CN112683970A - 一种检测α-乳白蛋白的光电化学生物传感器的制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种检测乳制品致敏原α‑乳白蛋白的光电化学免疫传感器的制备方法，属于功能纳米材料，食品分析以及光电化学生物传感技术领域。将CdWO₄‑CdS异质结复合材料固定在ITO电极表面，应用聚多巴胺作连接剂固定致敏原α‑乳白蛋白抗体，有效提高光电流响应及其灵敏度，通过层层组装方法，利用CdWO₄‑CdS异质结良好的光电活性以及α‑乳白蛋白与α‑乳白蛋白抗体间的特异性结合，实现α‑乳白蛋白的超灵敏检测，对于乳品中α‑乳白蛋白的分析检测应用具有重要的意义。

Description

一种检测α-乳白蛋白的光电化学生物传感器的制备方法及 应用

技术领域

本发明属于生物分析化学、纳米材料、免疫分析和光电化学生物传感技术领域，提供了一种检测α-乳白蛋白的光电化学生物传感器的制备方法及应用。具体是采用水热法合成CdWO₄-CdS异质结作为抗体捕获基底，应用聚多巴胺作连接剂固定致敏原α-乳白蛋白抗体，制备一种检测α-乳白蛋白的无标型光电化学生物传感器。

背景技术

牛奶过敏是最重要的过敏反应之一，牛奶也是食品中最常见的过敏原之一，其特征是对牛奶蛋白产生强烈的IgE反应。2岁以下儿童CMA患病率约为2.5 %。CMA对儿童来说是一个严重的问题，因为牛奶是他们补充蛋白质的重要来源，严格避免使用牛奶是不可行的，代替牛奶也是不现实的。此外，严重过敏可能会持续到成年期，因此引起过敏消费者的注意。牛奶中过敏原，α-乳白蛋白是牛奶中的主要过敏原之一。

α-乳白蛋白是一种Ca²⁺结合蛋白，在人与牛之间存在72 %以上的序列同源性，具有重要的生理作用和营养意义。α-乳白蛋白含有丰富的人体必需氨基酸，尤其是色氨酸和半胱氨酸，它们是血清素的前体。它还具有许多支链氨基酸，例如异亮氨酸和亮氨酸，它们与肌肉中的蛋白质合成有关。但α-乳白蛋白能引起约30-35 %的IgE介导的牛奶过敏。目前尚无食物过敏的治疗方法，因此，准确检测牛奶中α-乳白蛋白的含量对于牛奶的质量控制和预防牛奶过敏非常重要。

目前，高效液相色谱法是乳品工业中检测乳清蛋白的常用方法，液相色谱-质谱联用法由于其高分辨率和短分析时间而被用于分析乳蛋白。但是这些方法需要预处理以分离靶蛋白，迫切需要开发响应速度快、选择性好、灵敏度高、成本低的替代方法。光电化学免疫传感器以其选择性和敏感性好、分析速度快、背景影响小等优点在生物分析领域受到广泛关注。

对于光电化学免疫传感器来说，灵敏度是评价其性能的一个指标。提高灵敏度的方法多种多样，其中增加初始信号是最有效的方法之一。CdWO₄是一种重要的光电活性材料，由于其稳定性、合适的带隙和成本较低，但其光电活性受限于电子空穴对分离能力差、比表面积小、表面吸附能力弱。因此，有必要进一步优化CdWO₄的光电活性。在本发明中采用CdS进行敏化，合成CdWO₄-CdS异质结更有利于电荷的分离和转移，增强其光电响应。

本发明利用光电化学分析法，以CdS进行敏化，合成CdWO₄-CdS异质结，增强其可见光吸收，得到光电活性显著提高的复合材料，通过层层自组装方法，将聚多巴胺、α-乳白蛋白抗体、牛血清白蛋白和α-乳白蛋白抗原组装到CdWO₄-CdS异质结复合材料上，利用CdWO₄-CdS异质结良好的光电活性以及α-乳白蛋白与α-乳白蛋白抗体间的特异性结合，构建了一种基于CdWO₄-CdS的α-乳白蛋白光电化学传感器。该传感器具有优异的光电化学活性，具有灵敏度高、线性范围宽、检出限低、检测快速、制备过程相对简单等优点，实现了对α-乳白蛋白的超灵敏分析，对于乳品中α-乳白蛋白的分析检测应用具有重要的意义。

