CN110542713A - 一种基于石墨烯量子点修饰聚多巴胺@纳米二氧化钛的电化学传感器的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及电化学传感领域，公开了一种基于石墨烯量子点修饰聚多巴胺@纳米二氧化钛的电化学传感器的制备方法，本发明通过将石墨烯量子点分别与聚多巴胺和纳米级二氧化钛结合在一起形成两种复合材料，再将这两种复合材料附载于玻碳电极表面上，增强了电化学响应信号，能够灵敏检测出丝素蛋白。
Description
技术领域
本发明涉及电化学传感领域，尤其涉及一种基于石墨烯量子点修饰聚多巴胺@纳米二氧化钛的电化学传感器的制备方法。
背景技术
在人类社会漫长的发展过程中，留下了许多具有不可估量价值的文物。它们的发现不仅具有科技、文化、艺术等多方面的价值，更是社会交替，人文交融的历史见证者。蛋白质类文物占了出土文物的大多部分，但由于常年处于地下墓葬环境中，会受到环境的酸碱度、微生物的腐蚀、温度和湿度以及有害气体的影响从而发生老化和降解。一方面导致文物表面形貌损毁严重，致使要鉴定其种属有很大难度，更使后续的保护工作难以有针对性地进行；另一方面，文物出土的时候往往会伴有许多杂质，真正的有效成分极少。针对丝织品文物种属鉴别，寻找一种灵敏度高、特异性强、简单快捷、高效的丝织品文物种属鉴别方法，构建丝织品文物种属鉴别体系，对丝织品文物的鉴别存在着很重要的意义。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种基于石墨烯量子点修饰聚多巴胺@纳米二氧化钛的电化学传感器的制备方法。本发明通过将石墨烯量子点分别与聚多巴胺和纳米级二氧化钛结合在一起形成两种复合材料，再将这两种复合材料附载于玻碳电极表面上，增强了电化学响应信号，能够灵敏检测出丝素蛋白。
本发明的具体技术方案为：一种基于石墨烯量子点修饰聚多巴胺@纳米二氧化钛的电化学传感器的制备方法，包括以下步骤：
1)GQD的制备：称取1.5-2.5g柠檬酸置于容器中，将容器置于190-210℃温度下使柠檬酸开始熔解，随后液体的颜色从无色变到浅黄色，最终变成橘黄色，表明GQD的生成，之后用90-110mL、8～12mg/mL的NaOH溶液调节至中性，制得GQD溶液。
在步骤1)中，当液体变成橘黄色，表明GQD已经生成。
2)纳米TiO2的制备：取20-30ml无水乙醇，依次加入0.8-1.2ml正丁醇、0.8-1.2ml聚乙二醇、0.35-0.40ml氢氟酸、0.8-1.2ml乙二醇和0.5-0.6ml去离子水，搅拌10～20min，配制成溶液A；再取2.5-3.5ml钛酸四丁酯，加入8-12ml无水乙醇，搅拌10～20min配成溶液B；将溶液B以3.5-4.5ml/h的注射速度注入溶液A，同时剧烈搅拌溶液A，待注射完毕后继续搅拌2～4h；将搅拌好的溶液在140-160℃下并辅搅拌3～4h，至反应结束，分别用去离子水、正丁醇和无水乙醇离心洗涤，将洗净所得的产物烘干，研磨后煅烧，得到纳米TiO2。
在步骤2)中，离心洗涤是为了洗去有机溶剂和有机基团，也为了将生成物洗至中性，从而制得更为纯净的纳米二氧化钛；
3)GQDs-TiO2的制备：取8-12mLGQD，加入15.5-16.0gNaOH，加水定容至35-45mL，搅拌25-35min，配制成8-12mol/L含GQD的NaOH溶液；再取15-15.2mgTiO2，加入含GQD的NaOH溶液，搅拌25-35min，130-150℃下反应6-10h，待反应结束后，用4-6wt％的HCl溶液和去离子水分别离心清洗，再用无水乙醇离心清洗去除表面水分，将所得产物分散在体积比为2.5-3.5∶1的无水乙醇与正丁醇的混合溶液中，150-170℃下晶化定型，得到GQDs-TiO2。
