CN107217050A - 一种石墨相氮化碳纳米片表面固定化酶的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种石墨相氮化碳纳米片表面固定化酶的制备方法,属于固定化酶制备技术领域。石墨相氮化碳纳米片表面具有氨基活性基团,本发明利用双功能化学交联剂实现了石墨相氮化碳纳米片对生物酶分子的固定,提高了酶的操作稳定性与底物环境相容性,为固定化酶的催化提供了有利的催化界面环境,提高了酶的催化效率。本发明首次以石墨相氮化碳纳米片作为固定化酶载体材料,采用戊二醛通过化学交联反应固定酶,最大限度的保留酶的原有形貌及活性,材料成本低,制备简单,易于产业化。
Description
技术领域
本发明属于固定化酶制备技术领域,具体涉及一种石墨相氮化碳纳米片表面固定化酶的制备方法。
背景技术
酶作为具有特殊催化功能的生物催化剂,由于其催化高效性、高专一性及反应条件温和等性质被广泛用于生物工程、食品工业、医药、精细化学工业等领域。游离酶在水溶液中催化活性很不稳定,重复使用性差,同时在高温、高离子浓度、强酸、强碱及部分有机溶剂等环境中不够稳定,容易降低甚至丧失其催化能力。另外,酶促反应结束后游离酶不易从反应体系中分离,产物中会残留部分酶,导致产品纯度不高甚至酶回收重复使用性变差。游离酶的这些不足极大制约了其在实际生产中的应用。
为了解决酶循环使用的问题,人们多采用将酶固定于载体材料。目前用于固定酶的方法主要有物理法(吸附和包埋)和化学法(交联和共价结合)。物理法主要是通过氢键、静电吸附、范德华力等微弱的分子间作用力将酶吸附到载体表面实现酶的固定化,操作简单且成本低,易于产业化生产,是目前使用较多的一种固定酶方法。但物理法中酶与载体材料之间的吸附力强度较弱,酶易从载体材料上脱落,进而影响固定化酶的催化活性以及循环使用效果。化学法主要是通过载体的活性官能团与酶分子中的部分官能团形成共价键,由于这种共价结合力度强并且具有特异性固定的特征,从而大大提高了酶的稳定性。
针对载体材料固定酶的专利及文献,其载体材料主要是采用无机材料(如介孔碳材料、TiO2、介孔二氧化硅及硅胶等)和聚合物材料(如多糖、苯乙烯树脂、聚羟基丁酸戊酯等)来固定酶。中国专利CN201210421203.9公开了一种聚合物基材表面固定化酶的方法,在聚合物表面吸附光引发剂或共价连接光感应休眠基团,在可见光或紫外光照射下,光引发剂或休眠基团产生自由基,引发含有游离酶的单体溶液进行可控交联聚合反应,最终将酶固定在表面交联网络中。酶的固定化在可见光、低温或室温下进行,反应条件温和,有利于酶活性的保持。凝胶/基材复合结构提高了交联网络的机械强度,克服了凝胶网络易被破坏的缺点。中国专利CN201010190239.1公开了一种聚氨酯纳米纤维固定化酶的制备方法,以聚氨酯为原料,通过静电纺丝制备出聚氨酯纳米纤维,通过物理吸附的方法将惰性蛋白质吸附在纤维表面,获得表面改性的聚氨酯纳米纤维,利用戊二醛作为交联剂,通过共价键结合的方法将酶固定化在表面改性的纳米纤维上。该发明制备的固定化酶具有在有机溶剂中失活或者在高温下失活后,重新放置于缓冲溶液中能够逐步恢复大部分活性的特性,从而使其在有机溶剂中或者高温条件下具有更好的稳定性和更长的使用寿命。中国专利CN201410114538.5公开了一种磁驱固定化酶,利用硅基化外壳包埋铁粒子,目标酶通过基团化试剂引入的官能化基团固定化在硅基材料的外壳上,延长酶使用时间,赋予固定化酶磁释放、驱动和回收能力,可以在大水体催化反应中得到应用。但是这些载体材料制备过程复杂,原料昂贵,不利于产业化。
近些年来,石墨相氮化碳材料,因其具有独特的电子结构和优异的化学稳定性,在能源转化和材料相关领域受到了广泛关注。作为催化剂和催化剂载体,石墨相氮化碳材料在有机官能团的选择性转换、太阳能转化利用、燃料电池阴极氧还原反应等不同研究领域得到了广泛地应用。该材料可以由尿素、三聚氰胺、二氰二胺等廉价易得的原材料,通过简单高温煅烧法批量制备,具有大规模生产及商业化的潜力。文献报道了利用空气中的氧气将石墨相氮化碳中层与层之间的结构部分氧化,刻蚀,得到石墨相氮化碳纳米片(P.Niu,L.L.Zhang,et al.Advanced Functional Materials 2012,22,(22),4763)。这种制备方法操作简单,可实现石墨相氮化碳纳米片的生产。目前还未有利用氮化碳纳米片为载体材料的固定化酶相关的文献和专利。
