CN110488021A - 一种基于聚多巴胺-二氧化钛复合材料修饰玻碳电极的丝素蛋白电化学免疫传感器 - Google Patents

一种基于聚多巴胺-二氧化钛复合材料修饰玻碳电极的丝素蛋白电化学免疫传感器 Download PDF

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Abstract

本发明涉及文物保护技术领域，公开了一种基于聚多巴胺‑二氧化钛复合材料修饰玻碳电极的丝素蛋白电化学免疫传感器，其制备方法为：聚多巴胺的制备；纳米二氧化钛的制备；玻碳电极预处理；聚多巴胺/二氧化钛GCE电极的制备；丝素蛋白电化学免疫传感器的制备；本发明的传感器可应用于在蛋白质文物鉴定，具有较好的灵敏度、准确度、精密度以及选择性。

Description

一种基于聚多巴胺-二氧化钛复合材料修饰玻碳电极的丝素 蛋白电化学免疫传感器
技术领域
本发明涉及文物鉴定技术领域，尤其涉及一种基于聚多巴胺-二氧化钛复合材料修饰玻碳电极的丝素蛋白电化学免疫传感器。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种基于聚多巴胺-二氧化钛复合材料修饰玻碳电极的丝素蛋白电化学免疫传感器。
本发明的具体技术方案为：一种基于聚多巴胺-二氧化钛复合材料修饰玻碳电极的丝素蛋白电化学免疫传感器，以mg和mL计，制备方法包括以下步骤：
1)聚多巴胺的制备：向容器中加入8～10ml无水乙醇和18～20ml去离子水，随后加入0.898g/ml～0.907g/ml的500-700ul浓氨水(0.898g/ml～0.907g/ml)；将所得混合溶液搅拌20-40min后，缓慢加入45-55mg/ml的1.5-2.5ml多巴胺溶液；在常温下搅拌反应，将所得溶液离心后，取固体即为聚多巴胺。
在步骤1)中，多巴胺溶液要缓慢加入以及搅拌速率不应过高，是为了能充分制得聚多巴胺。
2)纳米二氧化钛的制备：取20-30ml无水乙醇，依次加入0.8-1.2ml正丁醇、 0.8-1.2ml聚乙二醇、0.35-0.40ml氢氟酸、0.8-1.2ml乙二醇和0.4-0.6ml去离子水，搅拌15～20min，配制成溶液A；再取2.5-3.5ml钛酸四丁酯，加入8-12ml无水乙醇，搅拌15～20min配成溶液B；将溶液B以3.5-4.5ml/h的注射速度注入溶液A，同时剧烈搅拌溶液A，待注射完毕后继续搅拌3～5h；将搅拌好的溶液在140-160℃下并辅搅拌 3.5～4h，至反应结束，分别用去离子水、正丁醇和无水乙醇离心洗涤，将洗净所得的产物烘干，研磨后煅烧，得到纳米二氧化钛。
在步骤2)中，离心洗涤是为了洗去有机溶剂和有机基团，也为了将生成物洗至中性，从而制得更为纯净的纳米二氧化钛；
3)玻碳电极预处理：工作玻碳电极在麂皮上用纳米级氧化铝和去离子水进行打磨抛光；然后用无水乙醇浸泡超声清洗，最后用去离子水超声清洗。
在步骤3)中，使用纳米级氧化铝和去离子水进行打磨抛光，是为了将电极表面打磨干净，为了避免其他物质对电极导电性产生影响。
4)在电极表面滴加2-4ul浓度为8-12ug/L的聚多巴胺溶液，烘干后用PBS缓冲液洗净，继续滴加2-4ul浓度为8-12ug/L的纳米二氧化钛溶液于电极表面，烘干后即制得聚多巴胺/二氧化钛/GCE电极；
在步骤4)中，采用两次烘干后，能让聚多巴胺和纳米二氧化钛均匀的附着在电极表面。
