CN114047236A

CN114047236A - 一种检测β-乳球蛋白的光电化学生物传感器的制备方法及应用

Info

Publication number: CN114047236A
Application number: CN202111358035.9A
Authority: CN
Inventors: 陈志伟; 孔玲; 李灿国; 朱琪颖; 孟庆红; 常慧琴; 刘安琪; 吴宇银; 刘红亮
Original assignee: Shandong University of Technology
Current assignee: Shandong University of Technology
Priority date: 2021-11-17
Filing date: 2021-11-17
Publication date: 2022-02-15

Abstract

本发明涉及一种检测乳品致敏原β‑乳球蛋白的光电化学免疫传感器的制备方法，属于功能纳米材料，食品分析以及光电化学生物传感技术领域。将CdWO₄‑TiO₂异质结复合材料固定在ITO电极表面，利用CdS量子点敏化增强其对可将光的吸收，并作为连接剂固定致敏原β‑乳球蛋白抗体，有效提高光电流响应及其灵敏度，通过层层组装方法，利用CdS量子点敏化CdWO₄‑TiO₂异质结良好的光电活性以及β‑乳球蛋白与β‑乳球蛋白抗体间的特异性结合，实现β‑乳球蛋白的超灵敏检测，对于乳品中β‑乳球蛋白的分析检测应用具有重要的意义。

Description

一种检测β-乳球蛋白的光电化学生物传感器的制备方法及应用

技术领域

本发明涉及一种检测乳品致敏原β-乳球蛋白的光电化学免疫传感器的制备方法，属于功能纳米材料，食品分析以及光电化学生物传感技术领域。将CdWO₄-TiO₂异质结复合材料固定在ITO电极表面，利用CdS量子点敏化增强其对可将光的吸收，并作为连接剂固定致敏原β-乳球蛋白抗体，有效提高光电流响应及其灵敏度，通过层层组装方法，利用CdS量子点敏化CdWO₄-TiO₂异质结良好的光电活性以及β-乳球蛋白与β-乳球蛋白抗体间的特异性结合，实现β-乳球蛋白的超灵敏检测，对于乳品中β-乳球蛋白的分析检测应用具有重要的意义。

背景技术

牛奶过敏是最重要的过敏反应之一，牛奶也是食品中最常见的致敏原之一。牛奶过敏对儿童来说是一个严重的问题，因为牛奶是他们补充蛋白质的重要来源，严格避免使用牛奶是不可行的，代替牛奶也是不现实的。2岁以下儿童牛奶过敏患病率约为2.5 %，过敏严重者可能会持续到成年，因此，牛奶过敏越来越引起消费者的注意。牛奶中的β-乳球蛋白是牛奶中的主要过敏原之一。

β-乳球蛋白是一种由162个氨基酸残基组成的分子量约为18.3 kDa的球状蛋白，约占牛乳清蛋白含量的50 %，占牛乳总蛋白含量的10 %。β-乳球蛋白可以引起约60 %的IgE介导的牛奶过敏症状，牛奶过敏患者之中，约82 %的患者对β-乳球蛋白过敏。因此，β-乳球蛋白可作为检测食品是否含有乳蛋白的有效标志物。目前尚无食物过敏的治疗方法，因此，准确检测牛奶中β-乳球蛋白的含量对于牛奶的质量控制和预防牛奶过敏非常重要。

目前，高效液相色谱法是乳品工业中检测乳清蛋白的常用方法，液相色谱-质谱联用法由于其高分辨率和短分析时间而被用于分析乳蛋白。但是这些方法存在设备昂贵、前处理工艺复杂、需要专人操作等问题，迫切需要开发响应速度快、选择性好、灵敏度高、成本低的替代方法。光电化学免疫传感器以其选择性和敏感性好、分析速度快、背景影响小等优点在生物分析领域受到广泛关注。

对于光电化学免疫传感器来说，灵敏度是评价其性能的一个指标。提高灵敏度的方法多种多样，其中增加初始信号是最有效的方法之一。CdWO₄是一种重要的光电活性材料，由于其稳定性、合适的带隙和成本较低，但其光电活性受限于电子空穴对分离能力差、比表面积小、表面吸附能力弱。因此，有必要进一步优化CdWO₄的光电活性。在本发明中采用CdWO₄与TiO₂形成异质结，CdS量子点进行敏化，促进光生电子的分离和转移，增强其光电响应。