发明内容

本发明提供了一种检测α-乳白蛋白的光电化学生物传感器的制备方法及应用，实现了α-乳白蛋白的超灵敏检测。本发明的目的之一是提供一种检测α-乳白蛋白的光电化学生物传感器的制备方法。本发明的目的之二是制备的光电化学免疫传感器实现对α-乳白蛋白的超灵敏检测。

本发明的技术方案，包括以下步骤：

（1）制备CdWO₄-CdS异质结；

（2）制备检测α-乳白蛋白的光电化学生物传感器的工作曲线。

其中步骤（1）制备CdWO₄-CdS异质结包括：

取0.5~1.5 mmol CH₄N₂S和0.5~1.5 mmol Na₂WO₄·2H₂O溶解在20 mL去离子水中，标记为溶液A；0.5~1.5 mmol Cd(CH₃COO)₂·2H₂O溶解在20 mL去离子水中，标记为溶液B；在磁力搅拌下，将溶液A逐滴滴加到溶液B中，搅拌2小时后，将白色悬浮液转移到转移到50毫升聚四氟乙烯反应釜中在160 ℃反应24 h，将所得混合物离心洗涤去离子水、无水乙醇各3次，然后在50 ℃下真空干燥；

其中步骤（2）制备无标型检测α-乳白蛋白的光电化学生物传感器的工作曲线包括：

①将2.5 cm×0.8 cm ITO导电玻璃依次用洗洁精、丙酮、无水乙醇和超纯水超声清洗，氮气吹干；

②将8 ~ 12 μL、3 ~ 7 mg / mL CdWO₄-CdS悬浮液滴在ITO电极上，室温下自然晾干，300 ℃煅烧30分钟；

③将3 ~ 5 μL、含1 mg/mL多巴胺盐酸盐的pH 8.5 Tris-HCl溶液滴加至CdWO₄-CdS修饰的电极表面，室温下反应50 ~ 70分钟，超纯水冲洗电极表面；

④滴加3 ~ 5 μL 10 μg/mL的α-乳白蛋白抗体溶液，反应20 ~ 40分钟后用超纯水冲洗电极表面，4 ℃冰箱中晾干；

⑤继续滴加3 ~ 5 μL、质量分数为1 %的BSA溶液，以封闭电极表面上非特异性活性位点，反应20 ~ 40 分钟后用超纯水冲洗电极表面，4 ℃冰箱中晾干；

⑥继续滴加3 ~ 5 μL、0.001 ~ 10 ng/mL的α-乳白蛋白，超纯水冲洗电极表面，4℃冰箱中晾干，制得一种基于CdWO₄-CdS的α-乳白蛋白的无标型光电化学生物传感器，于4℃冰箱中储存备用；

本发明所用的原材料均可在化学试剂公司或生物制药公司购买。

本发明的有益成果

（1）本发明通过基于CdWO₄-CdS异质结构建了一种新颖的光电化学免疫传感器用于乳品中致敏原α-乳白蛋白的检测。使用CdS敏化CdWO₄原位生长异质结的方法。

（2）该免疫传感器对α-乳白蛋白检测灵敏度高，线性范围从0.001 ng/mL到10 ng/mL，检测限低，为0.17 pg·mL^-1。制备的免疫传感器稳定性高，重现性好。

（3）本发明为α-乳白蛋白的早期检测提供了一种新颖可行的检测方法，操作简单，检测快捷，可用于实际样品的检测。

具体实施方式

现将本发明通过具体实施方式进一步说明，但不限于此

实施例1制备CdWO₄-CdS异质结，步骤如下：

取0.5 mmol CH₄N₂S和0.5 mmol Na₂WO₄·2H₂O溶解在20 mL去离子水中，标记为溶液A；0.5 mmol Cd(CH₃COO)₂·2H₂O溶解在20 mL去离子水中，标记为溶液B；在磁力搅拌下，将溶液A逐滴滴加到溶液B中，搅拌2小时后，将白色悬浮液转移到转移到50毫升聚四氟乙烯反应釜中在160 ℃反应24 h，将所得混合物离心洗涤去离子水、无水乙醇各3次，然后在50℃下真空干燥。

实施例2制备CdWO₄-CdS异质结，步骤如下：

取1.0 mmol CH₄N₂S和1.0 mmol Na₂WO₄·2H₂O溶解在20 mL去离子水中，标记为溶液A；1.0 mmol Cd(CH₃COO)₂·2H₂O溶解在20 mL去离子水中，标记为溶液B；在磁力搅拌下，将溶液A逐滴滴加到溶液B中，搅拌2小时后，将白色悬浮液转移到转移到50毫升聚四氟乙烯反应釜中在160 ℃反应24 h，将所得混合物离心洗涤去离子水、无水乙醇各3次，然后在50℃下真空干燥。

