JP2023136535A - 多剤耐性細菌検出方法及びプライマーキット - Google Patents

Abstract

【課題】試料中の多剤耐性細菌を簡便かつ迅速に検出可能な多剤耐性細菌検出方法を提供すること。【解決手段】試料中の多剤耐性細菌を検出する方法であり、下記（ｉ）～（ｉｉ）の遺伝子：（ｉ）特定のヌクレオチド配列を含む第１の遺伝子、（ｉｉ）別の特定のヌクレオチド配列を含む第２の遺伝子からなる第１群から選択される少なくとも１種の遺伝子を、例えば試料由来の核酸を鋳型として少なくとも１種のプライマーセットを用いて核酸増幅を行うことにより、検出する検出工程を含むことを特徴とする、多剤耐性細菌検出方法。【選択図】なし

Description

本発明は、多剤耐性細菌検出方法及びプライマーキットに関する。

ヒトや動物の疾患の多くは様々な細菌の感染によって惹き起こされることが知られており、例えば、ヒトや動物に感染すると下痢や敗血症等を発症させる病原性大腸菌は、豚や牛等の家畜に感染するとその死亡や発育不良をもたらすこともある。そのため、感染拡大の予測をしたり、ワクチン接種や投薬をするための情報として、細菌の分離年や分離地域等に加えて、その細菌の性状（血清型、遺伝子型、病原性関連遺伝子の保有状況、薬剤耐性等）を早期に把握することが求められている。さらに近年では、ワンヘルスアプローチの観点からも、ヒトとそれ以外の動物（好ましくは脊椎動物）との両方に感染する細菌による人獣共通感染症の監視体制の構築が求められている。

例えば、又吉ら，日獣会誌，５４，ｐ．９１３－９１９（２００１）（非特許文献１）には、腸管毒素原性大腸菌の農場特有の識別を目的として、薬剤耐性、βラクタマーゼ産生性、耐性遺伝子、接合性Ｒプラスミド及びプラスミドプロファイルによる解析を行ったことが記載されている。しかしながら、このような腸管毒素原性大腸菌を含む病原性大腸菌の分布や性状は十分に解明されておらず、上記情報として重視すべき指標は未だ絞り込まれていない。

また、大腸菌の性状と関連が高い指標としては、血清型や遺伝子型が優先して用いられており、これらの識別方法についてはこれまでに多くの検討がなされている。例えば、特開２０１６－４９１０９号公報（特許文献１）には、大腸菌の染色体上の特定の遺伝子を検出してその遺伝子型別分類を行なう方法が記載されている。しかしながら、多数の種類が存在する大腸菌に対して、複数の血清型や遺伝子型を網羅して簡便かつ迅速に識別する技術は未だ十分に確立されておらず、多くのコストや手間を要するといった問題があった。

さらに、このような大腸菌を含む細菌の性状に関しては、抗菌剤等の薬剤に対する耐性、さらには複数の薬剤に対する多剤耐性が近年では特に大きな問題となっており、薬剤耐性に関与する遺伝子の研究が盛んになされている。例えば、西野ら，日本細菌学雑誌，５７（２），ｐ．４５３－４６４（２００２）（非特許文献２）には、推定薬剤排出タンパク質遺伝子と二成分情報伝達系遺伝子とを網羅的にクローニング・解析することで薬剤耐性因子を同定したことが記載されている。また、例えば、Ｚｗａｍａ ｅｔ ａｌ．，ＣＯＭＭＵＮＩＣＡＴＩＯＮＳ ＢＩＯＬＯＧＹ，（２０１９）２：３４０，ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３８／ｓ４２００３－０１９－０５６４－６（非特許文献３）では、インフルエンザ菌（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）の多剤排出トランスポーターＡｃｒＢの構造を含めた解析がなされている。さらに、例えば、特開２００４－２１５５４２号公報（特許文献２）には、結核菌に含まれる薬剤耐性遺伝子を特定のプライマーを用いて検出する方法が記載されており、特開２０１０－５３６３４３号公報（特許文献３）には、バンコマイシン耐性腸球菌種などの薬剤耐性菌を検出するためのオリゴヌクレオチドが記載されている。

しかしながら、数多くの薬剤が存在する中で、多数の種類の細菌に対して個々の薬剤耐性を網羅して簡便かつ迅速に検出する技術も未だ確立されておらず、やはり多くのコストや手間を要するといった問題があった。とりわけ大腸菌には、性状（血清型、遺伝子型、病原性関連遺伝子の保有状況、薬剤耐性等）が異なる非常に多くの種類が存在するが、多剤耐性大腸菌を簡便に検出する方法やそのための指標は未だ報告されていない。

特開２０１６－４９１０９号公報 特開２００４－２１５５４２号公報 特開２０１０－５３６３４３号公報

又吉ら，日獣会誌，５４，ｐ．９１３－９１９（２００１） 西野ら，日本細菌学雑誌，５７（２），ｐ．４５３－４６４（２００２） Ｚｗａｍａ ｅｔ ａｌ．，ＣＯＭＭＵＮＩＣＡＴＩＯＮＳ ＢＩＯＬＯＧＹ，（２０１９）２：３４０，ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３８／ｓ４２００３－０１９－０５６４－６

本発明は上記課題に鑑みてなされたものであり、多剤耐性細菌を簡便かつ迅速に検出可能な多剤耐性細菌検出方法、及びこれに好適に用いることができるプライマーキットを提供することを目的とする。

本発明者は、先ず、１９９９年～２０１９年に日本国内の３１都道府県で大腸菌症や浮腫病の豚から分離された大腸菌１，７０８株について、各都道府県の家畜保健衛生所から提供された分離状況を整理した。また、様々な系統から選抜した２４種類の抗菌剤に対する薬剤耐性を調査したところ、病原性大腸菌では多剤耐性傾向にあることを見出した。さらにそのうち、２９６株の大腸菌の全ゲノム解析を行ない、各大腸菌における既知の薬剤耐性遺伝子を解析したところ、７９種類、のべ３，１３０個の薬剤耐性遺伝子が同定された。しかしながら、このように多い薬剤耐性遺伝子の数は、核酸増幅等によって迅速に検出する方法には現実的な数でない。

そこで、本発明者は、全ゲノム解析サンプルを９３５株に増やして、既知の薬剤耐性遺伝子に該当する遺伝子であるか否かを問わず、ゲノムワイド関連解析を行った。その結果、多剤耐性の株が有意に保有する遺伝子として、薬剤耐性試験を行った２４種類の抗菌剤からＣＬ、ＡＰＭ、ＢＣＭを除く２１種類のうち、９剤以上に対して耐性であった株の７５％、１２剤以上に対して耐性であった株の９７．４％が、一方又は両方を保有する２つの遺伝子（ｇ２７７２３及びｇ３３０２６）を同定した。つまり、ｇ２７７２３及び／又はｇ３３０２６を有する大腸菌では、これらをいずれも有さない大腸菌よりも、多剤耐性である確率が有意に高い、すなわち多剤耐性である可能性が高いことを見出した。

ｇ２７７２３及びｇ３３０２６はいずれも、機能が未知の遺伝子であるが、上記のようにこれらの一方又は両方を有する大腸菌は共通して多剤耐性の傾向にあり、かつ、かかる遺伝子の配列は他の細菌においても高い同一性（９５％以上、好ましくは９６％以上、９９％以上、又は１００％）で保存されていることから、本発明者は、これら遺伝子を指標として検出することにより、多剤耐性である細菌又は多剤耐性である可能性が高い細菌を容易かつ迅速に検出することが可能となることを見出し、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は、多剤耐性細菌検出方法及びプライマーキットに関し、より詳しくは、以下を提供するものである。
［１］
試料中の多剤耐性細菌を検出する方法であり、下記（ｉ）～（ｉｉ）の遺伝子：
（ｉ）配列番号１のヌクレオチド配列、配列番号１のヌクレオチド配列と８０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列、又は配列番号１のヌクレオチド配列の相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列からなる第１のコンセンサス領域を含む遺伝子からなる群から選択される少なくとも１種の第１の遺伝子
（ｉｉ）配列番号２のヌクレオチド配列、配列番号２のヌクレオチド配列と８０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列、又は配列番号２のヌクレオチド配列の相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列からなる第２のコンセンサス領域を含む遺伝子からなる群から選択される少なくとも１種の第２の遺伝子
からなる第１群から選択される少なくとも１種の遺伝子を検出する検出工程を含む、多剤耐性細菌検出方法。
［２］
前記検出工程が、前記試料由来の核酸を鋳型として、
第１のコンセンサス領域の少なくとも一部を増幅可能なプライマーの組み合わせであるプライマーセットＩ、及び
第２のコンセンサス領域の少なくとも一部を増幅可能なプライマーの組み合わせであるプライマーセットＩＩ
からなる群から選択される少なくとも１種のプライマーセットを用いて核酸増幅を行なう工程を含む、［１］に記載の多剤耐性細菌検出方法。
［３］
プライマーセットＩが、配列番号４のヌクレオチド配列のうちの１０塩基以上にハイブリダイズするフォーワードプライマーＩと、配列番号５のヌクレオチド配列のうちの１０塩基以上にハイブリダイズするリバースプライマーＩと、の組み合わせである、［２］に記載の多剤耐性細菌検出方法。
［４］
プライマーセットＩが、配列番号８のヌクレオチド配列のうちの１０塩基以上を含むフォーワードプライマーＩと、配列番号９のヌクレオチド配列のうちの１０塩基以上を含むリバースプライマーＩと、の組み合わせである、［２］又は［３］に記載の多剤耐性細菌検出方法。
［５］
プライマーセットＩＩが、配列番号６のヌクレオチド配列のうちの１０塩基以上にハイブリダイズするフォーワードプライマーＩＩと、配列番号７のヌクレオチド配列のうちの１０塩基以上にハイブリダイズするリバースプライマーＩＩと、の組み合わせである、［２］～［４］のうちのいずれか一項に記載の多剤耐性細菌検出方法。
［６］
プライマーセットＩＩが、配列番号１０のヌクレオチド配列のうちの１０塩基以上を含むフォーワードプライマーＩＩと、配列番号１１のヌクレオチド配列のうちの１０塩基以上を含むリバースプライマーＩＩと、の組み合わせである、［２］～［５］のうちのいずれか一項記載の多剤耐性細菌検出方法。
［７］
前記検出工程が、ｗｚｙ遺伝子の大腸菌Ｏ群血清型 Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｂｏｙｄｉｉ ９（ＯＳＢ９）特異的領域、ｗｚｘ遺伝子の大腸菌Ｏ群血清型１１６（Ｏ１１６）特異的領域、ｗｚｙ遺伝子の大腸菌Ｏ群血清型１３９（Ｏ１３９）特異的領域、ｗｚｙ遺伝子の大腸菌Ｏ群血清型１４７（Ｏ１４７）特異的領域、ｗｚｙ遺伝子の大腸菌Ｏ群血清型１４９（Ｏ１４９）特異的領域、Ｉｎｔｉｍｉｎをコードする遺伝子、エンテロトキシンＬＴをコードする遺伝子、Ｆ４線毛をコードする遺伝子、Ｆ１８線毛をコードする遺伝子、エンテロトキシンＳＴａをコードする遺伝子、エンテロトキシンＳＴｂをコードする遺伝子、志賀毒素Ｓｔｘ２ｅをコードする遺伝子、及びｇｙｒＢ遺伝子からなる第２群から選択される少なくとも１種の領域及び／又は遺伝子もさらに検出する工程である、［１］～［６］のうちのいずれか一項に記載の多剤耐性細菌検出方法。
［８］
前記検出工程が、前記試料由来の核酸を鋳型として、プライマーセットＩ及びプライマーセットＩＩからなる群から選択される少なくとも１種のプライマーセットと、第２群に含まれる領域又は遺伝子の少なくとも一部を増幅可能なプライマーの組み合わせであるプライマーセットのうちの少なくとも１種とを用いて、マルチプレックスＰＣＲを行なう工程を含む、［７］に記載の多剤耐性細菌検出方法。
［９］
下記（ｉ）－１～（ｉｉ）－１のプライマーセット：
（ｉ）－１ 配列番号１のヌクレオチド配列、配列番号１のヌクレオチド配列と８０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列、又は配列番号１のヌクレオチド配列の相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列からなる第１のコンセンサス領域の少なくとも一部を増幅可能なプライマーの組み合わせであるプライマーセットＩ、及び
（ｉｉ）－１ 配列番号２のヌクレオチド配列、配列番号２のヌクレオチド配列と８０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列、又は配列番号２のヌクレオチド配列の相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列からなる第２のコンセンサス領域の少なくとも一部を増幅可能なプライマーの組み合わせであるプライマーセットＩＩ
からなる群から選択される少なくとも１種のプライマーセットを含む、プライマーキット。
［１０］
プライマーセットＩが、配列番号４のヌクレオチド配列のうちの１０塩基以上にハイブリダイズするフォーワードプライマーＩと、配列番号５のヌクレオチド配列のうちの１０塩基以上にハイブリダイズするリバースプライマーＩと、の組み合わせである、［９］に記載のプライマーキット。
［１１］
プライマーセットＩが、配列番号８のヌクレオチド配列のうちの１０塩基以上を含むフォーワードプライマーＩと、配列番号９のヌクレオチド配列のうちの１０塩基以上を含むリバースプライマーＩと、の組み合わせである、［９］又は［１０］に記載のプライマーキット。
［１２］
プライマーセットＩＩが、配列番号６のヌクレオチド配列のうちの１０塩基以上にハイブリダイズするフォーワードプライマーＩＩと、配列番号７のヌクレオチド配列のうちの１０塩基以上にハイブリダイズするリバースプライマーＩＩと、の組み合わせである、［９］～［１１］のうちのいずれか一項に記載のプライマーキット。
［１３］
プライマーセットＩＩが、配列番号１０のヌクレオチド配列のうちの１０塩基以上を含むフォーワードプライマーＩＩと、配列番号１１のヌクレオチド配列のうちの１０塩基以上を含むリバースプライマーＩＩと、の組み合わせである、［９］～［１２］のうちのいずれか一項に記載のプライマーキット。
［１４］
ｗｚｙ遺伝子の大腸菌Ｏ群血清型 Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｂｏｙｄｉｉ ９（ＯＳＢ９）特異的領域、ｗｚｘ遺伝子の大腸菌Ｏ群血清型１１６（Ｏ１１６）特異的領域、ｗｚｙ遺伝子の大腸菌Ｏ群血清型１３９（Ｏ１３９）特異的領域、ｗｚｙ遺伝子の大腸菌Ｏ群血清型１４７（Ｏ１４７）特異的領域、ｗｚｙ遺伝子の大腸菌Ｏ群血清型１４９（Ｏ１４９）特異的領域、Ｉｎｔｉｍｉｎをコードする遺伝子、エンテロトキシンＬＴをコードする遺伝子、Ｆ４線毛をコードする遺伝子、Ｆ１８線毛をコードする遺伝子、エンテロトキシンＳＴａをコードする遺伝子、エンテロトキシンＳＴｂをコードする遺伝子、志賀毒素Ｓｔｘ２ｅをコードする遺伝子、及びｇｙｒＢ遺伝子からなる第２群から選択されるいずれかの領域又は遺伝子の少なくとも一部を増幅可能なプライマーの組み合わせであるプライマーセットのうちの少なくとも１種をさらに含む、［９］～［１３］のうちのいずれか一項に記載のプライマーキット。
［１５］
［１］～［８］のうちのいずれか一項に記載の多剤耐性細菌検出方法に用いるためのプライマーキットである、［９］～［１４］のうちのいずれか一項に記載のプライマーキット。