5)清洗烘干电极，室温干燥后在电极表面滴加18-22μL 0.04-0.06M的3-羟基丙酸水溶液，孵育0.5-1.5h形成饱和3-羟基丙酸单层，然后用PBS缓冲液彻底清洗，将修饰有3-羟基丙酸的电极在含有0.04-0.06M EDC/0.02-0.04M N-羟基琥珀酰亚胺的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐缓冲液中孵育0.5-1.5h，将3-羟基丙酸的末端羧基转化为活性N-羟基琥珀酰亚胺酯；再取4-6ul 8-12ug/mL的丝素蛋白抗体溶液，滴涂至电极表面，室温下晾干，用PBS缓冲液洗净未固定的抗体，得抗体/聚多巴胺/ 二氧化钛/GCE修饰电极；随后，用BSA溶液封闭20-40min，以封闭电极表面可能存在的非特异性结合位点，取出后用PBS缓冲液洗净，晾干，得丝素蛋白电化学免疫传感器；
在步骤5)中，将3-羟基丙酸的末端羧基转化为活性NHS酯是为了更好与抗体进行结合。
作为优选，步骤1)中，加入多巴胺溶液后的搅拌时间为25-35h，搅拌时避光，离心条件为9000-11000rpm，4-6min。
作为优选，步骤2)中，将洗净所得的产物在55-65℃下烘干，研磨1～2h后在 420-440℃煅烧20-40min，得到纳米二氧化钛。
作为优选，步骤3)中，用无水乙醇浸泡超声清洗8-12min；最后用去离子水超声清洗8-12min。
作为优选，步骤4)中，在室温下烘干。
作为优选，步骤4)至步骤6)中，所述PBS缓冲液的pH＝7.4。
作为优选，步骤5)中，所述BSA溶液的浓度为0.8-1.2wt％。
与现有技术对比，本发明的有益效果是：
在步骤4)中，本发明分两次将聚多巴胺和纳米二氧化钛附着于电极表面上，能极大增强电化学信号的传导。
在步骤5)中，本发明将3-羟基丙酸的末端羧基转化为活性NHS酯，可以通过转化基团来实现与抗体的结合。
本发明的传感器可应用于在蛋白质文物鉴定，具有较好的灵敏度、准确度、精密度以及选择性。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的描述。
实施例1
1)聚多巴胺的制备：往洁净的烧杯中加入8ml无水乙醇和18ml去离子水，随后加入600ul浓氨水(0.898ug/L)；将所得的混合溶液在磁力搅拌器上搅拌30min后，缓慢加入2ml多巴胺溶液(50mg/ml)；随后，在常温下磁力搅拌反应30h。将所得溶液于10000rpm下离心5min后，离心所得固体为聚多巴胺。
2)纳米二氧化钛的制备：取25ml无水乙醇，依次加入1ml正丁醇、1ml聚乙二醇、0.38ml氢氟酸、1ml乙二醇和0.5ml去离子水，磁力搅拌15min，配制成溶液A；再取3ml钛酸四丁酯，加入10ml无水乙醇，搅拌15min配成溶液B。将溶液B以4ml/h 的注射速度注入溶液A，同时剧烈搅拌溶液A，待注射完毕后继续磁力搅拌3h。将搅拌好的溶液在150℃恒温3.5h，并辅以磁力搅拌，至反应结束。分别用去离子水、正丁醇和无水乙醇离心洗涤，将洗净的TiO2在60℃烘干，研磨1h后在430℃煅烧 30min。
3)玻碳电极预处理：工作玻碳电极在麂皮上进行打磨抛光，此时所用的为纳米级氧化铝和去离子水。接下来，用无水乙醇浸泡进行超声清洗10min；再用去离子水进行超声清洗10min。
