CN108982877A - 一种sICAM-1荧光免疫层析检测试纸条、制备方法及其应用 - Google Patents

一种sICAM-1荧光免疫层析检测试纸条、制备方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于狼疮肾炎诊断技术领域，本发明公开了一种sICAM‑1荧光免疫层析检测试纸条、制备方法及其应用，试纸条包括由后到前依次粘贴吸附在衬板上的样品垫、荧光标记物结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸；硝酸纤维素膜上划有一根检测线和一根质控线；检测线包被有由sICAM‑1抗体与牛血清白蛋白偶联的标记物；质控线包被有羊抗鼠IgG抗体；荧光标记物结合垫有sICAM‑1抗体荧光微球标记物。本发明的试纸条对sICAM‑1的检测限达到0.05ng/mL，定量线性范围0.1～10ng/mL，样品无需任何前处理，检测时间仅需6min，可实现人体尿液中sICAM‑1的快速定量检测，实现狼疮肾炎的快速定量检测，可广泛应用于狼疮肾炎患者的诊断、分型、指导治疗和长期监测，极具实用价值。

Description

一种sICAM-1荧光免疫层析检测试纸条、制备方法及其应用
技术领域
本发明属于狼疮肾炎诊断技术领域，具体涉及一种sICAM-1荧光免疫层析检测试纸条、制备方法及其应用。
背景技术
系统性红斑狼疮(SLE)是我国常见的自身免疫性疾病，也是最常见的继发性肾脏病，狼疮肾炎(LN)是系统性红斑狼疮最常见的并发症，至少50％以上的SLE患者临床上有肾脏受累的证据。WHO根据狼疮肾炎患者的肾小球病变的严重程度，将狼疮肾炎分为I型(轻微系膜狼疮肾炎)～VI型(严重硬化型狼疮肾炎)，不同的分型具有不同的治疗方案。从狼疮肾炎发展为终末期肾病最主要的原因就是因为活跃期的狼疮肾炎没有被及时发现，导致了治疗不及时，肾脏引发不可逆的肾小球硬化以及间质血管纤维化。目前，肾脏穿刺活检术是判断狼疮肾炎患者的病情的“金标准”。然而，肾脏穿刺活检术为有创性检查，禁忌症和并发症较多，术后需绝对静卧24h。由于肾脏穿刺活检术的前述缺陷，容易导致患者错过最佳治疗时间，进一步发展为较为严重的狼疮肾炎，同时也不适用于患者的长期检测。由此可见，如果能开发一种无创、准确、快捷且安全的检测工具，对于判定狼疮肾炎的活跃期并给予及时治疗以及狼疮肾炎的长期监测有极大的促进作用。
目前对于狼疮肾炎的研究表明，狼疮肾炎的表征较多，机体内分子水平的变化广泛但难以选择出一种合适的标志物作为无创检测工具的标志物。中国专利“一种以NCAM-1为检测指标的双抗体夹心酶联免疫吸附检测试剂盒及其应用”(中国发明专利公开号CN106932593B)和“一种以NCAM-1为检测指标的金标试剂盒及其制备方法和应用”(中国发明专利公开号CN106885902B)以神经细胞粘附分子-1(NCAM-1)为标志物检测患者是否在狼疮肾炎活跃期。中国专利“以sICAM-1为检测指标的检测工具与检测盒在检测狼疮肾炎中的应用”(中国发明专利申请号CN201711014980.0)，该专利中以细胞间粘附分子-1(sICAM-1)为标志物检测患者是否在狼疮肾炎活跃期。这三个专利都存在一个较大的缺陷，只能检测受试者是否处理狼疮肾炎活跃期，即只能对其进行定性检测，无法进行定量检测，无法对狼疮肾炎患者的治疗以及长期监测提供指导意义。
发明内容
为了解决现有技术存在的上述问题，本发明目的在于提供一种可定量检测且精度高的快速无创检测工具，即一种sICAM-1荧光免疫层析检测试纸条，本发明还提供了前述试纸条的制备方法及其应用。
