CN110554008B - 一种丝素蛋白光电免疫传感器的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及文物保护技术领域，公开了一种丝素蛋白光电免疫传感器的制备方法，包括聚多巴胺的制备；纳米二氧化钛的制备；玻碳电极预处理；聚多巴胺/二氧化钛GCE电极的制备；丝素蛋白光电免疫传感器的制备；本发明以聚多巴胺/二氧化钛复合材料作为光电免疫传感器的敏感材料，该材料在405nm LED光源激发下，具有强而稳定的光电流，能够实现对丝素蛋白的高灵敏检测。本发明将纳米二氧化钛引入光电化学传感体系，该颗粒生物相容性好、具有较强稳定性。本发明的光电免疫传感器测定丝素蛋白的操作过程简便，不需要特殊实验条件，仪器要求简单，在文物鉴定领域具有较好的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及文物保护技术领域，尤其涉及一种丝素蛋白光电免疫传感器的制备方法。
背景技术
中国是世界上最早产生纺织品的国家之一。早在原始社会，人们就掌握了简单的纺织技术，通过搓、编、织将野生的麻等做成衣服以取代防寒保暖、遮羞蔽体的动物毛皮。随着农业、桑蚕业和畜牧业的发展，形成了以麻、丝、毛的为主要纺织原材料的中国古代纺织品体系。在漫长的历史长河中，纺织品文物见证了我国社会更替、经济发展和文化交融，是研究我国古代社会经济技术文化水平的珍贵史料。目前出土的纺织品中，蛋白类纺织品占多数。该类纺织品易受到墓葬环境中水分、温度、酸碱度及微生物等影响而发生老化分解，从而引起大分子链的断裂，肽段的降解，出土时已成为碎片、微痕迹。因此，针对文物的鉴定，建立科学有效而又灵敏的检测方法十分的必要，而光电化学免疫传感灵敏度较高，并且检测限可以进一步降低。此外，由于利用电信号响应，同传统的免疫相比，PEC检测仪器备简易，价格低廉且易于微型化等优点。光电化学免疫传感器在文物检测领域具有强大的应用前景。
光电化学免疫分析的基本方法原理是，在光照条件下，将免疫反应转变为光电活性物质的光电信号，从而实现对待测物的定性与定量检测。其中光电活性物质与增强光电流是光电化学免疫传感器的关键。纳米级的TiO2具有传导速率高，生物相容性好的特点。如何将其更好地应用于文物保护领域，是一道难题。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种丝素蛋白光电免疫传感器的制备方法。
本发明的具体技术方案为：一种丝素蛋白光电免疫传感器的制备方法，以mg和mL计，包括以下步骤：
1)聚多巴胺的制备：向容器中加入8～10ml无水乙醇和18～20ml去离子水，随后加入500-700ul浓氨水(0.898g/ml～0.907g/ml)；将所得混合溶液搅拌20-40min后，缓慢加入45-55mg/ml的1.5-2.5ml多巴胺溶液；在常温下搅拌反应，将所得溶液离心后，取固体即为聚多巴胺。
2)纳米二氧化钛的制备：取20-30ml无水乙醇，依次加入0.8-1.2ml正丁醇、0.8-1.2ml聚乙二醇、0.35-0.40ml氢氟酸、0.8-1.2ml乙二醇和0.4-0.6ml去离子水，搅拌15～20min，配制成溶液A；再取2.5-3.5ml钛酸四丁酯，加入8-12ml无水乙醇，搅拌15～20min配成溶液B；将溶液B以3.5-4.5ml/h的注射速度注入溶液A，同时剧烈搅拌溶液A，待注射完毕后继续搅拌3～5h；将搅拌好的溶液在140-160℃下并辅搅拌3.5～4h，至反应结束，分别用去离子水、正丁醇和无水乙醇离心洗涤，将洗净所得的产物烘干，研磨后煅烧，得到纳米二氧化钛。
3)玻碳电极预处理：工作玻碳电极在麂皮上用纳米级氧化铝和去离子水进行打磨抛光；然后用无水乙醇浸泡超声清洗，最后用去离子水超声清洗。
4)面滴加2-4ul已配置好的聚多巴胺溶液(10ug/L)，烘干后用PBS缓冲液洗净，继续滴加2-4ul已配置好的纳米二氧化钛溶液(10ug/L)于电极表面，烘干后即制得聚多巴胺/二氧化钛/GCE电极；