在步骤3)中，搅拌时间略久，是为了保证充分反应。
4)PDANS@Ag的制备：将80～120mg盐酸多巴胺加入到80～120mL的Tris-盐酸缓冲溶液与30～70mL异丙醇的混合液中，在室温下避光反应20-30h，离心分离并用水洗涤数次，之后将产物分散到4-6mL超纯水中，得到PDANS分散液；取0.8-1.2mLPDANS分散液稀释到4-6mL超纯水中，在搅拌条件下依次加入500～700mg柠檬酸三钠、18-22mL 0.015～0.035mol/LAgNO3溶液，通入N2除氧，避光条件下搅拌反应2.5～4.5h；反应完成后，将产物离心分离，并用超纯水洗涤数次，真空干燥，得到PDANS@Ag。
在步骤4)中，通入N2除去氧气，是为了防止剩余的氧气对制备产生影响。
5)巯基化GQD的制备：分别将13.4～17.4mg巯基乙胺、85.8～105.8mgEDC加入到20mL步骤1)所得GQD溶液中，室温下振荡反应20-30h，将反应后的溶液透析1-3天，制得巯基化GQD溶液。
在步骤5)中，透析是为了保证巯基化GQD的纯净。
6)将1～3mL巯基化GQD溶液与1～3mL浓度为1.8-2.2mg/mL PDANS@Ag溶液混合，室温下震荡10-14h，离心洗涤，得到PDANS@Ag/GQD。
7)玻碳电极预处理：工作玻碳电极在麂皮上用纳米级氧化铝和去离子水进行打磨抛光；然后用无水乙醇浸泡超声清洗，最后用去离子水超声清洗。
在步骤7)中，使用纳米级氧化铝和去离子水进行打磨抛光，是为了将电极表面打磨干净，为了避免其他物质对电极导电性产生影响。
8)在电极表面滴加2-4ul已配制好8-12ug/L的PDANS@Ag/GQD溶液，烘干后用PBS缓冲液洗净，继续滴加2-4ul已配制好8-12ug/L的GQDs-TiO2溶液于电极表面，烘干后即制得电极。
在步骤8)中，采用两次烘干后，能让PDANS@Ag/GQD和GQDs-TiO2均匀地附着在电极表面。
9)清洗烘干电极，向干燥后在电极表面滴加18-22μL 0.04-0.06M的3-羟基丙酸水溶液，孵育0.5-1.5h形成饱和3-羟基丙酸单层，然后用PBS缓冲液彻底清洗，将修饰有3-羟基丙酸的电极在含有0.04-0.06M EDC/0.02-0.04M N-羟基琥珀酰亚胺的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐缓冲液中孵育0.5-1.5h，将3-羟基丙酸的末端羧基转化为活性N-羟基琥珀酰亚胺酯；再取4-6ul 8-12ug/mL的丝素蛋白抗体溶液，滴涂至电极表面，室温下晾干，用PBS缓冲液洗净未固定的抗体，得抗体修饰电极；随后，用BSA溶液封闭20-40min，以封闭电极表面可能存在的非特异性结合位点，取出后用PBS缓冲液洗净，晾干，得到基于石墨烯量子点修饰聚多巴胺@纳米二氧化钛的电化学传感器。
在步骤9)中，将3-羟基丙酸的末端羧基转化为活性N-羟基琥珀酰亚胺酯是为了更好与抗体进行结合。
作为优选，步骤2)中，将洗净所得的产物在55-65℃下烘干，研磨1～2h后在420-440℃煅烧20-40min，得到纳米二氧化钛。
作为优选，步骤3)中，晶化定性的时间为3-5h。
作为优选，步骤4)中，所述Tris-盐酸缓冲溶液的pH＝8.6-9.0。
作为优选，步骤6)中，离心转速为10000-14000rpm。
作为优选，步骤7)中，用无水乙醇浸泡超声清洗8-12min；用去离子水超声清洗8-12min。
作为优选，步骤9)中，所述BSA溶液的浓度为0.8-1.2wt％。
与现有技术对比，本发明的有益效果是：
1)本发明分两次将PDANS@Ag/GQD和GQDs-TiO2附着于电极表面上，能极大增强电化学信号的传导。
