CN107414069A - 银纳米圆片、其制备方法及采用其制备的金纳米环和组装体 - Google Patents

银纳米圆片、其制备方法及采用其制备的金纳米环和组装体 Download PDF

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Abstract

本发明公开了银纳米圆片、其制备方法及采用其制备的金纳米环和组装体，所述方法包括：将水、乙腈、柠檬酸钠和抗坏血酸按合适比例混合搅拌，加入银种子和硝酸银溶液，搅拌得到银纳米圆片；通过电化学置换法在碱性盐酸羟胺的调控作用下选择性的在银纳米圆片边缘沉积金，然后利用刻蚀剂将银氧化刻蚀，得到溶液中游离的金纳米环。本发明的金纳米环具有中空结构，尺寸均匀、分散性好，尺寸与壁厚都可调控。本发明还提供了含有金纳米环的组装体，通过控制纳米金颗粒的大小以及纳米金颗粒与金环的比例，经过退火和分离纯化，可构建土星结构、钻戒结构以及领结结构组装体，在表面增强基底、生化物质检测和光学、化学、生物传感等领域有广阔应用前景。

Description

银纳米圆片、其制备方法及采用其制备的金纳米环和组装体
技术领域
本发明属于纳米材料技术领域，涉及一种银纳米圆片、其制备方法及采用其制备的金纳米环和组装体，尤其涉及一种银纳米圆片、其制备方法及采用其制备的金纳米环和金纳米环基组装体。
背景技术
贵金属纳米环以其独有的高度对称性，所展现出的特殊的光学性质，在负折射率材料，波导，表面等离子体聚焦，表面增强拉曼散射，生物传感器，纳米天线，以及纳米光操控等领域具有十分重要的潜在应用。贵金属纳米环由于其较大的空腔体积以及环内独有的电场分布使得贵金属纳米环具有较高的灵敏度以及较大的场增强效应，因此，在传感器领域中备受关注，具有极大的应用价值。金属环纳米结构还有一个极其重要的性质，即对称破裂(symmetry breaking)。对称破裂会诱导亮模(bright mode)和暗模(dark mode)之间的耦合，发生等离子体共振杂交。理论研究表明(Opt.Express 2009,17,2906.)，环上的一个小缺口对环的光学性质会产生强烈影响，对称破裂的环会呈现出多级暗模等离子体共振并导致电磁场的显著增强。对称破裂还会导致等离子体干扰效应，即法诺共振。Hao等(NanoLetters 2008,8,3983.)利用非同轴的环盘空腔(Nonconcentric Ring Disk Cavities，NCRDC)构建的等离子体结构显示出一个很强的窄带法诺共振峰。由于法诺共振峰非常窄，因此非同轴的环盘空腔结构可以用于构造具有高品质因数的高灵敏度的LSPR传感器。
贵金属纳米颗粒许多优异的性质源于其表面自由电子集体振荡的局域表面等离子体共振特性(Localized Surface Plasmon Resonance，LSPR)。基于LSPR光谱的纳米级传感器是将贵金属表面附近折射率的微小变化转换成一个可测量的波长移动响应。根据测得的消光光谱或散射光谱中最大吸收峰位对其周围纳米尺度范围内环境变化的敏感性可以用来发展高空间分辨率的光学传感器。基于LSPR效应所构筑的生物传感器在生物应用领域具有十分广阔的应用前景，因为它是一种无损的，无需标记的，并且具有高灵敏度的检测手段，可以检测一系列配体-受体相互作用，例如抗原-抗体，蛋白-DNA，DNA-DNA之间的相互作用。在一个典型的LSPR生物传感器中，在金属纳米结构表面结合目标生物分子是通过吸收光谱的共振峰的移动来检测的。在检测一些具有较低检测限的物质，例如具有较低分析浓度的生物标本，想要在较短的检测时间内获得可靠的光谱数据，该结构必须具有高信噪比，因此就要求所构筑的纳米结构具有较高的灵敏度以及信号强度。
因此，目前人们的研究重点集中在如何可控构建包含金纳米环的特异结构，从而利用其特殊的光学性质实现不同领域的应用，这也是等离子体领域中一个非常重要的研究方向。常用的构建金属环的方法是胶体平版印刷技术，化学合成，纳米印刷技术，以及电子束曝光。纳米环盘结构同时具有子辐射和超辐射偶极等离子体共振，相比于独立的单环，同轴环盘空腔，具有较大的关联场增强以及较高的折射率灵敏度，并且可以实现在可见光到近红外光范围内的可调。因此，许多课题组致力于构建同轴环-盘(或球)的特异结构。Large等(Opt.Express 2011,19,5587)利用电子束曝光技术构建的同轴环盘空腔(ConcentricRing-Disk Cavity，CRDC)，相比于独立的单环，同轴环盘空腔，具有非常大的电场增强效应以及较高的可调谐度。因此可以作为表面增强光谱，例如表面增强拉曼光谱(SurfaceEnhanced Raman Scattering，SERS)，或者表面增强红外光谱(Surface EnhancedInfrared Absorption，SEIRA)的有效基底。然而，这种技术很难构建亚微米尺度结构，并且在纳米尺度范围内精确控制粒子之间的空隙也是十分困难的。另外，这种方法一般需要用基底来保持结构的几何构型，从某种程度上限制了其在某些领域的应用。因此，合成构建溶液中独立的环-盘(或球)的复合结构仍然是目前极具挑战的课题。一方面，需要用化学合成的方法合成溶液中独立的金环，另一方面，还需要一种可以精确控制金环和金盘(或金球)之间距离的方法，从而优化二者之间的表面等离子体共振杂交，从而提高纳米结构作为传感器的灵敏度以及信号强度。
CN201511008039.9公开了一种制备金纳米环的方案，该方案将钯纳米片，抗坏血酸和分散剂溶解于溶剂中，然后将氯金酸水溶液缓慢注入到该溶液中，在0～35℃下反应，得到金纳米环。这一方案虽然能制得金纳米环，但是合成出的金纳米环中间并不是严格中空的，中间有黏连，并且金纳米环的形貌比较粗糙，环的形貌不均匀，总体来讲产品质量比较低，不利于产品的推广。
综上，研发更优良的、易于推广并能够实现大规模生产的金纳米环的制备方法，使得合成的金纳米环尺寸均一，分散性好，大小和厚度可控，具有重要的意义。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种银纳米圆片、其制备方法及采用其制备的金纳米环和组装体。本发明的银纳米圆片形貌均匀，尺寸可控，粒径分布均匀。本发明的金纳米环尺寸均一，表面光滑，环的曲率变化小，是严格中空的，没有黏连，其在溶液中独立存在，分散性好，大小和厚度可控，并且本发明银纳米圆片和金纳米环的制备方法简单，重复性高，产率高，成本低，易于推广并实现大规模生产。
第一方面，本发明提供一种银纳米圆片，所述银纳米圆片的直径为30～80nm，例如为30nm、35nm、4045nm、50nm、60nm、65nm、70nm或80nm等，所述银纳米圆片的厚度为3～10nm，例如为3nm、4nm、5nm、6nm、8nm、9nm或10nm等。
第二方面，本发明提供如第一方面所述的银纳米圆片的制备方法，所述方法包括以下步骤：
(1)将水、乙腈、柠檬酸钠和抗坏血酸混合，搅拌得到混合溶液；
其中，水、乙腈、柠檬酸钠和抗坏血酸的体积比为(22～88):(10～50):(0.1～0.6):(0.1～0.5)，且抗坏血酸的浓度为0.05～0.3M；
(2)向混合溶液中加入银种子和硝酸银溶液，搅拌，得到银纳米圆片。
本发明制备银纳米圆片的方法中，水、乙腈、柠檬酸钠和抗坏血酸的体积比为(22～88):(10～50):(0.1～0.6):(0.1～0.5)，例如为22:15:0.2:0.5、30:50:0.1:0.5、88:40:0.6:0.1、50:50:0.1:0.5、30:45:0.3:0.1、25:40:0.1:0.1、60:45:0.4:0.3或70:30:0.2:0.5等。
该方法中，步骤(1)和步骤(2)所述“搅拌”均指剧烈搅拌。
本发明中，步骤(2)所述银种子的制备为现有技术，本领域技术人员可参照现有技术公开的方法进行制备，优选的制备方法如下：
