KR20040094803A - 라만 산란법에 의해 뉴클레오타이드 신호를 증가시키는 방법 - Google Patents

라만 산란법에 의해 뉴클레오타이드 신호를 증가시키는 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 증강 라만 분광계에 의한 핵산 서열화에 관한 방법 및 장치에 관한 것이다. 본 발명의 특정 실시양태에서, 뉴클레오타이드는 핵산(13)으로의 혼입 전에 라만 라벨에 공유 부착된다. 상기 라벨화 핵산(3)의 엑소뉴클레아제(15) 처리에 의해 라벨화 뉴클레오타이드(16, 130)가 방출되고, 이는 라만 분광계에 의해 검출된다. 본 발명의 다른 실시양태에서, 엑소뉴클레아제(15) 처리에 의해 핵산(13)으로부터 방출된 뉴클레오타이드(16, 130)는 은 또는 금 나노입자(140)와 공유 가교연결되고, 표면 증강 라만 분광계(SERS), 표면 증강 공명 라만 분광계(SERRS) 및/또는 간섭성 반스톡스 라만 분광계(CARS)에 의해 검출된다. 본 발명의 다른 실시양태는 핵산 서열화를 위한 장치(10, 100, 210)에 관한 것이다.

Description

라만 산란법에 의해 뉴클레오타이드 신호를 증가시키는 방법{METHODS TO INCREASE NUCLEOTIDE SIGNALS BY RAMAN SCATTERING}
유전자 정보는 염색체로 조직화되어 있는 데옥시리보핵산(DNA)의 매우 긴 분자의 형태로 저장되어 있다. 인간 게놈은 DNA 서열중에 약 30억개의 염기를 갖는다. 이러한 DNA 서열 정보는 각각 개인의 다양한 특성을 결정한다. 다수의 공통 질환은 적어도 부분적으로 DNA 서열의 변종에 기초한다.
인간 게놈의 전체 서열을 결정하면, 이러한 질환의 유전적 근거를 확인하기 위한 기초가 제공된다. 그러나, 이러한 질환과 관련된 유전적 변종을 확인하기 위해서는 매우 다량의 작업이 수행되어야 한다. 질환을 촉진하는 DNA 서열의 특이적 변화를 확인하기 위해서는 이러한 질환을 나타내는 개인 또는 가계내의 유전자 일부의 DNA 서열분석이 요구된다. 리보핵산(RNA), 유전자 정보를 처리하는데 있어서 매개자 분자도 다양한 질환의 유전적 근거를 확인하기 위해서 서열분석될 수 있다.
크기에 의해 분리되는 형광 라벨화 핵산의 검출법에 기초하면, 핵산 서열분석을 위한 현존 방법은, 서열분석될 수 있는 핵산의 길이에 의해 제한된다. 전형적으로 단지 500 내지 1,000개 염기의 핵산 서열이 한번에 측정될 수 있다. 이는 길이로 수만 또는 수십만개의 염기로 구성되어 있는 것으로 유전자로 지칭되는 DNA의 기능성 단위의 길이 보다 매우 짧다. 현존하는 방법을 사용하면, 완전한 유전자 서열의 결정은, 생성되는 유전자를 수회 복제하고, 중복되는 분절로 절단하고, 서열분석하는 작업을 필요로 하며, 이후에, 중복되는 DNA 서열을 완전한 유전자로 조립할 수 있다. 이러한 방법은 노동집약적으로, 비용이 많이 들며, 비효율적이고, 시간-소모적이다.
본 발명의 방법 및 장치는 분자 생물학 및 게놈학(genomics)에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 방법 및 장치는 핵산 서열분석에 관한 것이다.
하기 도면은 본 발명의 명세서의 일부를 형성하고, 본 발명의 개시된 실시양태의 특정 양태를 추가로 설명하기 위해서 첨부되었다. 본 발명의 실시양태는, 본원에서 개시한 발명의 특정 실시양태의 상세한 설명과 함께 이러한 하나 이상의 도면을 참고하여 보다 잘 이해할 수 있을 것이다.
도 1은 라만 라벨에 공유결합된 뉴클레오타이드(16)을 사용하는, 핵산(13) 서열분석을 위한 예시적인 장치(10, 일정 비율이 아님) 및 방법을 나타낸다.
도 2는 SERS(surface enhance Raman spectroscopy; SERS)(180)에 의해 검출하기 전에 방출된 뉴클레오타이드(130)가 나노입자(140)에 공유결합된, 핵산(13) 서열분석을 위한 예시적인 장치(100, 일정 비율이 아님) 및 방법을 예시한다.
도 3은 핵산(13) 서열분석을 위한 다른 예시적인 장치(210, 일정 비율이 아님)를 예시한다.
개시된 방법 및 장치는 신속하고 자동화된 핵산(13)의 서열분석을 위해 사용된다. 본 발명의 구체적인 실시양태에서, 방법 및 장치(10, 100, 210)은 길이가 염기 1,000개 초과, 2,000개 초과, 5,000개 초과, 10,000개 초과, 20,000개 초과, 50,000개 초과, 100,000개 초과의 매우 긴 핵산 서열(13)의 서열분석을 위해 적당하다. 종래 방법에 비해 이점은 단일 서열분석 수행으로 긴 핵산(13) 서열을 판독할 수 있고, 서열분석 데이터를 얻는데 빠르며, 서열분석의 비용이 감소되며, 서열분석 데이터중 단위당 요구되는 작동 시간에 있어서의 효율이 크다는 점이다.
본 발명의 다양한 실시양태에서, 서열분석 정보는 단일 핵산 분자(13)을 사용하여 단일 서열분석 수행을 통해 수득될 수 있다. 본 발명의 다른 실시양태에서, 핵산 분자(13)의 다수 복제본은 평행하게 또는 순차적으로 서열분석하여, 핵산 서열을 확인하거나 완전한 서열 데이터를 수득할 수 있다. 본 발명의 다른 실시양태에서, 핵산 분자(13) 및 그의 상보적인 스트랜드는 서열 정보의 정확성을 확인시켜주기 위해서 서열분석될 수 있다.
본 발명의 특정 실시양태에서, RNA 또는 합성 뉴클레오타이드 유사체를 포함하는 다른 핵산(13)이 서열분석될 수 있음을 고려할 수 있지만, 서열분석될 핵산(13)은 DNA이다. 하기의 상세한 설명은 본 발명의 개시된 실시양태를 보다 전체적으로 이해하기 위해서, 다수의 구체적인 세부사항을 포함한다. 그러나, 당업계의 숙련자들에게 본 발명의 실시양태가 특정한 세부사항 없이 수행될 수 있음은 당업계의 숙련자들에게 명백할 것이다. 다른 경우에, 당업계에 공지된 장치, 방법, 공정, 및 개별 성분은 하기에서 상세하게 설명되지 않을 것이다.
본 발명의 다양한 실시양태에서, 도 1에서 예시된 것으로, 뉴클레오타이드는, 표면 증강된 라만 분광법(Surface enhanced Raman spectroscopy; SERS), 표면 증강된 공명 라만 분광법(Surface enhanced resonance Raman spectroscopy; SERRS), 간섭성 반스톡스 라만 분광법(coherent anti-Stokes Raman spectroscopy; CARS) 또는 다른 공지된 라만 검출법에 의해 검출되는 라만 신호를 증강시키기 위해서 라만 라벨에 공유결합되어 있을 수 있다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 이러한 라벨화 뉴클레오타이드는 표준 핵산 중합 기법을 사용하여 새롭게 합성된 핵산 스트랜드(13)에 도입될 수 있다. 전형적으로, 특정 서열의 프라이머 또는 하나 이상의 랜덤 프라이머는 주형 핵산에 혼성화된다. 폴리머라제 및 라벨화 뉴클레오타이드를 부가한 이후, 라만 라벨화 뉴클레오타이드는 프라이머의 3' 말단에 공유 결합되어, 결과적으로 주형에 대해 서열로 상보적인 라벨화 핵산 스트랜드(13)이 형성된다.
합성한 이후, 라벨화 핵산 스트랜드(13)는 하나 이상의 엑소뉴클레아제(15)에 의해 분해될 수 있다. 숙련자들은 개시된 방법이 엑소뉴클레아제(15) 자체를 한정하는 것이 아니며 핵산(13)의 하나 이상의 말단으로부터 뉴클레오타이드(16, 130)를 순차적으로 제거할 수 있는 임의의 효소 또는 다른 시약을 사용할 수 있음을 알 것이다. 본 발명의 특정 실시양태에서, 라만 라벨화 뉴클레오타이드(16, 130)는, 결과적으로 라벨화 핵산(13)의 3'말단(17)으로부터 떨어진다. 라벨화 핵산(13)으로부터의 분리 이후에, 라만 라벨화 뉴클레오타이드(16, 130)는 검출 유니트(18, 180, 300)로 검출된다. 후속적으로 검출된 라벨화 핵산(16, 130)에 대한 정보는, 주형 스트랜드의 서열에 상보적인 라벨화 핵산(13)의 서열을 종합하는데 사용된다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 라벨화 핵산 스트랜드(13)는 엑소뉴클레아제(15) 처리 이전에 비-라벨화 주형 스트랜드 및 미-도입된 뉴클레오타이드로부터 분리될 수 있다. 이는, 예를 들어 표면(14)에 가교결합되어 있는 프라이머 또는 표면(14)에 결합될 수 있는 유사한 기 또는 비오틴을 함유하는 프라이머를 사용하여 수행될 수 있다. 비오틴 라벨화 프라이머는 아비딘 또는 스트렙트아비딘으로 공유 개질된 표면(14)에 부착될 수도 있다. 라벨화 핵산(13)은 공지된 기법에 의해 비라벨화된 주형 스트랜드로부터 분리될 수도 있다.
본 발명의 특정 실시양태에서, 4개의 유형의 뉴클레오타이드는 각각 구별가능한 라만 라벨에 부착될 수 있다. 본 발명의 다른 실시양태에서, 단지 퓨린 뉴클레오타이드(사이토신 및/또는 티민 및/또는 우라실)이 라벨화될 수 있다. 하나의 예시적인 실시양태에서, 라벨화 뉴클레오타이드는 비오틴-라벨화 데옥시사이티딘-5'-트라이포스페이트(비오틴-dCTP) 및 디그옥시게닌-라벨화 데옥시우리딘-5'-트라이포스페이트(디그옥시게닌-dUTP)를 포함할 수도 있다.
도 2로 예시된 본 발명의 대체 실시양태에서, 라만 신호는 나노입자(140)에뉴클레오타이드(16, 130)을 공유결합시킴으로써 증강될 수 있다. 본 발명의 특정 실시양태에서, 이러한 결합은 도 1에서 개시한 바와 같이 핵산(13)의 엑소뉴클레아제(15) 처리 이후에 수행된다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 나노입자(140)는 은 또는 금이지만, 표면 증강된 라만 신호를 제공하는 것으로 공지된 나노입자(140)의 다른 유형이 고려된다. 나노입자(140)는 단일 나노입자(140), 나노입자(140)의 응집체, 또는 단일 나노입자(140)와 응집화 나노입자(140)의 혼합물일 수도 있다. 본 발명의 특정한 실시양태에서, 연결 화합물은 나노입자(140)에 핵산(16, 130)을 결합시키는데 사용될 수 있다. 본 발명의 다양한 실시양태에서, 연결 화합물의 길이는 1 내지 100nm, 2 내지 90nm, 3 내지 80 nm, 4 내지 70 nm, 5 내지 60 nm, 10 내지 50nm, 15 내지 40nm, 또는 20 내지 30 nm일 수 있다. 본 발명의 특정한 실시양태에서, 연결 화합물의 길이는 1 내지 50nm, 1 내지 5 nm, 2 내지 10 nm, 10 내지 20 nm 또는 약 5nm일 수 있다. 본 발명의 다른 실시양태에서, 2개 이상의 나노입자(140)가 연결 화합물을 사용하여 서로 결합될 수도 있다.