ICAM-1(细胞间粘附分子-1)，又名CD54，是一种重要的细胞表面粘附分子，属于免疫球蛋白超家族成员，在免疫应答启动后的炎症反应中有着重要的作用。ICAM-1的膜外部分可脱落为可溶性ICAM-1(sICAM-1)，从而在循环中被检测出来。申请人在前期研究中发现，肾小球肾炎患者的血清中sICAM-1水平的升高与狼疮肾炎的发病率呈正相关。
基于此，本发明选用sICAM-1作为标志物制作狼疮肾炎的无创检测工具，具体所采用的技术方案为：
本发明提供了一种sICAM-1荧光免疫层析检测试纸条，包括衬板、样品垫、荧光标记物结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸，所述样品垫、荧光标记物结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸由后到前依次粘贴吸附在所述衬板上；所述硝酸纤维素膜上划有一根检测线和一根质控线；所述检测线包被有由sICAM-1抗体与牛血清白蛋白偶联的标记物；所述质控线包被有羊抗鼠IgG抗体；所述荧光标记物结合垫有sICAM-1抗体荧光微球标记物。
本发明还提供了一种前述试纸条的制备方法，包括以下步骤：
(1)制备抗体的荧光微球标记物：
①稀释：将荧光微球用硼酸缓冲液稀释，得到荧光微球稀释溶液；
②活化：向所述荧光微球稀释溶液中加入EDC和NHS，所述EDC和NHS的质量比为1:2，离心得到沉淀一；
③一次复溶：向所述沉淀一中加入硼酸缓冲液复溶，混匀，得到复溶荧光微球；
④偶联：向所述复溶荧光微球中加入sICAM-1抗体，室温偶联2h，得到偶联物一；
⑤封闭：向所述偶联物一中加入封闭液封闭过夜，离心得到沉淀二；
⑥二次复溶：向所述沉淀二中加入硼酸缓冲液，混匀，得到sICAM-1抗体荧光微球标记物；
(2)制备硝酸纤维素膜检测线和质控线：
①抗体偶联：向2％牛血清白蛋白溶液中加入sICAM-1抗体，偶联后得到检测线工作液；将羊抗鼠IgG抗体稀释后得到质控线工作液；
②喷涂：将检测线工作液由左至右喷涂在硝酸纤维素膜表面形成检测线，将质控线工作液喷涂在检测线前边形成质控线，烘干，即得到处理后的硝酸纤维素膜；
(3)荧光标记物结合垫的制备：
①Fusion5膜预处理：用磷酸缓冲液浸泡Fusion5膜，烘干，得到干燥后的Fusion5膜；
②稀释：用磷酸缓冲液分别稀释sICAM-1抗体荧光微球标记物，得到荧光微球标记物稀释液；
③喷涂：将所述荧光微球标记物稀释液喷于干燥后的Fusion5膜上，烘干，得到处理后的荧光标记物结合垫；
(4)样品垫的处理：用PBS缓冲液浸泡样品垫，烘干，得到处理后的样品垫；
(5)试纸条的组装：在衬板上依次搭接并粘贴处理后的样品垫、荧光标记物结合垫和硝酸纤维素膜，再在酸纤维素膜的前边搭接吸水纸，组装后裁剪，即得到所述sICAM-1荧光免疫层析检测试纸条。
具体的，所述制备方法，所述步骤(1)中①所用的荧光微球的固含量为1％。
具体的，所述制备方法，所述步骤(1)中①、③和⑥所用的硼酸缓冲液的浓度为0.05mol/L，pH为6.0。
具体的，所述制备方法，所述步骤(1)中⑤所用的封闭液由50mmol/L的乙醇胺溶液和10％的BSA溶液按体积比1:10混匀得到。
具体的，所述制备方法，所述步骤(3)中①和②所用的磷酸缓冲液中含5％海藻糖、0.5％BSA和2％聚乙烯吡咯烷酮。
具体的，所述制备方法，所述步骤(4)中所用的PBS缓冲液中含2％EDTA、5％Tween-20、2％PVP和1％BSA。
本发明还提供了一种前述sICAM-1荧光免疫层析检测试纸条在制备判断患者是否为狼疮肾炎患者的检测工具中的应用。
