CN104531668A - 一种固定化酶载体及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种固定化酶载体及其制备方法和应用。所述固定化酶载体，包括磁性纳米颗粒、亲水性溶胶-凝胶型化合物以及碳纳米管，亲水性溶胶-凝胶型化合物包裹在磁性纳米颗粒表面形成富羟基壳，富羟基壳包裹碳纳米管的一端，将碳纳米管枝接在磁性纳米颗粒表面。本发明固定化酶载体与生物酶结合催化效率高，便于酶的回收再利用，能有效降低工业生产的成本。
Description
技术领域
本发明属于固相化酶材料制备及应用技术领域，具体涉及一种固定化酶载体及其制备方法和应用。
背景技术
酶的固定化是指通过物理、化学方法，利用载体将酶限制或束缚在一定的区域内进行催化反应的一种酶工程技术。固定化酶在一定程度上保持了酶特有的催化活性，同时克服了酶不稳定、易失活和难以分离提纯等不足，从而降低生产成本，是近年来酶工程领域最为活跃的研究重点之一，在工业生产、化学分析和医药等方面有极为广泛的应用前景。
目前酶的固定化，主要采用离子交换作用力、物理吸附力、包埋法或共价结合法。离子交换作用力，结合的酶过少；包埋法，酶易漏失，常存在扩散限制等问题，催化反应受传质阻力的影响；共价结合法，反应条件剧烈，会引起酶蛋白高级结构的变化，破坏部分活性中心，因此往往得不到活力高的固定化酶。
碳纳米管是一种新型的纳米材料，凭借其独特的结构和优良的机械、电学、光学、热力学、形态学特性及良好的生物相容性而备受人们的关注，在纳米电子学、纳米生物技术、生物传感器、生物大分子载体、生物医学器件、药物运载系统等方面更是受到了广大研究人员的青睐。与其他大体积的固体材料相比，碳纳米管特殊的中空管状结构具有较大的比表面积，且凭借其强吸附能力和高机械稳定性而成为一种理想的固定化酶材料。
碳纳米管可以通过非特异性吸附等方式吸附许多蛋白，碳纳米管的顶端可被氧化打开，小的蛋白质分子就可以进入管道中，用这种方式可以使固定在碳纳米管上的酶保持正常的生物活性。但是，由于碳纳米管颗粒尺寸过小，通过抽滤等方式分离困难，耗能过大且损失较多，不利于固定化酶的回收利用。磁性纳米颗粒为具有纳米级粒径的磁性颗粒，具有超顺磁性及大比表面积，广泛应用于医学、材料学领域。但是磁性纳米颗粒表面功能基团种类有限，传统多利用共价键或离子交换作用力结合酶分子，往往导致酶的分子结构形变，降低表观酶活力。
发明内容
发明目的：针对现有技术中存在的以上缺陷或改进需求，本发明的目的是提供了一种固定化酶载体，利用亲水性溶胶-凝胶型化合物将碳纳米管枝接在磁性纳米颗粒表面，通过非特异性吸附作用力将如碳酸酐酶的生物酶与固定化酶载体表面的碳纳米管结合，形成固定化的生物酶，利用磁性纳米颗粒的超顺磁性实现固定化酶的分离，由此解决目前碳纳米管颗粒固定化酶难以回收的技术问题。本发明的另一目的是提供一种上述固定化酶载体的制备方法。本发明还有一目的是提供一种上述固定化酶载体的应用。
技术方案：为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种固定化酶载体，包括磁性纳米颗粒、亲水性溶胶-凝胶型化合物以及碳纳米管，亲水性溶胶-凝胶型化合物包裹在磁性纳米颗粒表面形成富羟基壳，富羟基壳包裹碳纳米管的一端，将碳纳米管枝接在磁性纳米颗粒表面。
