JP4731570B2 - ラマン検出に基づくフローサイトメータ - Google Patents

Description

[0001]本発明は、一般にフローサイトメータ（flow cytometer;血球計算器具）に関し、より詳細には、計数される検体（specimen）を識別するために表面増強されたラマン分光計（Raman spectroscopy）を使用する可搬フローサイトメータに関する。

[0002]フローサイトメトリは、細胞又は粒子が、懸濁液内移動し、１つずつ検知点を通過するとき、細胞又は粒子のいくつかの光学特性を検知することによって、細胞又は粒子のいくつかの物理的及び化学的特徴を測定する良く知られている手段である。フローサイトメトリは、生物学及び医療分野で広く使用される。

[0003]一般的なフローサイトメータにおいて、粒子の単一のファイルフロー（file flow）が、シース流体（sheath fluid）内の懸濁された粒子の流体力学的な集束を使用して達成される。粒子は、次に光ビームによって個別に調べられる。ほとんどの現代のサイトメータにおいて、光源は、特定波長でコリーレント光を放出するレーザである。各粒子は、光ビームと相互作用し、各粒子によって生成される一般的に散乱され且つ任意の放出された蛍光光は収集される。散乱光を解析することによって、細胞サイズ、形状、及び内部複雑性などの物理的特徴が決定されることができる。任意の放出された蛍光光を収集することによって、蛍光成分によって検出されることができる任意の細胞成分又は機能が検査されることを可能にする。

[0004]伝統的なフローサイトメータは、粒子の原子又は分子構造に関する任意の情報を含まない、弾性散乱光（「レーリー散乱光」としても知られる）だけを検出する。そのようなフローサイトメータは、サイズ及び形状を識別できるが、分子又は細胞が、蛍光マーカで標識付けられなければ、それらは、類似するサイズであるが、化学的に異なる分子又は細胞を区別することができない。

[0005]原理的に、非弾性的に散乱光（「ラマン散乱光」としても知られる）を検出することは、各細胞又は分子が、その化学構造に基づく独特なラマンスペクトルを有するので、細胞又は分子の化学的特定を可能にする。しかしながら、ラマン散乱のための断面積は、レーリー散乱のための断面積より小さい約１／１５の強度である。これは、フローサイトメータ内の個別粒子のラマンスペクトルを得ることは、適切な強度の光源が無く、且つ任意の適切な感度の検出器が無いために、現実性の範囲を十分に超えることを意味する。しかしながら、ラマン断面積は、分子又は粒子が、適切に荒らされた貴金属表面と接触され、又は貴金属コロイド集合体と接触される表面増強されたラマン散乱として知られている技術によって劇的に増大されることができる。正しい条件下で、表面増強されたラマン散乱の断面積は、蛍光放出のための断面積に近づく。

[0006]粒子の化学的又は分子構造に主に基づいて個別粒子を識別することができるフローサイトメータのために、必要なものは、各粒子又は細胞がサイトメータ検知点を通過するとき、ラマンスペクトルが、各粒子又は細胞から得られることができるように、サイトメータ内の粒子又は細胞が、十分に大きな表面増強されたラマン散乱断面積を作る条件にあることを可能にする装置及び方法である。そのようなシステムは、全ての細胞又は粒子が、互いにいかにサイズ又は形状が類似していても、蛍光標識付けを全く必要とすることなく、全ての細胞又は粒子の個別の識別を可能にする。

本発明は、フローサイトメータが、主に個々の粒子の化学的又は分子構造によって個々の粒子を識別することを可能にするための方法及び装置に関する。本発明の好ましい実施形態において、化学的な識別は、個別の細胞又は分子が、フローサイトメータ内の検知点を通って流れるときに、個別の細胞又は分子であり得る粒子のラマンスペクトルを得ることによって達成される。粒子は、ラマン散乱断面積が表面増強されるように、適切な貴金属コロイド又はコロイド集合体に結合される。粒子は、次に、流体力学的に集束されたフロー流れを作ることができる流体制御モジュールによって単一ファイルに構成され、光源は、各粒子が検知点を通って流れるときに、各粒子を照明する。ラマン断面積が表面増強されるので、光源は、従来のレーザであり得る。