本发明还提供了一种前述sICAM-1荧光免疫层析检测试纸条在制备判断狼疮肾炎患者为活跃期狼疮肾炎患者、非活跃期狼疮肾炎患者或未合并狼疮肾炎的系统性红斑狼疮患者的检测工具中的应用。
本发明还提供了一种前述sICAM-1荧光免疫层析检测试纸条在制备判断狼疮肾炎患者治疗效果的检测工具或制备狼疮肾炎患者治疗后的长期监测工具中的应用。
本发明的有益效果为：
本发明提供的sICAM-1荧光免疫层析检测试纸条，在制备荧光微球标记物时增加封闭过程，并使用特定的溶液和步骤处理样品垫、荧光标记物结合垫和硝酸纤维素膜，使得本发明提供的sICAM-1荧光免疫层析检测试纸条可精准分辨出活跃期狼疮肾炎患者，对sICAM-1的检测限达到0.05ng/mL，定量线性范围0.1～10ng/mL，样品无需任何前处理，检测时间仅需6min，可实现人体尿液中sICAM-1的快速定量检测，实现狼疮肾炎的快速定量检测，可广泛应用于狼疮肾炎患者的诊断、分型、指导治疗和长期监测，极具实用价值。
附图说明
图1是本发明的sICAM-1荧光免疫层析检测试纸条的组装示意图；
图2是本发明的sICAM-1荧光免疫层析检测卡的结构示意图。
具体实施方式
下面结合附图及具体实施例对本发明做进一步阐释。
材料及试剂：
Eu荧光微球购自南京微测生物科技有限公司；(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、乙醇胺和BSA购自美国Sigma公司；鼠抗人sICAM-1单克隆抗体(以下简称sICAM-1抗体)、羊抗鼠IgG多克隆抗体(以下简称羊抗鼠IgG抗体)购自美国R&D公司。本发明中所指“％”均为质量体积比。
实施例1
本实施例的目的在于制备sICAM-1荧光免疫层析检测试纸条，包括如下步骤：
本实施例中，以样品中液体层析方向为前，以样品中液体层析的反方向为后。
(1)制备抗体的荧光微球标记物：
①稀释：取100μL固含量为1％的Eu荧光微球稀释于400μL的硼酸缓冲液(0.05mol/L，pH为6.0)中，得到荧光微球稀释溶液；
②活化：向所述荧光微球稀释溶液中加入30μL的EDC(10mg/mL)和60μL NHS(10mg/mL)，置于旋转摇床上，50rpm室温活化15min，然后10000rpm离心10分钟，去除上清液，得到沉淀一；
③一次复溶：向所述沉淀一中加入硼酸缓冲液(0.05mol/L，pH为6.0)复溶；80W超声处理30s，得到复溶荧光微球；
④偶联：向所述复溶荧光微球中加入50μg的鼠抗人sICAM-1抗体，置于旋转摇床上，50rpm室温偶联2小时(可根据实际情况适当调整偶联时间2～4h)，得到偶联物一；本发明中的sICAM-1抗体不限于鼠抗人sICAM-1单克隆抗体，还可为羊抗人sICAM-1多克隆抗体或兔抗人sICAM-1多克隆抗体；
⑤封闭：加入50μL封闭液封闭过夜，封闭液由50mmol/L的乙醇胺溶液和10％的BSA溶液按体积比1:10混匀得到，10000rpm离心10分钟，去除上清溶液，得到沉淀二；
⑥二次复溶：向所述沉淀二中加入硼酸缓冲液复溶(0.05mol/L，pH为6.0)，反复洗涤2～3次，然后80W超声处理30s，即为制备好的sICAM-1抗体荧光微球标记物，置于4～8℃冰箱中保存备用。
本发明所用的荧光微球的粒径范围为100～1000nm，优选粒径为200～400nm；荧光发光物为铕、钐、铽或镝等稀有元素，优选为铕元素；荧光微球表面基团为氨基、羧基、巯基或羟基等基团，优选为羧基；所述荧光微球表面基团密度(Parking Area)为20～250sq·A/grp，优选为25～50sq·A/grp；硼酸缓冲液pH范围为5.0-7.0，当pH为6.0时，sICAM-1抗体与上述优选粒径的荧光微球结合效果最佳。