本発明によれば、多剤耐性細菌を簡便かつ迅速に検出可能な多剤耐性細菌検出方法、及びこれに好適に用いることができるプライマーキットを提供することが可能となる。さらに、本発明によれば多剤耐性細菌を簡便かつ迅速に検出可能であるため、他の指標（血清型、病原性関連遺伝子の有無等）の検出と組み合わせて検出を行なうことも容易となる。したがってこの場合、本発明によれば、試料中の細菌の性状として、多剤耐性に加えて、上記他の指標に関連する性状を複数網羅して検出し、簡便に把握することも可能となる。

本発明の方法の応用例の一態様を示す概念図である。 参考試験１で、各大腸菌群において、各抗菌剤に対して耐性であった菌の割合（耐性菌率［％］）を示すグラフである。 参考試験１で、各大腸菌群について、２４種類のうちの耐性があった抗菌剤数に対して分布する株の割合（分布率［％］）を示すグラフである。 試験１で、全９３５株について、２１種類のうちの耐性があった抗菌剤数に対して分布する株数（分布数［株］、上段）と、そのうち、ｇ２７７２３及びｇ３３０２６のうちの少なくともいずれかを保有する株の割合（１００分率［％］、下段）とを示すグラフである。 試験２で、ＰＣＲ－１のプライマーの組み合わせで得られたＰＣＲ産物の２％アガロースゲル電気泳動写真である。 試験２で、ＰＣＲ－２のプライマーの組み合わせで得られたＰＣＲ産物の２％アガロースゲル電気泳動写真である。

以下、本発明をその好適な実施形態に即して詳細に説明する。

＜多剤耐性細菌検出方法・判別方法＞
本発明の多剤耐性細菌検出方法は、試料中の多剤耐性細菌を検出する方法であり、下記（ｉ）～（ｉｉ）の遺伝子：
（ｉ）配列番号１のヌクレオチド配列、配列番号１のヌクレオチド配列と８０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列、又は配列番号１のヌクレオチド配列の相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列からなる第１のコンセンサス領域を含む遺伝子からなる群から選択される少なくとも１種の第１の遺伝子
（ｉｉ）配列番号２のヌクレオチド配列、配列番号２のヌクレオチド配列と８０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列、又は配列番号２のヌクレオチド配列の相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列からなる第２のコンセンサス領域を含む遺伝子からなる群から選択される少なくとも１種の第２の遺伝子
からなる群（本明細書中、場合により「第１群」という）から選択される少なくとも１種の遺伝子（以下、場合により「第１の遺伝子及び／又は第２の遺伝子）という）を検出する検出工程を含む方法（本明細書中、場合により単に「本発明の検出方法」という）である。

また、本発明は、細菌から第１の遺伝子及び／又は第２の遺伝子を検出する検出工程を含む、細菌の多剤耐性判別方法（本明細書中、場合により単に「本発明の判別方法」といい、「本発明の検出方法」と総称して、場合により単に「本発明の方法」という）も提供する。

［多剤耐性細菌］
本発明の検出方法で検出される「多剤耐性細菌」とは、少なくとも２以上の複数の抗菌剤（多剤）に対して耐性がある、すなわち感受性の低い細菌を示し、少なくとも２以上の複数の抗菌剤に対して耐性がある可能性が高い細菌も含む。

（細菌）
本発明に係る「細菌」とは、原核生物を示すが、他は特に制限されず、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｆｅｒｇｕｓｏｎｉｉ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（大腸菌）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ａｌｂｅｒｔｉｉ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｈｅｒｍａｎｎｉｉ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｍａｒｍｏｔａｅ）、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ属、Ｃｒｏｎｏｂａｃｔｅｒ属、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ属、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ属、Ｋｌｕｙｖｅｒａ属、Ｌｅｃｌｅｒｃｉａ属、Ｐｈｙｔｏｂａｃｔｅｒ属、Ｒａｏｕｌｔｅｌｌａ属、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ属、Ｓｅｒｒａｔｉａ属、Ｓｈｉｇｅｌｌａ属、Ｙｅｒｓｉｎｉａ属、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ属、Ｇｌａｅｓｓｅｒｅｌｌａ属、Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ属、Ｐｒｏｔｅｕｓ属、Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ属、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ属、Ｖｉｂｒｉｏ属、Ｅｄｗａｒｄｓｉｅｌｌａ属、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ属、Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ属、Ｂｉｂｅｒｓｔｅｉｎｉ属、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｌｕｓ属、Ａｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｈｉｓｔｏｐｈｉｌｌｕｓ属、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ属、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ属、Ｃｏｘｉｅｌｌａ属、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ属、Ｄｉｃｈｅｌｏｂａｃｔｅｒ属、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ属、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ属、Ｔａｙｌｏｒｅｌｌａ属、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ属、Ｌａｗｄｏｎｉａ属、Ｂｒｕｃｅｌｌａ属、Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ属、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ属、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ属、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ属、Ｐｏｒｐｈｙｌｏｍｏｎａｓ属、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ属、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ属、Ｂｒａｃｈｙｓｐｉｒａ属、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ属、Ｂｏｒｒｅｌｉａ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｍｅｌｉｓｓｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属、Ｌｉｓｔｅｒｉａ属、Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ属、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ属、Ｔｒｕｅｐｅｒｅｌｌａ属、Ｎｏｃａｒｄｉａ属、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ属、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ属が挙げられる。

これらの中でも、本発明の検出方法で検出される細菌及び本発明の判別方法で判別される細菌としては、下記の配列番号３で示される第１の遺伝子（ｇ２７７２３）が特に高い同一性（９５％以上、好ましくは９６％以上、９９％以上、又は１００％）で保存されている観点から、第１の遺伝子を検出する場合には、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ属、Ｃｒｏｎｏｂａｃｔｅｒ属、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ属、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ属、Ｋｌｕｙｖｅｒａ属、Ｌｅｃｌｅｒｃｉａ属、Ｐｈｙｔｏｂａｃｔｅｒ属、Ｒａｏｕｌｔｅｌｌａ属、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ属、Ｓｅｒｒａｔｉａ属、Ｓｈｉｇｅｌｌａ属、Ｙｅｒｓｉｎｉａ属に属する細菌からなる群から選択される少なくとも１種であることが好ましい。

また、下記の配列番号２で示される第２の遺伝子（ｇ３３０２６）が特に高い同一性（９５％以上、好ましくは９６％以上、９９％以上、又は１００％）で保存されている観点から、第２の遺伝子を検出する場合には、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ属、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ属、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ属、Ｇｌａｅｓｓｅｒｅｌｌａ属、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ属、Ｌｅｃｌｅｒｃｉａ属、Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ属、Ｐｒｏｔｅｕｓ属、Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ属、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｒａｏｕｌｔｅｌｌａ属、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ属、Ｓｅｒｒａｔｉａ属、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ属、Ｓｈｉｇｅｌｌａ属、Ｖｉｂｒｉｏ属に属する細菌からなる群から選択される少なくとも１種であることが好ましい。

これらの中でも、本発明の検出方法で検出される細菌及び本発明の判別方法で判別される細菌としては、下痢症や尿路感染症等の多様の感染症の原因として重要であるという観点から、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属に属する細菌からなる群から選択される少なくとも１種であることがより好ましく、大腸菌であることがさらに好ましい。

（抗菌剤）
前記抗菌剤としては、上記に挙げた細菌に対する抗菌剤として従来公知の剤が挙げられ、特に限定されないが、例えば、アンピシリン（ＡＢＰＣ）、ピペラシリン（ＰＩＰＣ）等のペニシリン系抗菌剤；セファゾリン（ＣＦＺ）等の第１世代セファロスポリン、セフロキシム（ＣＸＭ）等の第２世代セファロスポリン、セフォタキシム（ＣＴＸ）等の第３世代セファロスポリン、セフェピム（ＣＦＰＭ）等の第４世代セファロスポリンなどのセファロスポリン系抗菌剤；セフォキシチン（ＣＦＸ）等のセファマイシン系抗菌剤、モキサラクタム（ＬＭＯＸ）等のオキサセフェム系抗菌剤などのセフェム系抗菌剤；アズトレオナム（ＡＺＴ）等のモノバクタム系抗菌剤などのβ－ラクタム系抗菌剤；イミペネム（ＩＰＭ）、メロペネム（ＭＥＰＭ）等のカルバペネム系抗菌剤；ゲンタマイシン（ＧＭ）、カナマイシン（ＫＭ）、ストレプトマイシン（ＳＭ）、アプラマイシン（ＡＰＭ）等のアミノグリコシド系抗菌剤；テトラサイクリン（ＴＣ）等のテトラサイクリン系抗菌剤；クロラムフェニコール（ＣＰ）等のフェニコール系抗菌剤；ナリジクス酸（ＮＡ）等のキノロン系抗菌剤；シプロフロキサシン（ＣＰＦＸ）、レボフロキサシン（ＬＶＦＸ）、ガチフロキサシン（ＧＦＬＸ）等のフルオロキノロン系抗菌剤；ＳＴ合剤（スルフォメトキサゾール／トリメトプリム配合剤、ＳＴ）等の葉酸合成阻害剤；コリスチン（ＣＬ）等のポリペプチド系抗菌剤；ビコザマイシン（ＢＣＭ）；アジスロマイシン、エリスロマイシン等のマクロライド系抗菌剤；ホスホマイシン等のホスホマイシン系抗菌剤が挙げられる。これらの中でも、例えば、アンピシリン、ピペラシリン、セファゾリン、セフロキシム、セフォタキシム、セフェピム、セフォキシチン、モキサラクタム、アズトレオナム、イミペネム、メロペネム、ゲンタマイシン、カナマイシン、ストレプトマイシン、アプラマイシン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、ナリジクス酸、シプロフロキサシン、レボフロキサシン、ガチフロキサシン、ＳＴ合剤、コリスチン、ビコザマイシンが好ましい。

本発明において「多剤耐性」という場合には、上記に挙げた抗菌剤のうちの少なくとも２以上の剤に対して耐性がある、又は同耐性がある可能性があればよいが、かかる耐性としては、より好ましくは４以上、７以上、９以上、１１以上、又は１２以上の剤に対する耐性であることが好ましい。

また、前記細菌が前記抗菌剤に対して実際に「耐性」があるか否かは、従来公知の方法又はそれに準じた方法で適宜確認することができ、例えば、ＣＬＳＩ（Ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）ガイドラインやＥＵＣＡＳＴ（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｎ Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｓｕｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ Ｔｅｓｔｉｎｇ）ガイドラインに記載された寒天平板希釈法やＫｉｌｂｙ－Ｂａｕｅｒディスク拡散法等に従って薬剤耐性試験を行ない、寒天平板希釈法ではＣＬＳＩガイドラインやＥＵＣＡＳＴガイドラインに記載された抗菌剤濃度で生残した細菌を、Ｋｉｌｂｙ－Ｂａｕｅｒディスク拡散法ではＣＬＳＩガイドラインやＥＵＣＡＳＴガイドラインに記載された直径以下の阻止円を示す又は阻止円を形成しない細菌を、それぞれ当該抗菌剤に対して耐性であると判定することができる。