공유 결합 이후에, 나노입자-뉴클레오타이드 착물(150)은 관류 셀(flow through cell, 170, 290)을 통과하며, 여기서 이들은 검출 유니트(18, 180, 300)를 사용하여 SERS, SERRS 및/또는 CARS에 의해 검출된다. 본 발명의 몇몇의 대체 실시양태에서, 뉴클레오타이드(16, 130)는 개질되지 않을 수 있지만, 다른 대체 실시양태에서, 뉴클레오타이드(16, 130)는 하나 이상의 라만 라벨에 의해 개질될 수도 있다. 본 발명의 특정 실시양태에서, 뉴클레오타이드(16, 130)의 각각의 유형은 구별가능한 라만 라벨에 부착될 수 있다. 다른 실시양태에서, 단지 피리미딘(16,130)이 라벨화될 수도 있다.
정의
본원에서 부정관사(a, an)는 하나 또는 하나 이상의 항목을 의미한다.
본원에서, "작동가능하게 결합된(operably coupled)"이란 용어는 둘 이상의 단위 사이에 기능적 상호작용이 있음을 의미한다. 예를 들어, 분석물, 예컨대 뉴클레오타이드(16, 130)가 관류 셀(170, 290)을 통과할 때 이를 검출할 수 있도록 검출기(21, 310)가 배열되는 경우 검출기(21, 310)는 관류 셀(170, 290)에 "작동가능하게 결합된" 것일 수 있다.
"핵산"(13)은 DNA, RNA, 단일-스트랜드, 이중-스트랜드 또는 삼중-스트랜드 및 그의 임의의 화학적 개질물을 포괄한다. 사실상 핵산(13)의 임의의 개질물이 고려된다. 본원에서, 단일 스트랜드 핵산(13)은 접두사 "ss"로 표시되고, 이중 스트랜드 핵산(13)은 접두사 "ds"로 표시되고, 삼중 스트랜드 핵산(13)은 접두사 "ts"로 표시된다.
"핵산"(13)은 10, 20, 30, 40, 50, 60, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10,000, 15,000, 20,000, 30,000, 40,000, 50,000, 75,000, 100,000, 150,000, 200,000, 500,000, 1,000,000, 1,500,000, 2,000,000, 5,000,000 또는 심지어 더 이상의 염기 길이로부터, 전체길이 염색체 DNA 분자(13)에 이르기까지 거의 임의의 길이일 수 있다.
"뉴클레오사이드"(16, 130)는 데옥시리보스, 리보스 또는 5탄당의 유도체 또는 유사체와 같은 5탄당에 공유결합된 퓨린 또는 피리미딘 염기(아데닌-"A", 시토신-"C", 구아닌-"G", 티민-"T" 또는 유라실-"U") 또는 그의 임의의 화학적 개질물 또는 구조적 유사체를 포함하는 분자이다.
"뉴클레오타이드"(16, 130)는 상기 5탄당에 공유결합된 하나 이상의 포스페이트 기를 추가로 포함하는 뉴클레오사이드(16, 130)를 지칭한다. 본 발명의 몇몇 실시양태에서, 뉴클레오타이드(16, 130)는 리보뉴클레오사이드 모노포스페이트(16, 130) 또는 데옥시리보뉴클레오사이드 모노포스페이트(16, 130)이지만, 뉴클레오사이드 다이포스페이트 또는 트라이포스페이트(16, 130)가 생성되고 검출될 수 있음이 예상된다. 본 발명의 다른 실시양태에서, 뉴클레오사이드(16, 130)는 핵산 분자(13)로부터 방출될 수 있다. 뉴클레오타이드(16, 130)가 폴리머라제 활성에 의해 핵산(13)에 혼입될 수 있고 엑소뉴클레아제(16) 또는 동등한 시약에 의해 방출될 수 있는 한 뉴클레오타이드(16, 130)의 구조에는 다양한 치환 및 개질이 이루어질 수 있다. 하나 이상의 유형의 뉴클레오타이드(16, 130)에 부착된 하나 이상의 라벨에 관계된 본 발명의 실시양태에서, 핵산(13)의 중합 및/또는 소화에 간섭하지 않는 한, 상기 라벨은 뉴클레오타이드(16, 130)의 임의의 부분, 예컨대 염기, 당 또는 포스페이트 기 또는 그들의 유사체에 부착될 수 있다. "뉴클레오타이드" 및 "라벨화 뉴클레오타이드"란 용어는 모든 비천연 뉴클레오타이드 착물, 예컨대 뉴클레오타이드-나노입자 착물 및 뉴클레오타이드-라벨 착물을 포괄하나 그에 한정되지 않는다.
"라만(Raman) 라벨"은 검출가능한 라만 신호를 생성할 수 있는 임의의 유기또는 무기 분자, 원자, 착물 또는 구조물일 수 있으며, 합성 분자, 염료, 피코에리트린(phycoerythrin)과 같은 천연 안료, C60, 버키볼(buckyball) 및 탄소 나노튜브와 같은 유기 나노구조물, 금 또는 은 나노입자 또는 나노프리즘과 같은 금속 나노구조물 및 퀀텀 도트와 같은 나노-규모 반도체를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 라만 라벨의 다수의 예를 하기에 개시한다. 당업자는 상기 예가 한정적인 것이 아니고, "라만 라벨"이 라만 분광학에 의해 검출될 수 있는 당해 분야에 공지된 임의의 유기 또는 무기 원자, 분자, 화합물 또는 구조물을 포괄함을 이해할 것이다.
핵산
서열분석될 핵산 분자(13)는 당해 분야에 공지된 임의의 기법으로 제조될 수 있다. 본 발명의 특정 실시양태에서, 핵산(13)은 천연 DNA 또는 RNA 분자이다. 사실상 염색체, 미토콘드리아 및 엽록체의 DNA 및 리보솜, 전사, 불균질 핵 및 메신저 RNA(mRNA)를 포함하나 그에 한정되지 않는 임의의 천연 핵산(13)이 제조되고 서열분석될 수 있다. 다양한 형태의 핵산(13)을 제조하고 단리하는 방법이 공지되어 있다. (예컨대, 문헌[Guide to Molecular Cloning Techniques, eds. Berger and Kimmel, Academic Press, New York, NY, 1987;Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., eds, Sambrook, Fritsch and Maniatis, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989] 참조). 상기 인용문헌에 개시된 방법은 단지 예시적이며 당해 분야에 공지된 임의의 변형을 사용할 수 있다. 단일 스트랜드 DNA(ssDNA)(13)를 서열분석하는 경우, ssDNA(13)는 임의의 공지된 방법에 의해 이중 스트랜드 DNA(dsDNA)로부터 제조될 수 있다. 상기 방법은 dsDNA를 가열하고 스트랜드가 분리되도록 하는 것을 포함하거나, 또는 다르게는 dsDNA로부터 임의의 증폭 또는 복제 방법, 예컨대 M13으로의 클로닝에 의해 ssDNA(13)를 제조하는 것을 포함할 수 있다. 이러한 공지된 방법은 ssDNA 또는 ssRNA(13)를 제조하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 특정 실시양태가 천연 핵산(13)의 제조를 고려하지만, 사실상 엑소뉴클레아제 또는 동등한 시약을 위한 기질(15)로서 작용할 수 있는 임의의 유형의 핵산(13)이 잠재적으로 서열분석될 수 있다. 예를 들어, 다양한 증폭 기법, 예컨대 폴리머라제 연쇄 반응(PCRTM) 증폭에 의해 제조된 핵산(13)이 서열분석될 수 있다. (미국 특허 제 4,683,195 호, 제 4,683,202 호 및 제 4,800,159 호 참조). 다르게는, 서열분석된 핵산(13)은 표준 벡터, 예컨대 플라스미드, 코스미드, BAC(박테리아 인공 염색체) 또는 YAC(이스트 인공 염색체)에서 클로닝될 수 있다. (예컨대, 문헌[Berger and Kimmel, 1987; Sambrook et al., 1989] 참조). 핵산 삽입물(13)은 예를 들어 적절한 제한 엔도뉴클레아제로 절제한 후 아가로스 겔 전기영동시킴으로써 벡터 DNA로부터 단리될 수 있다. 삽입물 핵산(13)을 단리하는 방법은 널리 공지되어 있다.
단일 핵산 분자의 단리
본 발명의 특정 실시양태에서, 서열분석될 핵산 분자(13)는 ssDNA 또는 ssRNA의 단일 분자이다. 단일 핵산 분자(13)를 선별 및 조작하는 다양한 방법, 예를 들어 수력학적 포커싱(focusing), 마이크로-조작자 결합, 광학 트래핑, 또는 이들 및 유사한 방법의 조합이 사용될 수 있다. (예컨대, 문헌[Goodwinet al., 1996,Acc. Chem. Res.29:607-619], 미국 특허 제 4,962,037 호, 제 5,405,747 호, 제 5,776,674 호, 제 6,136,543 호, 제 6,225,068 호 참조).
본 발명의 특정 실시양태에서, 마이크로유체공학 또는 나노유체공학을 사용하여 핵산 분자(13)를 정렬 및 단리시킬 수 있다. 수력학을 사용하여 핵산(13)의 마이크로채널, 마이크로모세관 또는 미세기공으로의 이동을 조작할 수 있다. 본 발명의 한 실시양태에서, 수력학적 힘을 사용하여 핵산 분자(13)를 빗(comb) 구조를 가로질러 이동하게 하여 단일 핵산 분자(13)를 분리시킬 수 있다. 핵산 분자(13)가 분리되면, 수력학적 포커싱을 사용하여 분자(13)를 반응 챔버(11, 220) 내에 배치시킬 수 있다. 또한 열 또는 전기 포텐셜, 압력 또는 진공을 사용하여 핵산(13)의 조작을 위한 구동력을 제공할 수 있다. 본 발명의 예시적인 실시양태에서, 핵산(13)의 서열분석을 위한 조작은 미세가공된 채널 및 통합된 겔 물질을 혼입하는 채널 블록 설계의 사용을 포함할 수 있다(미국 특허 제 5,867,266 호 및 제 6,214,246 호 참조).
본 발명의 다른 실시양태에서, 핵산 분자(13)를 함유하는 샘플은 고정화(immobilization) 표면(14)에 결합되기 전에 희석될 수 있다. 본 발명의 예시적인 실시양태에서, 고정화 표면(14)은 자성(magnetic) 또는 비자성 비드 또는 다른 불연속적 구조 단위의 형태일 수 있다. 적절한 희석시, 각각의 비드(14)는 0개 또는 1개의 핵산 분자(13)와 결합될 통계학적인 확률을 가질 것이다. 한 개의 핵산 분자(13)가 부착된 비드(14)는 예를 들어 형광 염료 및 유동 사이토미터(cytometer)정렬 또는 자기(magnetic) 정렬을 사용하여 동정될 수 있다. 비드(14) 및 핵산(13)의 상대적 크기 및 균일성에 따라, 결합된 단일 핵산 분자(13)를 함유하는 비드(14)를 분리하기 위해 자기 필터 및 질량 분리를 사용할 수도 있다. 본 발명의 다른 실시양태에서, 단일 비드 또는 다른 고정화 표면(14)에 부착된 다수의 핵산(13)이 서열분석될 수 있다.
본 발명의 다른 실시양태에서, 코팅된 섬유 첨단(14)을 사용하여 서열분석을 위한 단일 분자 핵산(13)을 생성한다(예컨대, 미국 특허 제 6,225,068 호). 다른 대안적인 실시양태에서, 고정화 표면(14)은 아비딘 또는 다른 가교결합제의 단일 분자를 함유하도록 제조될 수 있다. 이러한 표면(14)은 서열분석될 단일 바이오틴화된 핵산 분자(13)를 부착할 수 있다. 이러한 실시양태는 아비딘-바이오틴 결합 시스템에 한정되지 않으며, 임의의 공지된 결합 시스템에 적용될 수 있다.