实施例3制备CdWO₄-CdS异质结，步骤如下：

取1.5 mmol CH₄N₂S和1.5 mmol Na₂WO₄·2H₂O溶解在20 mL去离子水中，标记为溶液A；1.5 mmol Cd(CH₃COO)₂·2H₂O溶解在20 mL去离子水中，标记为溶液B；在磁力搅拌下，将溶液A逐滴滴加到溶液B中，搅拌2小时后，将白色悬浮液转移到转移到50毫升聚四氟乙烯反应釜中在160 ℃反应24 h，将所得混合物离心洗涤去离子水、无水乙醇各3次，然后在50℃下真空干燥。

实施例4制备无标型检测α-乳白蛋白的光电化学生物传感器的工作曲线，步骤如下：

①将2.5 cm ITO导电玻璃依次用洗洁精、丙酮、无水乙醇和超纯水超声清洗，氮气吹干；

②将8 μL、3 mg/mL CdWO₄-CdS悬浮液滴在ITO电极上，室温下自然晾干，300 ℃煅烧30分钟；

③将3 μL、含1 mg/mL多巴胺盐酸盐的pH 8.5 Tris-HCl溶液滴加至CdWO₄-CdS修饰的电极表面，室温下反应50分钟，超纯水冲洗电极表面；

④滴加3 μL 10 μg/mL的α-乳白蛋白抗体溶液，反应20分钟后用超纯水冲洗电极表面，4 ℃冰箱中晾干；

⑤继续滴加3 μL、质量分数为1 %的BSA溶液，以封闭电极表面上非特异性活性位点，反应20 min后用超纯水冲洗电极表面，4 ℃冰箱中晾干；

⑥继续滴加3 μL、0.001 ~ 10 ng/mL的α-乳白蛋白，超纯水冲洗电极表面，4 ℃冰箱中晾干，制得一种基于CdWO₄-CdS的α-乳白蛋白的无标型光电化学生物传感器，于4 ℃冰箱中储存备用。

实施例5制备无标型检测α-乳白蛋白的光电化学生物传感器的工作曲线，步骤如下：

①将2.5 cm ITO导电玻璃依次用洗洁精、丙酮、无水乙醇和超纯水超声清洗，氮气吹干；

②将10 μL、5 mg/mL CdWO₄-CdS悬浮液滴在ITO电极上，室温下自然晾干，300 ℃煅烧30分钟；

③将4 μL、含1 mg/mL多巴胺盐酸盐的pH 8.5 Tris-HCl溶液滴加至CdWO₄-CdS修饰的电极表面，室温下反应60分钟，超纯水冲洗电极表面；

④滴加4 μL 10 μg/mL的α-乳白蛋白抗体溶液，反应30分钟后用超纯水冲洗电极表面，4 ℃冰箱中晾干；

⑤继续滴加4 μL、质量分数为1 %的BSA溶液，以封闭电极表面上非特异性活性位点，反应30 min后用超纯水冲洗电极表面，4 ℃冰箱中晾干；

⑥继续滴加4 μL、0.001 ~ 10 ng/mL的α-乳白蛋白，超纯水冲洗电极表面，4 ℃冰箱中晾干，制得一种基于CdWO₄-CdS的α-乳白蛋白的无标型光电化学生物传感器，于4 ℃冰箱中储存备用。

实施例6制备无标型检测α-乳白蛋白的光电化学生物传感器的工作曲线，步骤如下：

①将2.5 cm ITO导电玻璃依次用洗洁精、丙酮、无水乙醇和超纯水超声清洗，氮气吹干；

②将12 μL、7 mg/mL CdWO₄-CdS悬浮液滴在ITO电极上，室温下自然晾干，300 ℃煅烧30分钟；

③将5 μL、含1 mg/mL多巴胺盐酸盐的pH 8.5 Tris-HCl溶液滴加至CdWO₄-CdS修饰的电极表面，室温下反应70分钟，超纯水冲洗电极表面；

④滴加5 μL 10 μg/mL的α-乳白蛋白抗体溶液，反应40分钟后用超纯水冲洗电极表面，4 ℃冰箱中晾干；

⑤继续滴加5 μL、质量分数为1 %的BSA溶液，以封闭电极表面上非特异性活性位点，反应40 min后用超纯水冲洗电极表面，4 ℃冰箱中晾干；

⑥继续滴加5 μL、0.001 ~ 10 ng/mL的α-乳白蛋白，超纯水冲洗电极表面，4 ℃冰箱中晾干，制得一种基于CdWO₄-CdS的α-乳白蛋白的无标型光电化学生物传感器，于4 ℃冰箱中储存备用。