将100～400mL超纯水，100～300μL,0.05～1M硝酸银，6～24mL,45～100mM柠檬酸钠，240μL～2mL双氧水在500～1000mL烧杯中混合均匀，然后加入新鲜配制的硼氢化钠(0.6～2.4mL,0.05～1M)。溶液缓慢搅拌5～10min，然后在黑暗条件下，4～30℃孵育2～4h。将合成好的银种子在10000～14000r/min(rpm)下，离心10～30min，收集沉淀得到银种子，可用于后续银纳米圆片的合成。
优选地，步骤(2)所述硝酸银溶液的浓度为0.1～1M，例如为0.1M、0.3M、0.5M、0.8M或1M等，且所述硝酸银溶液和步骤(1)所述乙腈的体积比为(0.12～0.48):(10～50)，例如为0.12:10、0.12:20、0.15:30、0.15:10、0.15:50、0.25:10、0.25:20、0.25:40、0.30:10、0.30:20、0.30:45、0.48:10、0.48:25、0.45:30或0.45:50等。
优选地，步骤(2)所述搅拌的时间为10～60min，例如为10min、20min、25min、30min、40min、45min、50min、60min等。
优选地，所述方法还包括在步骤(2)搅拌完成后进行离心的步骤，所述离心的转速优选为10000～14000rpm，所述离心的时间优选为10～30min。
优选地，所述方法还包括将离心产物溶于1～10mg/mL的柠檬酸钠溶液中。
作为本发明所述银纳米圆片的制备方法的优选技术方案，所述方法包括以下步骤：
在100～500mL烧杯中加入20～88mL超纯水，10～50mL乙腈，100～500μL,0.05～1M抗坏血酸，100～600μL,0.05～0.3M柠檬酸钠，剧烈搅拌。加入上述方法合成的银种子，以及120～480μL,0.1～1M硝酸银。混合溶液剧烈搅拌10～60min，得到的银纳米圆片在10000～14000rpm条件下离心10～30min，溶于12～48mL，1～10mg/mL的柠檬酸钠溶液中。
第三方面，本发明提供一种采用第一方面所述的银纳米圆片制备金纳米环的方法，所述方法包括以下步骤：
(A)通过电化学置换法利用金、银之间氧化还原电势的不同以及碱性盐酸羟胺的调控作用，使金优先在权利要求1所述的银纳米圆片的边缘晶面沉积，得到边缘沉积金的银纳米圆片；
(B)将边缘沉积金的银纳米圆片加入到刻蚀剂溶液中，在室温条件下静置，实现刻蚀，得到溶液中游离的金纳米环。
本发明提供了一种简单的化学合成的方法合成溶液中可独立存在的金纳米环的方法，具体地，首先合成银纳米圆片，然后利用电化学沉积法选择性的在银纳米圆片边缘沉积金，最后用刻蚀剂将银纳米圆片刻蚀掉，即可得到金纳米环。
该方法中，使用的碱性盐酸羟胺具有弱还原性，可以对沉积效果进行调控，可以保证较少的银片刻蚀以及减少自成核金纳米粒子的产生。
优选地，步骤(A)制备边缘沉积金的银纳米圆片的过程为：将权利要求1所述的银纳米圆片溶于水中，在搅拌的条件下分别加入还原剂碱性盐酸羟胺和氯金酸，反应，得到边缘沉积金的银纳米圆片。
该方法中，所述“搅拌”指剧烈搅拌。
优选地，所述碱性盐酸羟胺是通过在盐酸羟胺中加入氢氧化钠得到的，优选通过在10～20mL，1～20mM的盐酸羟胺中加入200～400μL，0.1～3M氢氧化钠得到的。
优选地，所述银纳米圆片、水、碱性盐酸羟胺和氯金酸的体积比为(2～10):(8～40):(1～10):(1～10)，所述氯金酸的浓度为0.1～1.2mM。
优选地，所述分别加入还原剂碱性盐酸羟胺和氯金酸的方式为：通过两个独立的管道利用机械微量注射泵分别以1～5mL/h的速度注入碱性盐酸羟胺和氯金酸。
优选地，所述反应的时间为30～90min，例如为30min、40min、48min、55min、65min、75min、80min或90min等。
优选地，所述方法还包括在步骤(A)反应完成后进行离心并收集沉淀(即为边缘沉积金的银纳米圆片)的步骤，所述离心的转速优选为8000～12000rpm，所述离心的时间优选为10～20min。
优选地，步骤(B)所述室温优选为15～35℃，例如为15℃、18℃、20℃、22℃、23℃、24℃、25℃、27℃、30℃、32℃或35℃等，进一步优选为25℃。
优选地，步骤(B)所述静置的时间为1～24h，例如为1h、2h、3h、6h、8h、10h、12h、15h、18h、20h、22h或24h等。
优选地，所述方法还包括在步骤(B)静置完成后进行离心并收集沉淀(即金纳米环)的步骤，所述离心的转速优选为10000～14000rpm，所述离心的时间优选为10～30min。
优选地，所述方法还包括将金纳米环溶于1～10mg/mL的柠檬酸钠溶液中储备的步骤。
作为本发明所述金纳米环的制备方法的优选技术方案，所述刻蚀剂溶液包括双氧水、氨水或二水合双(对磺酰苯基)苯基膦化二钾盐(Benzenesulfonic acid,4,4'-(phenylphosphinidene)bis-,potassium salt(1:2)，BSPP)溶液中的任意一种或至少两种的化合物，但并不限于上述列举的刻蚀剂溶液，只要具有将银刻蚀的功能，任何刻蚀剂溶液均可用于本发明。
作为本发明所述采用第一方面所述的银纳米圆片制备金纳米环的方法的优选技术方案，所述刻蚀剂溶液为BSPP溶液。使用的BSPP溶液可以鳌合银离子，使银纳米圆片进一步氧化，溶解银纳米圆片，从而可以得到游离的金纳米环。使用BSPP溶液刻蚀的方法条件温和，刻蚀快速，可以非常简便，快速的合成形貌均一的金纳米环，产率高。
优选地，所述刻蚀液的浓度为(1～50)mg/(10～100)mL，例如为1mg/10mL、5mg/10mL、10mg/10mL、15mg/10mL、20mg/10mL、25mg/10mL、30mg/10mL、40mg/10mL、50mg/10mL、1mg/10mL、1mg/20mL、1mg/30mL、1mg/40mL、1mg/50mL、1mg/60mL、1mg/70mL、1mg/80mL、1mg/100mL、50mg/15mL、50mg/20mL、50mg/30mL、50mg/50mL、50mg/80mL、50mg/90mL、3mg/100mL、15mg/100mL、20mg/100mL、30mg/100mL、40mg/100mL、55mg/100mL、60mg/100mL、75mg/100mL或85mg/100mL等。
作为本发明采用第一方面所述的银纳米圆片制备金纳米环的方法的优选技术方案，所述方法包括以下步骤：
(Ⅰ)选择性的在银纳米圆片的边缘沉积金
取2～10mL合成的银纳米圆片溶于8～40mL超纯水中，在剧烈搅拌下，将1～10mL还原剂碱性盐酸羟胺(在10～20mL，1～20mM盐酸羟胺中加入200～400μL，0.1～3M氢氧化钠)与1～10mL，0.1～1.2mM的氯金酸分别通过两个独立的管道利用机械微量注射泵以1～5mL/h的速度注入到上述混合溶液中。经过30～90min后，将混合溶液在8000～12000rpm下离心10～20min，收集沉淀，即可得到边缘沉积金的银纳米圆片；
(Ⅱ)溶液中游离的金纳米环的合成
将边缘沉积金的银纳米圆片沉淀加入4～50mL的刻蚀剂溶液中，在室温条件下静置1～24h，将混合溶液在10000～14000rpm条件下离心10～30min即可得到溶液中游离的金纳米环。将得到的金纳米环沉淀溶于1～10mL，1～10mg/mL的柠檬酸钠溶液中储备。
第四方面，本发明提供如第三方面所述方法制备得到的金纳米环，所述金纳米环的内径为25～75nm，例如为25nm、28nm、30nm、35nm、40nm、42.5nm、45nm、50nm、55nm、60nm、65nm、70nm、72nm或75nm等；外径为35～85nm，例如为35nm、40nm、42.5nm、45nm、50nm、55nm、60nm、70nm、75nm或85nm等；金纳米环的壁厚为5～10nm，例如为5nm、6nm、7nm、8nm、9nm或10nm等。
第五方面，本发明提供一种金纳米环二次生长的方法，通过二次生长控制金纳米环的大小和厚度。所述二次生长的方法包括以下步骤：将第四方面所述的金纳米环溶于水中，在搅拌(具体指剧烈搅拌)的条件下，通过两个独立的管道利用机械微量注射泵，分别以1～5mL/h的速度注入还原剂碱性盐酸羟胺与0.1～1.2mM的氯金酸，反应，得到二次生长的金纳米环。