본 발명의 다른 대안적인 실시양태에서, 광학적 트랩을 사용하여 서열분석을 위한 단일 분자 핵산 분자(13)를 조작할 수 있다. (예컨대, 미국 특허 제 5,776,674 호). 예시적인 광학 트래핑 시스템은 셀 로보틱스 인코포레이티드(Cell Robotics, Inc.)(미국 뉴멕시코주 앨버커크 소재), S+L GmbH(독일 하이델베르크 소재) 및 P.A.L.M. GmbH(독일 볼프라츠하우젠 소재)에서 상업적으로 구입가능하다.
라만 라벨
본 발명의 특정 실시양태는 검출 유니트(18, 180, 300)에 의한 측정을 용이하게 하기 위해 뉴클레오타이드(16, 130)에 라벨을 부착시키는 것을 포함할 수 있다. 라만 분광학에 사용될 수 있는 비제한적인 라벨은 TRIT(테트라메틸 로다민 아이소티올), NBD(7-나이트로벤즈-2-옥사-1,3-다이아졸), 텍사스 레드 염료, 프탈산, 테레프탈산, 아이소프탈산, 크레실 패스트 바이올렛, 크레실 블루 바이올렛, 브릴리언트 크레실 블루, 파라-아미노벤조산, 에리트로신, 바이오틴, 다이곡시게닌, 5-카복시-4',5'-다이클로로-2',7'-다이메톡시 플루오레세인, 5-카복시-2',4',5',7'-테트라클로로플루오레세인, 5-카복시플루오레세인, 5-카복시 로다민, 6-카복시로다민, 6-카복시테트라메틸 아미노 프탈로사이아닌, 아조메틴, 사이아닌, 크산틴, 석시닐플루오레세인 및 아미노아크리딘을 포함한다. 상기 및 기타 라만 라벨은 상업적 공급원(예컨대, 미국 오래곤주 유진 소재의 몰레큘러 프로브즈(Molecular Probes))으로부터 구입할 수 있다.
폴리사이클릭 방향족 화합물이 당해 분야에 공지된 바와 같이 라만 라벨로서 작용할 수 있다. 본 발명의 특정할 실시양태에 사용할 수 있는 다른 라벨은 사이아나이드, 티올, 염소, 브롬, 메틸, 인 및 황을 포함한다. 본 발명의 특정 실시양태에서, 탄소 나노튜브가 라만 라벨로서 유용할 수 있다. 라만 분광학에서의 라벨의 사용은 공지되어 있다(예컨대, 미국 특허 제 5,306,403 호 및 제 6,174,677 호). 당업자는 사용된 라만 라벨이 구별가능한 라만 스펙트럼을 생성해야 하며 상이한 유형의 뉴클레오타이드(16, 130)에 특정하게 결합하거나 관련될 수 있다는 것을 이해할 것이다.
라벨은 뉴클레오타이드(16, 130)에 직접 부착될 수 있거나 다양한 연결 화합물을 통해 부착될 수 있다. 개시된 방법에서 유용한 가교결합제 및 연결 화합물은 이하에 추가로 기술된다. 다르게는, 라만 라벨에 공유결합된 뉴클레오타이드를 표준 상업적 공급원(예컨대, 미국 인디아나주 인디아나폴리스 소재의 로슈 몰레큘러 바이오케미칼스(Roche Molecular Biochemicals); 미국 위스콘신주 매디슨 소재의 프로메가 코포레이션(Promega Corp.); 미국 텍사스 오스틴 소재의 앰비온, 인코포레이티드(Ambion, Inc.); 미국 뉴저지주 피스카타웨이 소재의 애머셤 파마시아 바이오테크(Amersham Pharmacia Biotech))으로부터 구입가능하다. 다른 분자, 예컨대 뉴클레오타이드(16, 130)와 공유결합적으로 반응하도록 설계된 반응성 기를 함유하는 라만 라벨은 상업적으로 구입가능하다(예컨대, 미국 오래곤주 유진 소재의 몰레큘러 프로브즈). 라벨화 뉴클레오타이드를 제조하고 이를 핵산(13)에 혼입시키는 방법은 공지되어 있다(예컨대, 미국 특허 제 4,962,037 호, 제 5,405,747 호, 제 6,136,543 호 및 제 6,210,896 호).
나노입자
본 발명의 특정 실시양태는 나노입자(140)를 사용하여 뉴클레오타이드(16, 130)로부터 수득된 라만 신호를 증강시키는 것을 포함한다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 나노입자(140)는 은 또는 금 나노입자(140)이지만, 표면 증강 라만 분광법(SERS) 신호를 제공할 수 있는 임의의 나노입자(140)를 사용할 수도 있다. 본 발명의 다른 실시양태에서, 나노입자(140)는 나노프리즘이다(문헌[Jin et al., Science 294:1902-3, 2001] 참조). 직경이 1nm 내지 2㎛의 나노입자(140)가 사용될 수 있다. 다른 실시양태에서, 직경이 2nm 내지 1㎛, 5 내지 500nm, 10 내지 200nm, 20 내지 100nm, 30 내지 80nm, 40 내지 70nm 또는 50 내지 60nm의 나노입자(140)가 고려된다. 본 발명의 특정 실시양태에서, 평균 직경이 10 내지 50nm, 50내지 100nm, 또는 약 100nm의 나노입자(140)가 고려된다. 나노입자(140)는 형태가 거의 구형, 막대형, 엣지형(edgy), 평면형(faceted) 또는 뾰족형(pointy)일 수 있지만, 임의 형태의 나노입자(140) 또는 불규칙 형태의 나노입자(140)가 사용될 수 있다. 나노입자의 제조 방법이 공지되어 있다(예컨대, 미국 특허 제 6,054,495 호; 제 6,127,120 호; 제 6,149,868 호; 문헌[Lee and Meisel,J. Phys. Chem.86:3391-3395, 1982]; [Jin et al., 2001] 참조). 또한, 나노입자는 상업적 공급원으로부터 구입할 수 있다(예컨대, 미국 뉴욕주 야판크 소재의 나노프로브사; 미국 펜실베이니어주 워링톤 소재의 폴리사이언스사).
본 발명의 특정 실시양태에서, 나노입자(140)는 단일 나노입자(140) 및/또는 나노입자(140)의 무작위 응집물(콜로이드성 나노입자(140))일 수 있다. 본 발명의 다른 실시양태에서, 나노입자(140)는 가교결합된 나노입자(140)의 특정한 응집물, 예컨대 이량체, 삼량체, 사량체 또는 기타 응집물을 생성할 수 있다. 본 발명의 특정 실시양태는 상이한 크기의 집합물의 이종 혼합물을 사용할 수 있지만, 다른 대안적 실시양태는 나노입자(140)의 동종 집단을 사용할 수 있다. 본 발명의 특정 실시양태에서, 선택된 수의 나노입자(140)를 함유하는 응집물은 자당 용액 중에서 한외 여과와 같은 공지 기술에 의해 진해지거나 정제될 수 있다. 본 발명의 다양한 실시양태에서, 나노입자(140) 응집물의 크기는 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 내지 1000nm이거나 또는 그 이상이 고려될 수 있다.
나노입자(140)의 가교결합 방법은 공지되어 있다(예컨대, 문헌[Assembly of metal nanoparticle arrays using molecular bridges, The ElectrochemicalSociety Interface, Fall, 2001, pp. 22-25] 참조). 금 나노입자(140)는, 예컨대 말단 싸이올 또는 설프하이드릴 기를 함유하는 이작용성 연결 화합물을 사용하여 가교결합될 수 있다. 금 나노입자(140)와의 반응시, 연결자는 연결자의 길이만큼 떨어진 나노입자(140) 이량체를 형성한다. 본 발명의 다른 실시양태에서, 3개, 4개 또는 그 이상의 싸이올 기를 갖는 연결자가 사용되어 다중 나노입자(140)에 동시에 부착될 수 있다([Feldheim, 2001] 참조). 연결 화합물에 대해서 과량의 나노입자(140)를 사용하는 것은 다중 가교결합 및 나노입자(140) 침전의 형성을 방지한다. 은 나노입자(140)의 응집물은 당업계에 공지된 표준 합성법에 의해 형성될 수 있다.
본 발명의 다른 실시양태에서, 나노입자(140)는 연결 화합물에 부착되기 전에 개질되어 다양한 반응성 기를 함유할 수 있다. 개질된 나노입자(140)는 상업적으로 입수가능하다(예컨대, 미국 뉴욕주 야판크 소재의 나노프로브사의 나노골드(Nanogold)(등록상표) 나노입자(140)). 나노골드(등록상표) 나노입자(140)는 나노입자(140) 당 부착된 단일 또는 다중 말레이미드, 아민 또는 기타 기와 함께 수득될 수 있다. 또한, 나노골드(등록상표) 나노입자(140)는 양극 또는 음극으로 대전된 형태로 적용가능하다. 이러한 개질된 나노입자(140)는 다양한 공지 연결 화합물에 부착되어 나노입자(140)의 이량체, 삼량체 또는 기타 응집물을 제공할 수 있다.
용액 중에서 침전을 일으키지 않는 나노입자(140)의 작은 응집물을 생성하는 것이면 사용되는 연결 화합물의 유형은 제한되지 않는다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 연결 기는 페닐아세틸렌 중합체를 포함할 수 있다([Feldheim, 2001] 참조). 다르게는, 연결 기는 폴리테트라플루오로에틸렌, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 폴리아크릴아미드, 폴리에틸렌 또는 기타 공지의 중합체를 포함할 수 있다. 사용되는 연결 화합물은 중합체에 한정되지 않고, 실란, 알칸, 유도된 실란 또는 유도된 알칸과 같은 기타 유형의 분자를 또한 포함할 수 있다.
본 발명의 다양한 실시양태에서, 나노입자(140)는 뉴클레오타이드(16, 130)에 공유결합될 수 있다. 본 발명의 다른 실시양태에서, 뉴클레오타이드(16, 130)는 나노입자(140)에 직접 부착되거나 나노입자(140)에 공유결합 또는 비공유결합되는 연결 화합물에 부착될 수 있다. 본 발명의 이런 실시양태에서, 연결 화합물은 둘 이상의 나노입자(140)를 함께 가교결합하기보다 뉴클레오타이드(16, 130)를 나노입자(140) 또는 나노입자(140) 응집물에 부착시키는데 사용될 수 있다. 본 발명의 특정 실시양태에서, 나노입자(140)는 유도된 실란으로 코팅될 수 있다. 이러한 개질된 실란은 표준 방법을 사용하여 뉴클레오타이드(16, 130)에 공유결합될 수 있다. 핵산(13)을 표면(14)에 가교결합시키는 것으로 알려진 다양한 방법들이 또한 뉴클레오타이드(16, 130)를 나노입자(140)에 부착시키는데 사용될 수 있다. 뉴클레오타이드(16, 130)를 부착시키기 위해 사용된 연결 화합물은 거의 임의의 길이, 약 0.05, 0.1, 0.2, 0.5, 0.75, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 27, 30, 35, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90 내지 100nm 또는 그 이상의 길이의 범위일 수 있다. 본 발명의 특정 실시양태는 상이한 길이의 링커를 사용할 수 있다.
본 발명의 다른 실시양태에서, 뉴클레오타이드(16, 130)는 나노입자(140)의 표면상에 흡착되거나, 나노입자(140)에 매우 근접할 수 있다(약 0.2 내지 1.0 nm). 뉴클레오타이드(16, 130)를 나노입자(140)에 공유결합시키는 것은 SERS, SERRS 또는 CARS에 의한 증강된 라만 신호를 생성하기 위해 필요한 것이 아님을 당업자는 인식할 것이다.