发明内容
本发明的目的在于解决现有固定化酶所用载体材料制备过程复杂、原料成本高等问题,提供一种石墨相氮化碳纳米片作为固定化酶载体材料在制备固定化酶中的应用。本发明的目的还在于提供一种石墨相氮化碳纳米片表面固定化酶的制备方法。
本发明的目的通过下述技术方案实现:
石墨相氮化碳纳米片表面具有氨基活性基团,本发明利用双功能化学交联剂实现了石墨相氮化碳纳米片对生物酶分子的固定,提高了酶的操作稳定性与底物环境相容性,为固定化酶的催化提供了有利的催化界面环境,提高了酶的催化效率。因此,石墨相氮化碳纳米片可作为固定化酶载体材料用于制备固定化酶。
一种石墨相氮化碳纳米片表面固定化酶的制备方法,包括以下步骤:
(1)交联剂活化石墨相氮化碳纳米片材料:将石墨相氮化碳纳米片分散于含双功能交联剂的磷酸缓冲液(0.1M,pH 7.0)中进行活化,活化后再通过洗涤除去未反应的游离的交联剂。
(2)石墨相氮化碳纳米片表面固定化酶的制备:将目标酶溶解于磷酸缓冲液(0.1M,pH 7.0)中,冷冻离心收集上层酶溶液,除去未完全溶解的酶。将上述活化后的石墨相氮化碳纳米片与目标酶溶液混合,震荡反应使目标酶固定在石墨相氮化碳纳米片上,反应结束后洗涤、冷冻离心,得到石墨相氮化碳纳米片表面固定化酶。
所述的石墨相氮化碳纳米片优选通过包括以下步骤的方法制备得到:将氮化碳前驱体于550~600℃煅烧2~4小时,得到石墨相块状氮化碳,将其研磨成粉末状再于500~550℃煅烧2小时,得到石墨相氮化碳纳米片。所述的氮化碳前驱体包括但不限于二腈二氨(DCDA)。
步骤(1)中,所述的双功能交联剂优选为戊二醛,磷酸缓冲液中戊二醛的质量百分含量优选为6~10%,石墨相氮化碳纳米片在磷酸缓冲液中的浓度优选25~35mg/mL;所述的活化的条件优选为50~70℃下振荡10~16小时。
步骤(2)中,所述的目标酶包括但不限于皱褶假丝酵母脂肪酶、柱状假丝酵母脂肪酶;所述的震荡反应的条件优选为30~37℃下振荡10~16小时;石墨相氮化碳纳米片与目标酶的质量比优选为1:0.2~4。
本发明具有以下优点和有益效果:
(1)石墨相氮化碳纳米片作为固定化酶载体,比表面积大,与酶结合率高且能够将酶牢固的固定在载体表面,提高了酶的操作稳定性。
(2)石墨相氮化碳纳米片表面含有氨基可采用交联剂戊二醛通过化学交联反应固定酶,提高了固定化过程的特异性,增强了载体材料与酶之间的稳定性。
(3)本发明首次以石墨相氮化碳纳米片作为固定化酶载体材料,采用戊二醛固定酶,最大限度的保留酶的原有形貌及活性,材料成本低,制备简单,易于产业化。
附图说明
图1是石墨相氮化碳纳米片固定化CRL酶和游离CRL酶的相对酶活与反应pH关系曲线图。
图2是石墨相氮化碳纳米片固定化CRL酶和游离CRL酶的相对酶活与反应温度关系曲线图。
图3是石墨相氮化碳纳米片固定化CRL酶和游离CRL酶的热稳定性图。
图4是石墨相氮化碳纳米片固定化CRL酶的重复使用性曲线图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步详细的描述,但本发明不仅仅局限于以下实施例。
实施例1
(1)石墨相氮化碳纳米片材料的制备:称取6g二腈二氨(DCDA)于50mL氧化铝坩埚中。将坩埚置于管式炉中,按照2.3℃/min的速度,升温到550℃,在该温度下继续煅烧4小时,反应停止并自然冷却到室温,氧化铝坩埚中的黄色块状固体即为石墨相块状氮化碳。取出黄色块状固体于玛瑙研钵中研磨成粉末。称取该黄色粉末3g于50mL瓷坩埚中。将坩埚置于管式炉中,按照5℃/min的速度,升温到500℃,在该温度下继续煅烧2小时,反应停止并自然冷却到室温,坩埚中的浅黄色粉末即为石墨相氮化碳纳米片材料。
(2)戊二醛活化石墨相氮化碳纳米片材料:称取1.2g石墨相氮化碳纳米片,超声分散于38.76mL质量百分含量为6%的戊二醛磷酸缓冲液(0.1M,pH 7.0)中,在65℃下振荡12小时进行活化,活化后的石墨相氮化碳纳米片用超纯水洗涤并真空抽滤收集。
(3)石墨相氮化碳纳米片表面固定化CRL酶(C3N4-NS@CRL)的制备:称取3.6g皱褶假丝酵母脂肪酶(CRL)溶解于240mL 0.1M、pH 7.0的磷酸缓冲液中,冷冻离心收集上层酶溶液。将上述活化后的石墨相氮化碳纳米片与CRL酶溶液混合,37℃下振荡反应12小时;反应结束后用磷酸缓冲液(0.1M,pH 7.0)洗涤,固定化CRL酶采用高速冷冻离心收集,并保存在4℃冰箱中。