本发明利用光电化学分析法，合成CdWO₄-TiO₂异质结，以CdS量子点进行敏化，增强其可见光吸收，得到光电活性显著提高的复合材料，通过层层自组装方法，将β-乳球蛋白抗体、牛血清白蛋白和β-乳球蛋白抗原组装到CdWO₄-TiO₂异质结复合材料上，利用CdS量子点敏化CdWO₄-TiO₂异质结良好的光电活性以及β-乳球蛋白与β-乳球蛋白抗体间的特异性结合，构建了一种基于CdS量子点敏化CdWO₄-TiO₂的β-乳球蛋白光电化学传感器。该传感器具有优异的光电化学活性，具有灵敏度高、线性范围宽、检出限低、检测快速、制备过程相对简单等优点，实现了对β-乳球蛋白的超灵敏分析，对于乳品中β-乳球蛋白的分析检测提供了新方法。

发明内容

本发明提供了一种检测β-乳球蛋白的光电化学生物传感器的制备方法及应用，实现了β-乳球蛋白的超灵敏检测。本发明的目的之一是提供一种检测β-乳球蛋白的光电化学生物传感器的制备方法。本发明的目的之二是制备的光电化学免疫传感器能够实现对β-乳球蛋白的超灵敏检测。

本发明的技术方案，包括以下步骤：

（1）制备CdWO₄；

（2）制备CdWO₄-TiO₂异质结；

（3）制备检测β-乳球蛋白的光电化学生物传感器的工作曲线。

其中步骤（1）制备CdWO₄包括：

取1.0 ~ 1.5 mmol Cd(NO₃)₂·4H₂O 和1.0 ~ 1.5 mmol Na₂WO₄·2H₂O分别溶解在12.5 mL去离子水中，分别标记为A和B；在搅拌下将溶液B滴加到溶液A中，持续搅拌30 min后，将混合物转移到50 mL聚四氟乙烯内衬不锈钢高压釜中，180 ℃下反应24 h；自然冷却至室温后，离心收集产物，分别用乙醇和去离子水洗涤各3次，然后在50 ℃下真空干燥；

其中步骤（2）制备CdWO₄-TiO₂异质结包括：

将20 ~ 30 mg合成的CdWO₄和25 ~ 35 mg TiF₄与10 mL H₂O放入聚四氟乙烯内衬不锈钢高压釜中，在90 ℃下保持24小时，冷却至室温后，离心收集沉淀，分别用乙醇和去离子水洗涤各3次，50 ℃下真空干燥；

其中步骤（3）制备检测β-乳球蛋白的光电化学生物传感器的工作曲线：

①将2.5 cm×0.8 cm ITO导电玻璃依次用洗洁精、丙酮、无水乙醇和超纯水超声清洗，氮气吹干；

②将8 ~ 12 μL、3 ~ 7 mg/mL CdWO₄-TiO₂悬浮液滴在ITO电极上，室温下自然晾干，300 ℃煅烧30分钟；

③将4 ~ 6 μL CdS量子点溶液滴加至CdWO₄-TiO₂修饰的电极表面，室温下反应20~ 40分钟，超纯水冲洗电极表面；

④在修饰电极表面继续滴加3 ~ 5 μL的l-乙基-3-(3-二甲基氨丙基）-碳化二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺，反应20 ~ 40 min后用超纯水冲洗，自然晾干；

⑤滴加3 ~ 5 μL 10 μg/mL的β-乳球蛋白抗体溶液，反应20 ~ 40分钟后用超纯水冲洗电极表面，4 ℃冰箱中晾干；

⑥继续滴加3 ~ 5 μL、质量分数为1 %的BSA溶液，以封闭电极表面上非特异性活性位点，反应20 ~ 40 分钟后用超纯水冲洗电极表面，4 ℃冰箱中晾干；

⑦继续滴加3 ~ 5 μL、0.005 ~ 10 ng/mL的β-乳球蛋白，超纯水冲洗电极表面，4℃冰箱中晾干，制得一种基于CdS量子点敏化CdWO₄-TiO₂的β-乳球蛋白的无标型光电化学生物传感器，于4 ℃冰箱中储存备用。