도 2에 개시된 본 발명의 예시적 실시양태에서, 미세유체 채널(160)을 따라 뉴클레오타이드(16, 130) 뉴클레오타이드-나노입자 착물(150)을 형성함에 따라 뉴클레오타이드(16, 130)는 나노입자(140)에 부착된다. 본 발명의 특정 실시양태에서, 가교결합 반응이 일어나기 위해 적용가능한 시간의 길이는 매우 한정적일 수 있다. 이러한 실시양태는 신속한 반응 속도를 갖는 높은 반응성의 가교결합기, 예컨대 에폭사이드 기, 아지도 기, 아릴아지도 기, 트라이아진 기 또는 다이아조 기를 사용할 수 있다. 본 발명의 특정 실시양태에서, 가교결합 기는 강한 빛, 예컨대 레이저에 노출시킴으로써 광 활성화시킬 수 있다. 예컨대, 다이아조 또는 아지도 화합물의 광활성화는 각각 높은 반응성의 카르벤 및 나이트렌 잔기를 형성한다. 본 발명의 특정 실시양태에서, 반응성 기는 나노입자(140)를 서로 가교결합시키는 것보다 나노입자(140)를 뉴클레오타이드(16, 130)에만 부착시키도록 선택될 수 있다. 뉴클레오타이드(16, 130)에 결합가능한 반응성 가교결합 기의 선택 및 제조는 당업계에 공지되어 있다. 본 발명의 다른 실시양태에서, 뉴클레오타이드(16, 130)는, 예컨대 금 나노입자(140)에 부착될 수 있는 설프하이드릴 기로서 그 자신이 공유결합적으로 개질될 수 있다.
본 발명의 특정 실시양태에서, 나노입자(140)는 당업계에 공지된 임의의 방법, 예컨대 마이크로유체학, 나노유체학, 유체역학적 포커싱 또는 전자-삼투에 의해 미세유체 채널(120, 160, 270, 280)에서 처리될 수 있다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 대전된 연결 화합물 또는 대전된 나노입자(140)의 사용은 전기적 구배의 사용을 통해 나노입자(140)의 처리를 촉진할 수 있다.
핵산의 고정화
본 발명의 특정 실시양태에서, 도 1에 예시된 바와 같이, 하나 이상의 핵산 분자(13)는 작용화된 유리, 규소, 실리케이트, PDMS(폴리다이메틸 실록산), 폴리비닐리덴 다이플루오라이드(PVDF), 은 또는 기타 금속 코팅된 표면, 석영, 플라스틱, PTFE(폴리테트라플루오로에틸렌), PVP(폴리비닐 피롤리돈), 폴리(비닐 클로라이드), 폴리(메틸 메타크릴레이트), 폴리(다이메틸 실록산), 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 폴리아크릴아미드, 라텍스, 나일론, 니트로셀룰로스, 유리 비드, 자성 비드, 핵산 분자(13)와 공유결합을 형성할 수 있는 니트렌, 카벤 및 케틸 라디칼과 같은 광반응성 종을 함유하는 광 중합체(미국 특허 제 5,405,766 호 및 제 5,986,076 호 참조), 또는 표면(14)상에 혼입된 아미노, 카복실, 싸이올, 하이드록실 또는 딜스스-앨더 반응물과 같은 작용기를 가질 수 있는 것으로 당업계에 알려진 기타 물질과 같은 표면(14)에 부착될 수 있다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 표면 작용기는 공유결합되어 화합물을 가교결합하여 입체 장애 없이 핵산 분자(13) 및 엑소뉴클레아제(15) 및/또는 폴리머라제 사이의 결합 상호작용이 일어나게 한다. 전형적 가교결합 기는 에틸렌 글리콜 올리고머 및 다이아민을 포함한다. 부착은 공유결합적 또는 비공유결합적으로 실행될 수 있다. 핵산 분자(13)를 표면(14)에 부착하는 다양한 방법이 당업계에 공지되어 있고, 이를 이용할 수 있다. 본 발명의 어떤 실시양태에서, 핵산 분자(13)는 적절하게 고정되고, 검출 유니트(18, 180, 300)를 지나 방출된 뉴클레오타이드(16, 130)를 수송하는 유동 경로(12) 및/또는 미세유체 채널(110, 160, 260, 280)를 내려가는 미세유체에 침지된다. 비제한적인 예에서, 미세유체는 유동 경로(12) 및/또는 미세유체 채널(110, 160, 260, 280)을 내려가는 용매의 벌크한 유동에 의해 일어날 수 있다.
본 발명의 다른 실시양태에서, 벌크한 매질은 천천히 움직이기만 하거나 또는 전혀 움직이지 않지만, 용액 내의 대전된 종(예컨대, 음극으로 대전된 뉴클레오타이드(16, 130))는 외부적 전기장 인가에 대한 반응으로 유동 경로(12) 및/또는 미세유체 채널(110, 160, 260, 280)을 내려온다.
핵산 분자(13)의 고정화는 공지된 다양한 방법에 의해 수행될 수 있다. 본 발명의 예시적인 실시양태에서, 고정화는 스트렙트아비딘 또는 아비딘으로 표면(14)을 코팅한 후, 바이오틴화된 핵산(13)을 부착시켜 수행될 수 있다(문헌[Holmstrom et al.,Anal. Biochem. 209: 278-283, 1993] 참조). 또한, 고정화는 규소, 유리 또는 기타 표면(14)을 폴리-L-Lys(라이신) 또는 폴리 L-Lys, Phe(페닐알라닌)으로 코팅한 후, 이작용성 가교결합제를 사용하여 아미노- 또는 설프하이드릴-개질된 핵산(13)에 공유결합시켜 일어날 수 있다(문헌[Running et al.,BioTechniques8: 276-277, 1990; Newton et al.,Nucleic Acids Res.21:1155-62,1993] 참조). 아민 잔기는 아미노실란의 사용을 통해 표면(14)상에 코팅될 수 있다.
고정화는 5'-포스포릴화된 핵산(13)을 화학적으로 개질된 표면(14)에 직접 공유결합시켜 일어날 수 있다(문헌[Rasmussen et al.,Anal. Biochem. 198: 138-142, 1991] 참조). 핵산(13)과 표면(14)의 공유 결합은 수용성 카보다이이미드와의 축합에 의해 형성될 수 있다. 이 방법은 핵산의 5'-포스페이트를 통해 지배적으로 핵산(13)의 5'-부착을 촉진시킨다.
DNA(13)는 먼저 유리 표면(14)을 실란화한 후, 카보다이이미드 또는 그루타르알데하이드와 함께 활성화함으로써 통상적으로 유리에 결합된다. 다른 방법은 분자의 3' 또는 5' 말단에 삽입된 아미노 연결기를 통해 결합된 DNA(13)와 함께 3-글리시독시프로필트라이메톡시실란(GOP) 또는 아미노프로필트라이메톡시실란(APTS)과 같은 시약을 사용할 수 있다. DNA(13)는 자외선 조사를 사용하여 막 표면(14)에 직접 감길 수 있다. 핵산(13)의 고정화 기법의 다른 비제한적 예가 미국 특허 제 5,610,287 호, 제 5,776,674 호 및 제 6,225,068 호에 개시되어 있다.
이작용성 가교제는 핵산 분자(13)를 표면(14)에 부착시키는 것과 같은 본 발명의 다양한 실시양태에 사용될 수 있다. 이작용성 가교제는 그의 작용기(예; 아미노, 구아디노, 인돌, 또는 카복실 특정 기)의 특이성에 따라 나뉘어질 수 있다. 분자의 교차결합에 대한 대표적인 방법은 미국 특허 제 5,603,872 호 및 제 5,401,511 호에 개시되어 있다. 교차 결합 시약은 글루타르알데하이드(GAD), 이작용성 옥시란(OXR), 에틸렌 글리콜 다이글리시딜 에테르(EGDE), 및 카보다이이미드(예; 1-에틸-3-(3-다이메틸아미노프로필)카보다이이미드(EDC))를 포함한다.
핵산 합성
폴리머라제
본 발명의 특정한 실시양태는 DNA 폴리머라제와 같은 합성 시약을 프라이머 분자에 연결하고, 라만(Raman) 라벨화 뉴클레오타이드를 프라이머의 3' 말단에 첨가하는 것을 포함한다. 폴리머라제의 비제한적 예는 DNA 폴리머라제, RNA 폴리머라제, 역전사효소, 및 RNA-의존성 RNA 폴리머라제를 포함한다. 그의 "교정(proofreading)" 활성 및 프라이머 및 프로모터 서열의 필요성 또는 필요성의 결여에 대한 폴리머라제 간의 차이가 당해 분야에 공지되어 있다. RNA 폴리머라제가 폴리머라제로서 사용되는 경우, 서열분석되는 주형 분자는 이중-스트랜드 DNA일 수 있다. 폴리머라제의 비제한적 예는 써마토가 마리티마(Thermatoga maritima) DNA 폴리머라제, 등록상표 앰플리택FS(AmplitaqFS) DNA 폴리머라제, 등록상표 태쿼나아제(Taquenase) DNA 폴리머라제, 등록상표 써모시쿼나아제(ThermaSequenase), 태크(Taq) DNA 폴리머라제, 등록상표 큐베타(Qbeta) 복제효소, T4 DMA 폴리머라제, 써무스 써모필러스(Thermus thermophilus) DNA 폴리머라제, RNA-의존성 RNA 폴리머라제 및 SP6 RNA 폴리머라제를 포함한다.
푸(Pwo) DNA 폴리머라제(미국 인디아나주 인디아나폴리스 소재의 베링거 맨하임 바이오케미칼스(Boehringer Mannheim Biochemicals)); 비스트(Bst) 폴리머라제(미국 캘리포니아주 헤르쿨레스 소재의 바이오-라드 래보러토리스(Bio-Rad Laboratories)); 등록상표 아이소썸(IsoTherm) DNA 폴리머라제(미국 위스콘신주 메디슨 소재의 에피센트르 테크놀러지스(Epicentre Technologies)); 몰로니 뮤린 류케미아 바이러스 리버스 트랜스크립타제(Moloney Murine Leukemia Virus Reverse Transcriptase), Pfu DNA 폴리머라제, 아비안 미엘로블라스토시스 바이러스 리버스 트랜스크립타제(Avian Myeloblastosis Virus Reverse Transcriptase), 써무스 플라버스(thermus flavus; Tfl) DNA 폴리머라제 및 써모코코스 리토랄리스(Termococcus litoralis; Tli) DNA 폴리머라제(미국 위스콘신주 매디슨 소재의 프로메가 코포레이션(Promega Corp.); RAV2 리버스 트랜스크립타제, HIV-1 리버스 트랜스크립타제, T7 RNA 폴리머라제, T3 RNA 폴리머라제, SP6 RNA 폴리머라제, 대장균(E. Coli) RNA 폴리머라제, 써무스 아쿠아티쿠스(Thermus aquaticus) DNA 폴리머라제, T7 DNA 폴리머라제 +/- 3'→5' 엑소뉴클레아제, DNA 폴리머라제 I의 클레노우 프래그먼트(Klenow Fragment), 써무스(Thermus) '보편적(ubiquitous)' DNA 폴리머라제, 및 DNA 폴리머라제 I(미국 뉴저지주 피스카타웨이 소재의 아머샴 파마시아 바이오테크(Amersham Pharmacia Biotech))을 비롯한, 많은 폴리머라제가 상업적으로 시판중이다. 라벨화 뉴클레오타이드의 주형 의존성 중합화 능력이 있는, 당해 분야에 공지된 임의의 폴리머라제가 사용될 수 있다(굿맨 및 티핀의 문헌["Nat.Rev.Mol.Cell Biol.1(2)", 101-9, 2000]; 미국 특허 제 6,090,589 호 참조). 폴리머라제를 사용하여 라벨화 뉴클레오타이드로부터 핵산(13)을 합성하는 방법이 공지되어 있다(미국 특허 제 4,962,037 호, 제 5,405,747 호, 제 6,136,543 호 및 제 6,210,896 호 참조).