4)采用滴涂法+滴涂法的方法，用移液枪在电极表面滴加3ul的聚多巴胺溶液(10ug/L)，在室温下烘干，用0.01mol·L-1PBS缓冲液(pH＝7.4)洗净，继续滴加3ul的纳米二氧化钛溶液(10ug/L)在电极表面，在室温下烘干，即制得聚多巴胺/二氧化钛GCE 电极。
5)随后用去离子水清洗烘干，室温干燥后在电极表面滴加20μL 0.05M的3-羟基丙酸水溶液，孵育1h形成饱和3-羟基丙酸单层，然后用PBS(pH＝7.4)彻底清洗。将修饰有3-羟基丙酸的电极在0.05M EDC/0.03M NHS的MES缓冲液中孵育1h，将3-羟基丙酸的末端羧基转化为活性NHS酯。再取5ul 10ug/mL的丝素蛋白抗体溶液，滴涂至聚多巴胺/二氧化钛/GCE修饰电极表面，室温下晾干，用0.01mol·L-1磷酸缓冲液(PBS) (pH＝7.4)洗净未固定的抗体，得抗体/聚多巴胺/二氧化钛/GCE修饰电极；随后，用1％的BSA封闭0.5h，以封闭电极表面可能存在的非特异性结合位点，取出后用0.01mol·L -1PBS缓冲液(pH＝7.4)洗净，晾干，得丝素蛋白电化学免疫传感器。
6)35℃下，将丝素蛋白电化学免疫传感器分别置于不同浓度的丝素蛋白溶液中，其浓度分别为：0.01ng·mL-1，0.1ng·mL-1，1ng·mL-1，10ng·mL-1，100ng·mL-1，和1000ng·mL-1孵育30min，然后用0.01mol·L-1PBS缓冲液(pH＝7.4)洗净，得结合了丝素蛋白的丝素蛋白电化学免疫传感器，4℃储存，备用。
实施例2
1)聚多巴胺的制备：往洁净的烧杯中加入9ml无水乙醇和18ml去离子水，随后加入600ul浓氨水(0.898ug/L)；将所得的混合溶液在磁力搅拌器上搅拌30min后，缓慢加入2ml多巴胺溶液(50mg/ml)；随后，在常温下磁力搅拌反应30h。将所得溶液于10000rpm下离心5min后，离心所得固体为聚多巴胺。
2)纳米二氧化钛的制备：取25ml无水乙醇，依次加入1ml正丁醇、1ml和聚乙二醇、0.38ml氢氟酸、1ml乙二醇和0.5ml去离子水，磁力搅拌15min，配制成溶液A；再取3ml钛酸四丁酯，加入10ml无水乙醇，搅拌15min配成溶液B。将溶液B以4ml/h 的注射速度注入溶液A，同时剧烈搅拌溶液A，待注射完毕后继续磁力搅拌3h。将搅拌好的溶液在150℃恒温3.5h，并辅以磁力搅拌，至反应结束。分别用去离子水、正丁醇和无水乙醇离心洗涤，将洗净的TiO2在60℃烘干，研磨1h后在430℃煅烧 30min。
3)玻碳电极预处理：工作玻碳电极在麂皮上进行打磨抛光，此时所用的为纳米级氧化铝和去离子水。接下来，用无水乙醇浸泡进行超声清洗10min；再用去离子水进行超声清洗10min。
4)采用滴涂法+滴涂法的方法，用移液枪在电极表面滴加3ul的聚多巴胺溶液(10ug/L)，在红外灯下烘干，用0.01mol·L-1PBS缓冲液(pH＝7.4)洗净，继续滴加3ul 的纳米二氧化钛溶液(10ug/L)在电极表面，在在红外灯下烘干，即制得聚多巴胺/二氧化钛GCE电极。
5)随后用去离子水清洗烘干，室温干燥后在电极表面滴加20μL 0.05M的3-羟基丙酸水溶液，孵育1h形成饱和3-羟基丙酸单层，然后用PBS(pH＝7.4)彻底清洗。将修饰有3-羟基丙酸的电极在0.05M EDC/0.03M NHS的MES缓冲液中孵育1h，将3-羟基丙酸的末端羧基转化为活性NHS酯。再取5ul 10ug/mL的丝素蛋白抗体溶液，滴涂至聚多巴胺/二氧化钛/GCE修饰电极表面，室温下晾干，用0.01mol·L-1磷酸缓冲液(PBS) (pH＝7.4)洗净未固定的抗体，得抗体/聚多巴胺/二氧化钛/GCE修饰电极；随后，用1％的BSA封闭0.5h，以封闭电极表面可能存在的非特异性结合位点，取出后用0.01mol·L -1PBS缓冲液(pH＝7.4)洗净，晾干，得丝素蛋白电化学免疫传感器。
