TWI702971B - 一種篩檢阿茲海默症前兆之變色眼藥水及其應用 - Google Patents
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Abstract
本發明有關於一種篩檢阿茲海默症前兆之變色眼藥水及其應用，所述變色眼藥水係包括1 pg/ml∼10 ng/ml的 Aβ
42適體(Aptamer)-奈米金粒子(AuNPs)及其醫藥學上可接受之載劑或媒劑，將變色眼藥水與一受試個體之淚液混合，並分析變色眼藥水之顏色變化，以用於判定受試個體之淚液所含Aβ
40：Aβ
42濃度比例；藉此，本發明可被用以快速篩檢受試個體是否具有阿茲海默症前兆，並具有低成本、使用便利之功效。
Description
本發明係有關於一種篩檢阿茲海默症前兆之變色眼藥水及其應用，尤其係指一種可藉由顏色變化得知受試個體是否具有阿茲海默症前兆之眼藥水，其具有早期、快速篩檢、低成本且檢測便利之功效。
失智症(Dementia)是因為腦細胞退化、萎縮，造成記憶力及其它大腦功能減退，程度嚴重到足以影響日常生活。阿茲海默症(Alzheimer's disease)為最常見的一種失智症(約佔50-60%)，初期症狀為記憶力減退，主因是類澱粉斑塊沉積於腦部，其次為血管性失智症(因腦血管阻塞引起，約佔20%)，再其次為混合性失智症(阿茲海默症合併腦中風，約佔10%)，以及其它疾病引起(如巴金森氏症、水腦症、頭部外傷、梅毒、愛滋病、憂鬱症、環境毒素引起，約佔10%)。由於老人失智症情形相當嚴重，各國已爭相投入相關研究，根據報導(The Global Impact of Dementia,World Alzheimer Report 2015)，於2015年全球每年花費在失智症的相關支出高達8,180億美元、預估2030年將突破2兆美元，這是一種花費社會成本最高的疾病。由於阿茲海默症約佔失智症高達50-60%，且目前
並無有效的治療方法，因此相關研創者紛紛開發各種篩檢阿茲海默症之工具，以期在嚴重發病之前進行篩檢，並藉由早期治療延緩腦細胞退化之進程。
舉例而言，美國專利公告第US 9,023,607號即揭示一種「利用光電晶體管早期診斷阿茲海默症的方法」，主要係使用光電晶體管裝置檢測細胞中β-澱粉樣蛋白(beta-amyloid)，所述方法包括提供可能含有β-澱粉樣蛋白的細胞，並利用磁珠標記具阿茲海默症特徵性蛋白質(β-澱粉樣蛋白)生物標誌物，再使細胞位於光電晶體管的溝道區域中，藉由檢測正常細胞和包含用磁珠標記的蛋白質生物標誌物的細胞之間的光電流差異，以在早期診斷阿茲海默症。然而，上述方法不僅磁珠之製備程序繁瑣，且須使用光電晶體管裝置進行分析，因此需有專業人士協助才得以檢測。
另，中華民國專利公告第I470205號提供一種「光學檢測方法」，其以非侵入性且免標定的方式檢測人眼內的β-澱粉類蛋白之濃度，以供早期診斷阿茲海默症；詳細而言，所述方法包括：(1)選定一物質為β-澱粉類蛋白(β-amyloid,A β)；(2)參照所選定的物質的一吸收光譜來選擇入射光的頻率以入射一光線至人眼內的一待測區，使光線之頻率等同或接近物質的其中一個分子能階的電子躍遷之共振模態的激發頻率，以激發物質產生共振拉曼效應或類共振拉曼效應，而獲得一檢測光譜，其中光線的波長範圍為300-330奈米；以及(3)接收檢測光譜，並依據檢測光譜的波峰強度來估計物質的濃度。雖然上述方法能以非侵入方式早期檢測人眼內的β-澱粉類蛋白之濃度，但其檢測方式仍涉及昂貴的光學儀器，且需要專業人士才得以操作並解讀檢測所得的光譜意義，於實際使用上仍缺乏便利性。
今，發明人即是鑑於上述現有篩檢阿茲海默症之方法於實際實施使用時仍具有多處缺失，於是藉由其豐富專業知識及多年之實務經驗所輔佐，而加以改善，並據此研創出本發明。
本發明主要目的為提供一種篩檢阿茲海默症前兆之變色眼藥水及其應用，所述變色眼藥水可藉由觀察與受試個體之淚液混合後是否變色，以得知受試個體是否具有阿茲海默症前兆。
為了達到上述實施目的，本發明提供一種篩檢阿茲海默症前兆之變色眼藥水，其係包括1pg/ml~10ng/ml的A β42(β-amyloid 42)適體(Aptamer)-奈米金粒子(AuNPs)及其醫藥學上可接受之載劑或媒劑，其中A β42適體係採用指數增值系統化配體篩選法(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment，SELEX)所得，其中A β42適體進行SELEX所需之序列為SEQID NO：1。
