CN110646399B - 基于sers的高通量蛋白检测芯片 - Google Patents
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Abstract
本申请提供了一种基于SERS的高通量蛋白检测芯片,包括:基底,采用表面羟基化处理的硅片;抗体或待测抗原;其中所述抗体可与待测抗原特异性结合;若干个Raman探针,用于产生拉曼信号,通过若干个Raman探针的拉曼特征峰强度或拉曼位移的变化进行待测抗原的定性或定量检测。该芯片可以有效排除由传统免疫方法带来的假阳性和假阴性,在癌症的早期诊断及初筛方面有着良好的应用前景,同时降低了芯片制作成本。
Description
技术领域
本申请涉及SERS检测技术领域,涉及纳米技术,生物医学,临床免疫分析技术,具体而言,涉及一种基于SERS的高通量蛋白检测芯片。
背景技术
肿瘤是一种常见病和多发病,发病率居第二位。全球肿瘤患者每年死亡人数高达百万。各种恶性肿瘤威胁着人类的身体健康。由于肿瘤发病早期往往无自觉症状,一旦发现已到达无法治疗的中晚期。因此,在肿瘤发病原因和治疗方法尚未完善的今天,尽早开展肿瘤的普查工作显得尤为重要。
目前,研究人员已经发现了多种肿瘤的相关抗原,例如甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、糖类抗原199(CA199)、癌抗原125(CA125)、肿瘤抗原153(CA153)、癌抗原50(CA50)、糖类抗原242(CA242)、β2微球蛋白(β2MG)、血清铁蛋白(Fe Pro)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)、人绒毛膜促性腺激素(HCG)、肿瘤坏死因子(TNF)等等。由于免疫分析具有特异性、专一性,所以利用某种肿瘤的抗原做成的试剂盒和检测方法(如化学发光、荧光比色法)只能检测一类肿瘤。如果被检查者需要检查体内常见的肿瘤就需要做多项检查,则需要支付多个项目的检查费用,同时也大大延长了检测时间。
表面增强拉曼散射(SERS)是一种超灵敏的表面分析技术,借助分子在SERS活性基底的吸附可将分子本身的拉曼信号显著增强。由于水对信号无影响,使得拉曼光谱受到生物科学工作者的青睐。近年来SERS已经广泛的应用于生物医学检测。与其他超灵敏检测技术相比,拉曼光谱有其自身的优点:1)极高的检测灵敏度:极大增强基底表面的待测物,对拉曼信号较弱的蛋白质检测提供了一种非常好的方法。2)信息的多样性:SERS提供了检测物的指纹信息,对于多组分的体系仍可以有很好的分辨能力。3)微区与原位检测:样品尺寸可以小到微米级,可以制备微型蛋白芯片。4)无损检测:采用的是可见光,对基底材料和生物样品都是非破坏性的。
众所周知,蛋白芯片是通过靶分子和捕捉分子相互作用来监测蛋白分子之间的相互作用,将拉曼技术与蛋白芯片相结合,不但可以实现SERS间接检测蛋白,同时也将蛋白芯片的灵敏度大大提高。充分利用SERS谱图信息多样性也是发明的创新点。
目前传统的蛋白芯片法是参考基因芯片制作方法制备而成,即在一个硝酸纤维膜上进行免疫分析。不可避免地,由于蛋白分子性质与DNA不同,在狭小的空间里蛋白之间容易产生相互作用,使蛋白芯片的结果产生了很严重的假阴性和假阳性。众所周知,蛋白芯片是通过靶分子和捕捉分子相互作用来监测蛋白分子之间的相互作用,将拉曼技术与蛋白芯片相结合,不但可以增加拉曼检测的灵敏度,同时也将蛋白芯片的灵敏度大大提高。本发明因此而来。
发明内容
本申请旨在提供一种基于SERS的高通量蛋白检测芯片,以解决现有技术中的问题。
为了实现上述目的,根据本申请的一个方面,提供了一种基于SERS的高通量蛋白检测芯片,所述芯片包括:
基底,采用表面羟基化处理的硅片,并在硅片上形成纳米银基底;
若干个Raman探针,预先标记到纳米银基底上;
抗体,通过Raman探针连接所述抗体,其中所述抗体可与待测抗原特异性结合;
所述Raman探针用于产生拉曼信号,通过若干个Raman探针的拉曼特征峰位移的变化进行待测抗原的定性或定量检测。
优选的技术方案中,所述在硅片上形成纳米银基底是通过聚二烯基丙二甲氨基氯化铵静电力组装银纳米粒子或使用蒸镀和3D打印技术在表面羟基化处理的硅片表面制备纳米银基底。
优选的技术方案中,所述纳米银基底表面通过聚二甲基硅烷(PDMS)压印,分成M个区域,在M个区域中分别连接标记Raman探针的抗体,其中M为自然数。
本发明的另一目的在于提供一种基于SERS的高通量蛋白检测芯片,所述芯片包括:
基底,采用表面羟基化处理的硅片;
待测抗原,所述待测抗原通过共价键结合在表面羟基化处理的硅片表面;
若干个Raman探针,预先标记到抗体或者抗体金溶胶上,用于产生拉曼信号,通过若干个Raman探针的拉曼特征峰强度的变化进行待测抗原的定性或定量检测;其中所述抗体或者抗体金溶胶上的抗体可与待测抗原特异性结合。
优选的技术方案中,将若干种抗体通过所述Raman探针连接到纳米金粒子上,然后混合得到的纳米金粒子形成纳米金溶胶。
优选的技术方案中,所述抗体或待测抗原通过共价键结合在表面羟基化处理的硅片表面的具体方法是,先羟基化硅片进行醛基化处理,然后通过共价键结合待测抗原。
优选的技术方案中,醛基化处理的试剂选用戊二醛、碳二亚胺,使用的试剂质量浓度为0.1-1mg/mL。
醛基化处理的硅片作为富集待测蛋白的作用,金纳米粒子复合的抗体与芯片结合,通过不同的Raman探针的拉曼特征峰强度进行定量。
优选的技术方案中,所述待测抗原为肿瘤标记物。所述肿瘤标记物选自作为肿瘤标志物蛋白的抗原、抗体、多肽或者编码所述肿瘤标志物蛋白的核酸分子。
优选的技术方案中,所述肿瘤标记物包括AFP、CEA、CA199、CA125、CA153、CA50、CA242、β2MG、Fe Pro、NSE、HCG、TNF的一种或者两种以上的任意组合。所述肿瘤标记物同时包括AFP、CEA、CA199、CA125、CA153、CA50、CA242、β2MG、Fe Pro、NSE、HCG、TNF 12种肿瘤标记物。且不同的肿瘤标记物对应不同的Raman探针分子。
优选的技术方案中,所述Raman探针包括对巯基苯甲酸(MBA)、对氨基苯甲酸(PATP)、5,5'-二硫代双(琥珀酰亚胺基-2-硝基苯甲酸)(DSNB)、6-巯基嘌呤(6-MP)、孔雀石绿(MGITC)、罗丹明衍生物、苝四羧酸(PTCA)。
优选的技术方案中,醛基化处理的试剂选用戊二醛、碳二亚胺,使用的试剂质量浓度为0.1-1mg/mL。
本发明的另一目的在于提供一种所述基于SERS的高通量蛋白检测芯片在定性或定量检测肿瘤标记物方面的应用。
优选的技术方案中,所述肿瘤标记物选自作为肿瘤标志物蛋白的抗原、抗体、多肽或者编码所述肿瘤标志物蛋白的核酸分子。
优选的技术方案中,所述肿瘤标记物包括AFP、CEA、CA199、CA125、CA153、CA50、CA242、β2MG、Fe Pro、NSE、HCG、TNF。
优选的技术方案中,所述Raman探针包括对巯基苯甲酸(MBA)、对氨基苯甲酸(PATP)、5,5'-二硫代双(琥珀酰亚胺基-2-硝基苯甲酸)(DSNB)、6-巯基嘌呤(6-MP)、孔雀石绿(MGITC)、罗丹明衍生物、苝四羧酸(PTCA)。
本发明的另一目的在于提供一种高通量检测肿瘤标记物的方法,所述方法包括:
(1)构建所述的高通量蛋白检测芯片;