粒子によって非弾性的に散乱される（ラマン散乱）光は、収集され、表面増強されたラマンスペクトルは、適切な分散光学装置及び適切な検出器を使用して記録される。表面増強されたラマンスペクトルは、次に、その分子構造から粒子を識別するために解析されることができる。本発明の好ましい実施形態において、細胞粒子は、金又は銀コロイド懸濁液を含む試料調製容器内にある間に、超音波ソニフィケーション（sonification）によって金又は銀コロイド粒子と結合される。本発明のこれら及び他の態様は、添付の図面を参照することによって、より詳細に以下に記載される。

[0013]本発明のラマンに基づくフローサイトメトリは、個別分子を順次観察するために、弱め合わない分子特定ラマン分光計をフローサイトメータの能力と組み合わせることによって、試料内の個別に識別される粒子を計数する。

[0014]ラマンに基づくフローサイトメトリの実施における１つの困難性は、ラマン散乱が、非常に小さい断面積を有し、すなわち、試料上に集束された光ビーム内の非常にわずかなパーセンテージの光子だけが、ラマン（非弾性的に）散乱される。しかしながら、試料の有効ラマン断面積は、各分子が、貴金属コロイド又はコロイド集合体に結合される表面増強されたラマン散乱の技術によって増大されることができる。この結合は、例えば、貴金属コロイド溶液内で細胞のソニフィケーションによって行われることができる。

[0015]流体力学的に集束するサイトメータ技術は、次に、流体シース内のコア流れとして流れる、光源による個別調査の準備がされた単一ファイルに調製された分子を構成するために使用されることができる。流体力学的な集束は、以下に詳細に記載されるように、正確なポンピング及び試料の制御、並びに適切に設計されたチャネル内のシース流体を必要とする。

[0016]好ましくはレーザ源である高強度光源が、ラマン分光計によって、サイトメータコア流れ内を流れる分子上に集束され、非弾性的に散乱された光が収集され、検出され且つ解析されることができる。分子を識別するために、検出システムは、十分に詳細な分子の特徴ラマンスペクトルを提供する適切な波長選択要素を必要とする。[0017]個別分子に対するラマン検出に基づくサイトメータを実行するための要素を有する、本発明の例示的な実施形態は、可能である程度まで、同様の符号が同様の要素を示す添付の図面を参照して以下に詳細に議論される。

[0018]図１は、ラマン検出に基づくサイトメータの例示的な実施形態の断面図であり、機器筐体１０、取り外し可能なカートリッジ１２、加圧モジュール１４、制御電子装置１６、照明源１８、源操作光学装置２０、源集束光学装置２２、ラマン散乱光収集光学装置２４、光分散光学要素２６、及び光検出要素２８を備える。

[0019]図２は、ラマン検出に基づくサイトメータの例示的な可搬実施形態の概略図であり、蓄電池３４、照明源１８、照明操作及びコリメート光学モジュール３８、及び制御電子装置１６を有する下部部分３２と、散乱された光検出及び分散モジュール４０、光検出要素２８、手動加圧ユニット４４、第１の圧力室７２ａ、７２ｂ、及び７２ｃ、第２の圧力室７４ａ、７４ｂ、及び７４ｃ、第１の弁７６ａ、７６ｂ、及び７６ｃ、並びに第２の組の弁７８ａ、７８ｂ、及び７８ｃを備える上方部分３０、並びに、試料供給ルーメン４８、流体制御ユニット５０、フロー流れ５２、ラマン室６１、及び排出容器５４を備える取り外し可能なカートリッジ１２を備える。取り外し可能なカートリッジ１２は、カートリッジが大量生産され且つ廃棄されることを可能にする成形プラスチックなどの材料で主に作られることができる。

[0020]図３は、本発明の取り外し可能なカートリッジ１２の例示的な実施形態の概略図であり、流体制御ユニット５０は、超音波源５５、試料調製容器５６、試料貯蔵容器５８、シース流体容器６０、フローセンサ６２ａ、６２ｂ、及び６２ｃ、流体力学的集束モジュール６４、シース流体５１がコア流れ５１を囲むフローチャネル５２を備える。