2)本发明将3-羟基丙酸的末端羧基转化为活性N-羟基琥珀酰亚胺酯，可以通过转化基团来实现与抗体的结合。
3)本发明的传感器可应用于在蛋白质文物鉴定，具有较好的灵敏度、准确度、精密度以及选择性。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的描述。
实施例1
1)GQD的制备：称取2g柠檬酸置于100mL烧杯中，将烧杯置于200℃鼓风干燥箱中，5min后柠檬酸开始熔解，随后液体的颜色从无色变到浅黄色，30min之后变成橘黄色，表明GQD的生成，之后用100mL、8mg/mL的NaOH溶液调节至中性，制得GQD溶液。
2)纳米TiO2的制备：通过控制氟离子晶面生长的水热法制备纳米TiO2，取25mL无水乙醇，依次加入1mL正丁醇和聚乙二醇、0.38mL氢氟酸、1mL乙二醇和0.58mL去离子水，磁力搅拌15min，配制成溶液A；再取3mL钛酸四丁酯，加入10mL无水乙醇，搅拌15min配成溶液B。将溶液B以4mL/h的注射速度注入溶液A，同时剧烈搅拌溶液A，待注射完毕后继续磁力搅拌3h。将搅拌好的溶液在150℃恒温3.5h，并辅以磁力搅拌，至反应结束。分别用去离子水、正丁醇和无水乙醇离心洗涤，将洗净的TiO2在60℃烘干，研磨1h后在430℃煅烧30min。
3)GQDs-TiO2的制备：取10mLGQD，加入15.8gNaOH，加水定容至40mL，磁力搅拌30min，配制成10mol/L含GQD的NaOH强碱溶液。再取15.1mgTiO2，加入配制好的GQD碱溶液，磁力搅拌30min，140℃下反应8h。待反应结束后，用5％的HCl和去离子水将样品分别离心清洗3次，再用无水乙醇离心清洗样品3次去除表面水分。将样品分散在无水乙醇与正丁醇的混合溶液(体积比3∶1)中，160℃下晶化定型4h。
4)PDANS@Ag的制备：80mg盐酸多巴胺加入到120mL(pH＝8.8)的Tris-盐酸缓冲溶液与30mL异丙醇的混合液中，在室温下避光反应24h，将产品离心分离并用超纯水洗涤五次，之后将产物分散到5mL超纯水中备用；取1mLPDANS稀释到5mL超纯水中，在搅拌的条件下依次加入500mg柠檬酸三钠、20mL 0.035mol/LAgNO3溶液，通入N2除氧，避光条件下搅拌反应4.5h；反应完成后，将产物离心分离，并用超纯水洗涤三次，最后产物真空干燥；
5)巯基化GQD的制备：分别将13.4mg巯基乙胺、105.8mg EDC加入到20mLGQD溶液中，室温下振荡反应24h，将反应后的溶液透析两天，制得巯基化GQD；
6)将1mL巯基化GQD溶液与1mL浓度为2mg/mLPDANS@Ag溶液混合，室温下震荡12h，离心洗涤，得到PDANS@Ag/GQD；
7)玻碳电极预处理：工作玻碳电极在麂皮上用纳米级氧化铝和去离子水进行打磨抛光；然后用无水乙醇浸泡超声清洗，最后用去离子水超声清洗；
8)在电极表面滴加4ul已配制好的PDANS@Ag/GQD；溶液(10ug/L)，烘干后用PBS缓冲液洗净，继续滴加4ul已配制好的GQDs-TiO2溶液(10ug/L)于电极表面，烘干后即制得电极；
9)清洗烘干电极，室温干燥后在电极表面滴加18μL 0.06M的3-羟基丙酸水溶液，孵育1h形成饱和3-羟基丙酸单层，然后用PBS缓冲液彻底清洗，将修饰有3-羟基丙酸的电极在含有0.04M EDC/0.04M N-羟基琥珀酰亚胺的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐缓冲液中孵育1h，将3-羟基丙酸的末端羧基转化为活性N-羟基琥珀酰亚胺酯；再取6ul12ug/mL的丝素蛋白抗体溶液，滴涂至电极表面，室温下晾干，用PBS缓冲液洗净未固定的抗体，得抗体修饰电极；随后，用1％BSA溶液封闭40min，以封闭电极表面可能存在的非特异性结合位点，取出后用PBS缓冲液洗净，晾干，得丝素蛋白电化学免疫传感器。