프라이머
긴 프라이머가 사용될 수 있지만, 일반적으로 프라이머의 길이는 10 내지 20 염기이다. 본 발명의 특정한 실시양태에서, 프라이머는 주형 핵산 분자의 공지된 부분에 상보적인 서열로 디자인된다. 공지된 프라이머 서열은, 예컨대 프라이머가 공지된 고정 염색체 서열에 인접한 서열 변화를 확인하는데 선택되는 경우, 비공지된 핵산 서열이 공지된 서열의 벡터로 삽입되는 경우, 또는 천연 핵산이 부분적으로 서열분석되는 경우에 사용될 수 있다. 임의의 서열의 프라이머를 합성하는 방법이 공지되어 있다. 본 발명의 다른 실시양태는 공지된 프라이머-결합 부위의 존재 하에 핵산(13)의 서열을 분석하는 것을 포함한다. 상기의 경우, 중합화를 개시하기 위하여 임의의 6량체 또는 임의의 올리고머와 같은 임의의 프라이머를 사용할 수 있다.
핵산 소화(digestion)
도 1에 예시된 본 발명의 특정한 실시양태에서, 핵산(13)의 서열분석법은 엑소뉴클레아제(15) 또는 균등한 시약을 핵산 분자(13)의 유리 말단(17)에 결합시키고 뉴클레오타이드(16, 130)를 한번에 제거하는 것을 포함한다. 사용 가능한 핵산 소화 효소(15)의 비제한적 예는 대장균 엑소뉴클레아제 I, III, V 또는 VII, 발(Bal) 31 엑소뉴클레아제, 녹두 뉴클레아제, S1 뉴클레아제, 대장균 DNA 폴리머라제 I 홀로엔자임 또는 클레노우 프래그먼트, RecJ, 엑소뉴클레아제 T, T4 또는 T7 DNA 폴리머라제, 태크 폴리머라제, 엑소뉴클레아제 T7 유전자 6, 뱀독 포스포다이에스터라아제, 비장 포스포다이에스터라아제, 써모코코스 리토랄리스 DNA 폴리머라제, 피로코코스 속(Pyrococcus sp.) GB-D DNA 폴리머라제, 람다(lambda) 엑소뉴클레아제, S. 아우레우스(S. aureus) 단구균 뉴클레아제, DNase I, 리보뉴클레아제 A, T1 단구균 뉴클레아제, 또는 당해 분야에 공지된 기타 뉴클레아제를 포함한다. 엑소뉴클레아제(15)는 뉴 잉글랜드 바이오랩(New England Biolabs; 미국 마이애미주 비벌리 소재), 아머샴 파마시아 바이오테크(미국 뉴저지주 피스카타웨이 소재), 프로메가(미국 위스콘신주 메디슨 소재), 시그마 케미칼스(Sigma Chemicals; 미국 미주리주 세인트 루이스 소재) 또는 베링거 맨하임(미국 인디아나주 인디아나폴리스 소재)과 같은 상업원에서 시판중이다.
당해 분야의 숙련자는 엑소뉴클레아제(15) 활성을 갖는 효소가 핵산 분자(13)의 5' 말단, 3' 말단, 또는 어느 하나의 말단으로부터 뉴클레오타이드(16, 130)를 제거할 수 있음을 인식할 것이다.
이들은 RNA, DNA 또는 RNA 및 DNA(13) 모두에 대해 특이성을 나타낼 수 있다. 이들의 활성은 단일 또는 이중-스트랜드(13)의 사용에 의존할 수 있다. 이들은 염 농도, 온도, pH, 또는 2가 양이온에 의해 상이하게 영향을 받을 수 있다. 엑소뉴클레아제(15)의 이들 특성 및 기타의 특성이 당해 분야에 공지되어 있다. 본 발명의 특정한 실시양태에서, 엑소뉴클레아제(15)의 활성률은 검출 유니트(18, 180, 300)에 의해 뉴클레오타이드(16, 130)의 최적 분석률에 일치하여 촉진될 수 있다. 반응 챔버(11, 220) 내에서 온도, 압력, pH, 염 또는 2가 양이온 농도의 조절을 비롯한, 엑소뉴클레아제(15)의 활성률을 조절하는 다양한 방법이 공지되어 있다.
뉴클레오사이드 모노포스페이트(16, 130)이 일반적으로 엑소뉴클레아제(15)의 활성에 의해 핵산(13)으로부터 유리됨에도 불구하고, 본 발명의 실시양태는 유리 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오사이드(16, 130)의 임의의 특정한 형태의 검출에 제한되지 않고, 핵산(13)으로부터 유리될 수 있는 임의의 단량체(16, 130)를 포함한다.
반응 챔버 및 통합 칩
도 1에 예시된 바와 같이, 본 발명의 일부 실시양태는 수성 환경에서 고정화 표면(14), 핵산 분자(13), 엑소뉴클레아제(15) 및 뉴클레오타이드(16, 130)를 함유하도록 디자인된 반응 챔버(11, 220)를 포함하는 장치(10, 100, 210)에 관한 것이다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 반응 챔버(11, 220)는, 예컨대 펠레티에르(Pelletier) 소자를 삽입하거나 당해 분야에 공지된 기타 방법으로써 온도를 조절할 수 있다. 저부피 액체를 위한 온도 조절 방법이 공지되어 있다(미국 특허 제 5,038,853 호, 제 5,919,622 호, 제 6,054,263 호 및 제 6,180,372 호 참조).
본 발명의 특정한 실시양태에서, 반응 챔버(11, 220) 및 예컨대 폐기 포트, 핵산(13) 주입 포트, 나노입자 저장소(370), 엑소뉴클레아제 공급원(15) 또는 기타 유체 부분으로의 연결을 제공하기 위한 유동 경로(12), 미세유체 채널(110, 160, 260, 280) 또는 채널(120, 230, 240, 270, 350, 360)과 같은 임의의 관련된 유체 채널이 컴퓨터 칩 제조 및/또는 미세모세관 칩 제조 분야에 공지된 바와 같은 배치식 구성 방법으로 제조될 수 있다. 본 발명의 일부 실시양태에서는, 반응 챔버(11, 220) 및 유동 경로(12) 및/또는 미세유체 채널(120, 160, 260, 280)과 같은 장치(10, 100, 210)의 기타 성분이 단일 통합 칩으로서 제조될 수 있다. 이러한칩은 사진석판술 및 에칭과 같은 당해 분야에 공지된 방법에 의해 제조될 수 있다. 그러나, 제조 방법은 비제한적이며, 레이저 절제, 사출 성형, 주조, 분자 빔 에피택시(epitax), 딥-펜 나노석판술, 화학 증착(CVD) 구성, 전자 빔 또는 집중 이온 빔 기술 또는 인상 기법과 같은 당해 분야에 공지된 기타 방법이 사용될 수 있다. 나노전자기계 시스템의 제조 방법이 본 발명의 특정한 실시양태에 사용될 수 있다(예컨대, 문헌[Craighead, Science 290, 1532-1536, 2000] 참조). 미세구조의 칩은, 예컨대 칼리퍼 테크놀러지 인코포레이티드(Caliper Technologies Inc.; 미국 캘리포니아주 마운틴 뷰 소재) 및 아클라라 바이오사이언스 인코포레이티드(ACLARA BioSciences Inc; 미국 캘리포니아주 마운틴 뷰 소재)에서 시판중이다.
검출 유니트(18, 180, 300)에 의해 뉴클레오타이드(16, 130)의 검출을 돕기 위하여, 유동 경로(12) 또는 관류 셀(170, 290)을 포함하는 물질이 여기상태의 전자기 조사 및 검출 유니트(18, 180, 300)에 사용되는 방출 주파수에 투과되도록 선택될 수 있다. 유리, 규소, 및 라만 분광법에 사용되는 파장에 일반적으로 투과되는 임의의 기타 물질이 사용될 수 있다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 검출 유니트(18, 180, 300)에 대향하는 유동 경로(12) 또는 관류 셀(170, 290)의 표면은 은, 금, 백금, 구리, 알루미늄 또는 검출 유니트(18, 180, 300)에 비교적 불투명한 기타 물질로 코팅될 수 있다. 상기 위치에서, 불투명 물질은 검출 유니트(18, 180, 300)의 작용을 방해하지 않고, 예컨대 SERS에 의해 라만 신호를 증강시키는데 이용가능하다. 다르게는, 유동 경로(12) 또는 관류 셀(170, 290)은 은, 금, 백금, 구리, 알루미늄 또는 기타의 라만 신호 증강 금속을 포함하는 메쉬를 함유할 수 있다.
유동 경로 및 미세유체 채널
본 발명의 특정한 실시양태에서, 핵산(13)으로부터 방출된 뉴클레오타이드(16, 130)는 검출 유니트(18, 180, 300)를 통과하여 유동 경로(12) 및/또는 미세유체 채널(110, 160, 260, 280)로 이동한다. 뉴클레오타이드(16, 130)의 수송을 위한 기법의 비제한적 예는 미세유체 기법을 포함한다. 유동 경로(12) 및/또는 미세유체 채널(110, 160, 260, 280)은 미세모세관(예컨대, 미국 캘리포니아 주 마운틴 뷰 소재의 아클라라 바이오사이언스에서 시판중임) 또는 액체 통합 회로(예컨대, 미국 캘리포니아주 마운틴 뷰 소재의 칼리퍼 테크놀러지스 인코포레이티드에서 시판중임)를 포함할 수 있다.
본 발명의 특정 양태에서, 검출되는 뉴클레오타이드(16, 130)는 용매의 벌크한 유동에 의하여 유동 경로(12) 및/또는 미세유체 채널(110, 160, 260, 280)을 하향 이동한다. 본 발명의 다른 양태에서, 마이크로모세관 전기영동을 이용하여 뉴클레오타이드(16, 130)를 유동 경로(12) 및/또는 미세유체 채널(110, 160, 260, 280)을 따라 하향 수송할 수 있다. 일반적으로 마이크로모세관 전기영동은 특정 분리 매질로 충진되거나 충진되지 않은 얇은 모세관 또는 채널의 사용을 포함한다. 적당히 하전된 분자종, 예컨대 음전하로 하전된 뉴클로오타이드(16, 130)의 전기영동은 장치(10, 100, 210)의 반응 챔버(11, 220) 측은 음으로, 검출 유니트(18, 180, 300) 측은 양으로 형성된 전기장에 반응하게 된다. 전기영동은 마이크로모세관에 동시에 부가되어 구성성분의 혼합물의 크기 분리에 종종 사용되지만, 이는 또한 핵산(13)으로부터 연속적으로 유리되는 비슷한 크기의 뉴클레오타이드(16, 130)을 수송하는데 사용될 수 있다. 퓨린 뉴클레오타이드(A, G)(16, 130)은 피리미딘 뉴클레오타이드(C, T, U)(16, 130)보다 더 크기 때문에 더 천천히 이동하고, 유동 경로(12) 및/또는 미세유체 채널(110, 160, 260, 280)의 길이 및 검출 유니트(18, 180, 300)를 지나는 대응하는 이동 시간을 최소로 유지하여 다른 이동을 방지하여 핵산(13)으로부터 유리되는 뉴클레오타이드(16, 130)의 순서가 섞이지 않도록 할 수 있다. 선택적으로, 매질 충진 마이크로모세관을 선택하여 유동 경로(12) 및/또는 미세유체 채널(110, 160, 260, 280)을 하향으로 지나는 퓨린 및 피리미딘 뉴클레오타이드(16, 130)의 이동 속도를 유사하거나 동일하게 할 수 있다. 마이크로모세관 전기영동법은, 예컨대, 문헌 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA,Woolley 및 Mathies, 91:11348-352, 1994]에 개시되어 있다.