5)清洗烘干电极，滴加8-12ul的0.04-0.06M 3-羟基丙酸水溶液，并于35-39℃下烘干反应0.5-1.5h；将修饰有3-羟基丙酸的电极在含有0.04-0.06M EDC/0.02-0.04M NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐缓冲液中孵育0.5-1.5h，将3-羟基丙酸的末端羧基转化为活性NHS酯；再取4-6ul 8-12ug/mL的量子点标记的丝素蛋白抗体溶液，滴涂至电极表面，室温下晾干，用PBS缓冲液洗净未固定的抗体，得抗体/聚多巴胺/二氧化钛/GCE修饰电极；随后，用BSA溶液封闭20-40min，以封闭电极表面可能存在的非特异性结合位点，取出后用PBS缓冲液洗净，晾干，得丝素蛋白光电免疫传感器。
作为优选，步骤1)中，加入多巴胺溶液后的搅拌时间为25-35h，搅拌时避光，离心条件为9000-11000rpm，4-6min。
作为优选，步骤2)中，将洗净所得的产物在55-65℃下烘干，研磨1～2h后在420-440℃煅烧20-40min，得到纳米二氧化钛。
作为优选，步骤3)中，用无水乙醇浸泡超声清洗8-12min；最后用去离子水超声清洗8-12min。
作为优选，步骤4)中，在室温下烘干。
作为优选，步骤4)至步骤6)中，所述PBS缓冲液的pH＝7.4。
作为优选，步骤5)中，所述BSA溶液的浓度为0.8-1.2wt％。
与现有技术对比，本发明的有益效果是：
在步骤4)中，本发明分两次将聚多巴胺和纳米二氧化钛附着于电极表面上，能极大增强电化学信号的传导。
在步骤5)中，本发明将3-羟基丙酸的末端羧基转化为活性NHS酯，可以通过转化基团来实现与抗体的结合，更将量子点标记的抗体引入体系。
本发明以聚多巴胺/二氧化钛复合材料作为光电免疫传感器的敏感材料，该材料在405nm LED光源激发下，具有强而稳定的光电流，能够实现对丝素蛋白的高灵敏检测。
本发明将纳米二氧化钛引入光电化学传感体系，该颗粒生物相容性好、具有较强稳定性。
本发明的光电免疫传感器测定丝素蛋白的操作过程简便，不需要特殊实验条件，仪器要求简单，在文物鉴定领域具有较好的应用前景。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的描述。
实施例1
1)聚多巴胺的制备：往洁净的烧杯中加入8ml无水乙醇和18ml去离子水，随后加入600ul浓氨水(0.898g/ml)；将所得的混合溶液在磁力搅拌器上搅拌30min后，缓慢加入2ml多巴胺溶液(50mg/ml)；随后，在常温下磁力搅拌反应30h。将所得溶液于10000～12000rpm下离心5min后，离心所得固体为聚多巴胺。
2)纳米二氧化钛的制备：取25ml无水乙醇，依次加入1ml正丁醇、1ml聚乙二醇、0.38ml氢氟酸、1ml乙二醇和0.5ml去离子水，磁力搅拌15min，配制成溶液A；再取3ml钛酸四丁酯，加入10ml无水乙醇，搅拌15min配成溶液B。将溶液B以4ml/h的注射速度注入溶液A，同时剧烈搅拌溶液A，待注射完毕后继续磁力搅拌3h。将搅拌好的溶液在150℃恒温3.5h，并辅以磁力搅拌，至反应结束。分别用去离子水、正丁醇和无水乙醇离心洗涤，将洗净的TiO2在60℃烘干，研磨1～h后在430℃煅烧30min。
3)玻碳电极预处理：工作玻碳电极在麂皮上进行打磨抛光，此时所用的为纳米级氧化铝和去离子水。接下来，用无水乙醇浸泡进行超声清洗10min；再用去离子水进行超声清洗10min。
4)采用滴涂法+滴涂法的方法，用移液枪在电极表面滴加3ul的聚多巴胺溶液(10ug/L)，在室温下烘干，用0.01mol·L-1PBS缓冲液(pH＝7.4)洗净，继续滴加3ul的纳米二氧化钛溶液(10ug/L)在电极表面，在室温下烘干，即制得聚多巴胺/二氧化钛GCE电极。