［試料］
本発明の検出方法の対象となる「試料」としては、前記細菌が存在し得る試料である限り特に制限はなく、例えば、各種生物（細胞、組織、器官、個体を含む）及びその抽出液；ヒト及び動物の体液（唾液、鼻腔吸引液、鼻腔拭い液、咽頭拭い液、うがい液、鼻汁、涙、汗、尿、喀痰、気管支肺胞洗浄液、血液、血清、血漿、髄液、リンパ液、精液、羊水等）や糞便；植物生体液；生物培養液；環境中の水（河川、湖沼、港湾、水路、地下水、浄水、下水、排水等）；固形物（土壌等）の懸濁液等を目的に応じて適宜用いることができる。例えば、前記細菌として大腸菌を検出する場合には、ヒト及び動物（例えば、チンパンジーやサル等の霊長類；牛、豚、馬、ニワトリ、ネコ、イヌ等の家畜、家禽や愛玩動物；シカ、イノシシ、アライグマ、イタチ、ネズミ、ハト等の野生動物や野鳥）の糞便を前記試料として用いることができる。

また、前記試料としては、粉砕や凍結等の処理がなされたものであっても、希釈液で適宜希釈又は懸濁したものであっても、適宜ｐＨ調整したものであってもよい。前記希釈液としては、例えば、水；生理食塩水；ナトリウムリン酸バッファー、ＴｒｉＳ緩衝液、リン酸緩衝液、グッド緩衝液等の緩衝液が挙げられる。さらに、前記試料としては、前記試料から必要に応じて単離して培養した細菌を含む培養細菌試料であってもよい。前記試料から目的の細菌を単離する方法や目的の細菌を培養する方法としては、適宜公知の方法を採用することができる。

本発明の判別方法の対象となる細菌としては、前記培養細菌試料の他、前記試料として挙げたものに含まれる細菌が挙げられ、本発明の判別方法には前記試料をそのまま供してもよい。

［第１の遺伝子、第２の遺伝子］
本発明の方法では、第１の遺伝子及び第２の遺伝子からなる第１群から選択される少なくとも１種の遺伝子を検出する。第１の遺伝子及び第２の遺伝子は、いずれも細菌のゲノムＤＮＡ上に存在する機能が未知の遺伝子であるが、本発明者は、この一方又は両方を有する大腸菌は有さない大腸菌よりも多剤耐性である確率が有意に高く、かつ、かかる遺伝子のヌクレオチド配列は他の細菌においても高い同一性（例えば、９５％以上、好ましくは９６％以上、９９％以上、又は１００％）で保存されていることを見出した。したがって、これら遺伝子を指標として検出することにより、多剤耐性である細菌又は多剤耐性の可能性が高い細菌を検出することや、細菌が多剤耐性である又は多剤耐性である可能性が高いか否かの判別をすることが可能となることを見出した。

（ｉ）第１の遺伝子
第１の遺伝子は、典型的には、配列番号３のヌクレオチド配列で示される遺伝子（本明細書中、場合により「ｇ２７７２３」ともいう）である。ｇ２７７２３のヌクレオチド配列は細菌間で広く保存されているが、特に、配列番号１のヌクレオチド配列からなる領域（コンセンサス領域）の同一性が細菌間で高く、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属と、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ属、Ｃｒｏｎｏｂａｃｔｅｒ属、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ属、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ属、Ｋｌｕｙｖｅｒａ属、Ｌｅｃｌｅｒｃｉａ属、Ｐｈｙｔｏｂａｃｔｅｒ属、Ｒａｏｕｌｔｅｌｌａ属、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ属、Ｓｅｒｒａｔｉａ属、及びＳｈｉｇｅｌｌａ属、Ｙｅｒｓｉｎｉａ属のそれぞれとの間で、同一性は９９～１００％である。したがって、本発明の方法で検出する第１の遺伝子は、典型的には、「（ｉａ）配列番号１のヌクレオチド配列からなる領域を含む遺伝子」である。

また、遺伝子のヌクレオチド配列は、その変異などにより、自然界において（好ましくは非人工的に）変異し得ることから、本発明においては、このような変異体も第１の遺伝子とすることができる。さらに、現在の技術水準においては、当業者であれば、例えば、配列番号１のヌクレオチド配列情報が得られた場合、そのヌクレオチド配列を改変することもできるため、このような改変体も第１の遺伝子としてよい。

したがって、本発明に係る第１の遺伝子の態様には、「（ｉｂ）配列番号１のヌクレオチド配列と８０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなる領域を含む遺伝子」も含まれる。ヌクレオチド配列の同一性は、例えば、ＢＬＡＳＴのプログラム（Ａｌｔｓｃｈｕｌら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５，１９９０年、ｐ．４０３－４１０）を用いて、パラメーター：例えばｓｃｏｒｅ＝１００、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝１２等で決定することができる。また、このときの配列番号１のヌクレオチド配列との同一性は、８０％以上であればよいが、好ましくは、８１％以上、８２％以上、８３％以上、８４％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、９９．１％以上、９９．２％以上、９９．３％以上、９９．４％以上、９９．５％以上、９９．６％以上、９９．７％以上、９９．８％以上、９９．９％以上である。

さらに、現在の技術水準においては、当業者であれば、例えば、配列番号１のヌクレオチド配列情報が得られた場合、そのヌクレオチド配列に基づいて、ハイブリダイゼーション技術（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，Ｅ．Ｍ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，９８：５０３－５１７，１９７５）や、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術（Ｓａｉｋｉ，Ｒ．Ｋ．，ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３０：１３５０－１３５４，１９８５、Ｓａｉｋｉ，Ｒ．Ｋ．ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：４８７－４９１，１９８８）等により、他の細菌から相同遺伝子を取得することが可能である。

したがって、本発明に係る第１の遺伝子の態様には、「（ｉｃ）配列番号１のヌクレオチド配列の相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列からなる領域を含む遺伝子」も含まれる。相同遺伝子を単離するためには、通常、ストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーション反応を行なう。「ストリンジェントな条件」とは、ハイブリダイゼーション後のメンブレンの洗浄操作を、高温下、低塩濃度溶液中で行なうことを示し、かかる条件としては、例えば、２×ＳＳＣ濃度（１×ＳＳＣ：１５ｍＭクエン酸３ナトリウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウム）、０．５％ ＳＤＳ溶液中で６０℃、２０分間の洗浄条件が挙げられる。また、ハイブリダイゼーションは、例えば、公知であるＥＣＬダイレクトＤＮＡ／ＲＮＡラベリング・検出システム（ＧＥヘルスケア バイオサイエンス株式会社製）に添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。ハイブリダイゼーションの条件が厳しくなるほど、高い同一性を有するＤＮＡの単離を期待し得る。ただし、上記の条件は例示であり、ＤＮＡの濃度、ＤＮＡの長さ、ハイブリダイゼーションの反応時間等を適宜組み合わせることにより、必要な厳密性（ストリンジェンシー）を実現することが可能である。

本明細書中、（ｉａ）配列番号１のヌクレオチド配列からなる領域、（ｉｂ）配列番号１のヌクレオチド配列と８０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなる領域、及び（ｉｃ）配列番号１のヌクレオチド配列の相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列からなる領域をそれぞれ、「第１のコンセンサス領域」という。

（ｉｉ）第２の遺伝子
第２の遺伝子は、典型的には、配列番号２のヌクレオチド配列で示される遺伝子（本明細書中、場合により「ｇ３３０２６」ともいう）である。ｇ３３０２６のヌクレオチド配列は細菌間で広く保存されており、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属と、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ属、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ属、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ属、Ｇｌａｅｓｓｅｒｅｌｌａ属、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ属、Ｌｅｃｌｅｒｃｉａ属、Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ属、Ｐｒｏｔｅｕｓ属、Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ属、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｒａｏｕｌｔｅｌｌａ属、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ属、Ｓｅｒｒａｔｉａ属、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ属、Ｓｈｉｇｅｌｌａ属、Ｖｉｂｒｉｏ属のそれぞれとの間で、同一性は９６～１００％である。したがって、本発明の方法で検出する第２の遺伝子は、典型的には、「（ｉｉａ）配列番号２のヌクレオチド配列からなる領域を含む遺伝子」である。

また、第１の遺伝子と同様の観点で、本発明に係る第２の遺伝子の態様には、「（ｉｉｂ）配列番号２のヌクレオチド配列と８０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなる領域を含む遺伝子」も含まれる。このときの配列番号２のヌクレオチド配列との同一性は、８０％以上であればよいが、好ましくは、８１％以上、８２％以上、８３％以上、８４％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、９９．１％以上、９９．２％以上、９９．３％以上、９９．４％以上、９９．５％以上、９９．６％以上、９９．７％以上、９９．８％以上、９９．９％以上である。

さらに、第１の遺伝子と同様の観点で、本発明に係る第２の遺伝子の態様には、「（ｉｉｃ）配列番号２のヌクレオチド配列の相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列からなる領域を含む遺伝子」も含まれる。「ストリンジェントな条件」としては、第１の遺伝子に記載のとおりである。

本明細書中、（ｉｉａ）配列番号２のヌクレオチド配列からなる領域、（ｉｉｂ）配列番号２のヌクレオチド配列と８０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなる領域、及び（ｉｉｃ）配列番号２のヌクレオチド配列の相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列からなる領域をそれぞれ、「第２のコンセンサス領域」という。

［第１の遺伝子、第２の遺伝子の検出］
本発明において、第１の遺伝子及び第２の遺伝子を検出する方法としては、それぞれ独立に、従来公知の方法又はそれに準じた方法を適宜適用することができ、特に制限はないが、例えば、下記の方法が挙げられる。なお、本発明において遺伝子の検出とは、原則として、ゲノムＤＮＡ上の遺伝子を検出することを意味するが、転写レベルや翻訳レベルでの間接的な検出であってもよい。

第１の遺伝子及び第２の遺伝子の検出方法の態様としては、例えば、前記試料中の細菌（本発明の検出方法の場合）や前記細菌（本発明の判別方法の場合）の全ゲノムＤＮＡのヌクレオチド配列を決定する方法が挙げられる。この態様においては、先ず、対象の試料や細菌からＤＮＡ試料を調製する。ＤＮＡ試料としては、ゲノムＤＮＡ試料、及びｍＲＮＡからの逆転写によって調製されるｃＤＮＡ試料が挙げられる。前記試料や細菌からゲノムＤＮＡ又はｍＲＮＡを抽出する方法、及びｃＤＮＡを調製する方法としては特に制限はなく、それぞれ公知の方法又はそれに準じた方法を適宜採用することができ、例えば、ボイル法、アルカリボイル法、ＳＤＳフェノール法、市販の核酸抽出・精製キットを用いる方法を採用できる。次いで、調製したゲノムＤＮＡやｃＤＮＡからＤＮＡライブラリを作成し、次世代シーケンサー等を用いて全ゲノムＤＮＡのヌクレオチド配列を決定する。得られたシーケンスデータから、例えば、配列番号１のヌクレオチド配列又は配列番号２のヌクレオチド配列をクエリーとして、第１の遺伝子又は第２の遺伝子の有無を検出することができる。

前記検出方法の他の態様としては、例えば、第１の遺伝子及び第２の遺伝子、又はその発現産物（すなわち、当該遺伝子から転写されたｍＲＮＡ若しくは前記ｍＲＮＡを鋳型とするｃＤＮＡ）に特異的に結合可能なプローブ分子を用いて前記遺伝子又はその発現産物（以下、場合により「標的ヌクレオチド」という）を検出する方法が挙げられる。

この態様においては、例えば、前記プローブ分子として、前記標的ヌクレオチドの塩基配列中の適切な位置にハイブリダイズするように設計したオリゴヌクレオチドプローブを用い、サザンブロッティング、ノーザンブロッティング、ドットブロット、ＲＮａｓｅプロテクションアッセイ、ＤＮＡマイクロアレイ解析法、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法等によって、前記標的ヌクレオチドを検出する方法が挙げられる。

この場合には、例えば、前記オリゴヌクレオチドプローブとして、標識物質によって標識されたものを用い、当該標識物質に応じたシグナルを検出することにより、前記標的ヌクレオチドを検出（すなわち、第１の遺伝子又は第２の遺伝子を検出）することができる。このときの標識物質としては、例えば、ＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート）、ＦＡＭ（フルオレセインアミダイト）、ＤＥＡＣ（７－（ジエチルアミノ）クマリン）、Ｒ６Ｇ（ローダミン６Ｇ）、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ、Ｃｙ５、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ（商品名）等の蛍光物質；β－Ｄ－グルコシダ―ゼ、ルシフェラーゼ、ＨＲＰ（ホースラディッシュペルオキシダーゼ）等の酵素；^３Ｈ、^１４Ｃ、^３２Ｐ、^３５Ｓ、^１２３Ｉ等の放射性同位体；ビオチン、ストレプトアビジン等の親和性物質；ルミノール、ルシフェリン、ルシゲニン等の発光物質が挙げられる。

なお、本発明において、「シグナル」には、呈色（発色）、反射光、発光、消光、蛍光、放射性同位体による放射線等が含まれ、肉眼で確認できるものの他、シグナルの種類に応じた測定方法・装置によって確認できるものも含まれる。

また、例えば、前記プローブ分子として、前記標的ヌクレオチド中の適切な位置を挟み込むように設計したオリゴヌクレオチドプライマーを用い、前記試料や細菌由来の核酸を鋳型として、ＰＣＲ、ＲＴ－ＰＣＲ、ＴＲＣ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｃｏｎｃｅｒｔｅｄ）、ＮＡＳＢＡ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ－Ｂａｓｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、ＴＭＡ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ－Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）等の核酸増幅によって、前記標的ヌクレオチドを増幅して検出する方法も挙げられる。