본 발명의 특정 양태에서, 유동 경로(12) 및/또는 미세유체 채널 110, 160, 260, 280은 글리세롤 용액과 같은 상대적으로 고 점도의 수용액을 함유할 수 있다. 이러한 고점도 용액은 유동 속도를 감소시켜, 예컨대, 뉴클레오타이드(16, 130)를 나노입자(140)로 가교시키는데 이용가능한 반응 시간을 증가시키는 역할을 한다.
마이크로모세관 전기영동 장치를 포함하여, 마이크로유동 장치의 마이크로제작을, 예컨대, 문헌 [Anal. Biochem, Jacobsen 등, 209:278-283, 1994]; 문헌 [Anal. Chem., Effenhauser 등, 66:2949-2953, 1994]; 문헌 [Science, Harrison 등, 261:895-897, 1993] 및 미국 특허 제 5,904,824 호에 개시하고 있다. 이러한 방법은 표준 사진평판술 또는 초점 이온 광선 기법, 또는 실리카, 실리콘 또는 다른결정성 기질 또는 칩상에 마이크론 크기의 채널을 사진평판 에칭하는 방법을 사용하여 만들어진 실리콘 마스터와의 마이크로주조 기법을 포함한다. 이러한 기법은 개시된 방법 및 장치에서 사용하기 위하여 쉽게 개작될 수 있다. 본 발명의 몇 몇 양태에서, 마이크로모세관을 당해 기술분야에서 공지된 기법을 사용하여, 반응 챔버(11, 220)의 제작을 위하여 사용되는 동일 재료로부터 제작할 수 있다.
검출 단위
본 발명의 여러 양태에서, 라만 분광법으로 뉴클레오타이드(16, 130)를 검출하고 정량하기 위하여 검출 유니트(18, 180, 300)를 고안하였다. 라만 분광법에 의한 뉴클레오타이드(16, 130)의 검출 방법은 당해 기술 분야에 공지되어 있다(미국 특허 제 5,306,403 호; 제 6,002,471 호; 제 6,174,677 호 참조). 표면 증강된 라만 분광법(SERS), 표면 증강된 공명 라만 분광법(SERRS) 및 간섭성 반스톡스 라만 분광법(CARS)에 관한 변형이 개시되어 있다. 라만 검출의 감도는 은, 금, 백금, 구리 또는 알루미늄 표면과 같은 거친 금속 표면에 인접한 분자에 대하여 106이상의 인자로 향상된다.
라만 검출 유니트(18, 180, 300)의 비제한적인 예는 미국 특허 제 6,002,471 호에 개시되어 있다. 여기 광선(20, 330)이 532nm 파장의 2배 진동수 Nd:YAG 레이저(19, 320) 또는 365nm 파장의 2배 진동수 Ti:사파이어 레이저(19, 320)에 의하여 생성된다. 펄스 레이저 광선(20, 330) 또는 연속 레이저 광선(20, 330)이 사용될 수 있다. 여기 광선(20, 330)은 공초점 렌즈 및 현미경 대물렌즈를 통과하고, 유동경로(12) 및/또는 관류 셀(170, 290)으로 집중된다. 뉴클레오타이드(16, 130)로부터의 라만 방출광은 현미경 대물렌즈 및 공초점 렌즈에 의하여 수집되어 스펙트럼 분리를 위한 단색화장치에 결합된다. 공초점 렌즈는 잡음 신호를 감소하기 위하여 이색성 필터, 장벽 필터, 공초점 핀홀, 렌즈 및 거울의 조합을 포함한다. 공초점 렌즈 뿐 아니라 표준 충진 필드 렌즈도 사용될 수 있다. 라만 방출 신호는 라만 검출기(21, 310)에 의하여 검출되며, 이는 신호의 카운트 및 디지털화를 위한 컴퓨터와 인터페이스로 연결된 전자사태 광다이오드를 포함한다.
라만 검출 유니트(18, 180, 300)의 다른 예는 미국 특허 제 5,306,403 호에 개시되어 있며, 이는 단일-광자 계수 방식으로 작동되는 갈륨-아세나이드 광전자 배증관(RCA 모델 C31034 또는 불 인더스트리스(Burle Industries) 모델 C3103402)과 함께 스펙스 모델(Spex Model) 1403 이중-그레이팅 분광광도계(21, 310)를 포함한다. 여기 공급원(19, 320)은 스펙트라피직스(SpectraPhysics)사의 모델 166으로부터의 514.5nm 선의 아르곤-이온 레이저(19, 320) 및 코히어런트(Coherent)사의 이노바(Innova) 70의 647.1nm 선의 크립톤-이온 레이저(19, 320)를 포함한다.
선택적인 여기 공급원(19, 320)은 레이저 사이언스 인코포레이티드(Laser Science Inc.)의 337nm의 질소 레이저(19, 312) 및 린코녹스(Linconox)사의 325nm의 헬륨-카드뮴 레이저(19, 320)(미국 특허 제 6,174,677 호), 광 방출 다이오드 19, 320, Nd:YLF 레이저(19, 320) 및/또는 여러 이온 레이저(19, 320) 및/또는 색조 레이저(19, 320)를 포함한다. 여기 광선(20, 330)은 코리온(Corion)사의 밴드패스 필터로 스펙트럼 정제하고 뉴포트(Newport)사의 모델 L6X의 6X 대물렌즈를 사용하여 유동 경로(12) 및/또는 관류 셀(170, 290)로 집중될 수 있다. 대물 렌즈는 뉴클레오타이드(16, 130)을 여기하고 라만 신호를 수집하는데 사용될 수 있고, 카이저 옵티컬 시스템즈 인코포레이티드(Kaiser Optical Systems, Inc.) 모델 HB 647-26N18의 홀로그래픽 광선 스플리터를 사용하여 직각의 기학학적 구조를 갖는 여기 광선(20, 330) 및 방출된 라만 신호를 생성한다. 카이저 옵티컬 시스템즈 인코포레이티드의 홀로그래픽 노치 필터는 레일레이(Rayleigh) 산란 방사선을 감소시키는데 사용된다. 선택적인 라만 검출기(21, 310)는 프린스톤 인스트루먼츠(Princeton Instruments)사의 적색-증진된 강화된 전하-결합 장치(RE-ICCD) 검출 시스템을 갖춘 ISA HR-320 분광기를 포함한다. 다른 유형의 검출기(21, 310)를 사용할 수 있는데, 예컨대 미카엘슨 인터페로미터스(Michaelson Interferomenters)사의 퓨리에-변환 분광기, 하전된 주입 장치, 광다이오드 어레이, INGaAs 검출기, 전자-증폭된 CCD, 강화된 CCD 및/또는 광트랜지스터 어레이를 사용할 수 있다.
라만 분광법 또는 당해 기술분야에 공지된 관련 기법의 적절한 형태 또는 배열이 뉴클레오타이드(16, 130)의 검출에 사용될 수 있는데, 이는 정상적인 라만 산란, 공명 라만 산란, 표면 증강된 라만 산란, 표면 증강된 공명 라만 산란, 간섭성 반스톡스 라만 분광법(CARS), 자극된 라만 산란, 역 라만 분광법, 자극된 수득 라만 분광법, 하이퍼-라만 산란, 분자 광학 레이저 시험장치(MOLE) 또는 라만 마이크로탐침 또는 라만 현미경 또는 공초점 라만 마이크로분광계, 3차원 또는 스캐닝 라만, 라만 포화 분광법, 시간 분석 공명 라만, 라만 디커플링 분광법 또는 UV-라만 현미경을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
정보 처리 및 제어 시스템 및 데이터 분석
본 발명의 특정 양태에서, 핵산 서열분석 장치(10, 100, 210)는 정보 처리 시스템을 포함할 수 있다. 개시된 방법 및 장치(10, 100, 210)는 사용되는 정보 처리 시스템의 유형에 대하여 제한을 두지 않는다. 예시적인 정보 처리 시스템은 정보를 보내는 버스 및 정보를 처리하는 프로세서를 포함하는 컴퓨터를 편입할 수 있다. 본 발명의 한 양태에서, 프로세서는 프로세서의 펜티엄(Pentium, 등록상표) 족으로부터 선택되는데, 이는 미국 캘리포니아주의 산타클라라 소재의 인텔 코포레이티드(Intel Corp.)의 펜티엄 II 족, 펜티엄 III 족 및 펜티엄 4 족의 프로세서를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 선택적인 양태에서, 프로세서는 미국 캘리포니아주 산타 클라라 소재의 인텔 코포레이티드의 셀러론(Celeron, 등록상표), 이타늄(Itanium, 등록상표) 또는 펜티엄 제온(Pentium Xeon, 등록상표) 프로세서일 수 있다. 본 발명의 여러 다른 양태에서, 프로세서는 인텔(Intel, 등록상표) IA-32 또는 인텔 IA-64 아키텍처와 같은 인텔 아키텍처를 기초로 할 수 있다. 선택적으로 다른 프로세서를 사용할 수 있다. 정보 처리 및 제어 시스템은 메모리, 디스플레이, 키보드 및/또는 기타 장치와 같은 당해 기술분야에 공지된 부수 장치를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 특정 양태에서, 검출 유니트(18, 180, 300)는 정보 처리 시스템에 실시가능하게 결합될 수 있다. 검출 유니트(18, 180, 300)로부터의 데이터는 프로세서 및 메모리에 저장된 데이터에 의하여 처리될 수 있다. 표준 뉴클레오타이드(16, 130)에 대한 방출 프로파일에 대한 데이터를 또한 메모리에 저장할 수 있다.프로세서는 핵산 분자(13)로부터 유리된 뉴클레오타이드(16, 130)의 유형을 동정하기 위하여 유동 경로(12) 및/또는 관류 셀(170, 290)내의 뉴클레오타이드(16, 130)로부터의 방출 스펙트럼을 비교할 수 있다. 또한 메모리는 핵산 분자(13)로부터 유리되는 뉴클레오타이드(16, 130)의 서열을 저장할 수 있다. 프로세서는 검출 유니트(18, 180, 300)로부터의 데이터를 분석하여 핵산(13)의 서열을 결정할 수 있다. 또한 정보 처리 시스템은 겹치는 신호가 검출될 때 잡음 신호의 제거 및 "베이스-콜링(base-calling)" 측정과 같은 표준 과정을 실시할 수 있다.
개시된 방법은 프로그램된 프로세서 하에서 실시될 수 있으므로, 본 발명의 선택적인 양태에서, 본 방법은 필드 프로그래머블 게이트 어레이즈(Field Programmable Gate Arrays)(FPGAs), TTL 로직 또는 어플리케이션 스페시픽 인테그레이티드 서큐츠(Application Specific Integrated Circuits)(ASICs)와 같은 프로그램 가능하거나 하드코드된 논리에 의하여 완전히 또는 부분적으로 실행될 수 있다. 더욱이, 개시된 방법은 프로그램된 일반적인 목적의 컴퓨터 구성성분 및/또는 통상적인 하드웨어 구성성분의 조합에 의하여 실시될 수 있다.
데이터 수집 작업후, 데이터는 전형적으로 기록되어 데이터 분석 작업에 들어간다. 분석 작업을 용이하게 하기 위하여 검출 유니트(18, 180, 300)에 의하여 수득한 데이터는 상기한 바와 같은 디지털 컴퓨터를 사용하여 전형적으로 분석된다. 전형적으로, 컴퓨터는 검출 유니트(18, 180, 300)로부터 데이터의 수집과 저장 및 수집된 데이터의 분석과 기록을 위하여 적절하게 프로그램된다.