(2)制备硝酸纤维素膜检测线和质控线：
①抗体偶联：向2％牛血清白蛋白溶液中加入sICAM-1抗体，偶联后得到检测线工作液，检测线工作液中sICAM-1抗体的浓度为0.5～2mg/ml，优选为1mg/ml；将羊抗鼠IgG抗体稀释后得到质控线工作液，质控线工作液中羊抗鼠IgG抗体为0.4～1.5mg/ml，优选为0.6mg/ml；
②喷涂：将检测线工作液由左至右喷涂在硝酸纤维素膜表面形成检测线，将质控线工作液喷涂在检测线前边形成质控线，检测线和质控线之间的间距为3～10mm，将喷涂好的硝酸纤维素膜37℃烘干2小时，即得到处理后的硝酸纤维素膜，置于室温干燥环境中保存备用；
(3)荧光标记物结合垫的制备：
①Fusion5膜预处理：用含5％海藻糖、0.5％BSA和2％聚乙烯吡咯烷酮(PVP)的磷酸缓冲液浸泡Fusion5膜，然后置于37℃烘箱中烘干2小时，得到干燥后的Fusion5膜；
②稀释：将sICAM-1抗体荧光微球标记物用前述磷酸缓冲液分别稀释后，得到荧光微球标记物稀释液；
③喷涂：用喷金仪喷于处理烘干后的Fusion5膜上，置于37℃烘箱中烘干2小时后，即得到处理后的荧光标记物结合垫，置于密封干燥包装袋中保存备用；
(4)样品垫的处理：用含2％EDTA、5％Tween-20、2％PVP和1％BSA的PBS缓冲液浸泡样品垫，然后置于37℃烘箱中烘烤2小时至完全干燥，得到处理后的样品垫，置于密封干燥包装袋中保存备用；样品垫为玻璃纤维素膜、聚酯膜或海绵；
(5)试纸条的组装：在衬板(PVC硬板纸)上依次搭接并粘贴处理后的样品垫、荧光标记物结合垫和硝酸纤维素膜，再在酸纤维素膜的前边搭接吸水纸，组装完毕后剪切成4mm宽的试纸条，得到sICAM-1荧光免疫层析检测试纸条，如图1所示，将sICAM-1荧光免疫层析检测试纸条装入塑料卡壳中，得到sICAM-1荧光免疫层析检测卡，如图2所示，然后装入内置有干燥剂的铝箔袋中，室温干燥保存即可。前述卡壳包括面板和底板，面板上设置有加样孔、检测孔和凸档，加样孔和检测孔的位置分别与前述试纸条上样品垫和硝酸纤维素膜的位置对应，凸档设置在卡壳操作端，便于插入检测仪和取出，底板设置有卡槽，用于放置试纸条。
实施例2
本实施例的目的在于利用实施例1提供的sICAM-1荧光免疫层析检测试纸条检测sICAM-1。
1、检测原理
sICAM-1荧光免疫层析检测试纸检测sICAM-1的原理如下：将待检测的样品滴入试纸条的样品垫上，样品经试纸条上样品垫过滤后，样品层析达到荧光标记物结合垫，样品中的sICAM-1与荧光标记物结合垫上的sICAM-1抗体荧光微球标记物结合，形成sICAM-1抗体荧光微球标记物-sICAM-1复合物，通过层析作用先与硝酸纤维素膜上的sICAM-1抗体结合形成双抗夹心复合物(sICAM-1抗体荧光微球标记物-sICAM-1复合物-sICAM-1抗体)后形成检测线(T线)；未结合完的sICAM-1抗体荧光微球标记物随样品向前层析，与羊抗鼠IgG抗体结合，形成质控线(C线)。
2、检测结果判定
(1)若T线和C线在紫外激发光照射下同时显现绿色荧光印迹，表示检测结果为阳性，说明被检测样本中含有sICAM-1抗原。
(2)若在紫外激发光照射下T线无绿色荧光印迹，C线显现绿色荧光印迹，表示检测结果为阴性，说明被检测样本中不含sICAM-1抗原，或其浓度小于0.05ng/mL。
(3)若在紫外激发光照射下C线无绿色荧光印迹，本次检测无效，需分析失败原因并重新检测。
3、定量检测sICAM-1
(1)激发波长：365nm；荧光检测波长：615nm。