另，本發明亦提供一種變色眼藥水之應用，係包括將變色眼藥水與一受試個體之淚液混合，並分析變色眼藥水之顏色變化，以用於判定受試個體之淚液所含A β40：A β42濃度比例。
藉此，本發明無須使用貴重儀器進行檢測，即可早期且快速辨別受試個體是否具有罹患阿茲海默症的可能性。
第一圖：本發明之變色眼藥水於加入含A β42淚液後之變色示意圖。
第二圖：本發明之變色眼藥水應用於試紙檢測之示意圖。
本發明之目的及其結構功能上的優點，將依據以下圖面所示之結構，配合具體實施例予以說明，俾使審查委員能對本發明有更深入且具體之瞭解。
本發明提供一種篩檢阿茲海默症前兆之變色眼藥水及其應用，所述變色眼藥水，係包括1pg/ml~10ng/ml的A β42適體(Aptamer)-奈米金粒子(AuNPs)及其醫藥學上可接受之載劑或媒劑，其中A β42適體係採用指數增值系統化配體篩選法(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment，SELEX)所得，較佳而言，A β42適體進行SELEX所需之序列如SEQID NO：1所示。
本發明亦提供一種變色眼藥水之應用，係包括將變色眼藥水與一受試個體之淚液混合，並分析變色眼藥水之顏色變化，以用於判定受試個體之淚液所含A β40：A β42濃度比例。
此外，藉由下述具體實施例，可進一步證明本發明可實際應用之範圍，但不意欲以任何形式限制本發明之範圍。
實施例一：建立A β
42
適體(Aptamer)-奈米金粒子(AuNPs)
(1)製備A β42適體
一般而言，A β42抗體只會專一性結合(Specific binding)檢體中的A β42並與之結合，而不會與A β40進行結合，但抗體相當昂貴且保存不易，且將抗體製成檢測試劑或檢測套組之程序複雜，因此本發明建立A β42適體取代抗體，以達到可專一性結合A β42，同時亦可專一性結合A β40之特性，並且易於保存。
本實施例採用指數增值系統化配體篩選法(SELEX,Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment)製備出A β42適體序列，進行SELEX所需之序列如序列表SEQID NO：1。
(2)接合奈米金粒子
由於金(Au)有良好的生物相容性，且奈米化的金粒子表面具
有表面電漿共振效特性(surface plasmon resonance)，因此奈米金粒子(gold nanoparticles，AuNPs)常用於生物醫學上的檢測、疾病診斷及基因偵測。於本實施中，主要參考Wen Yun等人發表之期刊European Food Research and Technology 238(6)：989-995和Lin,Xiaoyan等人發表之期刊Chem Sci.2017 May 1；8(5)：3905-3912，製備A β42適體(Aptamer)-奈米金粒子(AuNPs)。
首先，將檸檬酸鈉(sodium citrate)作為還原劑加入氯金酸(chloroauric acid，HAuCl4)來製備奈米金粒子。簡言之，將含有0.01g氯金酸的100mL溶液回流，並於攪拌氯金酸溶液時加入2.5mL濃度為1%檸檬酸鈉溶液，以形成一混合溶液；接續，將混合物溶液保持沸騰30分鐘，再冷卻至室溫後，儲存於4℃的深色玻璃瓶中以供使用。將上述A β42適體序列加入10mM TCEP(tris(2-carboxyethyl)phosphine)溶液至於室溫中30分鐘，接著取100nM反應後的適體序列、0.01% tween20及200nM PEG-thiol加入50nM的奈米金粒子中於室溫反應1.5小時，反應完成後以12000rpm離心30分鐘，取出上清液後即可製成A β42與適體-奈米金粒子(Aptamer-AuNPs)複合物。
實施例二：實際檢測