この場合には、例えば、得られた増幅産物を、蛍光色素（例えば、エチジウムブロマイド、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ（商品名）、ＳＹＴＯ６３（商品名）等）、他の蛍光物質（ＦＩＴＣ、ＦＡＭ、ＤＥＡＣ、Ｒ６Ｇ、ＴｅｘＲｅｄ、Ｃｙ５、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ等）、放射性同位体（^３Ｈ、^１４Ｃ、^３２Ｐ、^３５Ｓ、^１２３Ｉ等）、発光物質（ルミノール、ルシフェリン、ルシゲニン等）等の標識物質で標識し、前記標識物質に応じたシグナルを検出することにより、前記標的ヌクレオチドを検出（すなわち、第１の遺伝子又は第２の遺伝子を検出）することができる。また、前記オリゴヌクレオチドプローブと組み合わせて検出してもよい（ダブルダイプローブ法等）。さらに、前記増幅産物を含む反応後液を直接シーケンサーに供して解析することにより、前記標的ヌクレオチドを検出してもよい。

このようなオリゴヌクレオチドプローブ及びオリゴヌクレオチドプライマーは、当業者であれば、前記標的ヌクレオチドの配列（好ましくは、配列番号１のヌクレオチド配列又は配列番号２のヌクレオチド配列）に基づいて、公知の方法又はそれに準じた方法で設計することができる。前記オリゴヌクレオチドプローブ及びオリゴヌクレオチドプライマーの長さとしては、それぞれ独立に、１０塩基以上であることが好ましく、通常は、１５～１００塩基であり、好ましくは１７～３０塩基であり、より好ましくは２０～２７塩基である。

前記オリゴヌクレオチドプローブ及びオリゴヌクレオチドプライマーは、例えば、市販のオリゴヌクレオチド合成機により合成することができる。また、天然のヌクレオチド（デオキシリボヌクレオチド及び／又はリボヌクレオチド）のみから構成されていなくともよく、例えば、ＰＮＡ（ｐｏｌｙａｍｉｄｅ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）、ＬＮＡ（登録商標、ｌｏｃｋｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）、ＥＮＡ（登録商標、２’－Ｏ，４’－Ｃ－Ｅｔｈｙｌｅｎｅ－ｂｒｉｄｇｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ）等の非天然型のヌクレオチドにてその一部又は全部が構成されていてもよい。

（核酸増幅）
本発明に係る第１の遺伝子及び第２の遺伝子の検出方法としては、上記の中でも、前記オリゴヌクレオチドプライマー（本明細書中、場合により単に「プライマー」という）を用いて前記標的ヌクレオチドを増幅（核酸増幅）して検出する方法であることが好ましく、ＰＣＲにより検出する方法であることがより好ましい。

このような核酸増幅の方法として、本発明の方法においてより具体的には、前記試料や細菌由来の核酸を鋳型として、
（ｉ）－１ 第１のコンセンサス領域の少なくとも一部を増幅可能なプライマーの組み合わせであるプライマーセットＩ、及び
（ｉｉ）－１ 第２のコンセンサス領域の少なくとも一部を増幅可能なプライマーの組み合わせであるプライマーセットＩＩ
からなる群から選択される少なくとも１種のプライマーセットを用いる方法が好ましく、プライマーセットＩ及びプライマーセットＩＩを用いてマルチプレックスＰＣＲを行なう方法がさらに好ましい。

〔プライマーセット〕
第１のコンセンサス領域及び第２のコンセンサス領域において、プライマーセットＩ及びプライマーセットＩＩによって増幅する範囲は、それぞれ独立に、各領域内の一部分であっても、全範囲であってもよい。また、１つのプライマーセットにおいては、それぞれ各領域上の互いに異なる２つの部位（以下、場合により「プライマー設計部位」という）にそれぞれハイブリダイズするように２つのプライマーを設計するが、１つのプライマーセットに係る前記プライマー設計部位としては、互いに一部重複していてもよい。このようなプライマー設計部位は、増幅産物サイズ、これにハイブリダイズするプライマーの特異性や増幅効率等を考慮して、当業者であれば適宜設定することができる。

第１のコンセンサス領域において、増幅する範囲の塩基数、すなわち、増幅産物サイズに対応する塩基数（ｂｐ）としては、５０～８４４塩基であることが好ましく、１００～８００塩基であることがより好ましく、２００～７００塩基であることがさらに好ましい。また、第２のコンセンサス領域において、増幅する範囲の塩基数、すなわち、増幅産物サイズに対応する塩基数（ｂｐ）としては、５０～５４３塩基であることが好ましく、１００～５００塩基であることがより好ましく、２００～４８０塩基であることがさらに好ましい。ただし、第１の遺伝子及び第２の遺伝子を同時に検出する場合、プライマーセットＩ及びプライマーセットＩＩによって増幅する範囲としては、互いに異なる塩基数の範囲、すなわち、核酸増幅で得られる増幅産物サイズ（ｂｐ）が互いに異なるようにすることが好ましい。

これらの中でも、第１のコンセンサス領域及び第２のコンセンサス領域において、プライマーセットＩ及びプライマーセットＩＩで増幅するように選択する範囲として好ましくは、特に非特異反応が低減され、各領域の核酸増幅による増幅効率が高い傾向にある観点から、それぞれ、以下の範囲：
（ｉ）－２ 第１のコンセンサス領域では、配列番号１のヌクレオチド配列上の、配列番号４のヌクレオチド配列の５’端の塩基～配列番号５のヌクレオチド配列の３’端までに含まれる範囲、又はこの範囲に対応する範囲
（ｉｉ）－２ 第２のコンセンサス領域では、配列番号２のヌクレオチド配列上の、配列番号６のヌクレオチド配列の５’端の塩基～配列番号７のヌクレオチド配列の３’端までに含まれる範囲、又はこの範囲に対応する範囲
が挙げられる。

このとき、第１のコンセンサス領域及び第２のコンセンサス領域のプライマー設計部位にそれぞれハイブリダイズするように設計するプライマーセットとして好ましくは、それぞれ、以下のプライマーセット：
（ｉ）－３ 第１のコンセンサス領域では、配列番号４のヌクレオチド配列のうちの１０塩基以上（好ましくは１５塩基以上、１７塩基以上、又は２０塩基以上）にハイブリダイズするフォーワードプライマーＩと、配列番号５のヌクレオチド配列のうちの１０塩基以上（好ましくは１５塩基以上、１７塩基以上、又は２０塩基以上）にハイブリダイズするリバースプライマーＩと、の組み合わせであるプライマーセットＩ、
（ｉｉ）－３ 第２のコンセンサス領域では、配列番号６のヌクレオチド配列のうちの１０塩基以上（好ましくは１５塩基以上、１７塩基以上、又は２０塩基以上）にハイブリダイズするフォーワードプライマーＩＩと、配列番号７のヌクレオチド配列のうちの１０塩基以上（好ましくは１５塩基以上、１７塩基以上、又は２０塩基以上）にハイブリダイズするリバースプライマーＩＩと、の組み合わせであるプライマーセットＩＩ
が挙げられる。

なお、本発明において、プライマーが前記プライマー設計部位に対して「ハイブリダイズする」には、プライマーが前記プライマー設計部位のセンス鎖（例えば、配列番号１のヌクレオチド配列又は配列番号２のヌクレオチド配列上）にハイブリダイズすることに加えて、その相補鎖にハイブリダイズすることも含む。

また、本発明において、プライマーが前記プライマー設計部位に対して「ハイブリダイズする」とは、当該プライマーの少なくとも一部と前記プライマー設計部位とが二本鎖を形成可能なヌクレオチド配列であればよく、完全に相補的でなくともよい。本発明において、かかるハイブリダイズの条件としては、当該プライマーと前記プライマー設計部位とのヌクレオチド配列の配列相補性が、８０％以上、９０％以上、９５％以上、（例えば、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上）であることが好ましい。なお、前記配列相補性は、公知の手法（例えば、ＢＬＡＳＴのプログラム）を用いて適宜計算することができる。また、本発明において、前記ハイブリダイズの条件としては、前記プライマーのヌクレオチド配列が、前記プライマー設計部位のヌクレオチド配列の全長に対して完全に相補的なヌクレオチド配列の１～複数個所において、連続して１～５塩基（好ましくは１～３塩基、例えば、３塩基、２塩基、１塩基）の塩基が挿入、欠失、又は置換されたものであってもよい。

このようなプライマーを構成するヌクレオチド配列は、上記ハイブリダイズの条件を満たすように、前記プライマー設計部位のヌクレオチド配列に合わせて、より好ましくは他の部位や他のプライマーにハイブリダイズすることがないように、また、ＧＣ含量が互いに近くかつ好ましい範囲内になるように、当業者であれば適宜設計することができる。

前記各プライマーの塩基数としては、それぞれ独立に、１０塩基以上であることが好ましく、１５～３０塩基であることがより好ましく、１７～３０塩基であることがより好ましく、２０～２７塩基であることがさらに好ましい。

このようなプライマーセットとして、より具体的には、以下のプライマーセット：
（ｉ）－４ プライマーセットＩとしては、配列番号８のヌクレオチド配列のうちの１０塩基以上（好ましくは１５塩基以上、１７塩基以上、又は２０塩基以上）を含むフォーワードプライマーＩと、配列番号９のヌクレオチド配列のうちの１０塩基以上（好ましくは１５塩基以上、１７塩基以上、又は２０塩基以上）を含むリバースプライマーＩと、の組み合わせ
（ｉｉ）－４ プライマーセットＩＩとしては、配列番号１０のヌクレオチド配列のうちの１０塩基以上（好ましくは１５塩基以上、１７塩基以上、又は２０塩基以上）を含むフォーワードプライマーＩＩと、配列番号１１のヌクレオチド配列のうちの１０塩基以上（好ましくは１５塩基以上、１７塩基以上、又は２０塩基以上）を含むリバースプライマーＩＩと、の組み合わせ
が挙げられる。

これらの中でも、第１の遺伝子及び第２の遺伝子を同時に検出する場合には、プライマーが他の部位や他のプライマーにハイブリダイズすることがない、電気泳動等による各増幅産物の区別がより明確となる、各核酸増幅による増幅効率が互いに同等になるといった観点から、前記プライマーセットとしては、上記の（ｉ）－３～４のいずれかと（ｉｉ）－３～４のいずれかとの組み合わせであることが好ましく、（ｉ）－４と（ｉｉ）－４との組み合わせであることより好ましい。

各プライマーセットによれば、上記のように菌株間で数塩基の欠失、挿入等による個体差は生じ得るため、それぞれ次の増幅産物：
（ｉ）－５ 例えば、配列番号８のヌクレオチド配列からなるフォーワードプライマーＩ（ｇ２７７２３－Ｆ－プライマー）と、配列番号９のヌクレオチド配列からなるリバースプライマーＩ（ｇ２７７２３－Ｒ－プライマー）と、の組み合わせであるプライマーセットＩによれば、配列番号１のヌクレオチド配列上の、配列番号４のヌクレオチド配列の５’端の塩基～配列番号５のヌクレオチド配列の３’端までの範囲（５８３塩基）、又はこの範囲に対応する範囲（好ましくは、５３３～６０３塩基）が増幅された増幅産物；
（ｉｉ）－５ 例えば、配列番号１０のヌクレオチド配列からなるフォーワードプライマーＩＩ（ｇ３３０２６－Ｆ－プライマー）と、配列番号１１のヌクレオチド配列からなるリバースプライマーＩＩ（ｇ３３０２６－Ｒ－プライマー）と、の組み合わせであるプライマーセットＩＩによれば、配列番号２のヌクレオチド配列上の、配列番号６のヌクレオチド配列の５’端の塩基～配列番号７のヌクレオチド配列の３’端までの範囲（４７３塩基）、又はこの範囲に対応する範囲（好ましくは、４２３～４９３塩基）が増幅された増幅産物；
が得られる。

上記において、ヌクレオチド配列の各範囲に「対応する」範囲とは、ＢＬＡＳＴのプログラム等を用いて（例えば、パラメータ：デフォルト値（すなわち初期設定値））、ヌクレオチド配列を整列させた際に、対照の範囲と同列になるヌクレオチド配列の範囲のことである。

〔増幅反応〕
本発明に係る核酸増幅において、増幅反応としては、特に制限されず、従来公知の方法又はそれに準じた方法で適宜実施することができ、例えば、先ず、対象の試料や細菌から核酸試料を調製する。核酸試料としては、試料や細菌から抽出したＤＮＡを含むＤＮＡ試料、ｍＲＮＡを含むｍＲＮＡ試料、ｍＲＮＡからの逆転写によって調製されるｃＤＮＡ試料が挙げられる。前記試料や細菌からＤＮＡ又はｍＲＮＡを抽出する方法、及びｃＤＮＡを調製する方法としては特に制限はなく、上述のとおりである。次いで、例えばＰＣＲの場合には、調製した核酸試料に、プライマーセットＩ及び／又はプライマーセットＩＩ、並びに、相補鎖合成酵素（例えば、ＤＮＡポリメラーゼ）を添加して、熱変性、アニール、及び伸長反応を複数サイクル繰り返すことにより、対象の試料や細菌中に目的の第１の遺伝子及び／又は第２の遺伝子が存在する場合には、第１のコンセンサス領域及び／又は第１のコンセンサス領域に前記プライマーがハイブリダイズし、前記プライマーセットに挟まれる領域を鋳型としてヌクレオチド断片が合成され、かかるヌクレオチド断片が増幅された増幅産物を得ることができる。