6)35℃下，将丝素蛋白电化学免疫传感器分别置于不同浓度的丝素蛋白溶液中，其浓度分别为：0.01ng·mL-1，0.1ng·mL-1，1ng·mL-1，10ng·mL-1，100ng·mL-1，和1000ng·mL-1孵育30min，然后用0.01mol.L-1PBS缓冲液(pH＝7.4)洗净，得结合了丝素蛋白的丝素蛋白电化学免疫传感器，4℃储存，备用。
实施例3
1)聚多巴胺的制备：往洁净的烧杯中加入10ml无水乙醇和18ml去离子水，随后加入600ul浓氨水(0.898ug/L)；将所得的混合溶液在磁力搅拌器上搅拌30min后，缓慢加入2ml多巴胺溶液(50mg/ml)；随后，在常温下磁力搅拌反应30h。将所得溶液于10000rpm下离心5min后，离心所得固体为聚多巴胺。
2)纳米二氧化钛的制备：取25ml无水乙醇，依次加入1ml正丁醇、1ml聚乙二醇、0.38ml氢氟酸、1ml乙二醇和0.5ml去离子水，磁力搅拌15min，配制成溶液A；再取3ml钛酸四丁酯，加入10ml无水乙醇，搅拌15min配成溶液B。将溶液B以4ml/h 的注射速度注入溶液A，同时剧烈搅拌溶液A，待注射完毕后继续磁力搅拌3h。将搅拌好的溶液在150℃恒温3.5h，并辅以磁力搅拌，至反应结束。分别用去离子水、正丁醇和无水乙醇离心洗涤，将洗净的TiO2在60℃烘干，研磨1h后在430℃煅烧 30min。
3)玻碳电极预处理：工作玻碳电极在麂皮上进行打磨抛光，此时所用的为纳米级氧化铝和去离子水。接下来，用无水乙醇浸泡进行超声清洗10min；再用去离子水进行超声清洗10min。
4)采用滴涂法+滴涂法的方法，用移液枪在电极表面滴加3ul的聚多巴胺溶液(10ug/L)，在室温下烘干，用0.01mol·L-1PBS缓冲液(pH＝7.4)洗净，继续滴加3ul的纳米二氧化钛溶液(10ug/L)在电极表面，在室温下烘干，即制得聚多巴胺/二氧化钛GCE 电极。
5)随后用去离子水清洗烘干，室温干燥后在电极表面滴加20μL 0.05M的3-羟基丙酸水溶液，孵育1h形成饱和3-羟基丙酸单层，然后用PBS(pH＝7.4)彻底清洗。将修饰有3-羟基丙酸的电极在0.05M EDC/0.03M NHS的MES缓冲液中孵育1h，将3-羟基丙酸的末端羧基转化为活性NHS酯。再取5ul 10ug/mL的丝素蛋白抗体溶液，滴涂至聚多巴胺/二氧化钛/GCE修饰电极表面，室温下晾干，用0.01mol.L-1磷酸缓冲液(PBS) (pH＝7.4)洗净未固定的抗体，得抗体/聚多巴胺/二氧化钛/GCE修饰电极；随后，用1％的BSA封闭0.5h，以封闭电极表面可能存在的非特异性结合位点，取出后用0.01mol·L -1PBS缓冲液(pH＝7.4)洗净，晾干，得丝素蛋白电化学免疫传感器。
6)35℃下，将丝素蛋白电化学免疫传感器分别置于不同浓度的丝素蛋白溶液中，其浓度分别为：0.01ng·mL-1，0.1ng·mL-1，1ng·mL-1，10ng·mL-1，100ng·mL-1，和1000ng·mL-1孵育30min，然后用0.01mol.L-1PBS缓冲液(pH＝7.4)洗净，得结合了丝素蛋白的丝素蛋白电化学免疫传感器，4℃储存，备用。
