CN109406487B - 检测阿尔茨海默症标志物的拉曼生物传感器及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物传感器技术领域，涉及一种检测阿尔茨海默症标志物的拉曼生物传感器，特别涉及一种基于SERS增强来检测阿尔茨海默症两种生物标志物的拉曼生物传感器及其制备方法和应用。本发明提供一种检测tau蛋白和Aβ1‑42低聚体的拉曼生物传感器，其检测过程通过适配体修饰纳米金，显著提高了检测灵敏度。该拉曼生物传感器，包括两条适配体DNA、金纳米粒子、均相反应液。制备的生物传感器，灵敏度高、检测快、重复性好、成本低，且制备方法简单。
Description
技术领域
本发明属于生物传感器技术领域，涉及一种检测阿尔茨海默症标志物的拉曼生物传感器，特别涉及一种基于SERS增强来检测阿尔茨海默症两种生物标志物的拉曼生物传感器及其制备方法。
背景技术
阿尔茨海默病（AD）是一种起病隐匿的进行性发展的神经系统退行性疾病。临床上以记忆障碍、失语、失用、失认、视空间技能损害、执行功能障碍以及人格和行为改变等全面性痴呆表现为特征，病因迄今未明。65岁以前发病者，称早老性痴呆；65岁以后发病者称老年性痴呆。AD最具特征性的病理改变是细胞外老年斑的形成和细胞内神经元纤维缠结的形成。老年斑主要由β淀粉样蛋白肽Aβ构成，Aβ是一种含有39-42个氨基酸的多肽，由β淀粉样前体蛋白APP经过α、β、γ分泌酶裂解衍生而来的，在AD的发生发展中起着重要作用，Aβ1-42是老年斑的主要成分。Tau蛋白是含量最高的微管相关蛋白，在正常脑中Tau蛋白的细胞功能是与微管蛋白结合促进其聚合形成微管；在阿尔茨海默症中异常磷酸化tau蛋白增加，造成形成神经纤维缠结。
目前报道的检测tau蛋白和Aβ1-42低聚体的方法主要有酶联免疫法（ELISA）、表面等离子体共振、电化学方法等，这些方法往往存在仪器和抗体价格昂贵、操作复杂、灵敏度低、重现性差等问题，因此，目前急需建立一种快速，准确，灵敏且高特异性的检测方法来检测tau蛋白和Aβ1-42低聚体从而来诊断阿尔茨海默症的方法。
发明内容
针对目前缺乏快速，准确，灵敏且高特异性的检测tau蛋白和Aβ1-42低聚体的方法的问题，本发明提供一种检测tau蛋白和Aβ1-42低聚体的拉曼生物传感器，其检测过程通过适配体修饰纳米金，显著提高了检测灵敏度。
本发明是通过以下步骤得到的：
一种检测阿尔茨海默症标志物的拉曼生物传感器，包括两条适配体DNA、金纳米粒子、均相反应液。
所述的两条适配体DNA序列分别是：
PolyA10-Tau aptamer :5’-AAAAAAAAAATTTTTGCGGAGCGTGGCAGG-3’；
PolyA10-Aβ1-42aptamer :5’-AAAAAAAAAATTTTTGCCTGTGGTGTTGGGGCGGGTGCG-3’。
所述的均相反应液为：1*PBS，目标物以及事先标记好目标物对应的各自DNA适配体的AuNPs；所述的均相溶液中1*PBS 的NaCl终浓度为77.5 mM；所述的目标物为： tau蛋白或/和Aβ1-42低聚体。
上述拉曼生物传感器的制备方法，包括以下步骤：
（1）将两条适配体DNA各自修饰到金纳米粒子表面；
（2）将修饰后的的纳米金粒子与均相反应溶液混合；
（3）拉曼强度分析。
所述的步骤（1）的具体操作步骤如下：
S1 制备1 nM纳米金溶液，加入拉曼染料4-NTP和适配体DNA，混合均匀后，4 ℃下保存；
S2 搅拌条件下，按照1μL/min的速度将PB缓冲液滴加到步骤S1得到的溶液中，然后1μL/min的速度加入PBS缓冲液，加完后置于4℃保存；
S3 向步骤S2得到的溶液中加入灭菌水，离心，去除上清液；再加入灭菌水，离心，此过程重复两次，得到修饰后的纳米金浊液。
所述步骤S1中适配体DNA的加入量为：最终体系中的修饰好的纳米金浓度为0.3nM，目标物tau蛋白的浓度为0 fM-10 nM，Aβ1-42低聚体的浓度为0 nM-30 nM。
所述步骤S2中PBS加入量为使其中PB的浓度为10 mM, NaCl终浓度为77.5 mM。
所述的S3中标记到纳米金上的DNA与AuNPs的摩尔比为150:1。
所述的步骤（2）的过程为：将修饰后的纳米金溶液与均相溶液混合，37 ℃水浴下反应。
本发明中一共用到了2条DNA链，其序列分别是：