本発明に係る核酸増幅における相補鎖合成酵素の種類、反応液の組成、反応温度、時間、及びサイクル数等の反応条件としては、特に制限なく適宜選択することができ、市販のＰＣＲキット等を用いてもよい。

〔増幅産物の検出〕
前記増幅反応で得られた増幅産物は、適宜公知の方法又はそれに準じた方法で検出することができる。これにより、目的の第１の遺伝子及び／又は第２の遺伝子を検出することが可能となり、間接的にこれら遺伝子を有する細菌を検出することが可能となる。

前記増幅産物の検出方法としては、例えば、アガロースゲル等の電気泳動によって前記増幅産物を分離して検出する方法；前記増幅産物にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブが固定された基板を用いて測定するＤＮＡアレイ法；高速液体クロマトグラフィー同位体希釈質量分析法（ＬＣ－ＩＤＭＳ）；誘導結合プラズマ発光分析法（ＩＣＰ－ＯＥＳ）；誘導結合プラズマ質量分析法（ＩＣＰ－ＭＳ）；原子吸光分光法（Ａｔｏｍｉｃ Ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ、ＡＡＳ）等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。得られた増幅産物は、それぞれ、例えば、上記の標識物質で標識し、当該標識物質に応じたシグナルを検出する方法で確認することができる。

前記増幅産物の検出方法としては、上記の方法に限定されず、また、上記の方法のうちの２以上の方法や従来公知の方法を適宜組み合わせてもよい。中でも、本発明に係るプライマーセット（プライマーセットＩ及び／又はプライマーセットＩＩ）を用いる場合には、特に容易に増幅産物の分離が可能であることから、前記検出方法としては、前記電気泳動により前記増幅産物を分離する工程を含むことが好ましい。この場合には、例えば、アガロースゲル（例えば２％）のゲルに、得られた増幅産物を電気泳動し、前記蛍光色素で染色して、分離された増幅産物のバンドの有無を蛍光によって確認することで、目的の増幅産物の有無、すなわち、目的の第１の遺伝子及び／又は第２の遺伝子の有無、つまり、これら遺伝子を有する細菌の有無を検出することができる。

第１の遺伝子及び／又は第２の遺伝子を保有する細菌は高い確率で多剤耐性細菌である傾向にあることから、本発明の検出方法において、目的の増幅産物が検出された場合には、対象の試料中に多剤耐性細菌が存在する、又は多剤耐性である可能性が高い細菌が存在すると判定することができる。すなわち、本発明の検出方法には、試料中から実際に多剤耐性細菌である細菌を検出する方法に加えて、試料中から多剤耐性細菌である可能性が高い細菌を検出する方法（スクリーニング方法）も含む。

また、本発明の判別方法において、目的の増幅産物が検出された場合、すなわち、対象の細菌から第１の遺伝子及び／又は第２の遺伝子が検出された場合には、その細菌が多剤耐性である、又は多剤耐性である可能性が高いと判別することができる。

ここで、「多剤耐性である可能性が高い」とは、好ましくは、任意の細菌群（例えば、ｎ≧５０）を第１の遺伝子及び／又は第２の遺伝子を有する細菌群と第１の遺伝子及び第２の遺伝子のいずれも有さない細菌群とに分け、さらに、２１種類の抗菌剤（例えば、アンピシリン、ピペラシリン、セファゾリン、セフロキシム、セフォタキシム、セフェピム、セフォキシチン、モキサラクタム、アズトレオナム、イミペネム、メロペネム、ゲンタマイシン、カナマイシン、ストレプトマイシン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、ナリジクス酸、シプロフロキサシン、レボフロキサシン、ガチフロキサシン、ＳＴ合剤）のうち、２以上の剤（好ましくは、４以上、７以上、９以上、１１以上、又は１２以上の剤）に対して実際に耐性がある細菌群と実際に耐性がない細菌群とに分けた場合に、フィッシャーの正確確率検定で、第１の遺伝子及び／又は第２の遺伝子を有する細菌群と上記の２以上の剤に対して実際に耐性がある細菌群との間に関連がある、すなわち、ｐが０．０５未満、好ましくは０．０１未満、より好ましくは０．００１未満となる有意差があることをいう。

さらに、本発明の検出方法及び判別方法としては、検出した又は判別した細菌が実際に多剤耐性であることを確認する確認工程をさらに含んでいてもよく、このような確認工程としては、例えば、上記の寒天平板希釈法やＫｉｌｂｙ－Ｂａｕｅｒディスク拡散法等の薬剤耐性試験を行なう工程が挙げられる。

［その他の指標］
本発明の方法においては、上記の第１の遺伝子及び／又は第２の遺伝子の検出に加えて、細菌の性状把握においてより多観点での情報を網羅する観点から、他の病原因子に関連する遺伝子領域及び／又は遺伝子等も、細菌の各性状の指標として検出することができる。このような領域や遺伝子としては特に制限されないが、例えば、以下のものが挙げられる。

（大腸菌Ｏ群血清型特異的領域）
細菌の血清型は、従来からその性状と関連が高い指標として用いられており、その細胞表面に存在する抗原の型（分子構造）によって決定される。大腸菌では、鞭毛の構造に基づくＨ抗原やリポポリサッカライドの構造に基づくＯ（オー）抗原がその性状を示す指標として知られている。本明細書では、かかる大腸菌のＯ抗原性の違いによる分類を「Ｏ群血清型」という。リポポリサッカライドは脂質及び糖鎖から構成され、さらにその糖鎖部分はコア多糖とＯ側鎖多糖と呼ばれる部分から構成されている。このＯ側鎖多糖がＯ抗原性を担っており、３～５個の単糖が組み合わさった基本構造が４～４０程度回繰り返された構造を有する。かかるリポポリサッカライドの糖鎖構造は遺伝子によって直接的にはコードされていないが、糖鎖合成経路に依存していることから、かかる糖鎖合成に関与するタンパク質をコードする遺伝子の各Ｏ群血清型に特異的な領域を検出対象とすることにより、当該血清型の細菌を検出することができる。

前記糖鎖合成に関与するタンパク質としては、糖鎖ユニットの輸送及び鎖状に関与するＷｚｘ、Ｗｚｙ、Ｗｚｍ、Ｗｚｔ等が挙げられ、これらのタンパク質をコードする遺伝子（ｗｚｘ遺伝子、ｗｚｙ遺伝子、ｗｚｍ遺伝子、ｗｚｔ遺伝子等）において、各Ｏ群血清型に特異的な領域（大腸菌Ｏ群血清型特異的領域）としては、例えば、Ｉｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，５３，Ｎｕｍｂｅｒ ８，ｐ．２４２７－２４３２（２０１５）、及びＩｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，５８，Ｉｓｓｕｅ １１，ｅ０１４９３－２０（２０２０）に記載の各プライマーセットで増幅される領域が挙げられる。

これらの中でも、本発明の方法で検出する領域としては、病原性大腸菌が示すＯ群血清型（例えば、ＯＳＢ９、Ｏ１１６、Ｏ１３９、Ｏ１４７、Ｏ１４９、Ｏ８、Ｏ１４１、Ｏ２、Ｏ９、Ｏ８６、Ｏ４５、Ｏ１２１、Ｏ１４２、Ｏ１８０、Ｏ３５、Ｏ１０３、Ｏ１５７、Ｏ９８、Ｏ１３８、Ｏ１１５）に特異的な領域であることが好ましく、これらのうちの１種であっても２種以上であってもよいが、より具体的には、例えば、ｗｚｙ遺伝子のＯＳＢ９特異的領域、ｗｚｘ遺伝子のＯ１１６特異的領域、ｗｚｙ遺伝子のＯ１３９特異的領域、ｗｚｙ遺伝子のＯ１４７特異的領域、及びｗｚｙ遺伝子のＯ１４９特異的領域からなる群から選択される少なくとも１種の領域が好ましい。

（毒素産生関連遺伝子）
病原性細菌は、主に毒素や毒性因子（アフェシン）を産生することで感染したヒトや動物に疾患を引き起こす。したがって、細菌の性状を示す好ましい指標としては、かかる毒素産生に関与する遺伝子（毒素産生関連遺伝子）の有無も挙げられる。

このような毒素産生関連遺伝子としては、従来公知のものが挙げられ、特に制限されないが、例えば、易熱性エンテロトキシンＬＴをコードする遺伝子、ＬＴ２をコードする遺伝子；耐熱性エンテロトキシンＳＴａをコードする遺伝子、ＳＴｂをコードする遺伝子、ＥＡＳＴ１をコードする遺伝子；志賀毒素Ｓｔｘ２ｅをコードする遺伝子、Ｓｔｘ１をコードする遺伝子が挙げられ、これらのうちの１種であっても２種以上であってもよい。これらの遺伝子のヌクレオチド配列は、例えば、Ｇｅｎ Ｂａｎｋ（ＮＣＢＩ）等の公共のデータベースより取得可能である。

これらの中でも、本発明の方法で検出する遺伝子としては、例えば、エンテロトキシンＬＴをコードする遺伝子、エンテロトキシンＳＴａをコードする遺伝子、エンテロトキシンＳＴｂをコードする遺伝子、及び志賀毒素Ｓｔｘ２ｅをコードする遺伝子からなる群から選択される少なくとも１種の遺伝子が好ましい。

（表面タンパク質関連遺伝子）
また、病原性細菌の性状としては、宿主（ヒトや動物）への感染力の強さも重要であり、前記宿主への感染は、腸上皮細胞等への接着によって起こる。したがって、細菌の性状を示す好ましい指標としては、かかる表面タンパク質に関与する遺伝子（表面タンパク質関連遺伝子）の有無も挙げられる。

このような表面タンパク質関連遺伝子としては、従来公知のものが挙げられ、特に制限されないが、例えば、Ｉｎｔｉｍｉｎをコードする遺伝子（ｅａｅ遺伝子）；Ｆ４線毛をコードする遺伝子、Ｆ１８線毛をコードする遺伝子、Ｆ５線毛をコードする遺伝子、Ｆ６線毛をコードする遺伝子、Ｆ４１線毛をコードする遺伝子等の線毛をコードする遺伝子が挙げられ、これらのうちの１種であっても２種以上であってもよい。これらの遺伝子のヌクレオチド配列も、例えば、Ｇｅｎ Ｂａｎｋ（ＮＣＢＩ）等の公共のデータベースより取得可能である。

これらの中でも、本発明の方法で検出する遺伝子としては、例えば、Ｉｎｔｉｍｉｎをコードする遺伝子、Ｆ４線毛をコードする遺伝子、及びＦ１８線毛をコードする遺伝子からなる群から選択される少なくとも１種の遺伝子が好ましい。

（ハウスキーピング遺伝子）
病原性細菌の検出に際しては、検出の精度の確認（細菌自体の存在の有無の確認、反応完了確認、検出試薬の調製ミスの有無の確認、検出装置の故障の有無の確認等）を目的として、全ての細菌が共通して有する遺伝子も合わせて検出することが好ましい。このような遺伝子としては、例えば、ハウスキーピング遺伝子（ＧＡＰＤＨをコードする遺伝子、ｆｕｓＡ遺伝子、ｇｙｒＢ遺伝子、ｈｓｐ６０遺伝子、ｉｌｅＳ遺伝子、ｐｙｒＧ遺伝子、ｒｅｃＡ遺伝子、ｒｅｃＧ遺伝子等）、リボゾーム遺伝子（１６Ｓリボゾーム遺伝子、２３Ｓリボゾーム遺伝子）が挙げられ、これらのうちの１種であっても２種以上であってもよい。これらの遺伝子のヌクレオチド配列も、例えば、Ｇｅｎ Ｂａｎｋ（ＮＣＢＩ）等の公共のデータベースより取得可能である。

これらの中でも、本発明の方法で検出する遺伝子としては、ハウスキーピング遺伝子（例えば、ｇｙｒＢ遺伝子）が好ましい。

上記のその他の指標、好ましくは、ｗｚｙ遺伝子のＯＳＢ９特異的領域、ｗｚｘ遺伝子のＯ１１６特異的領域、ｗｚｙ遺伝子のＯ１３９特異的領域、ｗｚｙ遺伝子のＯ１４７特異的領域、ｗｚｙ遺伝子のＯ１４９特異的領域、Ｉｎｔｉｍｉｎをコードする遺伝子、エンテロトキシンＬＴをコードする遺伝子、Ｆ４線毛をコードする遺伝子、Ｆ１８線毛をコードする遺伝子、エンテロトキシンＳＴａをコードする遺伝子、エンテロトキシンＳＴｂをコードする遺伝子、志賀毒素Ｓｔｘ２ｅをコードする遺伝子、及びｇｙｒＢ遺伝子からなる群（本明細書中、場合により「第２群」という）から選択される少なくとも１種の領域及び／又は遺伝子（より好ましくは、第２群から選択される５種以上、さらに好ましくは７種以上の領域及び／又は遺伝子）の検出方法としては、特に制限されず、それぞれ独立に、上記の第１の遺伝子、第２の遺伝子の検出で挙げた方法を適宜採用することができる。