经试验测试，本发明电化学免疫传感器对丝素蛋白的检测限为三十皮克。
实施例2
1)GQD的制备：称取2g柠檬酸置于100mL烧杯中，将烧杯置于200℃鼓风干燥箱中，5min后柠檬酸开始熔解，随后液体的颜色从无色变到浅黄色，30min之后变成橘黄色，表明GQD的生成，之后用100mL、8mg/mL的NaOH溶液调节至中性，制得GQD溶液。
2)纳米TiO2的制备：通过控制氟离子晶面生长的水热法制备纳米TiO2，取25mL无水乙醇，依次加入1mL正丁醇和聚乙二醇、0.38mL氢氟酸、1mL乙二醇和0.58mL去离子水，磁力搅拌15min，配制成溶液A；再取3mL钛酸四丁酯，加入10mL无水乙醇，搅拌15min配成溶液B。将溶液B以4mL/h的注射速度注入溶液A，同时剧烈搅拌溶液A，待注射完毕后继续磁力搅拌3h。将搅拌好的溶液在150℃恒温3.5h，并辅以磁力搅拌，至反应结束。分别用去离子水、正丁醇和无水乙醇离心洗涤，将洗净的TiO2在60℃烘干，研磨1h后在430℃煅烧30min。
3)GQDs-TiO2的制备：取10mLGQD，加入15.8gNaOH，加水定容至40mL，磁力搅拌30min，配制成10mol/L含GQD的NaOH强碱溶液。再取15.1mgTiO2，加入配制好的GQD碱溶液，磁力搅拌30min，140℃下反应8h。待反应结束后，用5％的HCl和去离子水将样品分别离心清洗3次，再用无水乙醇离心清洗样品3次去除表面水分。将样品分散在无水乙醇与正丁醇的混合溶液(体积比3∶1)中，160℃下晶化定型4h。
4)PDANS@Ag的制备：90mg盐酸多巴胺加入到120mL(pH＝8.8)的Tris-盐酸缓冲溶液与30mL异丙醇的混合液中，在室温下避光反应24h，将产品离心分离并用超纯水洗涤五次，之后将产物分散到5mL超纯水中备用；取1mLPDANS稀释到5mL超纯水中，在搅拌的条件下依次加入500mg柠檬酸三钠、20mL 0.035mol/LAgNO3溶液，通入N2除氧，避光条件下搅拌反应4.5h；反应完成后，将产物离心分离，并用超纯水洗涤三次，最后产物真空干燥；
5)巯基化GQD的制备：分别将13.4mg巯基乙胺、105.8mg EDC加入到20mLGQD溶液中，室温下振荡反应24h，将反应后的溶液透析两天，制得巯基化GQD；
6)将1mL巯基化GQD溶液与1mL浓度为2mg/mLPDANS@Ag溶液混合，室温下震荡12h，离心洗涤，得到PDANS@Ag/GQD；
7)玻碳电极预处理：工作玻碳电极在麂皮上用纳米级氧化铝和去离子水进行打磨抛光；然后用无水乙醇浸泡超声清洗，最后用去离子水超声清洗；
8)在电极表面滴加4ul已配制好的PDANS@Ag/GQD；溶液(10ug/L)，烘干后用PBS缓冲液洗净，继续滴加4ul已配制好的GQDs-TiO2溶液(10ug/L)于电极表面，烘干后即制得电极；
9)清洗烘干电极，室温干燥后在电极表面滴加18μL 0.06M的3-羟基丙酸水溶液，孵育1h形成饱和3-羟基丙酸单层，然后用PBS缓冲液彻底清洗，将修饰有3-羟基丙酸的电极在含有0.04M EDC/0.04M N-羟基琥珀酰亚胺的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐缓冲液中孵育1h，将3-羟基丙酸的末端羧基转化为活性N-羟基琥珀酰亚胺酯；再取6ul12ug/mL的丝素蛋白抗体溶液，滴涂至电极表面，室温下晾干，用PBS缓冲液洗净未固定的抗体，得抗体修饰电极；随后，用1％BSA溶液封闭40min，以封闭电极表面可能存在的非特异性结合位点，取出后用PBS缓冲液洗净，晾干，得丝素蛋白电化学免疫传感器。