[0021]試料は、オフラインで又は試料調製容器５６内で調製されることができる。分子のラマン断面積を増強する試料調製技術の例は、例えば、その内容が参照によって本明細書に組み込まれる、Kneippらの「Surface-Enhanced Raman Spectroscopy in Single Living Cells Using Gold Nanoparticles」との名称の論文、Applied Spectroscopy、第５６巻、第２号、２００２年、頁１５０〜１５４に詳細に記載されるように、液体相取り込み又はソニフィケーションによってコロイド状の金で細胞を充填することを含む。分子は、例えば、その内容が参照によって本明細書に組み込まれる、Lendlらの「Flow Analysis-based Surface-Enhanced Raman Spectroscopy Employing Exchangable Microbeads as SERS-active Surfaces」との名称の論文、Applied Spectroscopy、第５４巻、第７号、２０００年、頁１０１２〜１０１８に詳細に記載されるように、貴金属（銅、金、銀、白金、パラジウム、及びイリジウム）コロイドで充填されたマイクロビーズにそれらを取り付けることによって、増強されたラマン断面積も有することができる。

貴金属コロイドは、例えば、その内容が参照によって本明細書に組み込まれる、Kneipeらの「Single Molecule Detection Using Surface-Enhanced Raman Scattering(SERS)」との論文、Physical Review Letters、第７８巻、第９号、１９９７年、頁１６６７〜１６７０に詳細に記載されるように、個々の分子を取り付けるために適したクラスタに集合させるために作られることもできる。分子は、貴金属コロイドで充填され又は被覆されるリポソーム（liposome;細胞内脂肪粒子）などの微細構造体に取り付けられることもできる。分子自体は、貴金属コロイドで被覆されることもできる。細胞粒子を貴金属コロイド粒子に結合する他の可能な方法は、それに限定されず、個別細胞内への金属コロイドの手動の注入、発射体としての金属コロイド粒子の処理、及び細胞粒子内でのそれらの焼成を含む。

[0022]個別細胞のラマンに基づくサイトメトリのために意図された好ましい実施形態において、試料調製容器５６は、制御電子装置１６によって制御されることができる超音波源５５に隣接する。試料調製容器５６は、６０ｎｍの金ナノ粒子の集合されたクラスタを含む細胞支持緩衝溶液を含む。一旦、試料細胞が緩衝溶液内に供給されると、短いバーストの超音波が、細胞膜を裂き、細胞によって金コロイドが取り込まれることを可能にする。超音波の停止時に、細胞膜は、一般に数秒内に自己焼き戻される。

[0023]調製された試料流体は、次に試料調製容器５６から試料貯蔵容器５８内に供給される。試料流体は、次に、例えば、その内容が参照によって本明細書に組み込まれる、２００３年７月２２日にＣａｂｕｚらへ発行された、名称「Portable Flow Cytometry」の米国特許第６５９７４３８号に詳細が記載されるような、流体力学的な集束を実行するために構成された流体回路であり得る、流体力学的集束モジュール６４内に供給される。流体力学的集束は、フローチャネル５２内のシース流体５１によって囲まれる単一ファイルの長いコア流れ５３内へ試料の分子を入れる。シース流体５１の速度は、好ましくは、コア流れ５３の約９倍である。さらに、シース流体５１及びコア流れ５３の速度は、フローチャネル５２内の層流を維持するために十分に低いままである。

[0024]好ましい実施形態において、シース流体及び試料流れの必要な速度は、全て制御電子装置１６の下で閉フィードバックループにおいて動作する、圧力室４６ｂ及び４６ｃを介して流体容器５８及び６０に結合される手動の加圧ユニット４４と、流体フローセンサ６２ｂ及び６２ｃとを組み合わせることによって提供される。

[0025]手動の加圧ユニット４４は、例えば、逆止弁を有する手動で動かされるプランジャ又はバルブであり得る。いずれの場合においても、手動で生成された圧力は、好ましくは、第１の圧力室７２ａ、７２ｂ、及び７２ｃに提供される。第１の弁７６ａ、７６ｂ、及び７６ｃは、次に、第２の圧力室７４ａ、７４ｂ、及び７４ｃに第１の圧力室７２ａ、７２ｂ、及び７２ｃ内の圧力を制御可能に放出するために提供される。第２の弁７８ａ、７８ｂ、及び７８ｃは、第２の圧力室７４ａ、７４ｂ、及び７４ｃ内の圧力を制御可能に通気するために第２の圧力室７４ａ、７４ｂ、及び７４ｃ内に提供されることができる。一般に、プログラム可能なマイクロプロセッサを備える制御電子装置１６は、対応する下流側流体流れ内の流体流れが、第１のいくつかの値未満に低下するときに、第１の弁７６ａ、７６ｂ、及び７６ｃを開き、下流側流体流れ内の流体流れが、第２のいくつかの値を超えて増大するときに、第２の通気弁７８ａ、７８ｂ、及び７８ｃを開く。各弁は、好ましくは、この個別にアドレス可能であり且つ制御可能である静電的に作動されるマイクロ弁のアレイである。流体フローセンサ６２ａ、６２ｂ、及び６２ｃは、好ましくは、熱風速計タイプのフローセンサである。