优选地，所述反应的时间为0.5～4h，例如为0.5h、1h、1.5h、2h、2.2h、2.5h、3h或4h等。
优选地，所述方法还包括在反应完成后进行离心并收集沉淀(即二次生长的金纳米环)的步骤，所述离心的转速优选为8000～12000rpm，所述离心的时间优选为10～20min。
本发明通过金纳米环二次生长的方法可以控制所合成的金纳米环的大小和厚度，具体是通过调整沉积的时间以及反应物的浓度来实现的。本发明对得到的二次生长的金纳米环的大小和厚度不作限定，允许较宽的金环大小和厚度范围，此处不作穷举，优选的可以控制金环外径为35～100nm，金环壁厚在5～30nm。
作为本发明所述金纳米环二次生长的方法的优选技术方案，所述方法包括以下步骤：
取第四方面所述的金纳米环溶于5～20mL超纯水中，在剧烈搅拌下，将碱性盐酸羟胺与0.1～1.2mM的氯金酸分别通过两个独立的管道利用机械微量注射泵以1～5mL/h的速度注入到上述混合溶液中。经过0.5h～4h后，将混合溶液在8000～12000rpm下离心10～20min，收集沉淀，即可得到不同大小和厚度的金纳米环。
此方法中，氯金酸的浓度为0.1～1.2mM，例如0.1mM、0.3mM、0.5mM、0.8mM、或1.2mM等。
第六方面，本发明提供一种组装体，是一种金纳米环基组装体，所述金纳米环基组装体包括第四方面和/或第五方面所述的金纳米环。
本发明所述“第四方面和/或第五方面”指：可以是第四方面的金纳米环，也可以是第五方面二次生长得到的金纳米环，还可以是第四方面的金纳米环和第五方面二次生长得到的金纳米环的组合。
作为本发明所述组装体的优选技术方案，所述组装体包括第四方面和/或第五方面的金纳米环、纳米金颗粒，以及通过金-硫键与所述金纳米环和纳米金颗粒连接的巯基DNA，所述巯基DNA位于所述的金纳米环和纳米金颗粒之间。巯基DNA起到纳米金颗粒与金纳米环的连接媒介作用，通过DNA的碱基互补杂交特性，将纳米金颗粒与金纳米环连接在一起，形成特定结构的组装体，由于本发明的巯基DNA分别通过共价键与纳米金颗粒以及金纳米环连接，因此，本发明所合成的各种组装体结构稳定。
本发明的组装体中，所述“巯基DNA”指被巯基修饰了的DNA，修饰位点可以是在DNA的任何位置，但为了更好的修饰纳米金颗粒与金纳米环，优选在DNA的靠近端部的位置修饰，最优选在DNA的最末端的碱基上修饰。
本发明通过控制纳米金颗粒的大小，以及纳米金颗粒与金环的尺寸和含量关系，可以构建土星结构、钻戒结构、领结结构以及卫星结构等多种构型的组装体。
优选地，所述金纳米环基组装体的形貌包括但不限于土星结构、卫星结构、领结结构、钻戒结构或纳米环阵列中的任意一种或至少两种的组合，优选为土星结构、领结结构、钻戒结构或卫星结构中的任意一种。
本发明所述组装体中，所述纳米金颗粒优选为金纳米球。
本发明所述组装体中，对金纳米环的大小与金纳米球的粒径不作任何限定，只要满足条件可以形成不同结构的组装体即可。作为优选，金纳米环的厚度优选为5～30nm，例如5nm，10nm，12nm，15nm，20nm，25nm或30nm等；金纳米环的内径优选为30～50nm，例如30nm、35nm、40nm或45nm等；金纳米环的外径优选为50～100nm；金纳米球的粒径优选为5～50nm，例如5nm、10nm、15nm、20nm、25nm、30nm、35nm或40nm等。
本发明的组装体中，对纳米金颗粒的形状不作限定，但为了更好的应用效果，本发明所述纳米金颗粒的形状选自棒状、环形、球形、锥形、三角形、圆片形、星形和带状中的一种或多种；本发明特别优选所述纳米金颗粒为金纳米球。
优选地，所述巯基DNA的末端修饰有巯基，且其中一条巯基DNA与所述纳米金颗粒共价键连接，另一条巯基DNA与所述金纳米环共价连接。
优选地，所述巯基DNA为单链巯基DNA，其中每条链均在3’端或均在5’端修饰有巯基，优选3’端修饰有巯基。
优选地，所述巯基DNA是两条单链巯基DNA，序列彼此互补，可以通过碱基互补配对原则发生退火杂交。
本发明的单链巯基DNA可以是直接将巯基修饰在单链DNA的一端得到的，也可以是先在单链DNA的一端修饰二硫键(称为“单链二硫键DNA”)，使用前再用还原剂将二硫键还原成巯基得到的单链巯基DNA，本发明优选后者，是因为巯基易被氧化，不利于长期保藏，而二硫键修饰的DNA不存在被氧化的问题，便于长期保藏。本发明中，对DNA的序列和长度不作任何限定，任何具有碱基互补配对的DNA序列均可作为本发明的单链DNA，任何长度的DNA均可用于本发明。
优选地，所述单链巯基DNA是单链二硫键DNA的二硫键发生还原得到的。
优选地，所述巯基DNA的末端分别含有至少1个碱基的不配对部分，优选含有1～12个碱基的不配对部分，更优选含有2～3个碱基的不配对部分。
第七方面，本发明提供如第六方面所述的组装体的制备方法，所述方法通过将金纳米环和金纳米颗粒分别用两条互补的巯基DNA进行修饰改性，然后将金纳米环和金纳米颗粒按一定的比例混合，并控制纳米金颗粒的粒径，在一定条件下，通过互补DNA杂交得到金纳米环-金纳米颗粒组装体，然后再经过分离提纯，从而得到特定结构的金纳米环-金纳米颗粒组装体。
作为本发明所述组装体的制备方法的优选技术方案，所述方法包括以下步骤：
(1)将两条具有碱基互补配对关系的单链二硫键DNA通过还原剂分别还原为两条单链巯基DNA；
(2)使其中一条带有巯基的单链DNA与金纳米环反应，生成带有单链DNA的金纳米环，其中，单链DNA与金纳米环通过巯基与金之间形成共价键连接；(2)’使另一条含有互补序列的单链巯基DNA与纳米金颗粒反应，生成带有单链DNA的纳米金颗粒，其中，单链DNA与纳米金颗粒通过巯基与金之间形成的共价键连接；
(3)将带有单链DNA的金纳米环与带有另一条互补序列单链DNA的纳米金颗粒进行混合，退火杂交，生成中间带有双链DNA的金纳米环-纳米金颗粒组装体，也即金纳米环基组装体。
优选地，所述方法还包括在步骤(3)混合之后，退火杂交之前，进行控制纳米金颗粒粒径的步骤。通过控制纳米金颗粒粒径以及与金纳米环的尺寸和添加量的关系，可以构建不同构型的组装体。
优选地，当控制金纳米球的粒径等于或“略小”于金纳米环的内径时，调节金纳米环和金纳米球的比例，使金纳米环相对于金纳米球相等或大过量，可以构建土星结构组装体及领结结构组装体，例如按照金纳米环：金纳米球(摩尔比)＝1:1～20:1的比例混合时，易于形成土星结构组装体及领结结构组装体。
当控制金纳米球的粒径小于金纳米环的内径时，调节金纳米环和金纳米球的比例，使金纳米环相对于金纳米球相等或大过量，则可以构建钻戒及领结结构组装体，例如按照金纳米环：金纳米球(摩尔比)＝1:1～20:1的比例混合时，易于形成钻戒及领结结构组装体。
无论金纳米球的粒径小于、等于或大于金纳米环的内径，在调节金纳米球相对于金纳米环大过量的条件下，均可形成卫星结构组装体，例如按照金纳米环：金纳米球(摩尔比)＝1:2～1:20的比例混合时，均可形成卫星结构组装体。
优选地，所述控制纳米金颗粒粒径的步骤中，在组装土星结构的组装体时，控制金纳米球的粒径与金纳米环内径相同或小于金纳米环的内径。
由于能量最低原理，金纳米球易于趋向在金纳米环内部组装，这是因为，在这种状态下，杂交的DNA条数最多，组装体趋于稳定，因此，在这种条件下可以组装成土星结构。
优选地，控制金纳米球的粒径略小于金纳米环的内径，即金纳米球的粒径与巯基DNA长度的2倍之和与金纳米环的内径相同，这种情况即为上述的“略小”于。
优选地，所述控制纳米金颗粒粒径的步骤中，在组装钻戒结构的组装体时，控制金纳米球的粒径小于金纳米环内径，优选金纳米球的粒径与巯基DNA的长度的2倍之和依然小于金纳米环的内径，在这种条件下，金纳米球上的DNA只能与金纳米环的一侧DNA进行杂交，因此可以组装成钻戒结构。
优选地，所述方法还包括在步骤(3)退火杂交之后，进行步骤(4)：分离和提纯，得到特定结构的金纳米环-纳米金颗粒组装体。
优选地，所述分离提纯的方式为：经过HPLC或利用琼脂糖凝胶电泳进行分离和提纯。