本发明所用的原材料均可在化学试剂公司或生物制药公司购买。

本发明的有益成果

（1）本发明通过基于CdS量子点敏化的CdWO₄-TiO₂异质结构建了一种新颖的光电化学免疫传感器用于乳品中致敏原β-乳球蛋白的检测。使用CdS量子点敏化CdWO₄-TiO₂异质结的方法。

（2）该免疫传感器对β-乳球蛋白检测灵敏度高，线性范围从0.005 ng/mL到10 ng/mL，检测限低，为0.17 pg·mL^-1。制备的免疫传感器稳定性高，重现性好。

（3）本发明为β-乳球蛋白的早期检测提供了一种新颖可行的检测方法，操作简单，检测快捷，可用于实际样品的检测。

具体实施方式

现将本发明通过具体实施方式进一步说明，但不限于此。

实施例1制备CdWO₄，步骤如下：

取1.0 mmol Cd(NO₃)₂·4H₂O 和1.0 mmol Na₂WO₄·2H₂O分别溶解在12.5 mL去离子水中，分别标记为A和B；在搅拌下将溶液B滴加到溶液A中，持续搅拌30 min后，将混合物转移到50 mL聚四氟乙烯内衬不锈钢高压釜中，180 ℃下反应24 h；自然冷却至室温后，离心收集产物，分别用乙醇和去离子水洗涤各3次，然后在50 ℃下真空干燥。

实施例2制备CdWO₄，步骤如下：

取1.25 mmol Cd(NO₃)₂·4H₂O 和1.25 mmol Na₂WO₄·2H₂O分别溶解在12.5 mL去离子水中，分别标记为A和B；在搅拌下将溶液B滴加到溶液A中，持续搅拌30 min后，将混合物转移到50 mL聚四氟乙烯内衬不锈钢高压釜中，180 ℃下反应24 h；自然冷却至室温后，离心收集产物，分别用乙醇和去离子水洗涤各3次，然后在50 ℃下真空干燥。

实施例3制备CdWO₄，步骤如下：

取1.5 mmol Cd(NO₃)₂·4H₂O 和1.5 mmol Na₂WO₄·2H₂O分别溶解在12.5 mL去离子水中，分别标记为A和B；在搅拌下将溶液B滴加到溶液A中，持续搅拌30 min后，将混合物转移到50 mL聚四氟乙烯内衬不锈钢高压釜中，180 ℃下反应24 h；自然冷却至室温后，离心收集产物，分别用乙醇和去离子水洗涤各3次，然后在50 ℃下真空干燥。

实施例4制备CdWO₄-TiO₂异质结，步骤如下：

将20 mg合成的CdWO₄和25 mg TiF₄与10 mL H₂O放入聚四氟乙烯内衬不锈钢高压釜中，在90 ℃下保持24小时，冷却至室温后，离心收集沉淀，分别用乙醇和去离子水洗涤各3次，50 ℃下真空干燥。

实施例5制备CdWO₄-TiO₂异质结，步骤如下：

将25 mg合成的CdWO₄和30 mg TiF₄与10 mL H₂O放入聚四氟乙烯内衬不锈钢高压釜中，在90 ℃下保持24小时，冷却至室温后，离心收集沉淀，分别用乙醇和去离子水洗涤各3次，50 ℃下真空干燥。

实施例6制备CdWO₄-TiO₂异质结，步骤如下：

将30 mg合成的CdWO₄和35 mg TiF₄与10 mL H₂O放入聚四氟乙烯内衬不锈钢高压釜中，在90 ℃下保持24小时，冷却至室温后，离心收集沉淀，分别用乙醇和去离子水洗涤各3次，50 ℃下真空干燥。

实施例7制备无标型检测β-乳球蛋白的光电化学生物传感器的工作曲线，步骤如下：

②将8 μL、3 mg/mL CdWO₄-TiO₂悬浮液滴在ITO电极上，室温下自然晾干，300 ℃煅烧30分钟；

③将4 μL CdS量子点溶液滴加至CdWO₄-TiO₂修饰的电极表面，室温下反应20分钟，超纯水冲洗电极表面；

④在修饰电极表面继续滴加3 μL的l-乙基-3-(3-二甲基氨丙基）-碳化二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺，反应20 min后用超纯水冲洗，自然晾干；