(2)使被测抗原或者被测抗原相应的特异性抗体与步骤(1)的高通量蛋白检测芯片硅片表面充分接触;
(3)通过拉曼光谱仪检测,获取拉曼特征峰拉曼位移或拉曼特征峰强度,进而定性或定量测定待测抗原的含量。
本发明中拉曼特征峰位移的变化是基底上预先标记Raman探针,随后与抗体连接;拉曼特征峰强度的变化是通过金与Raman探针和抗体相结合来实现的。
针对现有技术中的问题,本发明人首次结合芯片制备技术、纳米技术及具有拉曼活性和良好生物相容性的贵金属纳米粒子作为基底,设计了一个高通量,可以同时读出多种癌症标志物的蛋白芯片。这种蛋白芯片目前最具潜力的应用是对被检测者癌症普查与初筛,改善了传统方法只能检测一种癌症标记物。这种蛋白芯片可以有效排除由传统免疫方法带来的假阳性和假阴性,同时降低了芯片制作成本。
本发明技术方案中基于SERS的同时多组分蛋白检测芯片,是由硅片代替传统的蛋白芯片基质材料,可以通过多个Raman探针的强度或拉曼位移的变化实现定性或定量检测多种癌症标记物。一种基于表面增强拉曼光谱(SERS)的同时多组分蛋白检测芯片,涉及纳米技术、生物分子检测技术和临床免疫分析技术领域。所述多通道蛋白芯片的材料采用硅片这种可修饰性强的基底代替传统的蛋白芯片的基质材料。该芯片通过其表面不同癌症标记物抗体连接的Raman探针的表面增强拉曼散射(SERS)特征峰的变化(峰强、峰位移)实现一次性对多个组分的定性和定量分析。配以SERS分析处理软件,使得该蛋白芯片可以有效排除由传统免疫方法带来的假阳性和假阴性。本发明在癌症的早期诊断及初筛方面有着良好的应用前景,同时降低了芯片制作成本。
附图说明
构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本申请的进一步理解,本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请,并不构成对本申请的不当限定。在附图中:
图1示出了基于SERS强度的多通量检测芯片原理图,采用SERS信号的强度进行检测。
图2示出了基于SERS强度的多通量检测芯片SERS t-chip-12-I芯片中,抗体金合成与混合示意图。
图3示出了基于SERS强度的多通量检测芯片SERS t-chip-12-F新型蛋白芯片中基本单元示意图,图中的不同颜色区域代表不同抗体结合位置,也反映了PDMS压印的工艺流程。
图4示出了基于SERS位移的多通量检测芯片原理图,采用SERS信号的偏移进行检测。
图5示出了基于SERS位移的多通量检测芯片的SERS光谱图,实现了对6种组分的同时检测。
具体实施方式
应该指出,以下详细说明都是例示性的,旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明,本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是,这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式,而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的,除非上下文另外明确指出,否则单数形式也意图包括复数形式,此外,还应当理解的是,当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时,其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