优选地，所述分离提纯的方式为：优选利用琼脂糖凝胶电泳对目标产物进行分离和提纯。例如，可以将上述产物经过1％的琼脂糖凝胶电泳，将目标条带切下，并从胶内提出，即可得到分离提纯后的目标产物。
优选地，步骤(1)所述还原剂包括三(2-羧乙基)膦(tris(2-carboxyethyl)phosphine，TCEP)、巯基乙醇(2-巯基乙醇，2-Mercaptoethanol)或二硫苏糖醇(Dithiothreitol，DTT)中的任意一种或至少两种的组合，优选为三(2-羧乙基)膦。但并不限于上述列举的还原剂，只要具有将二硫键还原为巯基功能的任何还原剂均可用于本发明。
优选地，步骤(1)所述还原的时间为4～12h，例如为4h、5h、6h、8h、9h、10h或12h等。
优选地，所述方法还包括在步骤(1)还原之后，去除多余的还原剂得到纯化的单链巯基DNA。例如，多余的TCEP用G25吸附柱(可以从GE公司购得)，在3000～3500rpm下，离心2～3min进行去除。
优选地，所述单链二硫键DNA的3’端或5’端修饰有二硫键，优选所述单链二硫键DNA的3’端修饰有二硫键。
优选地，步骤(2)的具体过程为：在反应缓冲液中，将步骤(1)所得的一条单链巯基DNA与金纳米环混合均匀，然后在15～30℃下滴加氯化钠，反应，生成带有单链DNA的金纳米环。
此步骤(2)中，反应温度例如为16℃、18℃、20℃、22℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃或30℃等，该反应温度可以是与大部分化学反应一样，本发明化学反应的温度主要对反应速率有影响，因此温度并不是决定本发明是否能够实现的关键因素，本发明允许较宽的温度范围，上述列举的只是一部分可行的温度值，并非穷举。
更优选的，步骤(2)的具体过程为：在反应缓冲液中，将步骤(1)所得到的一条单链巯基DNA与金纳米环混合均匀，在15～30℃下缓慢加入NaCl，使溶液中NaCl的最终浓度为500mM，静置一晚，即可得到带有单链DNA的金纳米环，其中所述单链DNA与金纳米环通过巯基与金之间形成的共价键连接。本发明对反应缓冲液不作特别限定，只要能够提供适合反应的液体环境即可。例如可以是Tris硼酸盐缓冲液(TBE)、Tris-EDTA缓冲液(TE)、Tris乙酸盐缓冲液(TAE)、Tris磷酸盐缓冲液(TPE)、磷酸盐缓冲液(PBS)等。上述反应缓冲液都是本领域常用的反应缓冲液，可以任意选择，只要能够实现本发明为反应提供缓冲液环境的功能即可。
该方法中，步骤(2)中缓慢加入NaCl，可以通过一定的时间间隔加入50mM的NaCl来实现，时间间隔可以为0.5～2h，例如0.5h、1h、1.5h或2h等。本发明的反应时间并不局限于这些。本发明优选地先加入50mM NaCl，静置一晚，然后每间隔1h加入50mM的NaCl，直至NaCl的终浓度为500mM，静置一晚，让金纳米环表面充分修饰上巯基DNA，即可得到表面带有一条单链巯基DNA的金纳米环。
优选地，步骤(2)’的操作与步骤(2)相比，除将金纳米环替换为纳米金颗粒外完全相同。
优选地，步骤(2)’的具体过程为：在反应缓冲液中，将步骤(1)所得的另一条含有互补序列的单链巯基DNA与纳米金颗粒混合均匀，在15～30℃下反应，生成带有单链DNA的纳米金颗粒。
优选地，步骤(2)和步骤(2)’的反应时间独立地为8～24h，例如为8h、10h、12h、15h、18h、20h、22h或24h等。
优选地，所述方法还包括在步骤(2)或步骤(2)’反应完成后进行离心和提纯的步骤。例如，在7000～12000rpm下，离心10～25min进行提纯，取沉淀，溶于200～400μL的内含1×TBE和100mM的NaCl的溶液中。
优选地，步骤(2)’所述纳米金颗粒的形状包括但不限于环状、棒状、球形、锥形、三角形、圆片形、星形和带状中的任意一种或至少两种的组合，因为任何形状的纳米金颗粒的化学性质并没有本质区别，均可以通过与巯基形成共价键而连接，优选为球形。
本发明制备组装体的方法中，对金纳米环与金纳米球的比例不作任何限定，只要满足条件均可以形成所述结构。但是作为优选当合成土星结构的组装体、钻戒结构的组装体及领结结构的组装体时，带有单链DNA的金纳米环与带有另一条互补序列单链DNA的纳米金颗粒的摩尔比为2:1～10:1，例如为2:1、3:1、3.5:1、4:1、4.2:1、4.6:1、5:1、5.5:1、6:1、7:1、7.5:1、8:1、9:1或10:1等。当合成卫星结构的组装体时，带有单链DNA的金纳米环与带有另一条互补序列单链DNA的纳米金颗粒的摩尔比为1:2～1:10，例如为1:2、1:3、1:4、1:4.5、1:5、1:6、1:6.5、1:7、1:8或1:10等。
优选地，步骤(3)所述退火杂交的温度为从45℃到25℃退火12～36h，退火时间例如可以是12h、14h、16h、18h、20h、22h、24h、25h、27h、28h、30h、32h、33h、34h、35h或36h等。所述“退火”为缓慢退火，“缓慢退火”可以是指退火一定温度后持续一段时间继续退火，比如温度降低0.1℃后，持续6min，重复上述程序；又比如温度降低0.5℃后，持续30min，重复上述程序；也可以将样品加热到45℃之后拿到室温，使之缓慢降温，等等。
需要指出的是，退火温度范围选用45℃到25℃也仅是本发明的优选，其它可选择的温度范围还有很多，例如46℃到26℃、47℃到27℃、65℃到23℃、54℃到24℃等，只要在所选择的温度范围能能够实现两条单链DNA退火杂交形成双链DNA的功能即可。同样，退火杂交时间的选择也不局限于上述列举的时间，可以适当延长或缩短退火杂交的时间，只要在所选择的时间内能够实现两条单链DNA退火杂交形成双链DNA的功能即可。
本发明的组装体的制备方法中，所述“两条”用以指两种具有序列互补关系的DNA序列，不应当理解成两个DNA分子，因为本发明的反应并非单分子反应。“一条”和“另一条”(单链巯基DNA)的具体用量(例如摩尔数等)不作特别限定，具体实施中可以根据需要确定合适的摩尔数。在具体实施中，步骤(2)中修饰金纳米环用的单链巯基DNA比修饰金纳米颗粒用的另一条单链巯基DNA的用量可以高一些(比如2倍、3倍或4倍等)。这是因为：一方面，需要大量的巯基DNA才能使金纳米环修饰完全；另一方面，大量的巯基DNA使修饰的金纳米环比较稳定，不容易聚集。
本发明的组装体的制备方法中，所述“单链二硫键DNA”是指在单链DNA的3’端或5’端进行了二硫键(-S-S-)修饰的单链DNA。需要注意的是，两条单链二硫键DNA要么均在3’端要么均在5’端进行二硫键修饰。
第八方面，本发明提供如第六方面所述的组装体的用途，所述组装体用于光学传感、化学传感、生物传感、控制光限域、控制光增强和目标生化物质的检测等领域。优选在单一组装体的响应信号的检测中的应用。
本发明所述用于光学传感、化学传感、生物传感等方面，例如可以是应用于光学传感器、化学传感器、生物传感器中。
优选地，所述金纳米环基组装体用作生物传感器检测配体-受体相互作用或检测目标生化物质，例如抗原-抗体，蛋白-DNA，DNA-DNA之间的相互作用或检测特定的酶、抗体、抗原、微生物、细胞、组织或核酸在等生物活性物质。所述化学传感器例如可以利用局域表面等离子体共振(LSPR)，通过吸收光谱的共振峰的移动来检测目标生化物质或监控化学反应进程。
优选地，所述金纳米环基组装体用作表面增强光谱的有效基底，所述表面增强光谱包括但不限于表面增强拉曼散射(Surface Enhanced Raman Scattering，SERS)，表面增强红外吸收(Surface Enhanced Infrared Absorption，SEIRA)或局域表面等离子体共振(Localized Surface Plasmon Resonance，LSPR)中的任意一种。
本发明中所述的“水”优选为超纯水。