본 발명의 특정 양태에서, 통상적으로 고안된 소프트웨어 패키지는 검출 유니트(18, 180, 300)로부터 수득한 데이터를 분석하는데 사용될 수 있다. 본 발명의 선택적인 양태에서, 정보 처리 시스템 및 공개적으로 입수가능한 소프트웨어 패키지를 사용하여, 데이터 분석을 실시할 수 있다. DNA 서열 분석용으로서 입수가능한 소프트웨어의 비제한적인 예는 미국 캘리포니아주 포스터 시티 소재의 어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems)사의 프리즘(PRISM, 상표) DNA 서열 분석 소프트웨어, 미국 미시간주 앤 아버(Ann Arbor)소재의 진 코즈(Gene Codes)사의 시퀀처(Sequencher, 상표) 패키지 및 웹사이트 www.nbif.org/links/1.4.1.php.의 내셔널 바이오테크놀로지 인포메이션 패실리티(National Biotechnology Information Facility)로부터 입수가능한 다양한 소프트웨어 패키지를 포함한다.
실시예 1
라만 라벨화 뉴클레오타이드를 사용한 핵산 서열분석
도 1에서 예시된 바와 같이, 본 발명의 특정 실시양태는 반응 챔버 (11, 220)에 고정된 표면(14)에 부착되고 분해 반응에서 해체되는 개별적인 단일-스트랜드 핵산 분자(13)의 서열에 관한 것이다. 본 발명의 이러한 양태에서, 반응 챔버(11, 220)는 핵산 분자(13)의 비부착된 말단(17)으로부터 동시에 하나의 뉴클레오타이드(16, 130)를 순서대로 제거하는 하나 이상의 엑소뉴클레아제(15)를 함유한다.
뉴클레오타이드(16, 130)가 방출됨에 따라, 이들은 검출 유니트(18, 180,300)을 통과하여 유동 경로(12) 아래로 이동한다. 검출 유니트(18, 180, 300)는 여기 광선(20, 330)을 방출하는 레이저와 같은 여기 공급원(19, 320)을 포함한다. 여기 광선(20, 330)은 방출된 뉴클레오타이드(16, 130)와 반응하여 전자가 더 높은 에너지 상태로 여기된다. 라만 방출 스펙트럼은 더 낮은 에너지 상태로 전자의 복귀를 초래하는 라만 분광 검출기(21, 310), 예컨대 분광계, 단색계 또는 CCD 카메라와 같은 전하결합장치(CCD)에 의해 검출된다.
반응 챔버 및 유동 경로의 제조
보로플로우트 유리 웨이퍼(미국 캘리포니아 산타아나 소재의 플레시젼 글래스 앤 옵틱(Precision Glass & Optics))는 농축된 HF(플루오르화 수소산)에서 짧은 기간 동안 예비-에칭되고 플라즈마-강화된 화학적 증기 퇴적(RECVD) 시스템(PEII-A, 미국 캘리포니아주 산 요세 소재의 테크닉스 웨스트(Technics West))중에 비결정성 실리콘 희생된 층의 퇴적전에 세정된다. 웨이퍼를 광저항체 쉬플리(Shipley) 1818(마이애미주 말보로우 소재)로 회전 코팅시키고 연하게 구운 회전 코팅된 헥사메틸다이실라잔과 함께 준비한다. 접촉 마스크 정렬기(미국 캘리포니아주 산 조세 소재의 퀸텔 코포레이션(Quintel Corp.) 소재)는 하나 이상의 광 저항체 층을 마스크 디자인으로 노출시키고 노출된 마이크로포지트 현상제 농축기(쉬플리) 및 물의 혼합물을 사용하여 제거한다. 현상된 웨이퍼는 단단하게 구워지고 노출된 무결정성 실리콘은 PECVD 반응기내에서 CF4(탄소 테트라플루오라이드) 플라즈마를 사용하여 제거된다. 웨이퍼는 화학적으로 농축된 HF로 에칭되어 반응 챔버 (11, 220) 및유동 경로(12)를 제조한다. 잔류한 광 저항체를 벗기고 무결정성 실리콘를 제거한다. 이 방법을 사용하여 약 50 내지 100㎛ 직경의 미세채널을 제조할 수 있다. 보다 적은 직경 경로는 공지된 방법, 예컨대 좁은 직경에 미세채널의 내부를 피복 또는 나노리쏘그래피, 집중시킨 전자 광선으로 집중시킨 이온 광선 또는 집중시킨 원자 레이저 기술을 사용하여 제조한다.
진입 정공은 다이아몬드 천공기(미국 오하이오주 웨스터빌 소재의 크리스탈리트(Crystalite))를 사용하여 에칭된 웨이퍼내로 구멍을 뚫었다. 마무리 칩을 프로그램가능한 진공 로(미국 캘리포니아 유케이파 제이. 엠. 네이 소재의 센투리온 브이피엠(Centurion VPM))내에 서로 열적으로 결합된 두 개의 상호적인 에칭되고 천공된 플레이트로 제조한다. 반응 챔버(11, 220) 및 유동 경로(12)가 혼입된 칩의 다른 대표적인 제조방법은 미국 특허 제 5,867,266 호 및 제 6,214,246 호에 개시되어 있다. 본 발명의 특정 실시양태에서, 2,500달톤의 분자량 절사값을 갖는 나일론 필터는 반응 챔버 (11, 220)과 유동 경로(12) 사이에 삽입되어 반응 챔버(11, 220)에 엑소뉴클레아제(15)가 남겨지는 것을 차단한다.
핵산 제조 및 엑소뉴클레아제 처리
인간 게놈 DNA는 샘브룩(1989) 등에 따라 정제한다. 밤(Bam) H1로 절단한 후, 게놈 DNA 단편을 피블루스크립트(pBluescript: 등록상표) 파지미드 벡터(미국 캘리포니아 라 욜라 소재의 스트레타진 인코포레이션(Stratagene Inc.))의 다중 클로닝 위치내로 삽입하여 이. 콜라이에서 기른다. 암피실린을 함유한 한천 배지상에 플레이팅한 후, 단일 집락을 서열분석을 위해 선별하고 자라게 한다. 게놈 DNA단편의 단일-스트랜드 DNA 카피를 보조 파지로 상호-감염에 의해 재수득한다. 단백질분해효소 K: 나트륨 도데실 설페이트(SDS)의 용액에서 절단한 후, DNA를 페놀 추출하고, 이어서 아세트산 나트륨(pH 6.5, 약 0.3M) 및 2-프로판올 0.8부피를 첨가하여 침전시킨다. DNA 함유 펠렛을 트리스-EDTA 완충액에 용해시키고 사용할 때까지 -20℃에서 저장한다. 아가로즈 겔 전기영동은 정제된 DNA의 단일 밴드를 나타낸다.
게놈 DNA 삽입 다음에 위치하는 공지된 피블루스크립트(등록 상표) 서열에 상보적인 M13 전방향 프라이머를 미드랜드 컬티파이드 리에전트 캄파니(Midland Certified Reagent Company)(미국 텍사스 미드랜드 소재)로부터 구입한다. 프라이머를 올리고뉴클레오타이드의 5' 말단에 부착된 바이오틴 부분을 함유하도록 공유결합적으로 변형시킨다. 바이오틴 기를 (CH2)6스페이서를 경유해서 공유결합시킨다. 바이오틴-라벨화 프라이머는 피블루스크립트(등록상표) 벡터로부터 제조된 ssDNA 주형 분자가 가수분해시킨다. 이어서, 프라이머-주형 복합체는 돌(Dorre)(Bioimaging 5: 139-152, 1997) 등에 따라 스트렙트아비딘 피복된 비드(14)에 부착시킨다. 적당한 DNA 희석액에서, 단일 프라이머-주형 복합체 서열 형상(10, 100, 210)의 반응 챔버(11, 220)내로 삽입된다.
변형된 T7 DNA 중합효소(미국 오하이오주 클레브랜드 소재의 유나이티드 스테이트 바이오케미칼 코포레이션(United States Biochemical Corp.))와 함께 배양한다. 반응 혼합물은 라벨링되지 않은 데옥시아데노신-5'-트리포스페이트(dATP)및 데옥시구아노신-5'-트리포스페이트(dGTP), 딕옥시게닌-라벨화 데옥시우리딘-5'-트리포스페이트(딕옥시게닌-dUTP) 및 로다민-라벨화 데옥시시티딘-5'-트리포스페이트(로다민-dCTP)를 함유한다. 중합 반응은 37℃에서 2시간동안 진행된다. 딕옥시게닌 및 로다민 라벨화 핵산 (13)의 합성 후, 주형 스트랜드를 라벨화 핵산(13)으로부터 분리하고 주형 스트랜드, DNA 중합효소 및 혼입되지 않은 뉴클레오타이드를 반응 챔버(11, 220)에서 세척한다.
엑소뉴클레아제(15) 활성은 엑소뉴클레이즈 III(15)를 반응 챔버 (11, 220)에 첨가하여 개시된다. 반응 혼합물을 pH 8 및 37℃에서 유지한다. 뉴클레오타이드(16, 130)이 핵산(13)의 3' 말단(17)으로부터 방출되는 경우 이들은 검출 유니트(18, 180, 300)을 통과해서 유동 경로(12) 아래로 미세유체 유동에 의해 전달된다.
라벨화 뉴클레오타티드의 검출
검출 유니트(18, 180, 300)는 레이저(19, 320) 및 라만 검출기(21, 310)를 포함한다. 여기 광선(20, 330)은 근적외선 파장(750 내지 950nm)에서 티탄:사파이어 레이저(19, 320)(분광-물리에 의한 해일) 또는 785nm 또는 830nm에서 갈륨 알루미늄 아르세니드 다이오드 레이저(19, 320)(처리 장치의 PI-ECL 시리즈)로 발생된다. 진동하는 레이저 광선(20, 330) 또는 연속적인 광선(20, 330)을 사용할 수 있다. 여기된 광선(20, 330)은 수집된 광선과 함께 동일 선상으로 이색성 거울(카이저(Kaiser) 광학에 의해 홀로그라피 노치 필터 또는 크로마(Chroma) 또는 오메가(Omega) 광학에 의한 간섭 필터)에 의해서 반사된다. 반사된 광선은 현미경 대물렌즈(니콘(Nikon) LU 시리즈)를 통과하고 마이크로-웰, 유동 경로(미세채널)(12)또는 표적 뉴클레오타이드(16, 130)이 위치한 관류 셀(170, 290)에 초점을 맞춘다. 표적 뉴클레오타이드(16, 130)으로부터 라만 산란된 광은 동일한 현미경 대물렌즈로 수집되고 이색성 거울이 라만 검출기(21, 310)로 통과한다. 라만 검출기(21, 310)은 초점 렌즈, 분광그래프 및 배열 검출기로 구성된다. 초점 렌즈는 분광그래프의 투입 슬릿을 통해서 라만 산란된 광에 초점을 맞춘다. 분광그래프(로퍼사이언티픽(RoperScientific))는 그것의 파장으로 광을 분산하는 회절 격자를 포함한다. 분산된 광은 배열 검출기상에 이미지화된다(로퍼사이언티픽에 의한 역-발광된 딥-디플리션 CCD 카메라). 배열 검출기는 조절기 회로로 연결되고 데이터 전송용 컴퓨터 및 검출기(21, 310) 기능의 조절로 연결된다.