PolyA10-Tau aptamer :5’-AAAAAAAAAATTTTTGCGGAGCGTGGCAGG-3’
PolyA10-Aβ1-42aptamer :5’-AAAAAAAAAATTTTTGCCTGTGGTGTTGGGGCGGGTGCG-3’
这两条DNA链是Tau蛋白和Aβ1-42低聚体的适配体，能特异性地分别和这两种蛋白结合，其中这两条DNA链的5’端各修饰了一段重复的A碱基，即polyA10，polyA10的功能类似于-SH能和纳米金AuNPs结合，从而能将两种DNA链分别修饰到AuNPs上，当有目标物tau和Aβ1-42低聚体出现时，能分别和各自的适配体aptamer特异性结合，从而将DNA链从纳米金的表面释放下来，纳米金表面失去了DNA链的保护，在高盐的条件下发生团聚，纳米金的表面修饰了拉曼染料，纳米金不发生团聚时的拉曼信号非常弱，当目标物出现时，纳米金发生团聚，不仅溶液颜色会发生变化，而且由于团聚，使得纳米金之间的电磁场增强，从而发生表面增强拉曼散射SERS。通过测纳米金溶液的吸光度和拉曼信号均能实现tau蛋白和Aβ1-42低聚体的检测。
该发明的检测方式是纳米金团聚检测，利用目标物和适配体DNA的特异性结合使得纳米金产生聚沉，从而产生颜色的变化。在检测之前，先通过polyA10将适配体修饰到金纳米粒子表面，然后将不同浓度的目标物tau蛋白和Aβ1-42低聚体分别与标有各自适配体的纳米金粒子混合，然后在37℃孵育进行反应的发生。最后，通过检测溶液的紫外吸收光谱和拉曼信号强度进行目标物的检测。
本发明基于核酸适配体与目标物的特异性识别从而使纳米金在高盐条件下失去了DNA的保护构建了适体生物传感器。该传感器具有检测速度快，检测限低，灵敏度高等优点，可以弥补tau蛋白和Aβ1-42低聚体现有检测方法的缺陷与不足，实现对其快速，准确的定量检测。
本发明的有益效果：
1、灵敏度高：利用了核酸适配体的特异型识别，实现了对目标物tau蛋白和Aβ1-42低聚体的高特异性检测；该方法的检测下限为0.5 nM。
2、检测快：该传感器的反应条件温和，反应速度快；由于使用纳米金法，其检测方法操作简便、检测周期短、易携带、现象明显。
3、重复性好：制备方法简单，性能稳定，纳米金颜色变化的重复性好，适用于tau蛋白和Aβ1-42低聚体的检测从而辅助诊断阿尔茨海默症。
4、成本低：制作该生物传感器的工艺成本低，适用于产业化中价廉的要求。
附图说明
图1为该实验的原理图；
图2为实施例1标记完适配体的纳米金浓度优化检测结果图；
图3为实施例2传感器检测的紫外光谱标准曲线；A．Tau蛋白和纳米金体系的反应校准曲线B. Tau蛋白和纳米金体系的反应标准曲线；
图4为实施例2传感器检测的拉曼曲线。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步说明。
实施例1
将polyA10修饰的适配体DNA修饰到金纳米粒子表面的具体操作步骤如下：
① 取1 mL纳米金溶液于离心管中，离心10 min，同时离心两管备用。离心至上清液无色透明，去除上清液，加入300 μL灭菌水使纳米金溶液浓缩至1 nM。移入1 mL玻璃瓶中，用锡箔纸封口。
② 室温放置30 min后，加入10 μL浓度为50μM的拉曼染料4-NTP和140 μL浓度为10 μM的修饰了polyA10的适配体DNA，混合均匀后，4 ℃下放置24 h。
③ 分多次缓慢加入50 μL PB缓冲液，加入磁子（前一天用王水浸泡）搅拌10 min后，继续加入27 μL PBS缓冲液。取出磁子，4 ℃放置48 h。
④ 将标记好的纳米金溶液转移至离心管中，加入灭菌水至1 mL，离心10 min，去除上清液。再加入1 mL灭菌水离心，此过程重复两次（为了洗脱未标记上的DNA链）。
均相溶液中反应过程的主要步骤如下：
a.将不同浓度已标好的纳米金（终浓度为：0.1nM、0.2nM、0.3nM、0.4nM、0.5nM）,5μL1*PBS（NaCl终浓度为77.5mM）和5μL对应的各自的目标物（tau蛋白和Aβ1-42低聚体）加入离心管中，震荡30s，放入37℃的水浴锅中每隔10min观察颜色变化。
b.待颜色变化后，用紫外可见分光光度计测定混合溶液的吸收值并用拉曼光谱仪检测拉曼信号，据此检测目标物。
结果见图2，从图中可以看出，检测到的紫外吸收峰值随着AuNPs的终浓度在0.1-0.5nM区间变化明显，AuNPs最佳终浓度为0.3nM。