[0026]シース流体５１によって囲まれる、単一ファイルに構成された試料粒子を含む流体力学的に集束されたコア流れ５３は、フローチャネル５２を通してラマン室６１内へ流れ込む。

[0027]図４は、ラマン検出に基づくサイトメータの例示的な実施形態のサイトメータフローチャネルの断面図であり、フロー流れ５２、上方ガラス基板５６及び下方ガラス基板５４、照明マイクロレンズ５８、検出マイクロレンズ６０、源通過フィルタ６４及び源吸収フィルタ６６、試料粒子を含む集束されたコア流れ５３を備える。

[0028]図５は、ラマン検出に基づくサイトメータの例示的な実施形態の照明及び検出光学装置の概略図であり、照明源１８、源集束光学装置２２、試料粒子６８を含む集束されたコア流れ５３、ラマン散乱光収集光学装置２４、光分散光学要素２６、及び光検出要素２８を備える。[0029]好ましい実施形態において、ラマン室６１は、ガラス基板５６及び５４、フローチャネル５２、マイクロレンズ５８及び６０、源通過フィルタ６２、並びに源吸収フィルタ６４及び６６を備える。

[0030]光源１８によって放出された光は、ビーム操縦及びコリメート光学装置３８によって、コリメートされたビームとしてマイクロレンズ５８に向けられる。マイクロレンズ５８は、源通過フィルタ６２を通った光をコア流れ５３内の粒子に集束する。コア流れ４２内の粒子からの非弾性（ラマン）散乱された光は、源吸収フィルタ５６を通過し、マイクロレンズ６０並びに操縦及び弁別光学装置４０によって検出器２８に向かって向けられる。

[0031]光源１８は、ラマン分光計に適した波長、パワー、及び偏光を有するレーザ又はレーザのアレイであり得る。従来技術の光源は、２００ｍＷのパワーを集束して試料で約２×１０^５Ｗ／ｃｍ^２まで低下させる８３０ｎｍで動作する、アルゴンイオンでポンピングされるＴｉ：サファイヤレーザを含む。他の適切な光源は、１０６４ｎｍで動作するＮｄ：Ｙａｇレーザ、及び６３２．８ｎｍで動作するヘリウムネオンレーザを含む。垂直空洞表面放出レーザ（ＶＣＳＥＬ）は、可搬実装に特に適している。８５０ｎｍから６７０ｎｍの範囲の波長で動作するＶＣＳＥＬが利用可能である。１０×１０ミクロンの放出表面のＶＣＳＥＬは、一般的に約１ｍＷのパワーを有し、約１０ミクロンのガウシアンスポットに集束されたとき、約１×１０^３Ｗ／ｃｍ^２のパワー密度を作る。任意の適切な固体レーザが、光源１８として使用されることができる。

[0032]光源１８は、源側方位置又はコア流れ５３からの距離のいずれか、又は両方が、最適な散乱を達成するために調整されることができるように、１つ以上のステッパモータに移動可能に取り付けられた固体レーザ又はダイオードレーザなどの単一の光源であることもできる。コア流れ５３に対する焦点及び／又は横方向変位におけるそのような可動源の調整は、コア流れ５３とシース流体５１との間の屈折率における差によって反射される光に応答するフィードバックループを含むことができる。調整フィードバックループは、例えば、コア流れ内の関心の分子で分散された、追跡又は較正マイクロビーズから反射又は散乱された光を使用することによって達成されることもできる。

[0033]操縦及び弁別光学装置４０及び検出器２８は、例えば、Bilerica、MAのBruker Optics、Inc.によって供給される電荷結合デバイス検出器（ＣＣＤ）を有するSentinal Raman Spectrometerであり得る。検出器２８は、任意の他の低雑音の高量子効率マルチチャネル検出器又はＣＣＤアレイでもあり得る。操縦及び弁別光学装置モジュールは、フィルタ、音響光学調整可能なフィルタ（ＡＯＴＦ）、格子、回折光学装置、及びホログラム光学装置の任意の適切な組み合わせも備えることができる。好ましい実施形態において、操縦及び弁別光学装置モジュールは、波長選択を検出器２８上に収集されたラマン散乱光を集束することに組み合わせる、適切なホログラム回折格子である。