需要说明的是,本申请的说明书和权利要求书及上述附图中的术语“第一”、“第二”等是用于区别类似的对象,而不必用于描述特定的顺序或先后次序。应该理解这样使用的数据在适当情况下可以互换,以便这里描述的本申请的实施方式例如能够以除了在这里图示或描述的那些以外的顺序实施。此外,术语“包括”和“具有”以及他们的任何变形,意图在于覆盖不排他的包含,例如,包含了一系列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或设备不必限于清楚地列出的那些步骤或单元,而是可包括没有清楚地列出的或对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。
为了便于描述,在这里可以使用空间相对术语,如“在……之上”、“在……上方”、“在……上表面”、“上面的”等,用来描述如在图中所示的一个部件或者模块或特征与其他部件或者模块或特征的空间位置关系。应当理解的是,空间相对术语旨在包含除了部件或者模块在图中所描述的方位之外的在使用或操作中的不同方位。例如,如果附图中的部件或者模块被倒置,则描述为“在其他部件或者模块或构造上方”或“在其他部件或者模块或构造之上”的部件或者模块之后将被定位为“在其他部件或者模块或构造下方”或“在其他部件或者模块或构造之下”。因而,示例性术语“在……上方”可以包括“在……上方”和“在……下方”两种方位。该部件或者模块也可以其他不同方式定位(旋转90度或处于其他方位),并且对这里所使用的空间相对描述作出相应解释。
本发明的具体实施方式提供了一种基于SERS的高通量蛋白检测芯片,所述芯片包括:
基底,采用表面羟基化处理的硅片;
抗体或待测抗原,所述抗体或待测抗原通过层层组装或共价键结合在表面羟基化处理的硅片表面;其中所述抗体可与待测抗原特异性结合,所述待测抗原可与待测抗原的抗体特异性结合;
若干个Raman探针,预先标记到抗体或待测抗原上,用于产生拉曼信号,通过若干个Raman探针的拉曼特征峰强度或拉曼位移的变化进行待测抗原的定性或定量检测。
本发明技术方案基于SERS特征峰变化实现高通量新型蛋白检测芯片,其通过层层组装或共价键结合在羟基化的硅片上的抗体(或被测抗原)与被测抗原(或第一抗体)结合后,通过拉曼光谱仪检测后与对照组测得光谱比较,产生的拉曼特征峰拉曼位移或拉曼特征峰强度定性或定量测定待测抗原的含量。
所述通过共价键结合的方法是将羟基化硅片进行醛基化后,再通过共价键结合被测抗原。随后引入M种具有不同Raman探针及对应抗体的抗体金溶胶,通过Raman探针的SERS谱峰强度实现定性或定量检测M种癌症标记物。
所述通过层层组装的方法是:在羟基化的硅片表面,通过1%的聚二烯基丙二甲氨基氯化铵(PDDA)静电力组装银纳米粒子或使用蒸镀和3D打印技术制备纳米银基底。再将其表面通过聚二甲基硅烷(PDMS)压印,分成M个区域。最后在每个区域中分别连接Raman探针与抗体,通过Raman探针的SERS谱峰位移实现定性或定量检测M种癌症标记物。
本发明技术方案能够利用SERS的谱峰变化结合多种免疫配体对溶液中的蛋白或核酸进行联合定性或定量检测。其中所述蛋白包括抗原、抗体、多肽等肿瘤标志物;所述核酸均为单链DNA或RNA。即具体进行检测时,当被检测的溶液中含有N种蛋白或核酸,要求对其中M种(1<M<N)种蛋白或核酸进行定性或定量分析,必须用M种免疫配体对该溶液进行检测,新型蛋白芯片通过M种Raman探针实现一次检测分别读出M种蛋白或核酸的浓度。该方法通过M种Raman探针的SERS谱峰变化读出M种被测标记物的浓度,避免了由于交叉免疫反应造成的假阳性结果。
除了上述基于SERS谱峰变化与免疫反应结合的方法外,还在于与SERS数据处理软件结合,可以自动处理M种样品结果,生成标准曲线并计算各个被测标记物的含量,并根据设定的标准进行初步诊断和初筛。