上述过程中用到的溶液的制备方法：
5*PBS缓冲液是由以下方法配制：Na2HPO4 (100mM)，NaH2PO4 (100mM), NaCl (700mM), MgCl2 (5 mM), 最终溶液的pH值为7.4，用之前将5*PBS稀释成1*PBS。
配置的5*PBS缓冲液与所用超纯水均需进行高温灭菌处理。具体方法是，将5*PBS和超纯水分别放置在不同的锥形瓶中，然后用锡箔纸和报纸进行封口。在高压灭菌锅中在120 ℃的温度下灭菌20 min。
实施例2
将polyA10修饰的适配体DNA修饰到金纳米粒子表面的具体操作步骤如下：
① 取1 mL纳米金溶液于离心管中，离心10 min，同时离心两管备用。离心至上清液无色透明，去除上清液，加入300 μL灭菌水使纳米金溶液浓缩至1nM。移入1 mL玻璃瓶中，用锡箔纸封口。
② 室温放置30 min后，加入10 μL浓度为50 μM的拉曼染料4-NTP和140 μL浓度为10 μM的修饰了polyA10的适配体DNA，混合均匀后，4 ℃下放置24 h。
③ 分多次缓慢加入50 μL PB缓冲液，加入磁子（前一天用王水浸泡）搅拌10 min后，继续加入27 μL PBS缓冲液。取出磁子，4 ℃放置48 h。
④ 将标记好的纳米金溶液转移至离心管中，加入灭菌水至1 mL，离心10 min，去除上清液。再加入1 mL灭菌水离心，此过程重复两次（为了洗脱未标记上的DNA链）。
均相溶液中反应过程的主要步骤如下：
a.在体系中加入标记好的5μLAuNPs（终浓度为0.3nM），5μL1*PBS（NaCl终浓度为77.5mM）和5μL不同浓度（终浓度：10nM、5nM、1nM、100pM、10pM、1pM、100fM、50fM、10fM、0fM）的tau蛋白加入离心管中，震荡30s，放入37℃的水浴锅中每隔10min观察颜色变化。
b.待颜色变化后，用紫外可见分光光度计测定混合溶液的吸收值，据此检测tau蛋白。
同样的方法，在体系中加入（30nM、18nM、12nM、8nM、4nM、2nM、0.5nM、0nM)的Aβ1-42低聚体,然后用紫外可见分光光度计测定混合溶液的吸收值，据此检测Aβ1-42低聚体。
检测结果如图3所示，图中我们可以看到，当tau蛋白浓度在10fM到10nM时吸光值不断减小，其中tau蛋白浓度在10nM和5nM时吸光度下降剧烈，变化尤为明显，表明此时该体系非常灵敏，同时在1nM到10fM之间目标物浓度对数与紫外吸收峰值的大小成正比关系，拟合曲线：A =-0.0079*logC+0.1521（A是紫外吸收峰值，C是tau蛋白的浓度），图中的的吸收峰值的最高点因此可得到该方法的检测下限为10fM；当Aβ1-42低聚体浓度在0.5nM-30nM时吸光值不断减小，其中Aβ1-42低聚体浓度在30nM时吸光度下降剧烈，变化尤为明显，表明此时该体系非常灵敏，同时在0.5nM到18nM之间目标物浓度对数与紫外吸收峰值的大小成正比关系，拟合曲线：A =-0.019*logC+0.1101（A是紫外吸收峰值，C是Aβ1-42低聚体的浓度），图中的的吸收峰值的最高点因此可得到该方法的检测下限为0.5nM。
实施例3
将polyA10修饰的适配体DNA修饰到金纳米粒子表面的具体操作步骤如下：
① 取1 mL纳米金溶液于离心管中，离心10 min，同时离心两管备用。离心至上清液无色透明，去除上清液，加入300 μL灭菌水使纳米金溶液浓缩至1nM。移入1 mL玻璃瓶中，用锡箔纸封口。
② 室温放置30 min后，加入10 μL浓度为50μM的拉曼染料4-NTP和140 μL浓度为10 μM的修饰了polyA10的适配体DNA，混合均匀后，4 ℃下放置24 h。
③ 分多次缓慢加入50 μL PB缓冲液，加入磁子（前一天用王水浸泡）搅拌10 min后，继续加入27 μL PBS缓冲液。取出磁子，4 ℃放置48 h。
④ 将标记好的纳米金溶液转移至离心管中，加入灭菌水至1 mL，离心10 min，去除上清液。再加入1 mL灭菌水离心，此过程重复两次（为了洗脱未标记上的DNA链）。
均相溶液中反应过程的主要步骤如下：