与已有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明通过使用合适量的乙腈和双氧水，并配合调整其他原料组分及制备参数，制备得到了银纳米圆片，本发明的银纳米圆片形貌均匀，尺寸可控，粒径分布均匀。
(2)采用本发明的银纳米圆片，通过电化学置换法利用金、银之间氧化还原电势的不同以及碱性盐酸羟胺的调控作用，制备得到边缘沉积金的银纳米片，进一步刻蚀除掉银片，制备得到在溶液中游离金纳米环。
(3)本发明制备得到的金纳米环的形貌均一，分散性良好，金纳米环的各处的曲率变化小且厚度均一；而且，本发明的金纳米环的大小和厚度可控，从而调节金纳米环应用时的等离子体共振吸收等性能。
(4)本发明还提供了一种包含本发明的金纳米环的组装体，其具有很好的分散性，可以考察单一组装体的响应信号，从而避免了基于测量整体而可能发生的任何非均一的夸大和统计效应；
通过调节金纳米环的大小和厚度可以调节金纳米环的等离子体共振吸收，通过调控纳米金颗粒的粒径以及与金纳米环的比例，可以实现不同结构组装体的自组装，例如：土星结构，钻戒结构，卫星结构以及领结结构。
(5)本发明的银纳米圆片及金纳米环的合成方法操作简单，反应条件温和，常温操作即可，反应重复性好，产率高，成本低，易于推广并实现大规模生产。
(6)本发明的纳米金颗粒与金纳米环组装体可以做到无需标记、无污染、实时、高灵敏度的检测，具有显著的电磁场增强效应，作为传感器具有很高的灵敏度以及信号放大效应，可以应用于目标生化物质的检测和/或光学传感、化学传感、生物传感等方面。
附图说明
图1是实施例1制备的银纳米圆片的透射电镜照片。
图2a-图2h是实施例1制备的不同大小和厚度的金纳米环的扫描电镜照片，其中，图2a-图2h依次分别对应的二次生长时间为0.5h、1h、1.5h、2h、2.5h、3h、3.5h、4h。
图3是实施例1制备的不同大小和厚度的金纳米环的紫外吸收谱图，其中0.5h、1h、1.5h、2h、2.5h、3h、3.5h、4h指二次生长时间。
图4是实施例2制备的土星结构组装体的透射电镜照片。
图5是实施例3制备的钻戒结构组装体的透射电镜照片。
图6是实施例4制备的领结结构组装体的透射电镜照片。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。本领域技术人员将会理解，以下实施例仅为本发明的优选实施例，以便于更好地理解本发明，因而不应视为限定本发明的范围。对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所用的实验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂厂商购买得到的；所用的扫描电镜为超高分辨冷场发射扫描电子显微镜SU8220型(日本)，透射电镜为日立H7700型(日本)。
实施例1
(1)合成银纳米圆片及金纳米环
(a)银种子的合成
将200mL超纯水，100μL,0.05M硝酸银，12mL,100mM柠檬酸钠，240μL双氧水在500mL烧杯中混合均匀，然后加入新鲜配制的2.4mL,0.05M硼氢化钠。溶液缓慢搅拌5min，然后在黑暗条件下，4℃孵育2h。将合成好的银种子在14000转/分(rpm)下，离心10min，收集沉淀用于后续银纳米圆片的合成。
(b)银纳米圆片的合成
在100mL烧杯中加入22mL超纯水，10mL乙腈，100μL,0.05M抗坏血酸，100μL,0.05M柠檬酸钠，剧烈搅拌。加入上述方法合成的银种子，以及120μL,0.1M硝酸银。混合溶液剧烈搅拌30min，得到的银纳米圆片在12000rpm条件下离心20min，溶于12mL，1mg/mL的柠檬酸钠溶液中。
(c)选择性在银纳米圆片边缘沉积金
取2mL合成的银纳米圆片溶于8mL超纯水中，在剧烈搅拌下，将1mL碱性盐酸羟胺(在10mL，3mM盐酸羟胺中加入400μL，0.1M氢氧化钠)与1mL，0.1mM的氯金酸分别通过两个独立的管道利用机械微量注射泵以1mL/h的速度注入到上述混合溶液中。经过30min后，将混合溶液在9500rpm下离心15min，收集沉淀，即可得到边缘沉积金的银纳米圆片。
(d)溶液中游离的金纳米环的合成将边缘沉积金的银纳米圆片沉淀加入4mL的二水合双(对磺酰苯基)苯基膦二钾盐(BSPP)溶液(1mg的BSPP溶于10mL超纯水中)，在室温条件下静置一晚，将混合溶液在14000rpm条件下离心10min即可得到溶液中游离的金纳米环。将得到的金纳米环沉淀溶于1mL，1mg/mL的柠檬酸钠溶液中储备。
(2)采用二次生长的方法合成不同大小和厚度金纳米环
取上述方法合成的金纳米环溶于10mL超纯水中，在剧烈搅拌下，将碱性盐酸羟胺与1mM的氯金酸分别通过两个独立的管道利用机械微量注射泵以2mL/h的速度注入到上述混合溶液中。分别经过不同二次生长时间(0.5h、1h、1.5h、2h、2.5h、3h、3.5h、4h)的生长后，将不同沉积时间的溶液在9500rpm下离心15min，收集沉淀，即可得到不同大小和厚度的金纳米环。
图1是实施例1制备的银纳米圆片的透射电镜照片，由图可以看出，合成的银纳米圆片粒径均匀，尺寸均一，分散性良好。
图2a-图2h是实施例1制备的不同大小和厚度的金纳米环的扫描电镜照片，其中图2a-图2h分别对应的二次生长时间为0.5h、1h、1.5h、2h、2.5h、3h、3.5h、4h，由图可以看出，随着二次生长时间的延长，金纳米环的厚度逐渐增加，粒径逐渐加大。二次生长0.5h～4h后，金纳米环的厚度为10～30nm，金纳米环的外径大小为50～100nm。
图3是实施例1制备的不同大小和厚度的金纳米环的紫外吸收谱图，其中0.5h、1h、1.5h、2h、2.5h、3h、3.5h、4h指二次生长时间，由图可以看出，随着金纳米环大小和厚度的增加，金纳米环的等离子体共振吸收峰逐渐蓝移。
通过本实施例制备的金纳米环大小和厚度可控，粒径分布均匀，分散性好，产率高。并且，可以通过控制金纳米环的大小和厚度，实现金纳米环等离子体共振峰的可控调节。
实施例2
(1)合成银纳米圆片及金纳米环
(a)银种子的合成
将超纯水(400mL)，硝酸银(300μL,1M)，柠檬酸钠(24mL,100mM)，双氧水(2mL)在1000mL烧杯中混合均匀，然后加入新鲜配制的硼氢化钠(0.6mL,2M)。溶液缓慢搅拌10min，然后在黑暗条件下，4℃孵育3h。将合成好的银种子在12000rpm下，离心20min，收集沉淀用于后续银纳米圆片的合成。
(b)银纳米圆片的合成
在100mL烧杯中加入22mL超纯水，10mL乙腈，150μL,0.1M抗坏血酸，100μL,0.05M柠檬酸钠，剧烈搅拌。加入上述方法合成的银种子，以及120μL,0.1M硝酸银。混合溶液剧烈搅拌30min，得到的银纳米圆片在10000rpm条件下离心30min,溶于48mL，10mg/mL的柠檬酸钠溶液中。
(c)选择性在银纳米圆片边缘沉积金
取10mL合成的银纳米圆片溶于40mL超纯水中，在剧烈搅拌下，将10mL碱性盐酸羟胺(在20mL，20mM盐酸羟胺中加入200μL，3M氢氧化钠)与10mL，0.8mM的氯金酸分别通过两个独立的管道利用机械微量注射泵以5mL/h的速度注入到上述混合溶液中。经过30min后，将混合溶液在10000rpm下离心30min，收集沉淀，即可得到边缘沉积金的银纳米圆片。
(d)溶液中游离的金纳米环的合成
将边缘沉积金的银纳米圆片沉淀加入10mL的BSPP溶液(50mg的BSPP溶于100mL超纯水中)，在室温条件下静置一晚，将混合溶液在9000rpm条件下离心15min即可得到溶液中游离的金纳米环。将得到的金纳米环沉淀溶于1mL，1mg/mL的柠檬酸钠溶液中储备。
(2)采用二次生长的方法合成10nm厚金纳米环
取上述方法合成的金纳米环溶于20mL超纯水中，在剧烈搅拌下，将碱性盐酸羟胺与1.2mM的氯金酸分别通过两个独立的管道利用机械微量注射泵以5mL/h的速度注入到上述混合溶液中。经过1h后，将溶液在9500rpm下离心15min，收集沉淀，即可得到10nm厚的金纳米环。
(3)金纳米环和金纳米球的修饰：