所述新型SERS蛋白芯片为SERS t-chip-12-I,SERS t-chip-12-I是由AFP、CEA、CA199、CA125、CA153、CA50、CA242、β2MG、Fe Pro、NSE、HCG、TNF组成,配以12种Raman探针,用于医院中癌症12项检测,只需做一次即可在确定有无癌症的同时,初步确定癌症组织类型。
所述新型SERS蛋白芯片为SERS t-chip-12-F,SERS t-chip-12-F是由AFP、CEA、CA199、CA125、CA153、CA50、CA242、β2MG、Fe Pro、NSE、HCG、TNF组成,配以12种Raman探针,用于医院中癌症的12项检查,只需要做一次即可在确定有无癌症的同时,初步确定癌症的组织类型。
本发明的目的是提供一种新型蛋白芯片,它能够读出多种癌症标记物。在患者早期普查中,这种蛋白芯片对多种癌症的早期诊断和初筛均有指导意义。检测读出所有癌症标记物的定量方式均根据SERS特征峰的变化(拉曼特征峰的强度和拉曼位移变化),避免了由于基底不均匀造成的误差,提高检测准确度,降低制作成本。
本发明所述的蛋白芯片检测方法包括:蛋白芯片的制备;多种癌症标记物的浓度检测。
蛋白芯片的制备中,本发明的特点在于以硅片作为新型蛋白芯片的基质材料。所述的硅片通过浸泡于质量分数95~98%的浓硫酸水溶液和质量分数25~30%的过氧化氢水溶液混合溶液中,两种溶液的体积比7:3,直至溶液不再有气泡出现为止,将硅片取出并用水清洗,然后浸泡在水溶液中,实现硅片表面羟基化的修饰。
通过层层组装或共价键结合在羟基化的硅片上的抗体(或被测抗原)与被测抗原(或第一抗体)结合后,通过拉曼光谱仪检测后与对照组测得光谱比较,产生的拉曼特征峰拉曼位移或拉曼特征峰强度定性或定量测定待测抗原的含量,省去了三明治夹心法的标记第二抗体,也摒弃了传统的蛋白芯片判读仪器。
能够配合多种免疫配体对溶液中的蛋白或核酸进行联合定性或定量检测,其中所述蛋白包括抗原、抗体、多肽;核酸包括单链DNA和RNA。
当被检测的溶液中有N种蛋白或核酸,要求对其中M(1<M<N)种蛋白或核酸进行定性或定量分析,必须用M种抗体或单链配体DNA(RNA)进行免疫联合检测,因此利用新型蛋白芯片仅需作一次拉曼检测,配合数学分析方法即可实现对M种蛋白或核酸的定性或定量分析。
所述新型SERS蛋白芯片中,必须用到M种Raman探针,例如:对巯基苯甲酸(MBA)、对氨基苯甲酸(PATP)、5,5'-二硫代双(琥珀酰亚胺基-2-硝基苯甲酸)(DSNB)、6-巯基嘌呤(6-MP)、孔雀石绿(MGITC)、罗丹明衍生物、苝四羧酸(PTCA)等。每种探针和对应单独的免疫配体,每一种Raman探针反映一种被测蛋白或核酸的浓度。
传统的联合免疫分析中,某些肿瘤标记物可以与其它多种免疫配体发生交叉反应而产生假阳性结果,用所述新型蛋白配体,仅作一次免疫检测即可实现M种免疫配体检测某种或多种蛋白或核酸。一定程度上掌握或排除非特异性反应产生的假阳性假阴性结果,进而提高检测的准确度。
除上述检测方法外,还在于配用专门的SERS数据分析软件,该软件可以基于SERS谱图中特征峰的变化种类(强度和拉曼位移)采用不同的分析方法(加标、差谱等),自动生成M个标准曲线,自动用于各个被测物含量的计算,并根据各个癌症标记物的正常值给出结果(正常或超标),于是该新型蛋白芯片有能力初步诊断被检测者是否患有癌症。
所述新型SERS蛋白芯片为SERS t-chip-12-I,SERS t-chip-12-I是基于SERS特征峰强的变化,由AFP、CEA、CA199、CA125、CA153、CA50、CA242、β2MG、Fe Pro、NSE、HCG、TNF联合组成,用于检测医院中的肿瘤12项筛查,只需一次检测,不但具有能确定被检测者无有癌症,还具备定位癌症组织类型的能力。
