG-3’;
F367S位点:
正向突变型引物:5’-GTCACCTACAACGGGGACTTTTC-3’,
反向共用引物:5’-GCAACGCCCTCCCTCTCAAAT-3’;
L424V位点:
正向突变型引物:5’-ACCTTCCTGTGGGCAGTCATAATG-3’,
反向共用引物:5’-GTCCGTGGCCATCTGGATGCGT-3’;
P436R位点:
正向突变型引物:5’-GGGCAAGCTAGGCTATGAGCG-3’,
反向共用引物:5’-GTCCGTGGCCATCTGGATGCGT-3’;
M444K位点:
正向突变型引物:5’-GGCCAAGCTAGGCTATGATA-3’,
反向共用引物:5’-GTCCGTGGCCATCTGGATGCGT-3’;
S459F位点:
正向突变型引物:5’-CCTCAGACTCTGGCCACGTATTT-3’,
反向共用引物:5’-GTGCACAGAGCAAAGATGAATGGG-3’;
A456P位点:
正向突变型引物:5’-GCGTTCTCTCCTCAGACTCTGC-3’,
反向共用引物:5’-GTGCACAGAGCAAAGATGAATGGG-3’;
L424I位点:
正向突变型引物:5’-ACCTTCCTGTGGGCAGTCATAATCA-3’,
反向共用引物:5’-GTCCGTGGCCATCTGGATGCGT-3’;
D368Y位点:
正向突变型引物:5’-GTCACCTACAACGGGGACTTTTTTC-3’,
反向共用引物:5’-GCAACGCCCTCCCTCTCAAAT-3’;
V411L位点:
正向突变型引物:5’-GTTCTCATTCTCCTTCCAGGTGGT-3’,
反向共用引物:5’-GTCCGTGGCCATCTGGATGCGT-3’;
为了协调扩增效率、改进产物峰型、便于毛细管电泳检测,本申请进一步对所有引物进行一系列特定的改动。
示例性的,以P286R位点引物筛选为例,实验中初设计的引物对于该位点检测的特异性较差,野生型中也有检出。优化过程中,该位点引物对突变型引物3’端引入错配,具体优化的结果如图2和3所示:P286R位点的正向突变型引物、反向共用引物按比例混合,分别以金标准确定的野生、突变样本为模板进行扩增检测,结果显示均正确,且无杂峰。
综上对每个位点引物的重新设计和优化,经过各突变型位点引物的单独筛选和组合优化,确定了本实施例所采用的最终引物对序列如下:
P286R位点:
正向突变型引物:
反向共用引物:5’-ACTAACAGTGGGGCAGATGCTG-3’;
M295R位点:
正向突变型引物:5’-GATGCTGAGACAGACCAGATTAGGAG-3’,
反向共用引物:5’-ACTAACAGTGGGGCAGATGCTG-3’;
S297F位点:
正向突变型引物:
反向共用引物:5’-ATACTAACAGTGGGGCAGATGCTG-3’;
F367S位点:
正向突变型引物:5’-GTCACCTACAACGGGGACTGTTC-3’,
反向共用引物:5’-GCAACGCCCTCCCTCTCAAAT-3’;
L424V位点:
正向突变型引物:
反向共用引物:5’-GTCCGTGGCCATCTGGATGCGT-3’;
P436R位点:
正向突变型引物:5’-GGGCAAGCTAGGCTATGAGTG-3’,
反向共用引物:5’-GTCCGTGGCCATCTGGATGCGT-3’;
M444K位点:
正向突变型引物:
反向共用引物:5’-GTCCGTGGCCATCTGGATGCGT-3’;
S459F位点:
正向突变型引物:5’-CCTCAGACTCTGGCCACGTAGTT-3’,
反向共用引物:5’-GTGCACAGAGCAAAGATGAATGGG-3’;
A456P位点:
正向突变型引物:5’-GCGTTCTCTCCTCAGACTCCGC-3’,
反向共用引物:5’-GTGCACAGAGCAAAGATGAATGGG-3’;
L424I位点:
正向突变型引物:5’-ACCTTCCTGTGGGCAGTCATAATGA-3’,
反向共用引物:5’-GTCCGTGGCCATCTGGATGCGT-3’;
D368Y位点:
正向突变型引物:5’-GTCACCTACAACGGGGACTCTGCTC-3’,
反向共用引物:5’-GCAACGCCCTCCCTCTCAAAT-3’;
V411L位点:
正向突变型引物:
反向共用引物:5’-GTCCGTGGCCATCTGGATGCGT-3’;
其中:所述“-”单下划线表示在初始引物序列上的错配碱基;所述“=”双下划线表示在初始引物序列上增加的碱基序列;所述“▂”粗下划线表示相应位置的锁核酸修饰。另外,所有检测位点共用引物均在5’端进行FAM或HEX荧光标记。
实施例2、POLE基因突变检测体系的优化
本实施例在常规ARMS-PCR的基础上发明了半巢式PCR,该体系包含引物组合如实施例1最终优化的引物部分,在此基础上加入半巢式引物,所有引物按一定比例进行混合,配制成20×引物mix。
体系中还包含酶、PCR扩增缓冲液,其中PCR扩增缓冲液中包含dATP、dTTP、dCTP、dGTP、dUTP,以及Mg2+等成分,酶包含热启动DNA Taq酶和UDG酶。
为提高PCR扩增的特异性和灵敏度,并为检测位点提供参照峰,本申请在突变型ARMS引物(即内引物)外侧紧邻位置设计一条普通扩增引物(即半巢式引物),针对性地富集目标位点所在序列,具体引物序列如下:
F367S/D368Y半巢式引物:5’-GTTTGAACACGTCCAGGAGACCA-3’
P286R/M295R/S297半巢式引物:5’-GTTAGTGGTTTTGGCATTTGACATTGAGAC-3’
A456P/S459F半巢式引物:5’-GTTTCTTTGCTCTTGATTTTTGATGGCCCTGC-3’
V411L/L424I/L424V/P436R/M444K半巢式引物:
5’-ATTCGCATGTTAGAATCATCCTGGCTTCT-3’
经毛细管电泳检测显示(如图4-9),看得出无论是单独针对某一位点,还是多重体系下的多位点,优化后的方法在检测特异性、灵敏度相较未添加半巢式的常规ARMS体系均显著提高,并且成功为每个目标位点提供稳定的参照峰。
实施例3:POLE基因突变检测体系性能测试
本实施例中对体系的最低检出限进行测试,同时检测12个目标位点。具体实验步骤如下:
1)准备实验用样本
制备丰度为1%、2%、3%、4%、5%突变型样本,每个突变位点对应的每个丰度各制备3例样本。制备方法为使用3例稀释到100ng/μL子宫内膜癌野生型基因组DNA,与稀释到3×10^4拷贝/μL的各突变型质粒,分别按照下表中的投入量进行混合。
梯度丰度突变型样本配制表
混合后将各样本分别按照梯度稀释为30ng/μL、40ng/μL和50ng/μL样本,进行最低检测限研究。
2、PCR扩增体系的配制
该体系包含引物组合如实施例1,在生工生物工程(上海)有限公司合成,并且所有引物按照实验摸索的等比例进行混合,配制成20×引物mix。
该体系还包含酶、PCR扩增缓冲液,其中PCR扩增缓冲液中包含dATP、dTTP、dCTP、dGTP、dUTP,Mg2+,酶包含热启动DNA Taq酶和UDG酶。
PCR扩增体系的配制,振荡混匀后,根据样本数量进行分装,每管19μL。
3、加入模板
向对应PCR反应管中,加入各浓度梯度的DNA样本1μL,同时,设置质控对照(质控:1μL质控品,阴性对照:1μL无核酸纯水)。
4、PCR扩增
将各反应管放入PCR扩增仪反应槽内,设置反应体系为20μL。
PCR反应程序
5、扩增产物进行毛细血管电泳检测
配制混有分子量内标和甲酰胺的上样混合液:(0.5μL分子量内标+8.5μL甲酰胺)×检测样品数,涡旋振荡混匀10-15秒;用移液器给每个检测孔分装9μL的甲酰胺和内标混合物;取1μL扩增产物加入甲酰胺和内标混合物里,盖上封板胶盖。按照遗传分析仪用户使用手册步骤进行检测。
6、数据分析
向GeneMapper软件中导入相关文件,输入检测仪下机的原始数据(.fsa文件),分析数据。
检测位点信息:
检测位点 | 荧光通道 | 3500xL DX检测片段大小(bp) |
C1 | FAM | 122.8±0.8 |
F367S | FAM | 94.2±0.8 |
D368Y | FAM | 81.5±0.8 |
M444K | FAM | 110.0±0.8 |
P436R | FAM | 135.0±0.8 |
L424I | FAM | 175.5±0.8 |
L424V | FAM | 179.0±0.8 |
V411L | FAM | 213.0±0.8 |
C3 | FAM | 241.0±0.8 |
C2 | HEX | 138.5±0.8 |
S297F | HEX | 135.0±0.8 |
A456P | HEX | 106.5±0.8 |