5)清洗烘干电极，滴加8-12ul的0.04-0.06M 3-羟基丙酸水溶液，并于35-39℃下烘干反应0.5-1.5h；将修饰有3-羟基丙酸的电极在含有0.04-0.06M EDC/0.02-0.04M NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐缓冲液中孵育0.5-1.5h，将3-羟基丙酸的末端羧基转化为活性NHS酯；再取4-6ul 8-12ug/mL的量子点标记的丝素蛋白抗体溶液，滴涂至电极表面，室温下晾干，用PBS缓冲液洗净未固定的抗体，得抗体/聚多巴胺/二氧化钛/GCE修饰电极；随后，用BSA溶液封闭20-40min，以封闭电极表面可能存在的非特异性结合位点，取出后用PBS缓冲液洗净，晾干，得丝素蛋白光电免疫传感器。
实施例2
1)聚多巴胺的制备：往洁净的烧杯中加入9ml无水乙醇和18ml去离子水，随后加入600ul浓氨水(0.898g/ml)；将所得的混合溶液在磁力搅拌器上搅拌30min后，缓慢加入2ml多巴胺溶液(50mg/ml)；随后，在常温下磁力搅拌反应30h。将所得溶液于10000～12000rpm下离心5min后，离心所得固体为聚多巴胺。
2)纳米二氧化钛的制备：取25ml无水乙醇，依次加入1ml正丁醇、1ml聚乙二醇、0.38ml氢氟酸、1ml乙二醇和0.5ml去离子水，磁力搅拌15min，配制成溶液A；再取3ml钛酸四丁酯，加入10ml无水乙醇，搅拌15min配成溶液B。将溶液B以4ml/h的注射速度注入溶液A，同时剧烈搅拌溶液A，待注射完毕后继续磁力搅拌3h。将搅拌好的溶液在150℃恒温3.5h，并辅以磁力搅拌，至反应结束。分别用去离子水、正丁醇和无水乙醇离心洗涤，将洗净的TiO2在60℃烘干，研磨1～h后在430℃煅烧30min。
3)玻碳电极预处理：工作玻碳电极在麂皮上进行打磨抛光，此时所用的为纳米级氧化铝和去离子水。接下来，用无水乙醇浸泡进行超声清洗10min；再用去离子水进行超声清洗10min。
4)采用滴涂法+滴涂法的方法，用移液枪在电极表面滴加3ul的聚多巴胺溶液(10ug/L)，在室温下烘干，用0.01mol·L-1PBS缓冲液(pH＝7.4)洗净，继续滴加3ul的纳米二氧化钛溶液(10ug/L)在电极表面，在室温下烘干，即制得聚多巴胺/二氧化钛GCE电极。
5)清洗烘干电极，滴加8-12ul的0.04-0.06M 3-羟基丙酸水溶液，并于35-39℃下烘干反应0.5-1.5h；将修饰有3-羟基丙酸的电极在含有0.04-0.06M EDC/0.02-0.04M NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐缓冲液中孵育0.5-1.5h，将3-羟基丙酸的末端羧基转化为活性NHS酯；再取4-6ul 8-12ug/mL的量子点标记的丝素蛋白抗体溶液，滴涂至电极表面，室温下晾干，用PBS缓冲液洗净未固定的抗体，得抗体/聚多巴胺/二氧化钛/GCE修饰电极；随后，用BSA溶液封闭20-40min，以封闭电极表面可能存在的非特异性结合位点，取出后用PBS缓冲液洗净，晾干，得丝素蛋白光电免疫传感器。
实施例3
1)聚多巴胺的制备：往洁净的烧杯中加入8.5ml无水乙醇和19ml去离子水，随后加入600ul浓氨水(0.898g/ml)；将所得的混合溶液在磁力搅拌器上搅拌30min后，缓慢加入2ml多巴胺溶液(50mg/ml)；随后，在常温下磁力搅拌反应30h。将所得溶液于10000～12000rpm下离心5min后，离心所得固体为聚多巴胺。
2)纳米二氧化钛的制备：取25ml无水乙醇，依次加入1ml正丁醇、1ml聚乙二醇、0.38ml氢氟酸、1ml乙二醇和0.5ml去离子水，磁力搅拌15min，配制成溶液A；再取3ml钛酸四丁酯，加入10ml无水乙醇，搅拌15min配成溶液B。将溶液B以4ml/h的注射速度注入溶液A，同时剧烈搅拌溶液A，待注射完毕后继续磁力搅拌3h。将搅拌好的溶液在150℃恒温3.5h，并辅以磁力搅拌，至反应结束。分别用去离子水、正丁醇和无水乙醇离心洗涤，将洗净的TiO2在60℃烘干，研磨1～h后在430℃煅烧30min。