本发明中,本发明利用SERS谱图变化丰富,信息多样的特点。多种拉曼探针对应各自的蛋白或核酸标志物,互不干扰,实现了多种癌症标志物的一步同时检测,节约了时间,降低了成本。配以数学分析软件,可以有效提高检测方法的准确性和灵敏度。同时也为发展SERS作为医学诊断工具奠定基础。
实施例1
用于制备基于SERS强度的多通量检测芯片SERS t-chip-12-I,即SERS t-chip-12-I新型蛋白芯片。
首先,基于SERS强度的多通量检测芯片SERS t-chip-12-I的制备过程如下:
1.在一个200mL烧杯中加入质量分数98%的浓硫酸水溶液和质量分数30%的过氧化氢水溶液,两者的体积比=7:3。
2.将硅片切成边长为0.5cm的方块。
3.将切好的硅片放进浓硫酸和过氧化氢的混合溶液中,此时溶液开始有气泡产生。制备可修饰的硅基底。
4.将该烧杯加热,直至没有气泡冒出。将酸液倒出,用水稀释。随后将硅片用大量水清洗干净,再在质量分数为1-10%的硅烷偶联剂中多用1-2小时,取出后用大量水冲洗,氮气吹干。
5.再将硅片上的羟基转化成醛基:采用蛋白交联剂如戊二醛、碳二亚胺等,将硅片浸泡在0.1-1%交联剂溶液中,37℃反应2小时,用大量水冲洗,氮气吹干。
6.交联待测溶液:将上一步得到的硅片置入装有500μL待测溶液的离心管中,37℃温育2小时,用水冲洗,待测。待测溶液为含有待测抗原的溶液。
7.将抗体纳米金100μL,加入装有步骤6中待测芯片的离心管中,反应半小时后,进行拉曼检测,和标准品检测得到的标准曲线进行数学分析,定性比较或定量检测相应的癌症抗原的浓度,检测原理与光谱变化如图1所示。
其中,抗体纳米金按照如下步骤制备:通过传统的Meisel&Lee法制备20nm的金溶胶,将12mL金溶胶10000转/分离心7分钟后去掉上层清液,取1mL分别和100μL、1mg/mL的12种不同Raman探针溶液混合,反应3小时后,分别加入十二种抗体的饱和的的磷酸缓冲溶液20μL,Raman探针和抗体一一对应,反应12个小时,再加入100μL、0.1mg/mL的牛血清蛋白的磷酸缓冲溶液封闭,离心去掉上层清液后用磷酸缓冲溶液重新分散至500μL并保存于4℃冰箱中,得到12种抗体纳米金溶胶,最后通过一定比例将12种抗体金纳米粒子混合,示意图如图2所示。
本发明中使用的仪器是共聚焦拉曼光谱仪(Horiba LabRam ARAMIS),激发源波长为632.8nm功率为10W,扫描时间为1s。
实施例2
本实施例是基于拉曼特征峰位移的多通量检测,即SERS t-chip-12-F新型蛋白芯片的制备与应用。该方法主要用于对癌症被检测者的进行诊断和初筛。对患者的诊断确认分为两个步骤,第一是对癌症12项标记物的浓度进行检测,这12种肿瘤标志物分别是:AFP、CEA、CA199、CA125、CA153、CA50、CA242、β2MG、Fe Pro、NSE、HCG、TNF。其次是对数据进行分析得出初步诊断。
首先,通过上述方法制备蛋白芯片。
1.在一个200mL烧杯中加入质量分数98%的浓硫酸水溶液和质量分数30%的过氧化氢水溶液,两者的体积比=7:3。
2.将硅片切成边长为0.5cm的方块。
3.将切好的硅片放进浓硫酸和过氧化氢的混合溶液中,此时溶液开始有气泡产生。
4.将该烧杯加热,直至没有气泡冒出。将酸液倒出,用水稀释。随后将硅片用大量水清洗干净,再在质量分数为1%的聚二烯基并二甲氨基氯化铵(PDDA)水溶液中浸泡半小时,取出后用大量水冲洗,氮气吹干。
5.再浸泡到Meisel&Lee方法制备的60nm银溶胶中,浸泡4小时。将硅片从银溶胶中取出用水冲洗,氮气吹干,将其表面通过聚二甲基硅烷(PDMS)压印,分成12个区域,分区示意图如图3所示。