(2)标准曲线制备：将sICAM-1参考品分别用0.05mol/L、pH为7.4的PBS稀释到0ng/mL、0.1ng/mL、0.3ng/mL、0.5ng/mL、1.0ng/mL、2.5ng/mL、5.0ng/mL和10ng/mL。加样：分别取80μL样品滴加在sICAM-1荧光免疫层析检测试纸的加样孔内，室温正面朝上平放10min进行免疫层析。荧光检测：采用荧光检测仪进行免疫荧光分析，每个样品测10次荧光，取平均值，然后将所测得的数值输入Microdetection检测管理软件(南京微测生物科技有限公司)中，即可获得标准曲线的各个参数，然后将标准曲线的参数、产品批号等信息录入IC卡中即可(相同标准曲线的sICAM-1荧光免疫层析检测试纸共用一个IC卡)。
(3)检测方法
将Microdetection荧光读数仪开机预热5分钟，然后插入本批次产品所对应的标准曲线IC卡，读数仪将自动读取标准曲线参数。加样：打开检测卡的包装袋，平放于桌面上，取80μL待测样本，滴加至sICAM-1荧光免疫层析检测试纸的加样孔中；免疫层析：加样后将前述试纸于25℃下放置10min，进行免疫层析；荧光检测：将检测卡插入荧光读数仪中，每个样品检测6次；定量报告结果：按读数键即可进行读数和自动计算，sICAM-1的最终浓度可通过液晶屏显示，也可通过读数仪自带的热敏打印机现场打印，还可通过仪器上GPRS和WIFI无线通信模块将检测数据实时发送到云端数据管理平台，实现对检测结果的实时监控。
(4)结果
根据前述方法得到的标准曲线良好，满足测试要求，并且本发明提供的sICAM-1荧光免疫层析检测试纸条的检测限达到0.05ng/mL，定量线性范围为0.1～10ng/mL，检测时间仅需6min。
实施例3
本实施例的目的在于验证实施例1提供的sICAM-1荧光免疫层析检测试纸对于狼疮肾炎患者的分型判断。
①患者选择与分组：选取确认为活跃期狼疮肾炎患者尿液(组1)30人、非活跃期狼疮肾炎患者尿液(组2)27人、未合并狼疮肾炎的系统性红斑狼疮患者(组3)的患者28人，以及健康人尿液(组4)30人作为受试者。
②采样步骤：按照尿液标本收集与处理指南，采集上述分组的患者的晨尿，并交待患者留取中段尿，尿量需满足检测需要；尿液收集后于24h内完成检测。
③检测：按实施例2中提供的检测方法进行检测并计算尿液中sICAM-1的浓度，结果如表1所示。
表1
由表1可知，使用该试纸条进行检测时，活跃期狼疮肾炎患者尿液试纸条检测值均在5ng/ml以上，而非活跃期狼疮肾炎患者和未合并狼疮肾炎的系统性红斑狼疮患者试纸条检测基本都在2ng/ml以下，正常人群试纸条检测在1ng/ml以下。在后期应用中可将5ng/ml作为活跃期狼疮肾炎的提示警戒线，以2ng/ml作为活跃期狼疮肾炎患者转非活跃期狼疮肾炎患者或未合并狼疮肾炎的系统性红斑狼疮患者的提示警戒线，以1ng/ml作为正常人转狼疮肾炎患者的提示警戒线。故本发明提供的sICAM-1荧光免疫层析检测试纸条可以用于狼疮肾炎患者的病情监测及未合并狼疮肾炎的系统性红斑狼疮患者的狼疮肾炎病程监测。
实施例4
本实施例的目的在于提供实施例1的sICAM-1荧光免疫层析检测试纸条的应用。
1、用于判断患者是否患病并初步判断分型
(1)患者选择：选择疑似系统性红斑狼疮(SLE)患者30例，分别编号为1～30；
(2)采样步骤：按照尿液标本收集与处理指南，采集上述分组的患者的晨尿，并交待患者留取中段尿，尿量需满足检测需要；尿液收集后于24h内完成检测。