S459F | HEX | 92.5±0.8 |
C4 | HEX | 194.0±0.8 |
P286R | HEX | 165.0±0.8 |
M295R | HEX | 147.5±0.8 |
7、判定标准
1)确认所有参照峰的峰高≥175rfu。
2)确认所有参照峰、突变位点的峰高不超阈值(>30000rfu)。
3)若突变位点不存在≥175rfu的峰,则该位点为野生型;
4)若突变位点存在≥175rfu的峰,则需根据位点Ratio值对样本该位点突变情况进行判读(Ratio=突变位点峰高/相应参照峰峰高),如下表:
各位点Ratio值的阳性判断值
8、实验结果
各位点在不同突变丰度以及不同核酸浓度条件下的交叉实验检出结果,部分如下:
P286R研究结果如下表和附图10。
/>
M295R研究结果
S297F研究结果
F367S研究结果
D368Y研究结果
统计以上各位点交叉研究检测结果,当样本上样量为30ng(样本浓度30
ng/μL,上样体积为1μL)时,部分位点出现峰高<175rfu,导致检测结果与理论结果不完全一致。在40ng上样量与50ng上样量条件下,最低可检测丰度基本一致。相同丰度下,部分40ng可以检出的丰度,在30ng上样条件下无法检出。当某一位点的某一丰度的三个样本,在确定上样浓度的情况下可以全部检出时,此丰度确定为检测限的最低检测丰度。
综合所有位点的情况,最终确定总体检测限的上样浓度为40ng及以上,对应的最低检测丰度见下表:
突变名称 | 最低突变丰度 | 最小核酸浓度(ng/μL) |
P286R | 2% | 40 |
M295R | 3% | 40 |
S297F | 3% | 40 |
F367S | 1% | 40 |
D368Y | 3% | 40 |
V411L | 1% | 40 |
L424I | 2% | 40 |
L424V | 3% | 40 |
P436R | 4% | 40 |
M444K | 2% | 40 |
A456P | 3% | 40 |
S459F | 4% | 40 |
可见,该体系的灵敏度好,可检测到丰度在5%以下的突变。
实施例4:POLE基因突变检测体系临床样本检测与验证
本实施例采用本申请体系制备成试剂盒,对石蜡包埋组织DNA进行扩增检测,具体以150例临床子宫内膜癌石蜡包埋组织DNA样本的为例进行扩增检测,同时,使用Sanger测序对该试剂盒的扩增检测结果进行验证,进而证实本申请引物体系及试剂盒的有效性、特异性及准确性。
一、检测体系
本申请的试剂盒包含PCR Master Mix、质控品、内标。其中PCR Master Mix主要组分包含热启动DNA Taq酶、UDG酶、扩增缓冲液、实施例3中所用添加剂以及各位点扩增引物等。
二、检测方法
步骤1:PCR扩增反应
1)PCR预混溶液分装:振荡混匀PCR预混溶液(PCR Master Mix),按照155个检测数配制,每个PCR反应管分装19μL。2)加入模板:向对应PCR反应管中,加入待检测DNA样本1μL,同时,设置质控对照(质控:1μL质控品,阴性对照:1μL无核酸纯水)。3)PCR扩增:将各反应管放入PCR扩增仪反应槽内,设置反应体系为20μL。按实施例3的反应程序条件设置PCR仪,并进行PCR扩增。
步骤2和3:扩增产物的检测和数据的分析
按照实施例3的第5和6进行操作。
步骤4:检测结果的判定
如图11所示为临床样本的扩增检测结果图,各位点与参照峰的对应关系如下:
突变位点 | 相应参照峰 |
F367S、D368Y | C1 |
S459F、A456P | C2 |
L424I、L424V、V411L、P436R、M444K | C3 |
P286R、S297F、M295R | C4 |
突变型的判读标准如下(Ratio=突变位点峰高/相应参照峰峰高):
三、Sanger法测序:
根据最终确定的SNP位点信息,查找各位点的基因序列,在相应的SNP位点的上下游各至少100bp以上区域进行测序引物的设计(由生工生物工程(上海)有限公司进行合成)。使用设计好的各位点的测序引物,进行目标样本各位点所在片段的扩增,经电泳检测,确定有无扩增产物及目的片段大小正确后,送生工生物工程(上海)有限公司进行Sanger法测序。
四、CE结果与Sanger测序的对比:
根据毛细管电泳检测图,分析得到临床样本通过试剂盒扩增检测的基因分型,并与Sanger测序得到的数据进行对比。
各位点分型对比结果如下表:
/>
/>