3)玻碳电极预处理：工作玻碳电极在麂皮上进行打磨抛光，此时所用的为纳米级氧化铝和去离子水。接下来，用无水乙醇浸泡进行超声清洗10min；再用去离子水进行超声清洗10min。
4)采用滴涂法+滴涂法的方法，用移液枪在电极表面滴加3ul的聚多巴胺溶液(10ug/L)，在室温下烘干，用0.01mol·L-1PBS缓冲液(pH＝7.4)洗净，继续滴加3ul的纳米二氧化钛溶液(10ug/L)在电极表面，在室温下烘干，即制得聚多巴胺/二氧化钛GCE电极。
5)清洗烘干电极，滴加8-12ul的0.04-0.06M 3-羟基丙酸水溶液，并于35-39℃下烘干反应0.5-1.5h；将修饰有3-羟基丙酸的电极在含有0.04-0.06M EDC/0.02-0.04M NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐缓冲液中孵育0.5-1.5h，将3-羟基丙酸的末端羧基转化为活性NHS酯；再取4-6uL 8-12ug/mL的量子点标记的丝素蛋白抗体溶液，滴涂至电极表面，室温下晾干，用PBS缓冲液洗净未固定的抗体，得抗体/聚多巴胺/二氧化钛/GCE修饰电极；随后，用BSA溶液封闭20-40min，以封闭电极表面可能存在的非特异性结合位点，取出后用PBS缓冲液洗净，晾干，得丝素蛋白光电免疫传感器。
实施例4
1)聚多巴胺的制备：往洁净的烧杯中加入8ml无水乙醇和20ml去离子水，随后加入600ul浓氨水(0.898g/ml)；将所得的混合溶液在磁力搅拌器上搅拌30min后，缓慢加入2ml多巴胺溶液(50mg/ml)；随后，在常温下磁力搅拌反应30h。将所得溶液于10000～12000rpm下离心5min后，离心所得固体为聚多巴胺。
2)纳米二氧化钛的制备：取25ml无水乙醇，依次加入1ml正丁醇、1ml聚乙二醇、0.38ml氢氟酸、1ml乙二醇和0.5ml去离子水，磁力搅拌15min，配制成溶液A；再取3ml钛酸四丁酯，加入10ml无水乙醇，搅拌15min配成溶液B。将溶液B以4ml/h的注射速度注入溶液A，同时剧烈搅拌溶液A，待注射完毕后继续磁力搅拌3h。将搅拌好的溶液在150℃恒温3.5h，并辅以磁力搅拌，至反应结束。分别用去离子水、正丁醇和无水乙醇离心洗涤，将洗净的TiO2在60℃烘干，研磨1～h后在430℃煅烧30min。
3)玻碳电极预处理：工作玻碳电极在麂皮上进行打磨抛光，此时所用的为纳米级氧化铝和去离子水。接下来，用无水乙醇浸泡进行超声清洗10min；再用去离子水进行超声清洗10min。
4)采用滴涂法+滴涂法的方法，用移液枪在电极表面滴加3ul的聚多巴胺溶液(10ug/L)，在室温下烘干，用0.01mol.L-1PBS缓冲液(pH＝7.4)洗净，继续滴加3ul的纳米二氧化钛溶液(10ug/L)在电极表面，在室温下烘干，即制得聚多巴胺/二氧化钛GCE电极。
5)清洗烘干电极，滴加8-12ul的0.04-0.06M 3-羟基丙酸水溶液，并于35-39℃下烘干反应0.5-1.5h；将修饰有3-羟基丙酸的电极在含有0.04-0.06M EDC/0.02-0.04M NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐缓冲液中孵育0.5-1.5h，将3-羟基丙酸的末端羧基转化为活性NHS酯；再取4-6ul 8-12ug/mL的量子点标记的丝素蛋白抗体溶液，滴涂至电极表面，室温下晾干，用PBS缓冲液洗净未固定的抗体，得抗体/聚多巴胺/二氧化钛/GCE修饰电极；随后，用BSA溶液封闭20-40min，以封闭电极表面可能存在的非特异性结合位点，取出后用PBS缓冲液洗净，晾干，得丝素蛋白光电免疫传感器。
本发明中所用原料、设备，若无特别说明，均为本领域的常用原料、设备；本发明中所用方法，若无特别说明，均为本领域的常规方法。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制，凡是根据本发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效变换，均仍属于本发明技术方案的保护范围。