(3)检测：按实施例2中提供的检测方法进行检测。分别按如下时间测定尿液中的sICAM-1含量、按试纸条检测结果分类(“A”表示处于活跃期狼疮肾炎患者、“B”表示处于非活跃期狼疮肾炎患者或为未合并狼疮肾炎的系统性红斑狼疮、“C”表示正常人)、后期是否进行活检(“+”表示进行活检，“-”表示未进行活检)以及活检鉴定结果(“+”表示试纸条检测提示处于活跃期且活检鉴定处于活跃期，“-”表示试纸条检测提示处于活跃期但活检鉴定未处于活跃期)。结果如表2所示。
表2
由表2可知，使用本发明提供的sICAM-1荧光免疫层析检测试纸条检测出A型病人为21例，其中有20例进行活检，活检结果判定为活跃期的有19例，由此可见本发明提供的sICAM-1荧光免疫层析检测试纸条检测准确率为95％。
2、用于判断患者的治疗效果
(1)患者选择与分组：选择用本发明提供的sICAM-1荧光免疫层析检测试纸条检测出为A组并且活检诊断为活跃期的患者20例人；
(2)采样步骤：按照尿液标本收集与处理指南，采集上述分组的患者的晨尿，并交待患者留取中段尿，尿量需满足检测需要；尿液收集后于24h内完成检测。
(3)检测：按实施例2中提供的检测方法进行检测。分别按如下时间测定尿液中的sICAM-1含量，每次检测结果取各患者的平均值，结果如表3所示。
表3
由表3可知，随着治疗的逐渐进行，患者体内尿液中的sICAM-1含量逐渐下降，最终下降到1ng/mL以下，表明患者由活跃期狼疮肾炎转为正常。
3、用于患者治疗后的长期监测
(1)患者选择与分组：选择用本发明提供的sICAM-1荧光免疫层析检测试纸条检测出为A组并且活检诊断为活跃期的患者10例，选择治疗前使用本发明提供的sICAM-1荧光免疫层析检测试纸条检测结果为B型的患者且利用当前其他评判标准判断为B型的患者10例。
(2)采样步骤：按照尿液标本收集与处理指南，采集上述分组的患者的晨尿，并交待患者留取中段尿，尿量需满足检测需要；尿液收集后于24h内完成检测。
(3)检测：按实施例2中提供的检测方法进行检测。分别按如下时间测定尿液中的sICAM-1含量，每次检测结果取各患者的平均值，结果如表4所示。
表4
由表4可见，在治愈后的一年内，A组和B组患者尿液中的sICAM-1含量均为1ng/mL以下，未见复发。
总体而言，由于本发明提供的sICAM-1荧光免疫层析检测试纸条可定性和定量检测患者尿液中的sICAM-1的浓度，定量检测精确度高，检测限低，可用于制备以下检测工具或监测工具：
(1)判断患者是否为狼疮肾炎患者；
(2)判断狼疮肾炎患者为活跃期狼疮肾炎患者、非活跃期狼疮肾炎患者或未合并狼疮肾炎的系统性红斑狼疮患者；
(3)判断狼疮肾炎患者治疗效果；
(4)狼疮肾炎患者治疗后的长期监测。
本发明不局限于上述可选的实施方式，任何人在本发明的启示下都可得出其他各种形式的产品。上述具体实施方式不应理解成对本发明的保护范围的限制，本发明的保护范围应当以权利要求书中界定的为准，并且说明书可以用于解释权利要求书。

Claims (10)

1.一种sICAM-1荧光免疫层析检测试纸条，其特征在于：包括衬板、样品垫、荧光标记物结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸，所述样品垫、荧光标记物结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸由后到前依次粘贴吸附在所述衬板上；所述硝酸纤维素膜上划有一根检测线和一根质控线；所述检测线包被有由sICAM-1抗体与牛血清白蛋白偶联的标记物；所述质控线包被有羊抗鼠IgG抗体；所述荧光标记物结合垫有sICAM-1抗体荧光微球标记物。
2.一种权利要求1所述试纸条的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)制备抗体的荧光微球标记物：