实施例3
1)GQD的制备：称取2g柠檬酸置于100mL烧杯中，将烧杯置于200℃鼓风干燥箱中，5min后柠檬酸开始熔解，随后液体的颜色从无色变到浅黄色，30min之后变成橘黄色，表明GQD的生成，之后用100mL、8mg/mL的NaOH溶液调节至中性，制得GQD溶液。
2)纳米TiO2的制备：通过控制氟离子晶面生长的水热法制备纳米TiO2，取25mL无水乙醇，依次加入1mL正丁醇和聚乙二醇、0.38mL氢氟酸、1mL乙二醇和0.58mL去离子水，磁力搅拌15min，配制成溶液A；再取3mL钛酸四丁酯，加入10mL无水乙醇，搅拌15min配成溶液B。将溶液B以4mL/h的注射速度注入溶液A，同时剧烈搅拌溶液A，待注射完毕后继续磁力搅拌3h。将搅拌好的溶液在150℃恒温3.5h，并辅以磁力搅拌，至反应结束。分别用去离子水、正丁醇和无水乙醇离心洗涤，将洗净的TiO2在60℃烘干，研磨1h后在430℃煅烧30min。
3)GQDs-TiO2的制备：取10mLGQD，加入15.8gNaOH，加水定容至40mL，磁力搅拌30min，配制成10mol/L含GQD的NaOH强碱溶液。再取15.1mgTiO2，加入配制好的GQD碱溶液，磁力搅拌30min，140℃下反应8h。待反应结束后，用5％的HCl和去离子水将样品分别离心清洗3次，再用无水乙醇离心清洗样品3次去除表面水分。将样品分散在无水乙醇与正丁醇的混合溶液(体积比3∶1)中，160℃下晶化定型4h。
4)PDANS@Ag的制备：100mg盐酸多巴胺加入到120mL(pH＝8.8)的Tris-盐酸缓冲溶液与30mL异丙醇的混合液中，在室温下避光反应24h，将产品离心分离并用超纯水洗涤五次，之后将产物分散到5mL超纯水中备用；取1mLPDANS稀释到5mL超纯水中，在搅拌的条件下依次加入500mg柠檬酸三钠、20mL 0.035mol/LAgNO3溶液，通入N2除氧，避光条件下搅拌反应4.5h；反应完成后，将产物离心分离，并用超纯水洗涤三次，最后产物真空干燥；
5)巯基化GQD的制备：分别将13.4mg巯基乙胺、105.8mg EDC加入到20mLGQD溶液中，室温下振荡反应24h，将反应后的溶液透析两天，制得巯基化GQD；
6)将1mL巯基化GQD溶液与1mL浓度为2mg/mLPDANS@Ag溶液混合，室温下震荡12h，离心洗涤，得到PDANS@Ag/GQD；
7)玻碳电极预处理：工作玻碳电极在麂皮上用纳米级氧化铝和去离子水进行打磨抛光；然后用无水乙醇浸泡超声清洗，最后用去离子水超声清洗；
8)在电极表面滴加4ul已配制好的PDANS@Ag/GQD；溶液(10ug/L)，烘干后用PBS缓冲液洗净，继续滴加4ul已配制好的GQDs-TiO2溶液(10ug/L)于电极表面，烘干后即制得电极；
9)清洗烘干电极，室温干燥后在电极表面滴加18μL 0.06M的3-羟基丙酸水溶液，孵育1h形成饱和3-羟基丙酸单层，然后用PBS缓冲液彻底清洗，将修饰有3-羟基丙酸的电极在含有0.04M EDC/0.04M N-羟基琥珀酰亚胺的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐缓冲液中孵育1h，将3-羟基丙酸的末端羧基转化为活性N-羟基琥珀酰亚胺酯；再取6ul12ug/mL的丝素蛋白抗体溶液，滴涂至电极表面，室温下晾干，用PBS缓冲液洗净未固定的抗体，得抗体修饰电极；随后，用1％BSA溶液封闭40min，以封闭电极表面可能存在的非特异性结合位点，取出后用PBS缓冲液洗净，晾干，得丝素蛋白电化学免疫传感器。