[0034]源通過フィルタ６２は、源波長だけを帯域通過する被覆であり、それによってフローチャネル前に生じる収集ラマン散乱光を排除する。任意の適切な良く知られている多層又はホログラム帯域通過フィルタが、使用されることができる。[0035]源吸収フィルタ６４及び６６は、源波長を排除する被覆であり、それによってフローチャネル後のラマン散乱を排除する。任意の適切な良く知られている多層又はホログラム帯域通過フィルタが、使用されることができる。[0036]一旦、コア流れ５３及び周囲シース流体５１は、ラマン室６１を通過すると、それらは、排出容器５４内に排出する。

[0037]本発明は、構造特徴及び／又は方法論的作用に特定の用語で記載されるが、添付の請求項で規定される発明は、必ずしも記載される特定の特徴又は作用に限定されないことが理解されるべきである。むしろ、特定の特徴又は作用は、請求された発明を実施する例示的な形態として開示される。

ラマン検出に基づくサイトメータの例示的な実施形態の断面図である。 ラマン検出に基づくサイトメータの例示的な実施形態の概略図である。 本発明の取り外し可能なカートリッジの例示的な実施形態の概略図である。 ラマン検出に基づくサイトメータの例示的な実施形態のサイトメータフローチャネルの断面図である。 ラマン検出に基づくサイトメータの例示的な実施形態の照明及び検出光学装置の概略図である。

Claims (5)

1. 試料内の分子を識別するフローサイトメータであって、
   機器筐体（１０）と、
   前記機器筐体（１０）から取り外すことが可能なカートリッジ（１２）であって、前記分子を有する試料を受け入れるようにされ、コロイド形態の金属を前記分子と結合させる超音波源（５５）、及び前記分子を含む流体力学的に集束されたフロー流れ（５２）を作ることができる流体力学的集束モジュール（６４）を有し、前記分子が前記金属コロイドと結合される、前記取り外すことが可能なカートリッジ（１２）と、
   前記機器筐体に配置され、前記分子が前記流体力学的に集束されたフロー流れ（５２）内にある間に前記分子を照明することができる光源（１８）と、
   前記機器筐体（１０）に配置され、前記分子から非弾性的に散乱された光を検出することができる検出器（２８）と、
   前記分子を識別するために、前記検出された光を解析することができる解析モジュールと、
   を備える装置。
2. 請求項１に記載のフローサイトメータであって、前記光源（１８）は固体レーザであり、前記解析モジュールは代表的な分子の表面増強されたラマンスペクトル（ＳＥＲＳ）を含むデータベースをさらに備える、装置。
3. 機器筐体（１０）と、超音波源（５５）を有する取り外し可能なカートリッジ（１２）とを備えたフローサイトメータを使用して、分子を識別する方法であって、
   前記取り外し可能なカートリッジの前記超音波源（５５）を使用して、コロイド形態の金属を分子と結合するステップと、
   前記取り外し可能なカートリッジの流体力学的に集束されたフロー流れ（５２）内に分子を配置するステップと、
   前記分子が前記取り外し可能なカートリッジの流体力学的に集束されたフロー流れ（５２）内にある間に、前記機器筐体に配置された光源から所定波長の光で分子を照明するステップと、
   前記機器筐体に配置された、散乱された光検出及び分散モジュール（４０）及び光検出要素で、分子から非弾性的に散乱された光を検出するステップと、
   分子を識別するために、検出された非弾性的に散乱された光を解析するステップと、
   を含む方法。
4. 請求項３に記載の方法であって、前記結合するステップは、１つ以上の流体相の取り込み及びソニフィケーションによって、前記金属コロイドを前記分子内に組み込むステップをさらに含み、前記金属コロイドは、銅、金、銀、白金、パラジウム、及びイリジウムからなるグループから選択される、方法。
5. 請求項３に記載の方法であって、前記光源はレーザー（１８）であり、前記散乱された光検出及び分散モジュール（４０）は、プリズム、回折格子、薄膜フィルタ、吸収フィルタ、及び音響光学的に調整可能なフィルタ（ＡＯＴＦ）、又はそれらの組み合わせからなるグループから選択される弁別光学装置（４０）である、方法。

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