测定所获得的固定化CRL酶(C3N4-NS@CRL)及游离CRL酶的在不同pH、温度下的催化活性。酶催化活力是通过p-NPP显色法测定。固定化CRL酶和游离CRL酶在不同pH下的催化活性测定结果如图1所示:相对于游离CRL酶,固定化CRL酶(C3N4-NS@CRL)催化最佳pH向碱性环境偏移,并且固定化CRL酶可以在更宽的pH范围内保持较高的催化活性。固定化CRL酶和游离CRL酶在不同温度下的催化活性测定结果如图2所示:固定化CRL酶(C3N4-NS@CRL)在40~80℃下的催化活性均高于游离CRL酶,说明固定化CRL酶(C3N4-NS@CRL)耐高温能力得到提高。
测定固定化CRL酶和游离CRL酶的热稳定性,结果如图3所示:在50℃下,随反应时间的延长,反应时间为90min时,游离CRL酶的相对活性(此条件下的酶活性与初始酶活性的百分比)为20%,C3N4-NS@CRL固定化酶的相对活性为64%;此外,当反应时间延长到180min时,C3N4-NS@CRL固定化酶的相对活性仍能保持在60%。这说明酶固定在本发明的石墨相氮化碳纳米片载体材料上,其热稳定性有大幅度提高。
测定固定化CRL酶重复使用率,测定结果如图4所示:25mg C3N4-NS@CRL固定化酶在1mL磷酸盐缓冲溶液(0.1M,pH 7.0)和1mL0.5%p-NPP乙醇溶液组成的混合溶液中,37℃反应5分钟条件下重复使用10次后,其相对活性(此条件下的酶活性与首次使用酶活性的百分比)仍能保持为72%。这说明C3N4-NS@CRL固定化酶的循环使用性能得到改善,有利于商品化、产业化。
上述实施例为本发明较佳的实施方式,但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制,其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化,均应为等效的置换方式,都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.石墨相氮化碳纳米片在制备固定化酶中的应用。
2.一种石墨相氮化碳纳米片表面固定化酶的制备方法,其特征在于:包括以下步骤:
(1)交联剂活化石墨相氮化碳纳米片材料:将石墨相氮化碳纳米片分散于含双功能交联剂的磷酸缓冲液中进行活化,活化后再通过洗涤除去未反应的交联剂;
(2)石墨相氮化碳纳米片表面固定化酶的制备:将目标酶溶解于磷酸缓冲液中,冷冻离心收集上层酶溶液;将上述活化后的石墨相氮化碳纳米片与目标酶溶液混合,震荡反应使目标酶固定在石墨相氮化碳纳米片上,反应结束后洗涤、冷冻离心,得到石墨相氮化碳纳米片表面固定化酶。
3.根据权利要求2所述的石墨相氮化碳纳米片表面固定化酶的制备方法,其特征在于:所述的石墨相氮化碳纳米片通过包括以下步骤的方法制备得到:将氮化碳前驱体于550~600℃煅烧2~4小时,得到石墨相块状氮化碳,将其研磨成粉末状再于500~550℃煅烧2小时,得到石墨相氮化碳纳米片。
4.根据权利要求3所述的石墨相氮化碳纳米片表面固定化酶的制备方法,其特征在于:所述的氮化碳前驱体包括二腈二氨。
5.根据权利要求2所述的石墨相氮化碳纳米片表面固定化酶的制备方法,其特征在于:步骤(1)中,所述的双功能交联剂为戊二醛,磷酸缓冲液中戊二醛的质量百分含量为6~10%,石墨相氮化碳纳米片在磷酸缓冲液中的浓度为25~35mg/mL。
6.根据权利要求2所述的石墨相氮化碳纳米片表面固定化酶的制备方法,其特征在于:步骤(1)中所述的活化的条件为50~70℃下振荡10~16小时。
7.根据权利要求2所述的石墨相氮化碳纳米片表面固定化酶的制备方法,其特征在于:步骤(2)中所述的目标酶包括柱皱褶假丝酵母脂肪酶、状假丝酵母脂肪酶。
8.根据权利要求2所述的石墨相氮化碳纳米片表面固定化酶的制备方法,其特征在于:步骤(2)中所述的震荡反应的条件为30~37℃下振荡10~16小时。
9.根据权利要求2所述的石墨相氮化碳纳米片表面固定化酶的制备方法,其特征在于:步骤(2)中石墨相氮化碳纳米片与目标酶的质量比为1:0.2~4。
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