Claims (7)
1.一种丝素蛋白光电免疫传感器的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
1）聚多巴胺的制备：向容器中加入8~10ml无水乙醇和18~20ml去离子水，随后加入500-700ul浓度为0.898g/ml~0.907g/ml的浓氨水；将所得混合溶液搅拌20-40min后，缓慢加入45-55mg/ml 的1.5-2.5ml多巴胺溶液；在常温下搅拌反应，将所得溶液离心后，取固体即为聚多巴胺；
2）纳米二氧化钛的制备：取20-30ml无水乙醇，依次加入0.8-1.2ml正丁醇、0.8-1.2ml聚乙二醇、0.35-0.40ml氢氟酸、0.8-1.2ml乙二醇和0.4-0.6ml去离子水，搅拌15~20min，配制成溶液A；再取2.5-3.5ml钛酸四丁酯，加入8-12ml无水乙醇，搅拌15~20min配成溶液B；将溶液B以3.5-4.5ml/h的注射速度注入溶液A，同时剧烈搅拌溶液A，待注射完毕后继续搅拌3~5h；将搅拌好的溶液在140-160℃下并辅搅拌3.5~4h，至反应结束，分别用去离子水、正丁醇和无水乙醇离心洗涤，将洗净所得的产物烘干，研磨后煅烧，得到纳米二氧化钛；
3）玻碳电极预处理：工作玻碳电极在麂皮上用纳米级氧化铝和去离子水进行打磨抛光；然后用无水乙醇浸泡超声清洗，最后用去离子水超声清洗；
4）在电极表面滴加2-4ul浓度为8-12ug/L的聚多巴胺溶液，烘干后用PBS缓冲液洗净，继续滴加2-4ul浓度为8-12ug/L的纳米二氧化钛溶液于电极表面，烘干后即制得聚多巴胺/二氧化钛/GCE电极；
5）清洗烘干电极，滴加8-12ul的 0.04-0.06M 3-羟基丙酸水溶液，并于35-39℃下烘干反应0.5-1.5h；将修饰有3-羟基丙酸的电极在含有0.04-0.06M EDC和0.02-0.04M NHS的1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐缓冲液中孵育0.5-1.5h，将3-羟基丙酸的末端羧基转化为活性NHS酯；再取4-6ul 8-12ug/mL的量子点标记的丝素蛋白抗体溶液，滴涂至电极表面，室温下晾干，用PBS缓冲液洗净未固定的抗体，得抗体/聚多巴胺/二氧化钛/GCE修饰电极；随后，用BSA溶液封闭20-40min，以封闭电极表面可能存在的非特异性结合位点，取出后用PBS缓冲液洗净，晾干，得丝素蛋白光电免疫传感器。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤1）中，加入多巴胺溶液后的搅拌时间为25-35h，搅拌时避光，离心条件为9000-11000rpm，4-6min。
3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤2）中，将洗净所得的产物在55-65℃下烘干，研磨1~2h后在420-440℃煅烧20-40min，得到纳米二氧化钛。
4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤3）中，用无水乙醇浸泡超声清洗8-12min；最后用去离子水超声清洗8-12min。
5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤4）中，在室温下烘干。
6.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤4）至步骤5）中，所述PBS缓冲液的pH＝7.4。
7.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤5）中，所述BSA溶液的浓度为0.8-1.2wt%。
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