/>
/>
本实施例共检测了150例临床样本,阳性率约为5.3%(8/150),其中与Sanger测序结果一致率50%(4/8),针对所有测得的阳性样本,采用NGS(外送至北京诺禾致源生物科技有限公司)进行检测验证,经NGS检测验证均为较低丰度突变样本,检测结果与CE结果均一致,符合率100%(8/8),详细对比结果见下表。图11展示部分阳性样本(样本1093355-6和1157267-19)的检测结果。
由此,可说明本试剂盒经过对临床样本的检测,以及不同方法的验证,确定本试剂盒具有较高的灵敏度和准确性,能够准确地检测临床样本。
样本名称 | Sanger测序 | CE法 | NGS |
1093355-6 | c.857C>G(P286R) | c.857C>G(P286R) | C:81.41%G:18.23% |
1157267-19 | c.1231G>T(V411L) | c.1231G>(V411L) | G:71.39%T:28.43% |
1174821-1 | c.1366G>C(A456P) | c.1366G>(A456P) | G:66.91%C:32.73% |
1119007-1 | c.1231G>T(V411L) | c.1231G>(V411L) | G:65.73%T:33.95% |
993233-15 | 野生型 | c.1366G>(A456P) | G:98.44%C:1.42% |
1130693-7 | 野生型 | c.1231G>(V411L) | G:78.24%T:21.58% |
1147286-12 | 野生型 | c.1270C>(L424I) | C:84.01%A:15.36% |
1173367-1 | 野生型 | c.1270C>(L424I) | C:85.55%A:13.92% |
最后说明,以上各实施例仅用以说明本申请技术方案,而非限制;尽管参照前述各实施例对本申请进行了详细的说明,但本领域应当理解:其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改,或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换;而这些修改或者替换,并不使相应技术方案的本质脱离本申请各实施例技术方案的范围。
Claims (6)
1.一种用于POLE基因分型的引物组合物,其特征在于,所述引物组合物对POLE基因外显子上SNP位点进行扩增;
所述外显子包括:9号外显子、11号外显子、13号外显子和14号外显子;
所述SNP包括:
9号外显子:P286R、M295R、S297F;
11号外显子:F367S、D368Y;
13号外显子:V411L、L424I、L424V、P436R、M444K;
14号外显子:A456P、S459F;
所述引物序列如下:
其中:所述“-”单下划线表示错配碱基;所述“=”双下划线表示增加的碱基序列;所述“▂”粗下划线表示相应位置的锁核酸修饰。
2.根据权利要求1所述的引物组合物,其特征在于,所述引物进一步包括如下所示的半巢式引物:
F367S/D368Y半巢式引物:
5’-GTTTGAACACGTCCAGGAGACCA-3’;
P286R/M295R/S297半巢式引物:
5’-GTTAGTGGTTTTGGCATTTGACATTGAGAC-3’;
A456P/S459F半巢式引物:
5’-GTTTCTTTGCTCTTGATTTTTGATGGCCCTGC-3’;
V411L/L424I/L424V/P436R/M444K半巢式引物:
5’-ATTCGCATGTTAGAATCATCCTGGCTTCT-3’。
3.根据权利要求1-2任一所述的引物组合物,其特征在于,所述引物序列进一步包含标记;所述标记为全部反向共用引物均在5’端进行FAM或HEX荧光标记。
4.一种检测POLE基因分型的复合扩增体系,其特征在于,所述复合扩增体系包含权利要求1-3任一所述的引物组合物。
5.一种POLE基因突变检测试剂盒,其特征在于,所述试剂盒中包括权利要求1-3任一所述的引物组合物或权利要求4所述的复合扩增体系。
6.根据权利要求5所述的POLE基因突变检测试剂盒,其特征在于,所述试剂盒还包括热启动DNA Taq酶、UDG酶、2×PCR扩增缓冲液、质控品和内标。
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