a.在体系中加入标记好的5μLAuNPs（终浓度为0.3nM），5μL1*PBS（NaCl终浓度为77.5mM）和5μL不同浓度（终浓度：10nM、5nM、1nM、100pM、10pM、1pM、100fM、50fM、10fM、0fM）的tau蛋白加入离心管中，震荡30s，放入37℃的水浴锅中每隔10min观察颜色变化。
b.待颜色变化后，用拉曼光谱仪检测拉曼信号，据此检测tau蛋白。
同样的方法，在体系中加入（30nM、18nM、12nM、8nM、4nM、2nM、0.5nM、0nM)的Aβ1-42低聚体,然后用拉曼光谱仪检测拉曼信号，据此检测Aβ1-42低聚体。
检测结果如图4所示，与紫外光谱图吻合。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受实施例的限制，其它任何未背离本发明的精神实质与原理下所做的改变、修饰、组合、替代、简化均应为等效替换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 济南大学
<120>检测阿尔茨海默症标志物的拉曼生物传感器及其制备方法
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 30
<212> DNA
<213>人工序列(artiartificial sequence)
<400> 1
aaaaaaaaaa tttttgcgga gcgtggcagg 30
<210> 2
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(artiartificial sequence)
<400> 2
aaaaaaaaaa tttttgcctg tggtgttggg gcgggtgcg 39
Claims (7)
1.一种检测阿尔茨海默症标志物的拉曼生物传感器，其特征在于，包括两条适配体DNA、金纳米粒子、均相反应液；
所述的两条适配体DNA序列分别是：
PolyA10-Tau aptamer，其序列如SEQ ID No:1所示；
PolyA10-Aβ1-42 aptamer，其序列如SEQ ID No:2所示；
所述的均相反应液为：1*PBS、目标物以及事先标记好目标物对应的各自DNA适配体的AuNPs；所述的均相反应液中1*PBS 的NaCl终浓度为77.5 mM；所述的目标物为：tau蛋白或/和Aβ1-42低聚体。
2.一种权利要求1所述的拉曼生物传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将两条适配体DNA各自修饰到金纳米粒子表面；
（2）将修饰后的的纳米金粒子与均相反应溶液混合；
（3）拉曼强度分析。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述的步骤（1）的具体操作步骤如下：
S1 制备1 nM纳米金溶液，加入拉曼染料4-NTP和适配体DNA，混合均匀后，4 ℃下保存；
S2 搅拌条件下，按照1μL/min的速度将PB缓冲液滴加到步骤S1得到的溶液中，然后1μL/min的速度加入PBS缓冲液，加完后置于4℃保存；
S3 向步骤S2得到的溶液中加入灭菌水，离心，去除上清液；再加入灭菌水，离心，此过程重复两次，得到修饰后的纳米金浊液。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S1中适配体DNA加入量为1 μM, 最终体系中的修饰好的纳米金浓度为0.3 nM，目标物tau蛋白的浓度为0 fM-10 nM，Aβ1-42低聚体的浓度为0 nM-30 nM。
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S2中PBS加入量为使其中PB的浓度为10 mM，NaCl浓度为0.3 M，最终体系中NaCl终浓度为77.5 mM。
6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述的S3中标记到纳米金上的DNA与AuNPs的摩尔比为150:1。
7.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述的步骤（2）的过程为：将修饰后的纳米金溶液与均相溶液混合，37 ℃水浴下反应。
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