实施例4
1)聚多巴胺的制备：往洁净的烧杯中加入8ml无水乙醇和20ml去离子水，随后加入600ul浓氨水(0.898ug/L)；将所得的混合溶液在磁力搅拌器上搅拌30min后，缓慢加入2ml多巴胺溶液(50mg/ml)；随后，在常温下磁力搅拌反应30h。将所得溶液于10000rpm下离心5min后，离心所得固体为聚多巴胺。
2)纳米二氧化钛的制备：取25ml无水乙醇，依次加入1ml正丁醇、1ml聚乙二醇、0.38ml氢氟酸、1ml乙二醇和0.5ml去离子水，磁力搅拌15min，配制成溶液A；再取3ml钛酸四丁酯，加入10ml无水乙醇，搅拌15min配成溶液B。将溶液B以4ml/h 的注射速度注入溶液A，同时剧烈搅拌溶液A，待注射完毕后继续磁力搅拌3h。将搅拌好的溶液在150℃恒温3.5h，并辅以磁力搅拌，至反应结束。分别用去离子水、正丁醇和无水乙醇离心洗涤，将洗净的TiO2在60℃烘干，研磨1h后在430℃煅烧 30min。
3)玻碳电极预处理：工作玻碳电极在麂皮上进行打磨抛光，此时所用的为纳米级氧化铝和去离子水。接下来，用无水乙醇浸泡进行超声清洗10min；再用去离子水进行超声清洗10min。
4)采用滴涂法+滴涂法的方法，用移液枪在电极表面滴加3ul的聚多巴胺溶液(10ug/L)，在室温下烘干，用0.01mol·L-1PBS缓冲液(pH＝7.4)洗净，继续滴加3ul的纳米二氧化钛溶液(10ug/L)在电极表面，在室温下烘干，即制得聚多巴胺/二氧化钛GCE 电极。
5)随后用去离子水清洗烘干，室温干燥后在电极表面滴加20μL 0.05M的3-羟基丙酸水溶液，孵育1h形成饱和3-羟基丙酸单层，然后用PBS(pH＝7.4)彻底清洗。将修饰有3-羟基丙酸的电极在0.05M EDC/0.03M NHS的MES缓冲液中孵育1h，将3-羟基丙酸的末端羧基转化为活性NHS酯。再取5ul 10ug/mL的丝素蛋白抗体溶液，滴涂至聚多巴胺/二氧化钛/GCE修饰电极表面，室温下晾干，用0.01mol·L-1磷酸缓冲液(PBS) (pH＝7.4)洗净未固定的抗体，得抗体/聚多巴胺/二氧化钛/GCE修饰电极；随后，用1％的BSA封闭0.5h，以封闭电极表面可能存在的非特异性结合位点，取出后用0.01mol·L -1PBS缓冲液(pH＝7.4)洗净，晾干，得丝素蛋白电化学免疫传感器。
6)35℃下，将丝素蛋白电化学免疫传感器分别置于不同浓度的丝素蛋白溶液中，其浓度分别为：0.01ng·mL-1，0.1ng·mL-1，1ng·mL-1，10ng·mL-1，100ng·mL-1，和1000ng·mL-1孵育30min，然后用0.01mol·L-1PBS缓冲液(pH＝7.4)洗净，得结合了丝素蛋白的丝素蛋白电化学免疫传感器，4℃储存，备用。
本发明中所用原料、设备，若无特别说明，均为本领域的常用原料、设备；本发明中所用方法，若无特别说明，均为本领域的常规方法。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制，凡是根据本发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效变换，均仍属于本发明技术方案的保护范围。

Claims (7)

1.一种基于聚多巴胺-二氧化钛复合材料修饰玻碳电极的丝素蛋白电化学免疫传感器，其特征在于：以mg和mL计，制备方法包括以下步骤：