①稀释：将荧光微球用硼酸缓冲液稀释，得到荧光微球稀释溶液；
②活化：向所述荧光微球稀释溶液中加入EDC和NHS，所述EDC和NHS的质量比为1:2，离心得到沉淀一；
③一次复溶：向所述沉淀一中加入硼酸缓冲液复溶，混匀，得到复溶荧光微球；
④偶联：向所述复溶荧光微球中加入sICAM-1抗体，室温偶联2h，得到偶联物一；
⑤封闭：向所述偶联物一中加入封闭液封闭过夜，离心得到沉淀二；
⑥二次复溶：向所述沉淀二中加入硼酸缓冲液，混匀，得到sICAM-1抗体荧光微球标记物；
(2)制备硝酸纤维素膜检测线和质控线：
①抗体偶联：向2％牛血清白蛋白溶液中加入sICAM-1抗体，偶联后得到检测线工作液；将羊抗鼠IgG抗体稀释后得到质控线工作液；
②喷涂：将检测线工作液由左至右喷涂在硝酸纤维素膜表面形成检测线，将质控线工作液喷涂在检测线前边形成质控线，烘干，即得到处理后的硝酸纤维素膜；
(3)荧光标记物结合垫的制备：
①Fusion5膜预处理：用磷酸缓冲液浸泡Fusion5膜，烘干，得到干燥后的Fusion5膜；
②稀释：用磷酸缓冲液分别稀释sICAM-1抗体荧光微球标记物，得到荧光微球标记物稀释液；
③喷涂：将所述荧光微球标记物稀释液喷于干燥后的Fusion5膜上，烘干，得到处理后的荧光标记物结合垫；
(4)样品垫的处理：用PBS缓冲液浸泡样品垫，烘干，得到处理后的样品垫；
(5)试纸条的组装：在衬板上依次搭接并粘贴处理后的样品垫、荧光标记物结合垫和硝酸纤维素膜，再在酸纤维素膜的前边搭接吸水纸，组装后裁剪，即得到所述sICAM-1荧光免疫层析检测试纸条。
3.根据权利要求2所述试纸条的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中①所用的荧光微球的固含量为1％。
4.根据权利要求2所述试纸条的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中①、③和⑥所用的硼酸缓冲液的浓度为0.05mol/L，pH为6.0。
5.根据权利要求2所述试纸条的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中⑤所用的封闭液由50mmol/L的乙醇胺溶液和10％的BSA溶液按体积比1:10混匀得到。
6.根据权利要求2所述试纸条的制备方法，其特征在于：所述步骤(3)中①和②所用的磷酸缓冲液中含5％海藻糖、0.5％BSA和2％聚乙烯吡咯烷酮。
7.根据权利要求2所述试纸条的制备方法，其特征在于：所述步骤(4)中所用的PBS缓冲液中含2％EDTA、5％Tween-20、2％PVP和1％BSA。
8.一种权利要求1所述的sICAM-1荧光免疫层析检测试纸条在制备判断患者是否为狼疮肾炎患者的检测工具中的应用。
9.一种权利要求1所述的sICAM-1荧光免疫层析检测试纸条在制备判断狼疮肾炎患者为活跃期狼疮肾炎患者、非活跃期狼疮肾炎患者或未合并狼疮肾炎的系统性红斑狼疮患者的检测工具中的应用。
10.一种权利要求1所述的sICAM-1荧光免疫层析检测试纸条在制备判断狼疮肾炎患者治疗效果的检测工具或制备狼疮肾炎患者治疗后的长期监测工具中的应用。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111638363A (zh) * 2020-04-30 2020-09-08 吉林省格瑞斯特生物技术有限公司 3-脱氧果糖快速定量荧光检测装置及其制备方法