⑤滴加3 μL 10 μg/mL的β-乳球蛋白抗体溶液，反应20 ~ 40分钟后用超纯水冲洗电极表面，4 ℃冰箱中晾干；

⑥继续滴加3 μL、质量分数为1 %的BSA溶液，以封闭电极表面上非特异性活性位点，反应20分钟后用超纯水冲洗电极表面，4 ℃冰箱中晾干；

⑦继续滴加3 μL、0.005 ~ 10 ng/mL的β-乳球蛋白，超纯水冲洗电极表面，4 ℃冰箱中晾干，制得一种基于CdS量子点敏化CdWO₄-TiO₂的β-乳球蛋白的无标型光电化学生物传感器，于4 ℃冰箱中储存备用。

实施例8制备无标型检测β-乳球蛋白的光电化学生物传感器的工作曲线，步骤如下：

②将10 μL、5 mg/mL CdWO₄-TiO₂悬浮液滴在ITO电极上，室温下自然晾干，300 ℃煅烧30分钟；

③将5 μL CdS量子点溶液滴加至CdWO₄-TiO₂修饰的电极表面，室温下反应30分钟，超纯水冲洗电极表面；

④在修饰电极表面继续滴加4 μL的l-乙基-3-(3-二甲基氨丙基）-碳化二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺，反应30 min后用超纯水冲洗，自然晾干；

⑤滴加4 μL 10 μg/mL的β-乳球蛋白抗体溶液，反应20 ~ 40分钟后用超纯水冲洗电极表面，4 ℃冰箱中晾干；

⑥继续滴加4 μL、质量分数为1 %的BSA溶液，以封闭电极表面上非特异性活性位点，反应30分钟后用超纯水冲洗电极表面，4 ℃冰箱中晾干；

⑦继续滴加4 μL、0.005 ~ 10 ng/mL的β-乳球蛋白，超纯水冲洗电极表面，4 ℃冰箱中晾干，制得一种基于CdS量子点敏化CdWO₄-TiO₂的β-乳球蛋白的无标型光电化学生物传感器，于4 ℃冰箱中储存备用。

实施例9制备无标型检测β-乳球蛋白的光电化学生物传感器的工作曲线，步骤如下：

②将12 μL、7 mg/mL CdWO₄-TiO₂悬浮液滴在ITO电极上，室温下自然晾干，300 ℃煅烧30分钟；

③将6 μL CdS量子点溶液滴加至CdWO₄-TiO₂修饰的电极表面，室温下反应40分钟，超纯水冲洗电极表面；

④在修饰电极表面继续滴加5 μL的l-乙基-3-(3-二甲基氨丙基）-碳化二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺，反应40 min后用超纯水冲洗，自然晾干；

⑤滴加5 μL 10 μg/mL的β-乳球蛋白抗体溶液，反应40分钟后用超纯水冲洗电极表面，4 ℃冰箱中晾干；

⑥继续滴加5 μL、质量分数为1 %的BSA溶液，以封闭电极表面上非特异性活性位点，反应40分钟后用超纯水冲洗电极表面，4 ℃冰箱中晾干；

⑦继续滴加5 μL、0.005 ~ 10 ng/mL的β-乳球蛋白，超纯水冲洗电极表面，4 ℃冰箱中晾干，制得一种基于CdS量子点敏化CdWO₄-TiO₂的β-乳球蛋白的无标型光电化学生物传感器，于4 ℃冰箱中储存备用。

实施例10如权利要求l所述的一种检测β-乳球蛋白的的无标型光电化学生物传感器的制备方法及应用，其特征在于，用于β-乳球蛋白的检测，检测步骤如下：

①使用电化学工作站的三电极系统进行信号测定，测试溶液为10 mL ~ 15 mL、pH为6.0 ~ 8.5的0.1 mol/L的抗坏血酸磷酸盐缓冲溶液；

②采用i-t法对不同浓度的标品β-乳球蛋白进行检测，设置电压为0 V，运行时间为50 s，激发光源的为LED，记录电流的变化，绘制工作曲线；

③将待测样品稀释之后代替②中标准品进行检测，根据光电流响应强度和工作曲线，得到待测样品中β-乳球蛋白的含量。

Claims

1.一种检测β-乳球蛋白的光电化学生物传感器的制备方法及应用，其特征在于，步骤如下：

（1）将2.5 cm × 0.8 cm的ITO导电玻璃依次用洗洁精、丙酮、无水乙醇和超纯水超声清洗，氮气吹干；

（2）将8 ~ 12 μL、3 ~ 8 mg/mL CdWO₄-TiO₂悬浮液滴在ITO电极上，室温下自然晾干，300 ℃煅烧30分钟；

（3）将4 ~ 6 μL、CdS量子点溶液滴加至CdWO₄-TiO₂修饰的电极表面，室温下反应20 ~40分钟，超纯水冲洗电极表面；

（4）在修饰电极表面继续滴加3 ~ 5 μL的l-乙基-3-(3-二甲基氨丙基）-碳化二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺，反应20 ~ 40 min后用超纯水冲洗，自然晾干；