라만 검출기(21, 310)은 검출기(21, 310)를 통과하여 이동하는 dATP, dGTP, 로다민-dCTP 및 딕옥시게닌-dUTP의 단일 뉴클레오타이드 (16), (130)을 검출 및 동정할 수 있다. 라벨화 뉴클레오타이드 검출용 시간 과정상 데이터는 핵산 (13)의 서열을 수득해서 번역하고 분석한다.
실시예 2
나노입자에 공유결합 부착을 사용해서 핵산 서열분석
본 발명의 다른 전형적 양태는 도 2에 개시되어 있다. 뉴클레오타이드(16, 130)는 엑소뉴클레아제(15) 활성에 의해 핵산(13)으로부터 방출된다. 본 발명의 특정한 양태에서, 뉴클레오타이드(16, 130)은 라벨링되지 않는다. 이러한 양태는 프라이머 및 폴리머라제를 사용하여 상보 스트랜드(13)으로 라벨화 뉴클레오타이드의 혼입하는 것과 관련된 것이 아니다. 반대로, 기관, 조직 및/또는 세포 시료로부터 직접적으로 분리되거나 공지된 클로닝 방법에 의해 수득된 핵산(13)은 직접적으로 서열화될 수 있다. 본 발명의 일부의 양태에서, 단일-스트랜드 RNA 또는 DNA(13)의 단일 분자는 표면(14)의 표면에 부착되고 엑소뉴클레아제(15)로 처리될 수 있다. 방출된 뉴클레오타이드(16, 130)는 유동 경로(13) 아래로 이동한다. 유동 경로(12)는 미세유체 채널(110, 160, 260, 280)에 인접하거나 동일할 수 있다.
반응 챔버(11, 220)로부터 뉴클레오타이드(16, 130)는 금 및/또는 은 나노입자(140)와 혼합된다. 은 나노입자(140)는 이(Lee) 및 메이셀(Meisel)(J. Phys. Chem. 86: 3391-3395, 1982)에 따라 제조된다. 금 나노입자(140)를 폴리사이언스 인코포레이션(Polysciences, Inc.)(미국 펜실페니아주 웰링톤 소재)으로부터 구입한다. 금 나노입자(140)는 5, 10, 15, 20, 40 및 60nm 크기로 폴리사이언스 인코포레이션에서 시판중이다. 본 발명의 비제한적 실시예에서, 60nm 금 나노입자(140)를 사용한다.
뉴클레오타이드(16, 130)에 노출 이전에, 표면-변형된 나노입자 (140)는 실란, 예컨대 3-글리시드옥시프로필트라이메톡시실란(GOP), 반응 연결 화합물로 피복된다. GOP는 높은 반응성 에폭시 기 말단을 함유한다. 나노입자(140)는 GOP에 공유결합된 하이드록시 기를 함유하도록 변형된다. 실란화된 나노입자(140)는 뉴클레오타이드(16, 130)와 혼합되고 뉴클레오타이드(16, 130)와 공유결합 가교연결을 형성한다. 뉴클레오타이드-나노입자 착물(150)은 관류 셀(170, 290)을 통과하고 SERS, SERRS 및/또는 라만 검출 유니트(18, 180, 300)를 사용하는 CARS로 규명된다. 나노입자(140)에 뉴클레오타이드(16, 130)가 인접하기 때문에 라만 신호는 크게 증강되고 관류 셀(170, 290)을 통과하는 단일 뉴클레오타이드(16, 130)가 검출된다.
실시예 3
핵산 서열화 장치
도 3은 본 발명의 또다른 예시적 실시양태를 도시한 것이다. DNA 서열화 장치(10, 100, 210)는 유입 채널(230) 및 유출 채널(240)과 유체 연통되어 있는 반응 챔버(11, 220)를 포함한다. 유체 움직임은 하나 이상의 밸브(250)를 사용하여 제어될 수 있다. 미세유체 채널(130, 260)은 또한 반응 챔버(11, 220)와 유체 연통되어 있다. 엑소뉴클레아제(15) 작용에 의해 하나 이상의 핵산(13)으로부터 방출된 뉴클레오타이드(16, 130)는 미세유체 채널(110, 260)을 통해 반응 챔버(11, 120)에서 배출된다. 뉴클레오타이드(16, 130)는 미세유체 채널(110, 260)과 유체 연통되어 있는 나노입자 채널(120, 270)을 통해 이동하는 나노입자(140)와 혼합된다. 뉴클레오타이드(16, 130)의 나노입자(140)로의 공유 부착이 부착 채널(160, 280) 내에서 일어난다. 공유 결합된 뉴클레오타이드-나노입자 착체(150)는 뉴클레오타이드(16, 130)가 라만 검출 유니트(18, 180, 300)에 의해 규명되는 관류 셀(170, 290)을 통과한다. 검출 유니트(18, 180, 300)는 레이저(19, 320) 및 라만 검출기(21, 310)를 포함한다. 레이저는 관류 셀(170, 290) 내에서 뉴클레오타이드(16, 130)를 여기시키는 여기화 빔(20, 330)을 방출한다. 여기된 뉴클레오타이드(16, 130)는 라만 검출기(21, 310)에 의해 검출되는 라만 신호를 내보낸다.
본 발명의 특정 실시양태에서, 나노입자(140)는 재순환 챔버(340)에서 회수될 수 있다. 나노입자는 예컨대 산 용액으로 화학적 처리된 후, 세척되어 결합된 뉴클레오타이드(16, 130), 연결 화합물 및 임의의 다른 부착되거나 흡착된 분자를 제거한다. 나노입자(140)는 재순환 채널(360)을 거쳐 나노입자 저장소(370)로 재순환될 수 있다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 나노입자(140)는 재순환 채널(360) 및/또는 나노입자 저장소(370)에서 연결 화합물, 예컨대 GOP로 코팅될 수 있다. 폐기 유출물은 폐기물 채널(350)을 통해 재순환 챔버(340)로부터 제거된다.
본원에 개시되고 청구되는 모든 방법 및 장치는 본 발명의 개시내용에 비추어 부적당한 실험 없이 이루어지거나 행해질 수 있다. 다양한 변경안이 청구 대상의 개념, 취지 및 범위에서 벗어나지 않으면서 본원에 기재된 방법 및 장치에 적용될 수 있음이 당해 분야의 숙련자에게 자명할 것이다. 더욱 구체적으로는, 화학적으로 및 생리학적으로 모두 관련된 특정 약제는 동일하거나 유사한 결과가 달성되는 가운데 본원에 기재된 약제로 대체될 수 있음이 자명할 것이다. 당해 분야의 숙련자에 자명한 이러한 모든 유사한 대체안 및 수정안은 청구 대상의 취지, 범위 및 개념 내에 있는 것으로 간주된다.

Claims (30)

  1. (a) 뉴클레오타이드를 하나 이상의 핵산의 한 말단으로부터 연속적으로 제거하는 단계;
    (b) 각 뉴클레오타이드를 하나 이상의 나노입자에 부착시키는 단계;
    (c) 상기 뉴클레오타이드를 규명하는 단계; 및
    (d) 상기 핵산의 서열을 결정하는 단계
    를 포함하는 방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    핵산을 표면에 부착시키는 방법.
  3. 제 1 항에 있어서,
    나노입자를 하나 이상의 연결 화합물로 개질시키는 방법.
  4. 제 3 항에 있어서,
    뉴클레오타이드를 연결 화합물에 공유결합시키는 방법.
  5. 제 1 항에 있어서,
    뉴클레오타이드를 표면 증강 라만 분광계(surface enhanced Raman spectroscopy;SERS), 표면 증강 공명 라만 분광계(surface enhanced resonance Raman spectroscopy; SERRS) 및/또는 간섭성 반스톡스 라만 분광계(coherent anti-stokes Raman spectroscopy; CARS)에 의해 규명하는 방법.
  6. 제 1 항에 있어서,
    나노입자가 금 및/또는 은을 포함하는 방법.
  7. 제 6 항에 있어서,
    각 뉴클레오타이드를 단일 나노입자 또는 나노입자 응집물에 부착시키는 방법.
  8. 제 1 항에 있어서,
    뉴클레오타이드를 핵산 분자로부터 분리시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  9. 제 5 항에 있어서,
    뉴클레오타이드를 레이저로 여기시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  10. 제 9 항에 있어서,
    전하결합소자(CCD) 카메라를 사용하여 뉴클레오타이드를 규명하는 방법.
  11. 제 1 항에 있어서,
    각 뉴클레오타이드의 정체 및 각 뉴클레오타이드가 규명되는 시간을 기록하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  12. 제 1 항에 있어서,
    엑소뉴클레아제를 사용하여 뉴클레오타이드를 핵산으로부터 제거하는 방법.
  13. 제 1 항에 있어서,
    나노입자의 직경이 2㎚ 내지 2㎛인 방법.
  14. 제 13 항에 있어서,
    나노입자의 직경이 약 100㎚인 방법.
  15. (a) 라만 라벨에 부착된 뉴클레오타이드를 수득하는 단계;
    (b) 라벨화 뉴클레오타이드를 포함하는 핵산을 합성하는 단계;
    (c) 뉴클레오타이드를 핵산의 한 말단으로부터 제거하는 단계;
    (d) 라만 분광계에 의해 뉴클레오타이드를 확인하는 단계; 및
    (e) 핵산의 서열을 결정하는 단계
    를 포함하는 방법.
  16. 제 15 항에 있어서,
    핵산으로부터 제거된 뉴클레오타이드를 금속 코팅된 채널에 통과시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  17. 제 15 항에 있어서,
    각 유형의 뉴클레오타이드를 구별가능한 라만 라벨로 라벨링하는 방법.
  18. 제 15 항에 있어서,
    피리미딘 뉴클레오타이드만을 라만 라벨로 라벨링하는 방법.
  19. 제 15 항에 있어서,
    (i) 하나 이상의 주형 핵산 분자를 수득하는 단계;
    (ii) 상기 주형 핵산 분자를 프라이머에 혼성화시키는 단계; 및
    (iii) DNA 폴리머라제를 첨가하여 상기 핵산을 합성하는 단계
    를 추가로 포함하는 방법.
  20. 제 15 항에 있어서,
    뉴클레오타이드를 엑소뉴클레아제 활성에 의해 핵산으로부터 제거하는 방법.
  21. 제 20 항에 있어서,
    한 번에 하나의 핵산만을 엑소뉴클레아제 활성에 노출시키는 방법.
  22. 제 15 항에 있어서,
    라벨화 뉴클레오타이드를 표면 증강 라만 분광계(SERS), 표면 증강 공명 라만 분광계 및/또는 간섭성 반스톡스 라만 분광계(CARS)에 의해 규명하는 방법.
  23. 제 22 항에 있어서,
    뉴클레오타이드를 나노입자에 부착시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  24. (a) 반응 챔버;
    (b) 상기 반응 챔버와 유체 연통하는 제 1 채널;
    (c) 상기 제 1 채널과 유체 연통하는 제 2 채널;
    (d) 상기 제 1 및 제 2 채널과 유체 연통하는 관류 셀; 및
    (e) 상기 관류 셀과 연결되어 작동하는 검출 유니트
    를 포함하는 장치.
  25. 제 24 항에 있어서,
    검출 유니트가 라만 검출기를 포함하는 장치.
  26. 제 25 항에 있어서,
    검출 유니트가 레이저 및 CCD 카메라를 포함하는 장치.
  27. 제 24 항에 있어서,
    제 1 채널이 뉴클레오타이드를 함유하고, 제 2 채널이 나노입자를 함유하는 장치.
  28. 제 27 항에 있어서,
    뉴클레오타이드가 나노입자에 공유 부착되는 장치.
  29. 제 28 항에 있어서,
    뉴클레오타이드가 채널 내에서 나노입자에 공유 부착되는 장치.
  30. 제 28 항에 있어서,
    뉴클레오타이드를 나노입자에 공유 부착시킴으로써 라만 신호가 증강되는 장치.
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