(a)取100μL浓度为100μM的序列为SEQ ID NO：1所示的3’端修饰二硫键的DNA1和50μL浓度为100μM的序列为SEQ ID NO：2所示的3’端修饰二硫键的DNA2，分别加入10μL和5μL浓度为200mM的三(2-羧乙基)膦(tris(2-carboxyethyl)phosphine)，TCEP)溶液，进行还原12h。多余的TCEP用G25吸附柱，在3000rpm下，离心3min进行去除，即可以得到经还原提纯后的巯基DNA1和巯基DNA2；
其中，3’端修饰二硫键的DNA均由英潍捷基(上海)贸易有限公司合成，经HPLC纯化。还原得到的巯基DNA1和巯基DNA2均含18个碱基，并且均为3’端修饰巯基，其序列分别为：
巯基DNA1：5’-TTATAACTATTCCTAAAA-S-S-3’(SEQ ID NO：1)；
巯基DNA2：5’-TAGGAATAGTTATAAAAA-S-S-3’(SEQ ID NO：2)。
(b)配制1mL，0.5×TBE(1×TBE缓冲溶液的配制为2.16g Tris碱、1.1g硼酸、0.8mL0.5M的EDTA(pH 8.0)溶于200mL超纯水中)，然后，将还原提纯后的巯基DNA1加入到上述溶液中，混合均匀。将步骤(2)得到的10nm厚金环沉淀加入到上述混合溶液中，DNA1与金纳米环的摩尔比为10:1，混合均匀后，向溶液中加入50mM氯化钠(NaCl)，室温下静置过夜。第二天，向溶液中每隔2h加入50mM氯化钠(NaCl)的溶液，直至NaCl的终浓度为500mM，室温下静置过夜，使巯基DNA1修饰到金纳米环上。将修饰好巯基DNA1的金纳米环于9500rpm下，离心15min进行提纯，取沉淀，溶于200μL内含1×TBE溶液中。
(c)将50μL经还原提纯后的巯基DNA2加入到1mL，0.5×TBE缓冲液中，混合均匀。取40nm金纳米球加入到上述混合溶液中，
DNA2与金纳米球的摩尔比为2:1，混合均匀后，向溶液中加入50mM氯化钠(NaCl)，室温下静置过夜。第二天，向溶液中每隔2h加入50mM氯化钠(NaCl)的溶液，直至NaCl的终浓度为500mM，室温下静置过夜，使巯基DNA2修饰到金纳米球上。将修饰好巯基DNA2的金纳米球于6000rpm下，离心15min进行提纯，取沉淀。
(4)土星结构组装体的制备：
在上述修饰好巯基DNA1的金纳米环溶液中(内含1×TBE)，加入修饰好巯基DNA2的40nm金纳米球，金纳米环与金纳米球的摩尔比为1:1，混合均匀后，加入300mM NaCl溶液，混合均匀，放置于PCR仪中，从45℃到25℃缓慢退火36h。然后将混合物置于1％的琼脂糖凝胶电泳，85mV，电泳45min进行分离提纯，目标条带为比金纳米环条带移动速度慢的那一条条带，将目标条带切除，从凝胶中提出，即为组装好的土星结构组装体。
图4是实施例2制备的土星结构组装体的透射电镜照片。从图中可以看出，40nm的金纳米球很好的组装在金纳米环的内部，形成土星结构组装体。通过本实施例制备的土星结构组装体分散性好，产率高。可以实现单一组装体的响应信号的测量，避免了基于测量整体而可能发生的任何非均一的夸大和统计效应。
实施例3
(1)合成银纳米圆片及金纳米环
(a)银种子的合成
将超纯水(400mL)，硝酸银(300μL,0.1M)，柠檬酸钠(12mL,75mM)，双氧水(480μL)在500mL烧杯中混合均匀，然后加入新鲜配制的硼氢化钠(1.2mL,0.5M)。溶液缓慢搅拌10min，然后在黑暗条件下，4℃孵育3h。将合成好的银种子在12000转/分(rpm)下，离心30min，收集沉淀用于后续银纳米圆片的合成。
(b)银纳米圆片的合成
在200mL烧杯中加入88mL超纯水，20mL乙腈，600μL,0.1M抗坏血酸，剧烈搅拌。加入上述方法合成的银种子，以及480μL,0.1M硝酸银。混合溶液剧烈搅拌30min，得到的银纳米圆片在12000rpm条件下离心20min,溶于24mL，1mg/mL的柠檬酸钠溶液中。
(c)选择性在银纳米圆片边缘沉积金
取4mL合成的银纳米圆片溶于6mL超纯水中，在剧烈搅拌下，将1mL碱性盐酸羟胺(在15mL，3mM盐酸羟胺中加入300μL，0.5M氢氧化钠)与1mL，0.5mM的氯金酸分别通过两个独立的管道利用机械微量注射泵以2mL/h的速度注入到上述混合溶液中。经过30min后，将混合溶液在9000rpm下离心20min，收集沉淀，即可得到边缘沉积金的银纳米圆片。
(d)溶液中游离的金纳米环的合成
将边缘沉积金的银纳米圆片沉淀加入10mL的BSPP溶液(3.4mg的BSPP溶于10mL超纯水中)，在室温条件下静置一晚，将混合溶液在10000rpm条件下离心10min即可得到溶液中游离的金纳米环。将得到的金纳米环沉淀溶于1mL，1mg/mL的柠檬酸钠溶液中储备。
(2)采用二次生长的方法合成15nm厚金纳米环
取上述方法合成的金纳米环溶于10mL超纯水中，在剧烈搅拌下，将碱性盐酸羟胺与0.6mM的氯金酸分别通过两个独立的管道利用机械微量注射泵以2mL/h的速度注入到上述混合溶液中。经过2h后，将溶液在8500rpm下离心15min，收集沉淀，即可得到15nm厚的金纳米环。
(3)金纳米环和金纳米球的修饰：
(a)取80μL浓度为100μM的序列为SEQ ID NO：1所示的3’端修饰二硫键的DNA1和30μL浓度为100μM的序列为SEQ ID NO：2所示的3’端修饰二硫键的DNA2，分别加入8μL和3μL浓度为200mM的三(2-羧乙基)膦(tris(2-carboxyethyl)phosphine)，TCEP)溶液，进行还原24h。多余的TCEP用G25吸附柱，在3300rpm下，离心3min进行去除，即可以得到经还原提纯后的巯基DNA1和巯基DNA2；
其中，3’端修饰二硫键的DNA均由英潍捷基(上海)贸易有限公司合成，经HPLC纯化。还原得到的巯基DNA1和巯基DNA2均含18个碱基，并且均为3’端修饰巯基，其序列分别为：
巯基DNA1：5’-TTATAACTATTCCTAAAA-S-S-3’(SEQ ID NO：1)；
巯基DNA2：5’-TAGGAATAGTTATAAAAA-S-S-3’(SEQ ID NO：2)。
(b)配制0.5mL，0.5×TBE(1×TBE缓冲溶液的配制为2.16g Tris碱、1.1g硼酸、0.8mL 0.5M的EDTA(pH 8.0)溶于200mL超纯水中)，然后，将还原提纯后的巯基DNA1加入到上述溶液中，DNA1与金纳米环的摩尔比为2:1，混合均匀。将步骤(2)得到的15nm厚金环沉淀加入到上述混合溶液中，混合均匀后，向溶液中加入50mM氯化钠(NaCl)，室温下静置过夜。第二天，向溶液中每隔1.5h加入50mM氯化钠(NaCl)的溶液，直至NaCl的终浓度为300mM，室温下静置12h，使巯基DNA1修饰到金纳米环上。将修饰好巯基DNA1的金纳米环于8000rpm下，离心20min进行提纯，取沉淀，溶于200μL内含1×TBE溶液中。
(c)将30μL经还原提纯后的巯基DNA2加入到1mL，0.5×TBE缓冲液中，混合均匀。取25nm金纳米球加入到上述混合溶液中，DNA2与金纳米球的摩尔比为10:1，混合均匀后，向溶液中加入50mM氯化钠(NaCl)，室温下静置过夜。第二天，向溶液中每隔1.5h加入50mM氯化钠(NaCl)的溶液，直至NaCl的终浓度为300mM，室温下静置12h，使巯基DNA2修饰到金纳米球上。将修饰好巯基DNA2的金纳米球于7500rpm下，离心15min进行提纯，取沉淀。
(4)钻戒结构组装体的制备：
在上述修饰好巯基DNA1的金纳米环溶液中(内含1×TBE)，加入修饰好巯基DNA2的25nm金纳米球，使金纳米环与金纳米球的摩尔比为10:1，混合均匀后，加入300mM NaCl溶液，混合均匀，放置于PCR仪中，从45℃到25℃缓慢退火12h。然后将混合物置于1％的琼脂糖凝胶电泳，85mV，电泳30min进行分离提纯，目标条带为比金纳米环条带移动速度慢的那一条条带，将目标条带切除，从凝胶中提出，即为组装好的钻戒结构组装体。