实施例4
1)GQD的制备：称取2g柠檬酸置于100mL烧杯中，将烧杯置于200℃鼓风干燥箱中，5min后柠檬酸开始熔解，随后液体的颜色从无色变到浅黄色，30min之后变成橘黄色，表明GQD的生成，之后用100mL、8mg/mL的NaOH溶液调节至中性，制得GQD溶液。
2)纳米TiO2的制备：通过控制氟离子晶面生长的水热法制备纳米TiO2，取25mL无水乙醇，依次加入1mL正丁醇和聚乙二醇、0.38mL氢氟酸、1mL乙二醇和0.58mL去离子水，磁力搅拌15min，配制成溶液A；再取3mL钛酸四丁酯，加入10mL无水乙醇，搅拌15min配成溶液B。将溶液B以4mL/h的注射速度注入溶液A，同时剧烈搅拌溶液A，待注射完毕后继续磁力搅拌3h。将搅拌好的溶液在150℃恒温3.5h，并辅以磁力搅拌，至反应结束。分别用去离子水、正丁醇和无水乙醇离心洗涤，将洗净的TiO2在60℃烘干，研磨1h后在430℃煅烧30min。
3)GQDs-TiO2的制备：取10mLGQD，加入15.8gNaOH，加水定容至40mL，磁力搅拌30min，配制成10mol/L含GQD的NaOH强碱溶液。再取15.1mgTiO2，加入配制好的GQD碱溶液，磁力搅拌30min，140℃下反应8h。待反应结束后，用5％的HCl和去离子水将样品分别离心清洗3次，再用无水乙醇离心清洗样品3次去除表面水分。将样品分散在无水乙醇与正丁醇的混合溶液(体积比3∶1)中，160℃下晶化定型5h。
4)PDANS@Ag的制备：110mg盐酸多巴胺加入到120mL(pH＝8.8)的Tris-盐酸缓冲溶液与30mL异丙醇的混合液中，在室温下避光反应24h，将产品离心分离并用超纯水洗涤五次，之后将产物分散到5mL超纯水中备用；取1mLPDANS稀释到5mL超纯水中，在搅拌的条件下依次加入500mg柠檬酸三钠、20mL 0.035mol/LAgNO3溶液，通入N2除氧，避光条件下搅拌反应4.5h；反应完成后，将产物离心分离，并用超纯水洗涤三次，最后产物真空干燥；
5)巯基化GQD的制备：分别将13.4mg巯基乙胺、105.8mg EDC加入到20mLGQD溶液中，室温下振荡反应24h，将反应后的溶液透析两天，制得巯基化GQD；
6)将1mL巯基化GQD溶液与1mL浓度为2mg/mLPDANS@Ag溶液混合，室温下震荡12h，离心洗涤，得到PDANS@Ag/GQD；
7)玻碳电极预处理：工作玻碳电极在麂皮上用纳米级氧化铝和去离子水进行打磨抛光；然后用无水乙醇浸泡超声清洗，最后用去离子水超声清洗；
8)在电极表面滴加4ul已配制好的PDANS@Ag/GQD；溶液(10ug/L)，烘干后用PBS缓冲液洗净，继续滴加4ul已配制好的GQDs-TiO2溶液(10ug/L)于电极表面，烘干后即制得电极；
9)清洗烘干电极，室温干燥后在电极表面滴加18μL 0.06M的3-羟基丙酸水溶液，孵育1h形成饱和3-羟基丙酸单层，然后用PBS缓冲液彻底清洗，将修饰有3-羟基丙酸的电极在含有0.04M EDC/0.04M N-羟基琥珀酰亚胺的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐缓冲液中孵育1h，将3-羟基丙酸的末端羧基转化为活性N-羟基琥珀酰亚胺酯；再取6ul12ug/mL的丝素蛋白抗体溶液，滴涂至电极表面，室温下晾干，用PBS缓冲液洗净未固定的抗体，得抗体修饰电极；随后，用1.2％BSA溶液封闭40min，以封闭电极表面可能存在的非特异性结合位点，取出后用PBS缓冲液洗净，晾干，得丝素蛋白电化学免疫传感器。