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1448509A (zh) * 2002-03-29 2003-10-15 天津医科大学总医院 人的细胞间粘附分子－1膜外i－ⅲ功能区基因表达产物及其制备方法和该产物在放免技术中的应用
EP2163899A1 (en) * 2008-09-10 2010-03-17 Koninklijke Philips Electronics N.V. Sensitive fluorescence correlation measurements of soluble adhesion molecules
CN103267851A (zh) * 2013-05-08 2013-08-28 成都创宜生物科技有限公司 一种检测胎膜早破的试剂盒及其制备方法
CN104655837A (zh) * 2015-02-27 2015-05-27 南京微测生物科技有限公司 一种能同时检测藻毒素mc-lr/rr/yr的荧光定量试纸条及其制备方法和应用
CN107817343A (zh) * 2017-10-25 2018-03-20 成都创宜生物科技有限公司 以sICAM‑1为检测指标的检测工具与检测盒在检测狼疮肾炎中的应用

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1448509A (zh) * 2002-03-29 2003-10-15 天津医科大学总医院 人的细胞间粘附分子－1膜外i－ⅲ功能区基因表达产物及其制备方法和该产物在放免技术中的应用
EP2163899A1 (en) * 2008-09-10 2010-03-17 Koninklijke Philips Electronics N.V. Sensitive fluorescence correlation measurements of soluble adhesion molecules
CN103267851A (zh) * 2013-05-08 2013-08-28 成都创宜生物科技有限公司 一种检测胎膜早破的试剂盒及其制备方法
CN104655837A (zh) * 2015-02-27 2015-05-27 南京微测生物科技有限公司 一种能同时检测藻毒素mc-lr/rr/yr的荧光定量试纸条及其制备方法和应用
CN107817343A (zh) * 2017-10-25 2018-03-20 成都创宜生物科技有限公司 以sICAM‑1为检测指标的检测工具与检测盒在检测狼疮肾炎中的应用

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
周渭珩 等: "血清可溶性黏附分子与系统性红斑狼疮患者活动性的关系", 《中华皮肤科杂志》 *
徐红星 等: "血清sFas和sICAM-1的测定对系统性红斑狼疮患者疾病活动性及治疗转归预测价值", 《南京医科大学学报(自然科学版)》 *
熊彬等: "慢性心力衰竭患者IL-6、sICAM-1的血浆表达及与BNP和心功能关系的相关性研究", 《中国卫生检验杂志》 *
蒋培余 等: "不同病程SLE患者血清中sTNFR与sICAM-1的水平变化", 《检验医学》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111638363A (zh) * 2020-04-30 2020-09-08 吉林省格瑞斯特生物技术有限公司 3-脱氧果糖快速定量荧光检测装置及其制备方法

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