6.将步骤5得到的硅片按照分区,分别浸泡不同的Raman探针及抗体。如以对巯基苯甲酸和甲胎蛋白(MBA-AFP)为例:将图3分区1浸泡到10-4M的MBA乙醇中,4小时后取出,用酒精冲洗,氮气吹干。随后经过浓度为1mg/mL的EDC/NHS等浓度混合溶液活化羧基后4小时取出,用水冲洗后氮气吹干,加入500μL、30ng/mL的AFP抗体,反应12小时后取出用缓冲液洗净。再用0.1mg/mL的BSA溶液浸泡半小时取出,其检测原理与光谱变化如图4所示。对于其他分区,更换其他抗体与不同的Raman探针,重复该步骤后得到可以同时检测12种癌症标志物的新型蛋白芯片。
7.取100μL患者血清,分散到400μL的磷酸缓冲液中,室温下将蛋白芯片浸泡在其中半小时后取出,用磷酸缓冲溶液冲洗后,氮气吹干。将吹干后蛋白芯片放入样品台进行拉曼检测,通过谱图处理记录拉曼位移值。
通过SERS分析处理软件,以12种标准品的各个浓度对它的位移值做工作曲线。把12个回归曲线放到软件里,求出未知样品的各个指标是否正常或超标。结合制定的诊断标准,使该芯片SERS t-chip-12-F具有判断被检测者患各种癌症的初步诊断能力。
本发明中使用的仪器是共聚焦拉曼光谱仪(Horiba LabRam ARAMIS),激发源波长为632.8nm功率为10W,扫描时间为1s。
实施例3
本实施例基于拉曼特征峰位移的多通量检测,用于对癌症被检测者的进行诊断和初筛。对患者的诊断确认分为两个步骤,第一是对癌症6项标记物的浓度进行检测,这6种肿瘤标志物分别是:AFP、CEA、CA199、CA125、CA153、CA50。其次是对数据进行分析得出初步诊断。
首先,通过上述方法制备蛋白芯片。
1.在一个200mL烧杯中加入质量分数98%的浓硫酸水溶液和质量分数30%的过氧化氢水溶液,两者的体积比=7:3。
2.将硅片切成边长为0.5cm的方块。
3.将切好的硅片放进浓硫酸和过氧化氢的混合溶液中,此时溶液开始有气泡产生。
4.将该烧杯加热,直至没有气泡冒出。将酸液倒出,用水稀释。随后将硅片用大量水清洗干净,再在质量分数为1%的聚二烯基并二甲氨基氯化铵(PDDA)水溶液中浸泡半小时,取出后用大量水冲洗,氮气吹干。
5.再浸泡到Meisel&Lee方法制备的60nm银溶胶中,浸泡4小时。将硅片从银溶胶中取出用水冲洗,氮气吹干,将其表面通过聚二甲基硅烷(PDMS)压印,分成12个区域。
6.将步骤5得到的硅片按照分区,分别浸泡不同的Raman探针及抗体。如以对巯基苯甲酸和癌胚抗原(MBA-CEA)为例:将图3分区1浸泡到10-4M的MBA乙醇中,4小时后取出,用酒精冲洗,氮气吹干。随后经过浓度为1mg/mL的EDC/NHS等浓度混合溶液活化羧基后4小时取出,用水冲洗后氮气吹干,加入500μL、30ng/mL的CEA抗体,反应12小时后取出用缓冲液洗净。再用0.1mg/mL的BSA溶液浸泡半小时取出。对于其他分区,更换其他抗体与不同的Raman探针,重复该步骤后得到可以同时检测12种癌症标志物的新型蛋白芯片。Raman探针选用对巯基苯甲酸(MBA)、对氨基苯甲酸(PATP)、5,5'-二硫代双(琥珀酰亚胺基-2-硝基苯甲酸)(DSNB)、6-巯基嘌呤(6-MP)、罗丹明6G(R6G)、苝四羧酸(PTCA)。
7.取100μL患者血清,分散到400μL的磷酸缓冲液中,室温下将蛋白芯片浸泡在其中半小时后取出,用磷酸缓冲溶液冲洗后,氮气吹干。将吹干后蛋白芯片放入样品台进行拉曼检测,得到光谱如图5所示,通过谱图处理记录拉曼位移值。
通过SERS分析处理软件,以6种标准品的各个浓度对它的位移值做工作曲线。把12个回归曲线放到软件里,求出未知样品的各个指标是否正常或超标。