1)聚多巴胺的制备：向容器中加入8～10ml无水乙醇和18～20ml去离子水，随后加入0.898g/ml～0.907g/ml的500-700ul浓氨水；将所得混合溶液搅拌20-40min后，缓慢加入45-55mg/ml的1.5-2.5ml多巴胺溶液；在常温下搅拌反应，将所得溶液离心后，取固体即为聚多巴胺；
2)纳米二氧化钛的制备：取20-30ml无水乙醇，依次加入0.8-1.2ml正丁醇、0.8-1.2ml聚乙二醇、0.35-0.40ml氢氟酸、0.8-1.2ml乙二醇和0.4-0.6ml去离子水，搅拌15～20min，配制成溶液A；再取2.5-3.5ml钛酸四丁酯，加入8-12ml无水乙醇，搅拌15～20min配成溶液B；将溶液B以3.5-4.5ml/h的注射速度注入溶液A，同时剧烈搅拌溶液A，待注射完毕后继续搅拌3～5h；将搅拌好的溶液在140-160℃下并辅搅拌3.5～4h，至反应结束，分别用去离子水、正丁醇和无水乙醇离心洗涤，将洗净所得的产物烘干，研磨后煅烧，得到纳米二氧化钛；
3)玻碳电极预处理：工作玻碳电极在麂皮上用纳米级氧化铝和去离子水进行打磨抛光；然后用无水乙醇浸泡超声清洗，最后用去离子水超声清洗；
4)在电极表面滴加2-4ul浓度为8-12ug/L的聚多巴胺溶液，烘干后用PBS缓冲液洗净，继续滴加2-4ul浓度为8-12ug/L的纳米二氧化钛溶液于电极表面，烘干后即制得聚多巴胺/二氧化钛GCE电极；
5)清洗烘干电极，室温干燥后在电极表面滴加18-22μL 0.04-0.06M的3-羟基丙酸水溶液，孵育0.5-1.5h形成饱和3-羟基丙酸单层，然后用PBS缓冲液彻底清洗，将修饰有3-羟基丙酸的电极在含有0.04-0.06M EDC/0.02-0.04M N-羟基琥珀酰亚胺的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐缓冲液中孵育0.5-1.5h，将3-羟基丙酸的末端羧基转化为活性N-羟基琥珀酰亚胺酯；再取4-6ul 8-12ug/mL的丝素蛋白抗体溶液，滴涂至电极表面，室温下晾干，用PBS缓冲液洗净未固定的抗体，得抗体/聚多巴胺/二氧化钛/GCE修饰电极；随后，用BSA溶液封闭20-40min，以封闭电极表面可能存在的非特异性结合位点，取出后用PBS缓冲液洗净，晾干，得丝素蛋白电化学免疫传感器。
2.如权利要求1所述的丝素蛋白电化学免疫传感器，其特征在于，步骤1)中，加入多巴胺溶液后的搅拌时间为25-35h，搅拌时避光，离心条件为9000-11000rpm，4-6min。
3.如权利要求1所述的丝素蛋白电化学免疫传感器，其特征在于，步骤2)中，将洗净所得的产物在55-65℃下烘干，研磨1～2h后在420-440℃煅烧20-40min，得到纳米二氧化钛。
4.如权利要求1所述的丝素蛋白电化学免疫传感器，其特征在于，步骤3)中，用无水乙醇浸泡超声清洗8-12min；最后用去离子水超声清洗8-12min。
5.如权利要求1所述的丝素蛋白电化学免疫传感器，其特征在于，步骤4)中，在室温下烘干。
6.如权利要求1所述的丝素蛋白电化学免疫传感器，其特征在于，步骤4)至步骤6)中，所述PBS缓冲液的pH＝7.4。
7.如权利要求1所述的丝素蛋白电化学免疫传感器，其特征在于，步骤5)中，所述BSA溶液的浓度为0.8-1.2wt％。
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