图5是实施例3制备的钻戒结构组装体的透射电镜照片。从图中可以看出，25nm的金纳米球都组装在金纳米环的一侧，形成钻戒结构组装体。通过本实施例制备的钻戒结构组装体分散性好，产率高。由于金球的引入，实现金环的对称破裂，可以显著增强金球与金纳米环杂交处的电磁场效应，因此可以提高检测的灵敏度以及实现信号的放大输出。并且由于组装体的分散性良好，可以实现单一组装体的响应信号的测量，避免了基于测量整体而可能发生的任何非均一的夸大和统计效应。
实施例4
(1)合成银纳米圆片及金纳米环
(a)银种子的合成
将超纯水(300mL)，硝酸银(200μL,0.1M)，柠檬酸钠(20mL,45mM)，双氧水(1mL)在1000mL烧杯中混合均匀，然后加入新鲜配制的硼氢化钠(1.2mL,0.05M)。溶液缓慢搅拌20min，然后在黑暗条件下，4℃孵育2h。将合成好的银种子在10000转/分(rpm)下，离心30min，收集沉淀用于后续银纳米圆片的合成。
(b)银纳米圆片的合成
在100mL烧杯中加入44mL超纯水，30mL乙腈，300μL,0.1M抗坏血酸，600μL,0.05M柠檬酸钠，剧烈搅拌。加入上述方法合成的银种子，以及240μL,0.1M硝酸银。混合溶液剧烈搅拌30min，得到的银纳米圆片在10000rpm条件下离心20min，溶于24mL，1mg/mL的柠檬酸钠溶液中。
(c)选择性在银纳米圆片边缘沉积金
取8mL合成的银纳米圆片溶于10mL超纯水中，在剧烈搅拌下，将1mL碱性盐酸羟胺(在20mL，3mM盐酸羟胺中加入400μL，0.5M氢氧化钠)与1mL，0.1mM的氯金酸分别通过两个独立的管道利用机械微量注射泵以2mL/h的速度注入到上述混合溶液中。经过30min后，将混合溶液在9500rpm下离心15min，收集沉淀，即可得到边缘沉积金的银纳米圆片。
(d)溶液中游离的金纳米环的合成
将边缘沉积金的银纳米圆片沉淀加入10mL的BSPP溶液(3.4mg的BSPP溶于10mL超纯水中)，在室温条件下静置10h，将混合溶液在12000rpm条件下离心10min即可得到溶液中游离的金纳米环。将得到的金纳米环沉淀溶于1mL，1mg/mL的柠檬酸钠溶液中储备。
(2)采用二次生长的方法合成12nm厚金纳米环
取上述方法合成的金纳米环溶于10mL超纯水中，在剧烈搅拌下，将碱性盐酸羟胺与1.2mM的氯金酸分别通过两个独立的管道利用机械微量注射泵以2mL/h的速度注入到上述混合溶液中。经过1.5h后，将溶液在9000rpm下离心15min，收集沉淀，即可得到12nm厚的金纳米环。
(3)金纳米环和金纳米球的修饰：
(a)取50μL浓度为100μM的序列为SEQ ID NO：1所示的3’端修饰二硫键的DNA1和20μL浓度为100μM的序列为SEQ ID NO：2所示的3’端修饰二硫键的DNA2，分别加入5μL和2μL浓度为200mM的三(2-羧乙基)膦(tris(2-carboxyethyl)phosphine)，TCEP)溶液，进行还原24h。多余的TCEP用G25吸附柱，在3000rpm下，离心2min进行去除，即可以得到经还原提纯后的巯基DNA1和巯基DNA2；
其中，3’端修饰二硫键的DNA均由英潍捷基(上海)贸易有限公司合成，经HPLC纯化。还原得到的巯基DNA1和巯基DNA2均含18个碱基，并且均为3’端修饰巯基，其序列分别为：
巯基DNA1：5’-TTATAACTATTCCTAAAA-S-S-3’(SEQ ID NO：1)；
巯基DNA2：5’-TAGGAATAGTTATAAAAA-S-S-3’(SEQ ID NO：2)。
(b)配制2mL，0.5×TBE(1×TBE缓冲溶液的配制为2.16g Tris碱、1.1g硼酸、0.8mL0.5M的EDTA(pH 8.0)溶于200mL超纯水中)，然后，将还原提纯后的巯基DNA1加入到上述溶液中，使DNA1与金纳米环的摩尔比为5:1，混合均匀。将步骤(2)得到的12nm厚金环沉淀加入到上述混合溶液中，混合均匀后，向溶液中加入50mM氯化钠(NaCl)，室温下静置过夜。第二天，向溶液中每隔2h加入50mM氯化钠(NaCl)的溶液，直至NaCl的终浓度为400mM，室温下静置24h，使巯基DNA1修饰到金纳米环上。将修饰好巯基DNA1的金纳米环于10000rpm下，离心20min进行提纯，取沉淀，溶于200μL内含1×TBE溶液中。
(c)将20μL经还原提纯后的巯基DNA2加入到1mL，0.5×TBE缓冲液中，混合均匀。取40nm金纳米球加入到上述混合溶液中，使DNA2与金纳米球的摩尔比为5:1，混合均匀后，向溶液中加入50mM氯化钠(NaCl)，室温下静置过夜。第二天，向溶液中每隔2h加入50mM氯化钠(NaCl)的溶液，直至NaCl的终浓度为400mM，室温下静置24h，使巯基DNA2修饰到金纳米球上。将修饰好巯基DNA2的金纳米球于7000rpm下，离心10min进行提纯，取沉淀。
(4)领结结构组装体的制备：
在上述修饰好巯基DNA1的金纳米环溶液中(内含1×TBE)，加入40nm金纳米球，使金纳米环与金纳米球的摩尔比为20:1，混合均匀后，加入200mMNaCl溶液，混合均匀，放置于PCR仪中，从45℃到25℃缓慢退火28h。然后将混合物置于1％的琼脂糖凝胶电泳，90mV，电泳30min进行分离提纯，目标条带为比金纳米环条带以及土星结构条带移动速度都慢的那一条条带(一般来说，领结结构是移动速度最慢的那一个条带)，将目标条带切除，从凝胶中提出，即为组装好的领结结构组装体。
图6是实施例4制备的领结结构组装体的透射电镜照片。从图中可以看出，40nm的金纳米球夹杂在两个金纳米环中间，形成领结结构组装体。通过本实施例制备的领结结构组装体产率非常高，而且分散性良好。由于金球位于两个金纳米环中间，可以实现两个金环的对称破裂，显著增强金球位置的电磁场效应，因此可以提高检测的灵敏度以及实现信号的放大输出。并且由于组装体的分散性良好，可以实现单一组装体的响应信号的测量，避免了基于测量整体而可能发生的任何非均一的夸大和统计效应。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (10)

1.一种银纳米圆片，其特征在于，所述银纳米圆片的直径为30～80nm，所述银纳米圆片的厚度为3～10nm。
2.如权利要求1所述的银纳米圆片的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)将水、乙腈、柠檬酸钠和抗坏血酸混合，搅拌得到混合溶液；
其中，水、乙腈、柠檬酸钠和抗坏血酸的体积比为(22～88):(10～50):(0.1～0.6):(0.1～0.5)，且抗坏血酸的浓度为0.05～0.3M；
(2)向混合溶液中加入银种子和硝酸银溶液，搅拌，得到银纳米圆片；
优选地，步骤(2)所述硝酸银溶液的浓度为0.1～1M，且所述硝酸银溶液和步骤(1)所述乙腈的体积比为(0.12～0.48):(10～50)；
优选地，步骤(2)所述搅拌的时间为10～60min；
优选地，所述方法还包括在步骤(2)搅拌完成后进行离心的步骤，所述离心的转速优选为10000～14000rpm，所述离心的时间优选为10～30min；
优选地，所述方法还包括将离心产物溶于1～10mg/mL的柠檬酸钠溶液中。
3.一种采用权利要求1所述的银纳米圆片制备金纳米环的方法，其特征在于，所述方法包括：
(A)通过电化学置换法利用金、银之间氧化还原电势的不同以及碱性盐酸羟胺的调控作用，使金优先在权利要求1所述的银纳米圆片的边缘晶面沉积，得到边缘沉积金的银纳米圆片；
(B)将边缘沉积金的银纳米圆片加入到刻蚀剂溶液中，在室温条件下静置，实现刻蚀，得到溶液中游离的金纳米环。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(A)制备边缘沉积金的银纳米圆片的过程为：将权利要求1所述的银纳米圆片溶于水中，在搅拌的条件下分别加入还原剂碱性盐酸羟胺和氯金酸，反应，得到边缘沉积金的银纳米圆片；
优选地，所述碱性盐酸羟胺是通过在盐酸羟胺中加入氢氧化钠得到的，优选通过在10～20mL，1～20mM的盐酸羟胺中加入200～400μL，0.1～3M氢氧化钠得到的；