实施例7如权利要求l所述的一种检测α-乳白蛋白的的无标型光电化学生物传感器的制备方法及应用，其特征在于，用于α-乳白蛋白的检测，检测步骤如下：

①使用电化学工作站的三电极系统进行信号测定，测试溶液为10 mL ~ 15 mL、pH为5.0 ~ 8.0的0.1 mol/L的抗坏血酸磷酸盐缓冲溶液；

②采用i-t法对不同浓度的标品α-乳白蛋白进行检测，设置电压为0 V，运行时间为50 s，激发光源的为LED，记录电流的变化，绘制工作曲线；

③将待测样品稀释之后代替 ② 中标准品进行检测，根据光电流响应强度和工作曲线，得到待测样品中α-乳白蛋白的含量。

Claims (3)

1.一种检测α-乳白蛋白的光电化学生物传感器的制备方法及应用，其特征在于，步骤如下：

（1）将2.5 cm × 0.8 cm的ITO导电玻璃依次用洗洁精、丙酮、无水乙醇和超纯水超声清洗，氮气吹干；

（2）将8 ~ 12 μL、3 ~ 7 mg/mL CdWO₄-CdS悬浮液滴在ITO电极上，室温下自然晾干，300℃煅烧30分钟；

（3）将3 ~ 5 μL、含1 mg/mL多巴胺盐酸盐的pH 8.5 Tris-HCl溶液滴加至CdWO₄-CdS修饰的电极表面，室温下反应50 ~ 70分钟，超纯水冲洗电极表面；

（4）滴加3 ~ 5 μL 10 μg/mL的α-乳白蛋白抗体溶液，反应20 ~ 40分钟后用超纯水冲洗电极表面，4 ℃冰箱中晾干；

（5）继续滴加3 ~ 5 μL、质量分数为1 %的BSA溶液，以封闭电极表面上非特异性活性位点，反应20 ~ 40 分钟后用超纯水冲洗电极表面，4 ℃冰箱中晾干；

（6）继续滴加3 ~ 5 μL、0.001 ~ 10 ng/mL的α-乳白蛋白，超纯水冲洗电极表面，4 ℃冰箱中晾干，制得一种基于CdWO₄-CdS的α-乳白蛋白的无标型光电化学生物传感器，于4 ℃冰箱中储存备用。

2.如权利要求1所述的一种检测α-乳白蛋白的光电化学生物传感器的制备方法及应用，所述CdWO₄-CdS电极的制备，其特征在于，步骤如下：

（1）取0.5~1.5 mmol CH₄N₂S和0.5~1.5 mmol Na₂WO₄·2H₂O溶解在20 mL去离子水中，标记为溶液A；0.5~1.5 mmol Cd(CH₃COO)₂·2H₂O溶解在20 mL去离子水中，标记为溶液B；在磁力搅拌下，将溶液A逐滴滴加到溶液B中，搅拌2小时后，将白色悬浮液转移到转移到50毫升聚四氟乙烯反应釜中在160 ℃反应24 h，将所得混合物离心洗涤去离子水、无水乙醇各3次，然后在50 ℃下真空干燥；

（2）将8 ~ 12 μL、3 ~ 7 mg / mL CdWO₄-CdS悬浮液滴在ITO电极上，室温下自然晾干，300 ℃煅烧30分钟，自然冷却至室温，制得CdWO₄-CdS电极。

3.如权利要求l所述的一种检测α-乳白蛋白的光电化学生物传感器的制备方法及应用，其特征在于，用于α-乳白蛋白的检测，检测步骤如下：

（1）使用电化学工作站的三电极系统进行信号测定，测试溶液为10 mL ~ 15 mL、pH为5.0 ~ 8.0的0.1 mol/L的抗坏血酸磷酸盐缓冲溶液；

（2）采用i-t法对不同浓度的标品α-乳白蛋白进行检测，设置电压为0 V，运行时间为50s，激发光源为LED，记录电流的变化，绘制工作曲线；

（3）将待测样品稀释之后代替（2）中标准品进行检测，根据光电流响应强度和工作曲线，得到待测样品中α-乳白蛋白的含量。