所述磁性纳米颗粒为纳米铁氧化物、纳米钛氧化物或纳米硅氧化物；磁性纳米颗粒粒径为50～200nm。
所述亲水性溶胶-凝胶型化合物为高熔点琼脂糖或壳聚糖，其溶胶温度为40～80℃。
所述碳纳米管为多壁碳纳米管或单壁碳纳米管，其长度为50～500nm，每克固定化酶载体枝接有50～500mg碳纳米管。
所述富羟基壳的平均厚度为20～100nm。
一种制备所述固定化酶载体的方法，包括以下步骤：
1)制备磁性纳米颗粒；
2)将亲水性溶胶-凝胶型化合物溶于水中，加热至沸腾形成浓度为10～50g/L溶胶；将碳纳米管加入至沸腾的溶胶中，70～100℃220w超声分散30min，获得富含碳纳米管的亲水性溶胶-凝胶型化合物溶液；
3)将磁性纳米颗粒加入到富含碳纳米管的亲水性溶胶-凝胶型化合物溶液中，70～100℃220w超声分散30min，得到磁性Fe3O4、碳纳米管和琼脂糖的悬浊液；将悬浊液加入积比为50～100:1的甲苯-三氯甲烷溶液、司班80组成的混合溶液中，65℃，1000r/min，强力搅拌20～30min，得到均匀体系；
4)对均匀体系持续搅拌，自然冷却后，用乙醚和双蒸水清洗；磁性分离得到枝接有碳纳米管的磁性纳米颗粒；将碳纳米管枝接磁性纳米颗粒低温旋转蒸干，研磨后筛选粒径200目以下颗粒，即制得固定化酶载体。
步骤2)中，所述的碳纳米管在溶胶凝胶型化合物溶液中的质量浓度为10～100g/L。
步骤3)中，所述的磁性纳米颗粒在富含碳纳米管的亲水性溶胶-凝胶化合物溶液中的质量浓度为5～50g/L。
所述固定化酶载体在制备固定化酶中的应用。所述的酶包括碳酸酐酶、木聚糖酶和β-葡萄糖苷酶。
有益效果：与现有技术相比，本发明采用亲水性溶胶-凝胶型化合物，将碳纳米管枝接在磁性纳米颗粒表面，能够取得以下优点：
(1)该固定化酶载体，制备工艺简单，重复操作稳定性好，适用于大规模工业化制备，采用碳纳米管与磁性纳米颗粒结合，通过磁性分离回收生物酶，克服了碳纳米管作为固定化酶载体难以回收的困难，大幅度降低固定化酶连续运作回收利用的成本。
(2)该固定化酶载体，通过非特异性吸附作用与待固定化酶结合，能够将生物酶牢固的固定在载体表面，生物酶不易从固定化载体表面脱落，催化效果稳定持久。
(3)该固定化酶载体，通过非特异性吸附作用与待固定化酶结合，可结合不同的酶，非特异性的结合方式使得本载体的适用酶的范围较广。
(4)该固定化酶载体，具有较大比表面积，与生物酶结合效率高。
(5)该固定化酶载体，具有纳米级粒径，使得固定化酶在催化体系中的分散性优于微米级以上的固定化酶，从而减小固定化酶在催化体系中的传质阻力，最大限度地保证固定化酶的催化效率。
附图说明
图1为本发明提供的固定化酶载体的结构示意图；
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
一种固定化酶载体，其结构示意图如图1所示，包括磁性纳米颗粒1、亲水性溶胶-凝胶化合物2以及碳纳米管3。磁性纳米颗粒，平均粒径在50～200nm之间，可为纳米铁氧化物或纳米钛氧化物，例如：Fe3O4、Fe2O3、TiO2，优选磁性和稳定性良好且成本较低的Fe3O4；碳纳米管，为单壁碳纳米管或多壁碳纳米管，长度为50～500nm；亲水性溶胶-凝胶化合物，为高胶熔点琼脂糖或壳聚糖，磁性纳米颗粒包裹在亲水性溶胶-凝胶化合物内，亲水性溶胶-凝胶化合物包裹碳纳米管的一端，将碳纳米管枝接在磁性纳米颗粒表面，碳纳米管与待固定化的酶通过非特异性吸附结合。