本发明不限于上述实例中的免疫配体、SERS检测仪器的种类、肿瘤标志物的种类和数量、SERS增强基底种类、Raman探针种类等。
以上所述仅为本申请的优选实施例而已,并不用于限制本申请,对于本领域的技术人员来说,本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本申请的保护范围之内。
Claims (5)
1.一种基于SERS的高通量蛋白检测芯片,其特征在于,所述芯片包括:
基底,采用表面羟基化处理的硅片;
待测抗原,所述待测抗原通过共价键结合在表面羟基化处理的硅片表面;
若干个Raman 探针,预先标记到抗体或者抗体金溶胶上,用于产生拉曼信号,通过若干个Raman 探针的拉曼特征峰强度的变化进行待测抗原的定性或定量检测;其中所述抗体或者抗体金溶胶上的抗体可与待测抗原特异性结合;
其中,所述抗体或待测抗原通过共价键结合在表面羟基化处理的硅片表面的具体方法是,先羟基化硅片进行醛基化处理,然后通过共价键结合待测抗原,醛基化处理的试剂选用戊二醛、碳二亚胺,使用的试剂质量浓度为0.1-1 mg/mL,所述Raman探针选自对巯基苯甲酸、对氨基苯甲酸、5,5'-二硫代双(琥珀酰亚胺基-2-硝基苯甲酸)、6-巯基嘌呤、孔雀石绿、罗丹明衍生物或苝四羧酸。
2.根据权利要求1所述的基于SERS的高通量蛋白检测芯片,其特征在于,
将若干种抗体通过所述Raman 探针连接到纳米金粒子上,然后混合得到的纳米金粒子形成纳米金溶胶。
3.权利要求1-2中任意一项所述基于SERS的高通量蛋白检测芯片在定性或定量检测肿瘤标记物方面的应用,所述肿瘤标记物选自作为肿瘤标志物蛋白的抗原、抗体、多肽或者编码所述肿瘤标志物蛋白的核酸分子。
4.根据权利要求3所述的应用,其特征在于:所述肿瘤标记物选自AFP、CEA、CA199、CA125、CA153、CA50、CA242、β2MG、Fe Pro、NSE、HCG、TNF。
5.一种高通量检测肿瘤标记物的方法,其特征在于所述方法包括:
(1)构建权利要求1-2中任意一项所述的高通量蛋白检测芯片;
(2)使被测抗原或者被测抗原相应的特异性抗体与步骤(1)的高通量蛋白检测芯片硅片表面充分接触;
(3)通过拉曼光谱仪检测,获取拉曼特征峰拉曼位移或拉曼特征峰强度,进而定性或定量测定待测抗原的含量。
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Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
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---|---|---|---|---|
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CN103954764A (zh) * | 2014-05-16 | 2014-07-30 | 华南师范大学 | 快速定量检测玉米赤霉烯酮的方法 |
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Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
5,5"-二硫代双(琥珀酰亚氨基-2-硝基苯甲酸)功能化的SERS纳米探针在免疫检验中的应用;陈雷等;《高等学校化学学报》;20150831;第36卷(第8期);第1505-1510页 * |
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