（マルチプレックスＰＣＲ）
本発明の方法において、第１の遺伝子及び／又は第２の遺伝子（第１群の遺伝子）の検出と共に、上記のその他の指標（好ましくは、第２群の領域及び／又は遺伝子）の検出を行なう場合には、特に簡便に検出可能であるという観点から、上述の核酸増幅を行なうことことが好ましく、前記試料由来の核酸を鋳型として、プライマーセットＩ及びプライマーセットＩＩからなる群から選択される少なくとも１種のプライマーセットと、第２群に含まれる領域又は遺伝子の少なくとも一部を増幅可能なプライマーセットのうちの少なくとも１種とを用いてマルチプレックスＰＣＲを行なうことがさらに好ましい。

以下、第１群及び第２群の遺伝子及び／又は領域についてマルチプレックスＰＣＲを行なう場合の一態様を例に挙げて説明するが、これに限定されるものではない。

〔プライマーセット〕
第２群の領域及び遺伝子において、１つのプライマーセット（すなわち、互いに異なる２つの部位（プライマー設計部位）にそれぞれハイブリダイズするプライマーの組み合わせ）によって増幅する範囲は、それぞれ独立に、各領域又は遺伝子内の一部分であっても、全範囲であってもよい。

また、第２群の領域及び遺伝子において、増幅する範囲の塩基数、すなわち、マルチプレックスＰＣＲで得られる増幅産物サイズ（ＰＣＲ産物サイズ（ｂｐ））としては、第１群の遺伝子に対するプライマーセットで増幅する範囲の塩基数と合わせて、互いに異なる塩基数であればよく、互いに異なる数で、５０～１５００塩基であることが好ましく、１００～１０００塩基であることがより好ましく、１１０～９９０塩基であることがさらに好ましい。

このようなプライマーセットを設計するプライマー設計部位、及びそれに対応するプライマーのヌクレオチド配列は、それぞれ、特に制限はなく、上記の増幅する範囲（塩基数）の条件を満たすように、上記ハイブリダイズの条件を満たすように、好ましくは各プライマーが他の部位や他のプライマーにハイブリダイズすることがないように（非特異反応が低減されるように）、また、ＧＣ含量が互いに近くかつ好ましい範囲内になるように、当業者であれば適宜選択、設計することができる。

前記各プライマーの塩基数としては、それぞれ独立に、１０塩基以上であることが好ましく、１５～３０塩基であることがより好ましく、１７～３０塩基であることがより好ましく、２０～２７塩基であることがさらに好ましい。

このようなプライマーセットとして、より具体的には、第１群及び第２群の領域又は遺伝子において、プライマーが他の部位や他のプライマーにハイブリダイズすることがない、電気泳動等による各増幅産物の区別がより明確となる、各核酸増幅による増幅効率が互いに同等になるといった観点から、例えば、以下のプライマーセット：
ｗｚｙ遺伝子のＯＳＢ９特異的領域に対しては、配列番号１２のヌクレオチド配列からなるフォーワードプライマー（Ｏｇ９－Ｆ－プライマー）と、配列番号１３のヌクレオチド配列からなるリバースプライマー（Ｏｇ９－Ｒ－プライマー）と、の組み合わせ、
ｗｚｘ遺伝子のＯ１４９特異的領域に対しては、配列番号１４のヌクレオチド配列からなるフォーワードプライマー（Ｏｇ１４９－Ｆ－プライマー）と、配列番号１５のヌクレオチド配列からなるリバースプライマー（Ｏｇ１４９－Ｒ－プライマー）と、の組み合わせ、
ｗｚｙ遺伝子のＯ１３９特異的領域に対しては、配列番号３２のヌクレオチド配列からなるフォーワードプライマー（Ｏｇ１３９－Ｆ－プライマー）と、配列番号３３のヌクレオチド配列からなるリバースプライマー（Ｏｇ１３９－Ｒ－プライマー）と、の組み合わせ、
ｗｚｙ遺伝子のＯ１４７特異的領域に対しては、配列番号３０のヌクレオチド配列からなるフォーワードプライマー（Ｏｇ１４７－Ｆ－プライマー）と、配列番号３１のヌクレオチド配列からなるリバースプライマー（Ｏｇ１４７－Ｒ－プライマー）と、の組み合わせ、
ｗｚｙ遺伝子のＯ１１６特異的領域に対しては、配列番号２２のヌクレオチド配列からなるフォーワードプライマー（Ｏｇ１１６－Ｆ－プライマー）と、配列番号２３のヌクレオチド配列からなるリバースプライマー（Ｏｇ１１６－Ｒ－プライマー）と、の組み合わせ、
Ｉｎｔｉｍｉｎをコードする遺伝子（ｅａｅ遺伝子）に対しては、配列番号１６のヌクレオチド配列からなるフォーワードプライマー（ｅａｅ－Ｆ－プライマー）と、配列番号１７のヌクレオチド配列からなるリバースプライマー（ｅａｅ－Ｒ－プライマー）と、の組み合わせ、
エンテロトキシンＬＴをコードする遺伝子に対しては、配列番号１８のヌクレオチド配列からなるフォーワードプライマー（ＬＴ－Ｆ－プライマー）と、配列番号１９のヌクレオチド配列からなるリバースプライマー（ＬＴ－Ｒ－プライマー）と、の組み合わせ、
Ｆ４線毛をコードする遺伝子に対しては、配列番号２４のヌクレオチド配列からなるフォーワードプライマー（Ｆ４－Ｆ－プライマー）と、配列番号２５のヌクレオチド配列からなるリバースプライマー（Ｆ４－Ｒ－プライマー）と、の組み合わせ、
Ｆ１８線毛をコードする遺伝子に対しては、配列番号２８のヌクレオチド配列からなるフォーワードプライマー（Ｆ１８－Ｆ－プライマー）と、配列番号２９のヌクレオチド配列からなるリバースプライマー（Ｆ１８－Ｒ－プライマー）と、の組み合わせ、
エンテロトキシンＳＴａをコードする遺伝子に対しては、配列番号２０のヌクレオチド配列からなるフォーワードプライマー（ＳＴａ－Ｆ－プライマー）と、配列番号２１のヌクレオチド配列からなるリバースプライマー（ＳＴａ－Ｒ－プライマー）と、の組み合わせ、
エンテロトキシンＳＴｂをコードする遺伝子に対しては、配列番号３４のヌクレオチド配列からなるフォーワードプライマー（ＳＴｂ－Ｆ－プライマー）と、配列番号３５のヌクレオチド配列からなるリバースプライマー（ＳＴｂ－Ｒ－プライマー）と、の組み合わせ、
志賀毒素Ｓｔｘ２ｅをコードする遺伝子に対しては、配列番号３６のヌクレオチド配列からなるフォーワードプライマー（Ｓｔｘ２ｅ－Ｆ－プライマー）と、配列番号３７のヌクレオチド配列からなるリバースプライマー（Ｓｔｘ２ｅ－Ｒ－プライマー）と、の組み合わせ、
ｇｙｒＢ遺伝子に対しては、配列番号２６のヌクレオチド配列からなるフォーワードプライマー（ＧｙｒＢ－Ｆ－プライマー）と、配列番号２７のヌクレオチド配列からなるリバースプライマー（ＧｙｒＢ－Ｒ－プライマー）と、の組み合わせ、
が挙げられる。

上記の各プライマーセットによれば、上記のように菌株間で数塩基の欠失、挿入等による個体差は生じ得るため、それぞれ次の増幅産物：
ｗｚｙ遺伝子のＯＳＢ９特異的領域では、好ましくは１００～１０００塩基（例えば９２３塩基）が増幅された増幅産物、
ｗｚｘ遺伝子のＯ１４９特異的領域では、好ましくは１００～１０００塩基（例えば７１７塩基）が増幅された増幅産物、
ｗｚｙ遺伝子のＯ１３９特異的領域では、好ましくは１００～１０００塩基（例えば２８９塩基）が増幅された増幅産物、
ｗｚｙ遺伝子のＯ１４７特異的領域では、好ましくは１００～１０００塩基（例えば３９４塩基）が増幅された増幅産物、
ｗｚｙ遺伝子のＯ１１６特異的領域では、好ましくは１００～１０００塩基（例えば１５９塩基）が増幅された増幅産物、
Ｉｎｔｉｍｉｎをコードする遺伝子（ｅａｅ遺伝子）では、好ましくは１００～１０００塩基（例えば３４５塩基）が増幅された増幅産物、
エンテロトキシンＬＴをコードする遺伝子では、好ましくは１００～１０００塩基（例えば２８６塩基）が増幅された増幅産物、
Ｆ４線毛をコードする遺伝子では、好ましくは１００～８５２塩基（例えば７８６塩基）が増幅された増幅産物、
Ｆ１８線毛をコードする遺伝子では、好ましくは１００～５１３塩基（例えば５１０塩基）が増幅された増幅産物、
エンテロトキシンＳＴａをコードする遺伝子では、好ましくは１００～２１９塩基（例えば２１２塩基）が増幅された増幅産物、
エンテロトキシンＳＴｂをコードする遺伝子では、好ましくは１００～２１６塩基（例えば２１１塩基）が増幅された増幅産物、
志賀毒素Ｓｔｘ２ｅをコードする遺伝子では、好ましくは１００～１０００塩基（例えば１４３塩基）が増幅された増幅産物、
ｇｙｒＢ遺伝子では、好ましくは１００～１０００塩基（例えば６２５塩基）が増幅された増幅産物、
が得られる。

前記プライマーセットの組み合わせとしては、特に制限されず、第２群に含まれる領域又は遺伝子の少なくとも一部を増幅可能なプライマーセットのうちの１種以上（好ましくは５種以上、さらに好ましくは７種以上）と、プライマーセットＩ及び／又はプライマーセットＩＩと、を目的に応じて適宜組み合わせることができる。マルチプレックスＰＣＲの方法や反応条件、及び増幅産物の検出方法としては、これら複数のプライマーセットを用いること以外は、上記の増幅反応及び増幅産物の検出において述べた方法と同様である。

これにより、対象の試料又は細菌中に目的の領域又は遺伝子、すなわち目的の指標が存在する場合には、これに前記プライマーがハイブリダイズし、前記プライマーセットに挟まれる領域を鋳型としてヌクレオチド断片が合成され、かかるヌクレオチド断片が増幅された増幅産物（ＰＣＲ産物）を得ることができる。前記プライマーセットとして、例えば第１群又は第２群の領域若しくは遺伝子の検出のための全１５種（例えば８種と７種とに分けてもよい）のプライマーセットを用いたマルチプレックスＰＣＲによれば、前記試料又は細菌中に全１５種の領域又は遺伝子が存在する場合には、互いに異なるサイズの１５種の増幅産物を得ることができる。

［本発明の方法の応用］
本発明の方法によって第１の遺伝子及び／又は第２の遺伝子を検出することで、検出された又は判別された細菌について多剤耐性の傾向にあるか否かという情報を得ることができ、様々な用途に用いることができる。

さらに、本発明の方法によって、第１の遺伝子及び／又は第２の遺伝子と他の指標とを組み合わせて検出した場合には、検出された又は判別された細菌について、第１の遺伝子及び／又は第２の遺伝子の検出の有無による多剤耐性の傾向にあるか否かという情報に加えて、他の指標に基づく情報、例えば、Ｏ群血清型、毒素産生関連遺伝子の有無、表面タンパク質関連遺伝子等の情報を同時に得ることができる。

このような本発明の方法の応用の一態様としては、例えば、上記のマルチプレックスＰＣＲを行ない、その増幅産物の検出方法として、電気泳動等によって増幅産物を分離して検出する方法を採用することにより、増幅産物のバンドパターンと、得られた細菌の情報（例えば、前記指標で示される多剤耐性、Ｏ群血清型、毒素産生関連遺伝子の有無、表面タンパク質関連遺伝子等の他、その細菌の分離年や分離地域等）とを紐づけすることが可能となる。さらに、このように紐づけされたデータをデータ集として蓄積しておき、ある時、ある地点で新たな細菌が分離された場合には、かかる細菌についても上記のマルチプレックスＰＣＲを行ない、得られたバンドパターンを、蓄積されたデータ集に照会して比較することで、容易に、その新たに分離された細菌又はそれに近い細菌の過去の発生年や分布状況等を含めた性状を把握することが可能となる（図１）。これにより例えば、より迅速に多剤耐性細菌に対する対策を立てることができ、感染の拡大を抑制することも可能となる。

＜プライマーキット＞
本発明は、下記（ｉ）－１～（ｉｉ）－１のプライマーセット：
（ｉ）－１ 配列番号１のヌクレオチド配列、配列番号１のヌクレオチド配列と８０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列、又は配列番号１のヌクレオチド配列の相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列からなる第１のコンセンサス領域の少なくとも一部を増幅可能なプライマーの組み合わせであるプライマーセットＩ
（ｉｉ）－１ 配列番号２のヌクレオチド配列、配列番号２のヌクレオチド配列と８０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列、又は配列番号２のヌクレオチド配列の相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列からなる第２のコンセンサス領域の少なくとも一部を増幅可能なプライマーの組み合わせであるプライマーセットＩＩ
からなる群から選択される少なくとも１種のプライマーセットを含む、プライマーキットも提供する。本発明のプライマーキットに含まれるプライマーセットＩ及びプライマーセットＩＩとしては、それぞれ、その好ましい態様も含めて、上述したとおりである。