优选地，所述银纳米圆片、水、碱性盐酸羟胺和氯金酸的体积比为(2～10):(8～40):(1～10):(1～10)，所述氯金酸的浓度为0.1～1.2mM；
优选地，所述分别加入还原剂碱性盐酸羟胺和氯金酸的方式为：通过两个独立的管道利用机械微量注射泵分别以1～5mL/h的速度注入碱性盐酸羟胺和氯金酸；
优选地，所述反应的时间为30～90min；
优选地，所述方法还包括在步骤(A)反应完成后进行离心并收集沉淀的步骤，所述离心的转速优选为8000～12000rpm，所述离心的时间优选为10～20min；
优选地，步骤(B)所述室温优选为15～35℃，进一步优选为25℃；
优选地，步骤(B)所述静置的时间为1～24h；
优选地，所述方法还包括在步骤(B)静置完成后进行离心并收集沉淀的步骤，所述离心的转速优选为10000～14000rpm，所述离心的时间优选为10～30min；
优选地，所述方法还包括将金纳米环溶于1～10mg/mL的柠檬酸钠溶液中储备的步骤。
5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于，步骤(B)所述刻蚀剂溶液包括双氧水、氨水或二水合双(对磺酰苯基)苯基膦化二钾盐BSPP溶液中的任意一种或至少两种的化合物，优选为BSPP溶液；
优选地，所述刻蚀剂溶液的浓度为(1～50)mg/(10～100)mL。
6.如权利要求3-5任一项所述的方法制备得到的金纳米环，其特征在于，所述金纳米环的内径为25～75nm，外径为35～85nm，金纳米环的壁厚为5～10nm。
7.一种金纳米环二次生长的方法，其特征在于，所述二次生长的方法包括以下步骤：将权利要求6的金纳米环溶于水中，在搅拌的条件下，通过两个独立的管道利用机械微量注射泵，分别以1～5mL/h的速度注入还原剂碱性盐酸羟胺与0.1～1.2mM的氯金酸，反应，得到二次生长的金纳米环；
优选地，所述反应的时间为0.5～5h；
优选地，所述方法还包括在反应完成后进行离心并收集沉淀的步骤，所述离心的转速优选为8000～12000rpm，所述离心的时间优选为10～20min；
优选地，所述二次生长的金纳米环的外径为35～100nm，壁厚优选为5～30nm。
8.一种金纳米环基组装体，其特征在于，所述金纳米环基组装体包括权利要求6或7所述的金纳米环，优选包括权利要求6或7所述的金纳米环、纳米金颗粒，以及通过金-硫键与所述金纳米环和纳米金颗粒连接的巯基DNA，所述巯基DNA位于所述的金纳米环和纳米金颗粒之间；
优选地，所述金纳米环基组装体的形貌包括土星结构、卫星结构、领结结构、钻戒结构或纳米环阵列中的任意一种或至少两种的组合，优选为土星结构、领结结构、钻戒结构或卫星结构中的任意一种；
优选地，所述纳米金颗粒的形状选自环状、棒状、球形、锥形、三角形、圆片形、星形和带状中的任意一种或至少两种的组合，优选为球形；
优选地，所述纳米金颗粒为金纳米球，所述金纳米球的粒径优选为5～60nm；
优选地，所述巯基DNA的末端修饰有巯基，且其中一条巯基DNA与所述纳米金颗粒共价键连接，另一条巯基DNA与所述金纳米环共价连接；
优选地，所述巯基DNA为单链巯基DNA，其中每条链均在3’端或均在5’端修饰有巯基，优选3’端修饰有巯基；
优选地，所述巯基DNA是两条单链巯基DNA，序列彼此互补；
优选地，所述单链巯基DNA是单链二硫键DNA的二硫键发生还原得到的；
优选地，所述巯基DNA的末端分别含有至少1个碱基的不配对部分，优选含有1～12个碱基的不配对部分，更优选含有2～3个碱基的不配对部分。
9.如权利要求8所述的金纳米环基组装体的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)将两条具有碱基互补配对关系的单链二硫键DNA通过还原剂分别还原为两条单链巯基DNA；
(2)使其中一条带有巯基的单链DNA与金纳米环反应，生成带有单链DNA的金纳米环；(2)’使另一条含有互补序列的单链巯基DNA与纳米金颗粒反应，生成带有单链DNA的纳米金颗粒；
(3)将带有单链DNA的金纳米环与带有另一条互补序列单链DNA的纳米金颗粒进行混合，退火杂交，生成中间带有双链DNA的金纳米环-纳米金颗粒组装体，也即金纳米环基组装体；
优选地，所述方法还包括在步骤(3)混合之后，退火杂交之前，进行控制纳米金颗粒粒径的步骤；
优选地，所述控制纳米金颗粒粒径的步骤中，纳米金颗粒为金纳米球；
优选地，所述控制纳米金颗粒粒径的步骤中，在组装土星结构的组装体时，控制金纳米球的粒径与金纳米环内径相同或小于金纳米环的内径；
优选地，控制金纳米球的粒径小于金纳米环的内径，且金纳米球的粒径与巯基DNA长度的2倍之和与金纳米环的内径相同；
优选地，所述控制纳米金颗粒粒径的步骤中，在组装钻戒结构的组装体时，控制金纳米球的粒径小于金纳米环内径，优选金纳米球的粒径与巯基DNA的长度的2倍之和小于金纳米环的内径；
优选地，所述方法还包括在步骤(3)退火杂交之后，进行步骤(4)：分离和提纯，得到特定结构的金纳米环-纳米金颗粒组装体；
优选地，所述分离提纯的方式为：经过HPLC或利用琼脂糖凝胶电泳进行分离和提纯，优选利用琼脂糖凝胶电泳进行分离和提纯；
优选地，步骤(1)所述还原剂包括三(2-羧乙基)膦、巯基乙醇或二硫苏糖醇中的任意一种或至少两种的组合，优选为三(2-羧乙基)膦；
优选地，步骤(1)所述还原的时间为4～12h；
优选地，所述方法还包括在步骤(1)还原之后，去除多余的还原剂得到纯化的单链巯基DNA；
优选地，所述单链二硫键DNA的3’端或5’端修饰有二硫键，优选所述单链二硫键DNA的3’端修饰有二硫键；
优选地，步骤(2)所述带有单链DNA的金纳米环中，所述单链DNA与金纳米环通过巯基与金之间形成的共价键连接；
优选地，步骤(2)所述带有单链DNA的纳米金颗粒中，所述单链DNA与纳米金颗粒通过巯基与金之间形成的共价键连接；
优选地，步骤(2)的具体过程为：在反应缓冲液中，将步骤(1)所得的一条单链巯基DNA与金纳米环混合均匀，然后在15～30℃下滴加氯化钠，生成带有单链DNA的金纳米环；
优选地，步骤(2)’的具体过程为：在反应缓冲液中，将步骤(1)所得的另一条含有互补序列的单链巯基DNA与纳米金颗粒混合均匀，然后在15～30℃下滴加氯化钠，生成带有单链DNA的纳米金颗粒；
优选地，所述步骤(2)和步骤(2)’中所述滴加为：先加入50mM NaCl，静置一晚，然后每隔0.5～2h加入50mM NaCl，直至NaCl的终浓度为100～500mM；
优选地，所述方法还包括在步骤(2)或步骤(2)’反应完成后进行离心和提纯的步骤；
优选地，步骤(2)’所述纳米金颗粒的形状包括环状、棒状、球形、锥形、三角形、圆片形、星形和带状中的任意一种或至少两种的组合，优选为球形；
优选地，步骤(3)所述混合的步骤中，当合成土星结构的组装体、钻戒结构的组装体及领结结构的组装体时，带有单链DNA的金纳米环与带有另一条互补序列单链DNA的纳米金颗粒的摩尔比为2:1～10:1；
优选地，步骤(3)所述混合的步骤中，当合成卫星结构的组装体时，带有单链DNA的金纳米环与带有另一条互补序列单链DNA的纳米金颗粒的摩尔比为1:2～1:10；
优选地，步骤(3)所述退火杂交的温度为从45℃到25℃退火12～36h。
10.如权利要求8所述的金纳米环基组装体的用途，其特征在于，所述金纳米环基组装体用于光学传感、化学传感、生物传感、控制光限域、控制光增强或目标生化物质的检测领域；
优选地，所述金纳米环基组装体用于光学传感器、化学传感器或生物传感器中的任意一种；
优选地，所述金纳米环基组装体用作生物传感器检测配体-受体相互作用或检测目标生化物质；
优选地，所述金纳米环基组装体用作表面增强光谱的基底；
优选地，所述表面增强光谱包括表面增强拉曼散射SERS，表面增强红外吸收SEIRA或局域表面等离子体共振LSPR中的任意一种。
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