本发明中所用原料、设备，若无特别说明，均为本领域的常用原料、设备；本发明中所用方法，若无特别说明，均为本领域的常规方法。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制，凡是根据本发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效变换，均仍属于本发明技术方案的保护范围。
Claims (7)
1.一种基于石墨烯量子点修饰聚多巴胺@纳米二氧化钛的电化学传感器的制备方法，其特征在于，以mg，g和mL计，包括以下步骤：
1)GQD的制备：称取1.5-2.5g柠檬酸置于容器中，将容器置于190-210℃温度下使柠檬酸开始熔解，随后液体的颜色从无色变到浅黄色，最终变成橘黄色，表明GQD的生成，之后用90-110mL、8～12mg/mL的NaOH溶液调节至中性，制得GQD溶液；
2)纳米TiO2的制备：取20-30ml无水乙醇，依次加入0.8-1.2ml正丁醇、0.8-1.2ml聚乙二醇、0.35-0.40ml氢氟酸、0.8-1.2ml乙二醇和0.5-0.6ml去离子水，搅拌10～20min，配制成溶液A；再取2.5-3.5ml钛酸四丁酯，加入8-12ml无水乙醇，搅拌10～20min配成溶液B；将溶液B以3.5-4.5ml/h的注射速度注入溶液A，同时剧烈搅拌溶液A，待注射完毕后继续搅拌2～4h；将搅拌好的溶液在140-160℃下并辅搅拌3～4h，至反应结束，分别用去离子水、正丁醇和无水乙醇离心洗涤，将洗净所得的产物烘干，研磨后煅烧，得到纳米TiO2；
3)GQDs-TiO2的制备：取8-12mLGQD，加入15.5-16.0gNaOH，加水定容至35-45mL，搅拌25-35min，配制成8-12mol/L含GQD的NaOH溶液；再取15-15.2mgTiO2，加入含GQD的NaOH溶液，搅拌25-35min，130-150℃下反应6-10h，待反应结束后，用4-6wt％的HCl溶液和去离子水分别离心清洗，再用无水乙醇离心清洗去除表面水分，将所得产物分散在体积比为2.5-3.5∶1的无水乙醇与正丁醇的混合溶液中，150-170℃下晶化定型，得到GQDs-TiO2；
4)PDANS@Ag的制备：将80～120mg盐酸多巴胺加入到80～120mL的Tris-盐酸缓冲溶液与30～70mL异丙醇的混合液中，在室温下避光反应20-30h，离心分离并用水洗涤数次，之后将产物分散到4-6mL超纯水中，得到PDANS分散液；取0.8-1.2mLPDANS分散液稀释到4-6mL超纯水中，在搅拌条件下依次加入500～700mg柠檬酸三钠、18-22mL 0.015～0.035mol/LAgNO3溶液，通入N2除氧，避光条件下搅拌反应2.5～4.5h；反应完成后，将产物离心分离，并用超纯水洗涤数次，真空干燥，得到PDANS@Ag；
5)巯基化GQD的制备：分别将13.4～17.4mg巯基乙胺、85.8～105.8mgEDC加入到20mL步骤1)所得GQD溶液中，室温下振荡反应20-30h，将反应后的溶液透析1-3天，制得巯基化GQD溶液；
6)将1～3mL巯基化GQD溶液与1～3mL浓度为1.8-2.2mg/mL PDANS@Ag溶液混合，室温下震荡10-14h，离心洗涤，得到PDANS@Ag/GQD；
7)玻碳电极预处理：工作玻碳电极在麂皮上用纳米级氧化铝和去离子水进行打磨抛光；然后用无水乙醇浸泡超声清洗，最后用去离子水超声清洗；
8)在电极表面滴加2-4ul已配制好8-12ug/L的PDANS@Ag/GQD溶液，烘干后用PBS缓冲液洗净，继续滴加2-4ul已配制好8-12ug/L的GQDs-TiO2溶液于电极表面，烘干后即制得电极；