（5）滴加3 ~ 5 μL 10 μg/mL的β-乳球蛋白抗体溶液，反应20 ~ 40分钟后用超纯水冲洗电极表面，4 ℃冰箱中晾干；

（6）继续滴加3 ~ 5 μL、质量分数为1 %的BSA溶液，以封闭电极表面上非特异性活性位点，反应20 ~ 40 分钟后用超纯水冲洗电极表面，4 ℃冰箱中晾干；

（7）继续滴加3 ~ 5 μL、0.005 ~ 10 ng/mL的β-乳球蛋白，超纯水冲洗电极表面，4 ℃冰箱中晾干，制得一种基于CdS量子点敏化CdWO₄-TiO₂的β-乳球蛋白的无标型光电化学生物传感器，于4 ℃冰箱中储存备用；

所述的1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺含1 × 10^-2mol/L的1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺和2 × 10^-3 mol/L的N-羟基琥珀酰亚胺；

所述CdS量子点的制备步骤如下：（1）200 ~ 300 μL 巯基乙酸加入40 ~ 60 mL 0.01mol·L^-1 CdCl₂水溶液中，在40℃下通入N₂鼓泡30分钟以去除水中溶解的氧气；（2）加入1.0mol·L^-1 NaOH水溶液将步骤（1）溶液的pH值调节至11；（3）将4.5 ~ 6.5 mL 0.1 mol·L^-1Na₂S水溶液注入上述溶液（2）中，反应混合物在N₂气氛下回流4小时；（4）用相同体积的去离子水与溶液（3）混合，得到所需的CdS量子点溶液，并储存在4℃的冰箱中以备进一步使用。

2.如权利要求1所述的一种检测β-乳球蛋白的光电化学生物传感器的制备方法及应用，所述CdWO₄-TiO₂电极的制备，其特征在于，步骤如下：

（1）取1.0 ~ 1.5 mmol Cd(NO₃)₂·4H₂O 和1.0 ~ 1.5 mmol Na₂WO₄·2H₂O分别溶解在12.5 mL去离子水中，分别标记为A和B；在搅拌下将溶液B滴加到溶液A中，持续搅拌30 min后，将混合物转移到50 mL聚四氟乙烯内衬不锈钢高压釜中，180 ℃下反应24 h；自然冷却至室温后，离心收集产物，分别用乙醇和去离子水洗涤各3次，然后在50 ℃下真空干燥；

（2）将20 ~ 30 mg合成的CdWO₄和25 ~ 35 mg TiF₄与10 mL H₂O放入聚四氟乙烯内衬不锈钢高压釜中，在90 ℃下保持24小时，冷却至室温后，离心收集沉淀，分别用乙醇和去离子水洗涤各3次，50 ℃下真空干燥；

（3）将8 ~ 12 μL、3 ~ 7 mg/mL CdWO₄-TiO₂悬浮液滴在ITO电极上，室温下自然晾干，300 ℃煅烧30分钟，自然冷却至室温，制得CdWO₄-TiO₂电极。

3.如权利要求l所述的一种检测β-乳球蛋白的光电化学生物传感器的制备方法及应用，其特征在于，用于β-乳球蛋白的检测，检测步骤如下：

（1）使用电化学工作站的三电极系统进行信号测定，测试溶液为10 mL ~ 15 mL、pH为6.0 ~ 8.5的0.1 mol/L的抗坏血酸磷酸盐缓冲溶液；

（2）采用i-t法对不同浓度的标品β-乳球蛋白进行检测，设置电压为0 V，运行时间为50s，激发光源为LED，记录电流的变化，绘制工作曲线；

（3）将待测样品稀释之后代替（2）中标准品进行检测，根据光电流响应强度和工作曲线，得到待测样品中β-乳球蛋白的含量。