また、本発明のプライマーキットとしては、ｗｚｙ遺伝子のＯＳＢ９特異的領域、ｗｚｘ遺伝子のＯ１１６特異的領域、ｗｚｙ遺伝子のＯ１３９特異的領域、ｗｚｙ遺伝子のＯ１４７特異的領域、ｗｚｙ遺伝子のＯ１４９特異的領域、Ｉｎｔｉｍｉｎをコードする遺伝子、エンテロトキシンＬＴをコードする遺伝子、Ｆ４線毛をコードする遺伝子、Ｆ１８線毛をコードする遺伝子、エンテロトキシンＳＴａをコードする遺伝子、エンテロトキシンＳＴｂをコードする遺伝子、志賀毒素Ｓｔｘ２ｅをコードする遺伝子、及びｇｙｒＢ遺伝子からなる第２群から選択されるいずれかの領域又は遺伝子の少なくとも一部を増幅可能なプライマーの組み合わせであるプライマーセットのうちの少なくとも１種をさらに含むことも好ましい。これらのプライマーセットとしても、それぞれ、その好ましい態様も含めて、上述したとおりである。

本発明のプライマーキットは、上記の本発明の検出方法及び判別方法に好適に用いることができる。本発明のプライマーキットに含まれる各プライマーとしては、それぞれ、緩衝液、安定剤、保存剤、防腐剤等の他の成分が添加してあってもよい。また、本発明のプライマーキットとしては、前記試料の希釈液；核酸を抽出、精製するための試薬；核酸増幅（ＰＣＲ、マルチプレックスＰＣＲ等）に必要な酵素、緩衝液、ｐＨ調整剤等の試薬；検出工程に必要な試薬；標準核酸；使用説明書等をさらに備えていてもよい。

以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

＜参考試験１＞ 薬剤耐性の解析
１９９９年～２０１９年に日本国内の３１都道府県で大腸菌症や浮腫病の豚から分離された大腸菌１，７０８株について、下記の表１に記載の２４種類の抗菌剤に対する薬剤耐性を試験した。表１に記載の抗菌剤のうち、ＣＬ、ＡＰＭ、及びＢＣＭについては、ＣＬＳＩ（Ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）ガイドラインやＥＵＣＡＳＴ（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｎ Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｓｕｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ Ｔｅｓｔｉｎｇ）ガイドラインに記載された寒天平板希釈法に従って試験を行ない、それぞれ、各ガイドラインに記載された抗菌剤濃度で生残した大腸菌を当該抗菌剤に対して耐性であると判定した。それ以外の２１種類の抗菌剤については、Ｋｉｌｂｙ－Ｂａｕｅｒディスク拡散法（ＣＬＳＩガイドライン、ＥＵＣＡＳＴガイドライン）に従って試験を行ない、それぞれ、各ガイドラインに記載された直径以下の阻止円を示した又は阻止円を形成しなかった大腸菌を当該抗菌剤に対して耐性であると判定した。下記の表１に、薬剤耐性の試験に用いた２４種類の抗菌剤の略号、名称、及び系統分類を示す。

試験した大腸菌のうち、Ｏ群血清型が病原性大腸菌の主要なＯ群血清型であるＯ１３９（ｎ＝４４１）、Ｏ１４９（ｎ＝３４８）、Ｏ１１６（ｎ＝２３３）、及びＯＳＢ９（ｎ＝１３３）の各大腸菌群、Ｏ群血清型が判別不能な大腸菌群（ＯＵＴ、ｎ＝１３７）、及び前記以外の大腸菌群（Ｏｔｈｅｒｓ、ｎ＝４１６）において、各抗菌剤に対して耐性であった菌の割合（耐性菌率［％］）を示すグラフを図２に示す。また、これら各大腸菌群について、２４種類のうちの耐性があった抗菌剤数に対して分布する株の割合（分布率［％］）を示すグラフを図３に示す。図２に示したように、病原性大腸菌Ｏ１３９、Ｏ１４９、Ｏ１１６、及びＯＳＢ９、特にＯ１１６及びＯＳＢ９で、各抗菌剤（例えば、ＧＭ、ＣＰＦＸ、ＬＶＦＸ、ＧＦＬＸ）に対する耐性菌率が高くなった。なお、これらの病原性大腸菌における耐性菌率は、健康豚由来（非病原性）大腸菌と比較してかなり高値であった。さらに、図３に示したように、これらの病原性大腸菌（特に、Ｏ１１６及びＯＳＢ９等）は複数の剤に対して耐性を示す分布となり、多剤耐性傾向が強かった。

＜参考試験２＞ 全ゲノム解析
上記の参考試験１の大腸菌１，７０８株より、分離された都道府県、分離年、遺伝子型が異なる２９６株を選抜した。これら各株を培養して菌体を回収し、ＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いてゲノムＤＮＡを抽出した。得られたゲノムＤＮＡからＩｌｌｕｍｉｎａ社のＴｒｕＳｅｑ ＤＮＡ ＮａｎｏによりＤＮＡライブラリを調製し、Ｉｌｌｕｍｉｎａ社のＨｉＳｅｑ Ｘ Ｔｅｎ システムを用いて、ペアエンド法により、全ゲノムシーケンスを行った。得られたシーケンスデータについて、プログラムＰｌａｔａｎｕｓ－Ｂを用いてドラフトゲノム配列を取得し、得られたドラフトゲノム配列をＤＦＡＳＴ（ｈｔｔｐｓ：／／ｄｆａｓｔ．ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ／）及びプログラムＲｏａｒｙで解析したころ、同定された既知薬剤耐性遺伝子は、７９種類、のべ３，１３０個であった。

＜試験１＞ 多剤耐性細菌特異的遺伝子の選抜
先ず、上記の参考試験１の大腸菌１，７０８株より選抜する株を９３５株に増やし、参考試験２と同様にして、全ゲノムシーケンスを行った。得られたシーケンスデータについて、プログラムＰｌａｔａｎｕｓ－Ｂを用いてドラフトゲノム配列を取得し、得られたドラフトゲノム配列をＤＦＡＳＴ（ｈｔｔｐｓ：／／ｄｆａｓｔ．ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ／）及びプログラムＲｏａｒｙで解析し、薬剤耐性遺伝子であるか否かを問わず、全９３５株に存在する５０，３１８個の遺伝子を同定した。

次いで、９３５株のうち、上記の参考試験１で耐性であった抗菌剤数が９以上の株（以下、「多剤耐性菌株（９）」という）が有意に保有する遺伝子を探索した。なお、参考試験１の結果としては、表１に記載の抗菌剤のうち、２１種類の抗菌剤（ＡＢＰＣ、ＰＩＰＣ、ＣＦＺ、ＣＸＭ、ＣＴＸ、ＣＦＰＭ、ＣＦＸ、ＬＭＯＸ、ＡＺＴ、ＩＰＭ、ＭＥＰＭ、ＧＭ、ＫＭ、ＳＭ、ＴＣ、ＣＰ、ＮＡ、ＣＰＦＸ、ＬＶＦＸ、ＧＦＬＸ、ＳＴ）に対する試験結果を用いた。具体的には、先ず、上記で同定した５０，３１８遺伝子より、プログラムＳｃｏａｒｙを用いて、その遺伝子を保有している多剤耐性菌株（９）の数が多い２０個の遺伝子を選抜した。次いで、選抜した２０個の遺伝子のうち、１～３個の遺伝子を選抜した場合に、そのうち１個以上の遺伝子を保有する株の分布が、多剤耐性菌株（９）の集団において最大化する遺伝子の組み合わせを検討した。その結果、多剤耐性菌株（９）の７５％（さらには、上記の参考試験１で耐性であった抗菌剤数が１２以上の株の９７．４％）が一方又は両方を保有する２つの遺伝子として、配列番号３のヌクレオチド配列で示される遺伝子（ｇ２７７２３）及び配列番号２のヌクレオチド配列で示される遺伝子（ｇ３３０２６）を見出した。下記の表２に、全９３５株において、耐性があった抗菌剤数とｇ２７７２３及び／又はｇ３３０２６を保有する株の割合、並びに、ｇ２７７２３及びｇ３３０２６をいずれも保有しない株（非保有）の割合との関係を示す。また、図４に、全９３５株について、２１種類のうちの耐性があった抗菌剤数に対して分布する株数（分布数［株］、上段）と、そのうち、ｇ２７７２３及びｇ３３０２６のうちの少なくともいずれかを保有する株の割合（１００分率［％］、下段）とを示す。

表２に示したように、９～１７剤の抗菌剤に耐性を示した株の７５．０％が、ｇ２７７２３及び／又はｇ３３０２６を保有しており（感度７５．０％）、０～８剤の抗菌剤にしか耐性を示さなかった株の７７．２％は、ｇ２７７２３及びｇ３３０２６のいずれも保有していなかった（特異度７７．２％）。また、１２～１７剤の抗菌剤に耐性を示した株の９７．４％が、ｇ２７７２３及び／又はｇ３３０２６を保有しており（感度９７．４％）、０～１１剤の抗菌剤にしか耐性を示さなかった株の７０．０％は、ｇ２７７２３及びｇ３３０２６のいずれも保有していなかった（特異度７０．０％）。９～１７剤の抗菌剤に耐性を示した株とｇ２７７２３及び／又はｇ３３０２６の保有率との間、並びに、１２～１７剤の抗菌剤に耐性を示した株とｇ２７７２３及び／又はｇ３３０２６の保有率との間には、どちらも、それぞれ高い相関が認められた（フィッシャーの正確確率検定においてｐ＜０．００１）。また、図４に示したように、これら２種の遺伝子の一方又は両方を保有する株は、複数の剤に対して耐性を示す分布となった。これらより、ｇ２７７２３及びｇ３３０２６は、多剤耐性菌株に特異的な遺伝子であることが確認された。

＜試験２＞ 多剤耐性菌の検出（実施例）
（プライマーの設計）
上記で見出した２遺伝子（ｇ２７７２３、ｇ３３０２６）を増幅するためのプライマーセットをそれぞれ作成した。作成したプライマーセットのプライマー及びそのヌクレオチド配列を示す配列番号を下記の表３に示す。また、表３には、大腸菌において各プライマーセットで増幅され得るヌクレオチド断片の期待されるサイズ（ＰＣＲ産物サイズ（ｂｐ））も合わせて示す。

また、ｗｚｙ遺伝子又はｗｚｘ遺伝子の、病原性大腸菌の主要なＯ群血清型であるＯＳＢ９、Ｏ１１６、Ｏ１３９、Ｏ１４７、及びＯ１４９に特異的領域；最近の病原性鑑定で検査されている主要な指標である、Ｉｎｔｉｍｉｎをコードする遺伝子（ｅａｅ遺伝子）、エンテロトキシンＬＴをコードする遺伝子（下記の表中、ＬＴ）、エンテロトキシンＳＴａをコードする遺伝子（下記の表中、Ｓｔａ）、Ｆ４線毛をコードする遺伝子（下記の表中、Ｆ４）、Ｆ１８線毛をコードする遺伝子（下記の表中、Ｆ１８）、エンテロトキシンＳＴｂをコードする遺伝子（下記の表中、ＳＴｂ）、及び志賀毒素Ｓｔｘ２ｅをコードする遺伝子（下記の表中、Ｓｔｘ２ｅ）；ハウスキーピング遺伝子であるｇｙｒＢ遺伝子についても、これらを特異的に増幅するためのプライマーを作成した。作成したプライマーセットのプライマー及びそのヌクレオチド配列を示す配列番号を下記の表４及び表５に示す。表４～５には、大腸菌において各プライマーセットで増幅され得るヌクレオチド断片の期待されるサイズ（ＰＣＲ産物サイズ（ｂｐ））も合わせて示す。

表４～５に記載のプライマーのうち、ｗｚｙ遺伝子のＯＳＢ９特異的領域、ｗｚｙ遺伝子のＯ１４９特異的領域、ｗｚｘ遺伝子のＯ１１６特異的領域、ｗｚｙ遺伝子のＯ１４７特異的領域、ｗｚｙ遺伝子のＯ１３９特異的領域、及びｇｙｒＢ遺伝子に対するプライマーは、それぞれ、Ｉｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，５３，Ｎｕｍｂｅｒ ８，ｐ．２４２７－２４３２（２０１５）若しくはＩｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，５８，Ｉｓｓｕｅ １１，ｅ０１４９３－２０（２０２０）に記載のプライマー又はその鎖長を変更したものであり、Ｉｎｔｉｍｉｎをコードする遺伝子、エンテロトキシンＬＴをコードする遺伝子、Ｆ４線毛をコードする遺伝子、及びＦ１８線毛をコードする遺伝子に対するプライマーは、それぞれ、Ｖｕ－Ｋｈａｃ ｅｔ ａｌ．，Ｖｅｔ．Ｊ．，１７４，ｐ１７６－１８７（２００７）に記載のプライマー又はその鎖長を変更したものであり、エンテロトキシンＳＴａをコードする遺伝子、エンテロトキシンＳＴｂをコードする遺伝子、及び志賀毒素Ｓｔｘ２ｅをコードする遺伝子に対するプライマーは、それぞれ、本発明者が新規に作成したものである。