選取一正常受試個體初步測試眼藥水之變色情形，於採集淚液時，係利用一防止回吸淚條紙進行採集，並將淚條放置於離心管中離心，離心機轉速13000rpm，以取得約10μl的淚液；之後將從受試個體採集並離心下來的10μl之淚液加入10μl的AuNPs-Aptamer溶液混合並等待十分鐘。根據阿茲海默症協會報導指出正常人腦脊髓液中A β40：A β42濃度比例是9：1、而AD重症患者A β40：A β42濃度比例是1：1，因此當淚液中的A β40與A β42比例非為9：1時將改變原本奈米金的顏色，即可初步判定試個
體出現阿茲海默症之前兆，且之後可應用奈米金顏色深淺隨著比例由9：1至1：1不同之改變，再透過分光光度計量取其變色程度。
結果請參閱第一圖，本發明之變色眼藥水於加入含A β42淚液後出現顏色變化(藍色)。因此，變色眼藥水可適用於分離自受試個體的淚液，亦可直接點入受試個體之眼睛內，藉由是否產生變色以快速篩檢受試個體是否出現A β42濃度過高等阿茲海默症之前兆。
另，如第二圖所示，本發明之變色眼藥水亦可滴入檢測試紙上，再利用檢測試紙吸收受試個體之淚液，檢測是否出現顏色變化情形，如第二圖之試紙出現藍色變化，代表正常受試個體之淚液中含有A β 42，若受試個體A β 42濃度過高，使A β 40：A β 42濃度比例不再是9：1，則試紙的顏色變化情形會改變，將可根據顏色變化情形判斷是否出現阿茲海默症之前兆。
由上述之實施說明可知，本發明與現有技術相較之下，本發明具有以下優點：
1.本發明採用A β42適體-奈米金粒子之技術專一性辨識A β42，可解決習用抗體(antobidy)相當昂貴、保存不易且不易製成檢測試劑或檢測套組等缺失。
2.本發明利用A β42適體搭配奈米金粒子以藉由簡單的顏色變化快速檢測檢體是否具有高濃度的A β42，無須使用昂貴儀器進行判讀。
3.本發明將A β42適體搭配奈米金粒子製成眼藥水型式，受試個體可在日常生活中將眼藥水滴入眼睛後，觀察顏色是否有產生改變，用以初步監控是否出現阿茲海默症之前兆，若有顏色變化產生再到醫院進一步檢查即可。
綜上所述，本發明之一種篩檢阿茲海默症前兆之變色眼藥水
及其應用，的確能藉由上述所揭露之實施例，達到所預期之使用功效，且本發明亦未曾公開於申請前，誠已完全符合專利法之規定與要求。爰依法提出發明專利之申請，懇請惠予審查，並賜准專利，則實感德便。
惟，上述所揭之圖示及說明，僅為本發明之較佳實施例，非為限定本發明之保護範圍；大凡熟悉該項技藝之人士，其所依本發明之特徵範疇，所作之其它等效變化或修飾，皆應視為不脫離本發明之設計範疇。
<110> 國立交通大學
<120> 一種篩檢阿茲海默症前兆之變色眼藥水及其應用
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 42
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1
Claims (3)
- 一種篩檢阿茲海默症前兆之變色眼藥水，係包括1pg/ml~10ng/ml的A β42適體(Aptamer)-奈米金粒子(AuNPs)及其醫藥學上可接受之載劑或媒劑，其中該A β42適體係採用指數增值系統化配體篩選法(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment，SELEX)所得。
- 如請求項1所述之變色眼藥水，其中該A β42適體進行SELEX所需之序列為SEQID NO：1。
- 一種如請求項1或2所述之A β42適體(Aptamer)-奈米金粒子(AuNPs)於製備篩檢阿茲海默症前兆之變色眼藥水之應用，係包括：製備該A β42適體-奈米金粒子；配製該變色眼藥水含有1pg/ml~10ng/ml A β42適體-奈米金粒子及其醫藥學上可接受之載劑或媒劑；將該變色眼藥水與一受試個體之淚液混合，並藉由分光光度計分析該變色眼藥水之顏色變化；若該變色眼藥水的顏色改變，則以9：1-1：1的範圍測量該受試個體之淚液所含A β40：A β42濃度比例，其中若該A β40：A β42濃度比例由9：1偏離為9：1至1：1，則表示該A β40：A β42濃度比例具有過高的A β42濃度，可能存在阿茲海默症前兆。
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| Zhou Y et al., Sci Rep. 2016 Oct 11;6:35186. * |
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