9)清洗烘干电极，向干燥后在电极表面滴加18-22μL 0.04-0.06M的3-羟基丙酸水溶液，孵育0.5-1.5h形成饱和3-羟基丙酸单层，然后用PBS缓冲液彻底清洗，将修饰有3-羟基丙酸的电极在含有0.04-0.06M EDC/0.02-0.04M N-羟基琥珀酰亚胺的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐缓冲液中孵育0.5-1.5h，将3-羟基丙酸的末端羧基转化为活性N-羟基琥珀酰亚胺酯；再取4-6ul 8-12ug/mL的丝素蛋白抗体溶液，滴涂至电极表面，室温下晾干，用PBS缓冲液洗净未固定的抗体，得抗体修饰电极；随后，用BSA溶液封闭20-40min，以封闭电极表面可能存在的非特异性结合位点，取出后用PBS缓冲液洗净，晾干，得到基于石墨烯量子点修饰聚多巴胺@纳米二氧化钛的电化学传感器。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤2)中，将洗净所得的产物在55-65℃下烘干，研磨1～2h后在420-440℃煅烧20-40min，得到纳米二氧化钛。
3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤3)中，晶化定性的时间为3-5h。
4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤4)中，所述Tris-盐酸缓冲溶液的pH＝8.6-9.0。
5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤6)中，离心转速为10000-14000rpm。
6.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤7)中，用无水乙醇浸泡超声清洗8-12min；用去离子水超声清洗8-12min。
7.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤9)中，所述BSA溶液的浓度为0.8-1.2wt％。
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| CN110927238A (zh) * | 2019-12-12 | 2020-03-27 | 山东理工大学 | 一种检测前列腺特异性抗原的夹心型光电化学传感器的制备方法及应用 |
| CN110927238B (zh) * | 2019-12-12 | 2022-10-11 | 山东理工大学 | 一种检测前列腺特异性抗原的夹心型光电化学传感器的制备方法及应用 |
| CN112415070A (zh) * | 2020-10-27 | 2021-02-26 | 浙江理工大学 | 一种用于丝素蛋白检测的免疫传感器修饰电极的制备方法 |
| CN112415070B (zh) * | 2020-10-27 | 2022-12-06 | 浙江理工大学 | 一种用于丝素蛋白检测的免疫传感器修饰电极的制备方法 |
| CN113262645A (zh) * | 2021-05-14 | 2021-08-17 | 江南大学 | 一种自清洁复合超滤膜及其制备方法 |
| CN113552193A (zh) * | 2021-07-19 | 2021-10-26 | 浙江理工大学 | 一种基于石墨烯纳米ZnOAuNPs的电化学传感器的制备方法 |
| CN113552193B (zh) * | 2021-07-19 | 2024-01-30 | 浙江理工大学 | 一种基于石墨烯纳米ZnOAuNPs的电化学传感器的制备方法 |
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