（マルチプレックスＰＣＲ）
豚より分離した、実際に耐性のある抗菌剤が既知の多剤耐性大腸菌８株（２１種類の抗菌剤（ＡＢＰＣ、ＰＩＰＣ、ＣＦＺ、ＣＸＭ、ＣＴＸ、ＣＦＰＭ、ＣＦＸ、ＬＭＯＸ、ＡＺＴ、ＩＰＭ、ＭＥＰＭ、ＧＭ、ＫＭ、ＳＭ、ＴＣ、ＣＰ、ＮＡ、ＣＰＦＸ、ＬＶＦＸ、ＧＦＬＸ、ＳＴ）のうち、株番号１は１１剤に対して耐性；株番号２は９剤に対して耐性；株番号３は１１剤に対して耐性；株番号４は１３剤に対して耐性；株番号５は７剤に対して耐性；株番号６は７剤に対して耐性；株番号７は１５剤に対して耐性；株番号８は９剤に対して耐性）を培養して菌体を回収し、アルカリボイル法を用いてＤＮＡを抽出し、鋳型ＤＮＡとした。ＤＮＡポリメラーゼ（ＫＯＤ ＦＸ、東洋紡株式会社製）１Ｕ、ｄＮＴＰｓ各０．４ｍＭ、プライマー各０．３μＭ、鋳型ＤＮＡ １００ｎｇを含む５０μＬの反応液を調製し、９４℃で１２０秒熱変性させた後、熱変性：９８℃で１０秒、アニール：５５℃で３０秒、伸長反応：６８℃で６０秒を３０サイクルの条件で、核酸増幅反応（ＰＣＲ）を行なった。プライマーは、表３及び表４に記載のプライマーの組み合わせ（プライマーセット８セット：ＰＣＲ－１）と、表５に記載のプライマーの組み合わせ（プライマーセット７セット：ＰＣＲ－２）とに分けてそれぞれ行った。得られたＰＣＲ産物を２％アガロースゲル中で電気泳動することにより、そのサイズを確認した。

ＰＣＲ－１のプライマーの組み合わせ及びＰＣＲ－２のプライマーの組み合わせで得られたＰＣＲ産物の２％アガロースゲル電気泳動写真を、図５Ａ及び図５Ｂにそれぞれ示す。図５Ａ及び図５Ｂ中、レーンＭは１００ｂｐラダーマーカーを示し、レーン１～８は大腸菌の株番号（図５Ａ及び図５Ｂで共通）を示す。このように、ｇ２７７２３及び／又はｇ３３０２６を指標とすることで、多剤耐性である大腸菌（特に株番号１（１１剤耐性）、３（１１剤耐性）、４（１３剤耐性）、７（１５剤耐性）、８（９剤耐性））を迅速に検出可能であり、また、他の指標（血清型、毒素産生関連遺伝子、表面タンパク質関連遺伝子等）と組み合わせて、より多面的観点から多剤耐性細菌を検出したり細菌の情報を得ることも簡便に可能である。

以上説明したように、本発明によれば、多剤耐性細菌を簡便かつ迅速に検出可能な多剤耐性細菌検出方法、及びこれに好適に用いることができるプライマーキットを提供することが可能となる。

配列番号：８
＜２２３＞ ｇ２７７２３－Ｆ－プライマー
配列番号：９
＜２２３＞ ｇ２７７２３－Ｒ－プライマー
配列番号：１０
＜２２３＞ ｇ３３０２６－Ｆ－プライマー
配列番号：１１
＜２２３＞ ｇ３３０２６－Ｒ－プライマー
配列番号：１２
＜２２３＞ Ｏｇ９－Ｆ－プライマー
配列番号：１３
＜２２３＞ Ｏｇ９－Ｒ－プライマー
配列番号：１４
＜２２３＞ Ｏｇ１４９－Ｆ－プライマー
配列番号：１５
＜２２３＞ Ｏｇ１４９－Ｒ－プライマー
配列番号：１６
＜２２３＞ ｅａｅ－Ｆ－プライマー
配列番号：１７
＜２２３＞ ｅａｅ－Ｒ－プライマー
配列番号：１８
＜２２３＞ ＬＴ－Ｆ－プライマー
配列番号：１９
＜２２３＞ ＬＴ－Ｒ－プライマー
配列番号：２０
＜２２３＞ ＳＴａ－Ｆ－プライマー
配列番号：２１
＜２２３＞ ＳＴａ－Ｒ－プライマー
配列番号：２２
＜２２３＞ Ｏｇ１１６－Ｆ－プライマー
配列番号：２３
＜２２３＞ Ｏｇ１１６－Ｒ－プライマー
配列番号：２４
＜２２３＞ Ｆ４－Ｆ－プライマー
配列番号：２５
＜２２３＞ Ｆ４－Ｒ－プライマー
配列番号：２６
＜２２３＞ ＧｙｒＢ－Ｆ－プライマー
配列番号：２７
＜２２３＞ ＧｙｒＢ－Ｒ－プライマー
配列番号：２８
＜２２３＞ Ｆ１８－Ｆ－プライマー
配列番号：２９
＜２２３＞ Ｆ１８－Ｒ－プライマー
配列番号：３０
＜２２３＞ Ｏｇ１４７－Ｆ－プライマー
配列番号：３１
＜２２３＞ Ｏｇ１４７－Ｒ－プライマー
配列番号：３２
＜２２３＞ Ｏｇ１３９－Ｆ－プライマー
配列番号：３３
＜２２３＞ Ｏｇ１３９－Ｒ－プライマー
配列番号：３４
＜２２３＞ ＳＴｂ－Ｆ－プライマー
配列番号：３５
＜２２３＞ ＳＴｂ－Ｒ－プライマー
配列番号：３６
＜２２３＞ Ｓｔｘ２ｅ－Ｆ－プライマー
配列番号：３７
＜２２３＞ Ｓｔｘ２ｅ－Ｒ－プライマー

Claims (15)

1. 試料中の多剤耐性細菌を検出する方法であり、下記（ｉ）～（ｉｉ）の遺伝子：
   （ｉ）配列番号１のヌクレオチド配列、配列番号１のヌクレオチド配列と８０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列、又は配列番号１のヌクレオチド配列の相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列からなる第１のコンセンサス領域を含む遺伝子からなる群から選択される少なくとも１種の第１の遺伝子
   （ｉｉ）配列番号２のヌクレオチド配列、配列番号２のヌクレオチド配列と８０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列、又は配列番号２のヌクレオチド配列の相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列からなる第２のコンセンサス領域を含む遺伝子からなる群から選択される少なくとも１種の第２の遺伝子
   からなる第１群から選択される少なくとも１種の遺伝子を検出する検出工程を含むことを特徴とする、多剤耐性細菌検出方法。
2. 前記検出工程が、前記試料由来の核酸を鋳型として、
   第１のコンセンサス領域の少なくとも一部を増幅可能なプライマーの組み合わせであるプライマーセットＩ、及び
   第２のコンセンサス領域の少なくとも一部を増幅可能なプライマーの組み合わせであるプライマーセットＩＩ
   からなる群から選択される少なくとも１種のプライマーセットを用いて核酸増幅を行なう工程を含むことを特徴とする、請求項１に記載の多剤耐性細菌検出方法。
3. プライマーセットＩが、配列番号４のヌクレオチド配列のうちの１０塩基以上にハイブリダイズするフォーワードプライマーＩと、配列番号５のヌクレオチド配列のうちの１０塩基以上にハイブリダイズするリバースプライマーＩと、の組み合わせであることを特徴とする、請求項２に記載の多剤耐性細菌検出方法。
4. プライマーセットＩが、配列番号８のヌクレオチド配列のうちの１０塩基以上を含むフォーワードプライマーＩと、配列番号９のヌクレオチド配列のうちの１０塩基以上を含むリバースプライマーＩと、の組み合わせであることを特徴とする、請求項２又は３に記載の多剤耐性細菌検出方法。
5. プライマーセットＩＩが、配列番号６のヌクレオチド配列のうちの１０塩基以上にハイブリダイズするフォーワードプライマーＩＩと、配列番号７のヌクレオチド配列のうちの１０塩基以上にハイブリダイズするリバースプライマーＩＩと、の組み合わせであることを特徴とする、請求項２～４のうちのいずれか一項に記載の多剤耐性細菌検出方法。
6. プライマーセットＩＩが、配列番号１０のヌクレオチド配列のうちの１０塩基以上を含むフォーワードプライマーＩＩと、配列番号１１のヌクレオチド配列のうちの１０塩基以上を含むリバースプライマーＩＩと、の組み合わせであることを特徴とする、請求項２～５のうちのいずれか一項記載の多剤耐性細菌検出方法。
7. 前記検出工程が、ｗｚｙ遺伝子の大腸菌Ｏ群血清型 Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｂｏｙｄｉｉ ９（ＯＳＢ９）特異的領域、ｗｚｘ遺伝子の大腸菌Ｏ群血清型１１６（Ｏ１１６）特異的領域、ｗｚｙ遺伝子の大腸菌Ｏ群血清型１３９（Ｏ１３９）特異的領域、ｗｚｙ遺伝子の大腸菌Ｏ群血清型１４７（Ｏ１４７）特異的領域、ｗｚｙ遺伝子の大腸菌Ｏ群血清型１４９（Ｏ１４９）特異的領域、Ｉｎｔｉｍｉｎをコードする遺伝子、エンテロトキシンＬＴをコードする遺伝子、Ｆ４線毛をコードする遺伝子、Ｆ１８線毛をコードする遺伝子、エンテロトキシンＳＴａをコードする遺伝子、エンテロトキシンＳＴｂをコードする遺伝子、志賀毒素Ｓｔｘ２ｅをコードする遺伝子、及びｇｙｒＢ遺伝子からなる第２群から選択される少なくとも１種の領域及び／又は遺伝子もさらに検出する工程であることを特徴とする、請求項１～６のうちのいずれか一項に記載の多剤耐性細菌検出方法。
8. 前記検出工程が、前記試料由来の核酸を鋳型として、プライマーセットＩ及びプライマーセットＩＩからなる群から選択される少なくとも１種のプライマーセットと、第２群に含まれる領域又は遺伝子の少なくとも一部を増幅可能なプライマーの組み合わせであるプライマーセットのうちの少なくとも１種とを用いて、マルチプレックスＰＣＲを行なう工程を含むことを特徴とする、請求項７に記載の多剤耐性細菌検出方法。
9. 下記（ｉ）－１～（ｉｉ）－１のプライマーセット：
   （ｉ）－１ 配列番号１のヌクレオチド配列、配列番号１のヌクレオチド配列と８０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列、又は配列番号１のヌクレオチド配列の相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列からなる第１のコンセンサス領域の少なくとも一部を増幅可能なプライマーの組み合わせであるプライマーセットＩ
   （ｉｉ）－１ 配列番号２のヌクレオチド配列、配列番号２のヌクレオチド配列と８０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列、又は配列番号２のヌクレオチド配列の相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列からなる第２のコンセンサス領域の少なくとも一部を増幅可能なプライマーの組み合わせであるプライマーセットＩＩ
   からなる群から選択される少なくとも１種のプライマーセットを含むことを特徴とする、プライマーキット。
10. プライマーセットＩが、配列番号４のヌクレオチド配列のうちの１０塩基以上にハイブリダイズするフォーワードプライマーＩと、配列番号５のヌクレオチド配列のうちの１０塩基以上にハイブリダイズするリバースプライマーＩと、の組み合わせであることを特徴とする、請求項９に記載のプライマーキット。
11. プライマーセットＩが、配列番号８のヌクレオチド配列のうちの１０塩基以上を含むフォーワードプライマーＩと、配列番号９のヌクレオチド配列のうちの１０塩基以上を含むリバースプライマーＩと、の組み合わせであることを特徴とする、請求項９又は１０に記載のプライマーキット。
12. プライマーセットＩＩが、配列番号６のヌクレオチド配列のうちの１０塩基以上にハイブリダイズするフォーワードプライマーＩＩと、配列番号７のヌクレオチド配列のうちの１０塩基以上にハイブリダイズするリバースプライマーＩＩと、の組み合わせであることを特徴とする、請求項９～１１のうちのいずれか一項に記載のプライマーキット。
13. プライマーセットＩＩが、配列番号１０のヌクレオチド配列のうちの１０塩基以上を含むフォーワードプライマーＩＩと、配列番号１１のヌクレオチド配列のうちの１０塩基以上を含むリバースプライマーＩＩと、の組み合わせであることを特徴とする、請求項９～１２のうちのいずれか一項に記載のプライマーキット。
14. ｗｚｙ遺伝子の大腸菌Ｏ群血清型 Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｂｏｙｄｉｉ ９（ＯＳＢ９）特異的領域、ｗｚｘ遺伝子の大腸菌Ｏ群血清型１１６（Ｏ１１６）特異的領域、ｗｚｙ遺伝子の大腸菌Ｏ群血清型１３９（Ｏ１３９）特異的領域、ｗｚｙ遺伝子の大腸菌Ｏ群血清型１４７（Ｏ１４７）特異的領域、ｗｚｙ遺伝子の大腸菌Ｏ群血清型１４９（Ｏ１４９）特異的領域、Ｉｎｔｉｍｉｎをコードする遺伝子、エンテロトキシンＬＴをコードする遺伝子、Ｆ４線毛をコードする遺伝子、Ｆ１８線毛をコードする遺伝子、エンテロトキシンＳＴａをコードする遺伝子、エンテロトキシンＳＴｂをコードする遺伝子、志賀毒素Ｓｔｘ２ｅをコードする遺伝子、及びｇｙｒＢ遺伝子からなる第２群から選択されるいずれかの領域又は遺伝子の少なくとも一部を増幅可能なプライマーの組み合わせであるプライマーセットのうちの少なくとも１種をさらに含むことを特徴とする、請求項９～１３のうちのいずれか一項に記載のプライマーキット。
15. 請求項１～８のうちのいずれか一項に記載の多剤耐性細菌検出方法に用いるためのプライマーキットであることを特徴とする、請求項９～１４のうちのいずれか一項に記載のプライマーキット。