下面仅以磁性和稳定性良好且成本较低的Fe3O4为例，按照优选方案说明。
实施例1
一种固定化酶载体的制备方法，包括以下步骤：
(1)制备磁性纳米颗粒：采用化学共沉淀法制备磁性Fe3O4纳米颗粒，控制平均粒径为50nm。
(2)制备富含碳纳米管的亲水性溶胶-凝胶型化合物：将1.0g琼脂糖溶于45mL水中，加热至沸腾形成溶胶。将0.5g碳纳米管(长度为50nm)加入至沸腾的琼脂糖溶液中，80℃220w超声分散30min，获得富含碳纳米管的亲水性溶胶-凝胶型化合物溶液。
(3)对步骤(1)中制备的磁性纳米颗粒进行碳纳米管枝接修饰：将0.5g磁性纳米颗粒加入到45mL富含碳纳米管的亲水性溶胶-凝胶型化合物溶液中，80℃220w超声分散30min，得到磁性Fe3O4、碳纳米管和琼脂糖的悬浊液。将悬浊液加入由216mL甲苯、84mL三氯甲烷和4.5mL司班80组成的有机溶剂和表面活性剂的混合溶液中，65℃，1000r/min，强力搅拌20min，得到均匀体系。对均匀体系持续搅拌，自然冷却后，用大量乙醚和双蒸水清洗。磁性分离得到枝接有碳纳米管的磁性纳米颗粒。将碳纳米管枝接磁性纳米颗粒低温旋转蒸干，研磨后筛选粒径200目以下颗粒，即制得固定化酶载体。高胶熔点琼脂糖包裹在磁性纳米颗粒表面形成富羟基壳，其平均厚度为20nm。
将所获得的固定化酶载体应用于碳酸酐酶的固定化中，制备固定化的碳酸酐酶，并测定其固定化效率及催化活力。
取碳纳米管枝接的磁性纳米颗粒250mg，分散于10mL 5mg/mL的碳酸酐酶弱碱性磷酸钾盐缓冲溶液(50mmol/L pH 7.0～8.5)中，pH为8.0，28℃，摇床混合5h，摇床转速为200r/min。使碳纳米管枝接的磁性纳米颗粒与待固定化的碳酸酐酶通过非特异性吸附结合，即形成碳纳米管枝接的磁性纳米固定化碳酸酐酶。磁性分离并清洗颗粒，获得纯净的碳纳米管枝接的磁性纳米固定化碳酸酐酶。
作为对照，取碳纳米管250mg，按照上述同样的固定化方法，获得碳纳米管固定化碳酸酐酶。
将制备的固定化碳酸酐酶通过pH电极法测定催化活力，固定化酶每克蛋白的单位酶活力相对于游离酶每克蛋白的单位酶活力定义为单位酶活回收率，结果见表1。结果显示：本发明中的固定化载体制得的固定化碳酸酐酶与碳纳米管固定化的碳酸酐酶，催化效率相差无几，在酶催化完成后，采用外加磁场方式实现固定化酶的快速分离，操作简便，分离彻底。而碳纳米管固定化酶由于颗粒尺寸较小，分离则需要抽滤、离心等能耗较高的方式，增加了固定化酶批次使用的成本。
将所获得的固定化酶载体应用于木聚糖酶的固定化中，制备固定化的木聚糖酶，并测定其固定化效率及催化活力。
取碳纳米管枝接的磁性纳米颗粒250mg，分散于10mL 5mg/mL的木聚糖酶柠檬酸钠盐缓冲溶液(50mmol/L pH4.8～5.0)中，pH为4.8，28℃，摇床混合5h，摇床转速为200r/min。使碳纳米管枝接的磁性纳米颗粒与待固定化的木聚糖酶通过非特异性吸附结合，即形成碳纳米管枝接的磁性纳米固定化木聚糖酶。磁性分离并清洗颗粒，获得纯净的碳纳米管枝接的磁性纳米固定化木聚糖酶。作为对照，取碳纳米管250mg，按照上述同样的固定化方法，获得碳纳米管固定化木聚糖酶。
将制备的固定化木聚糖酶通过DNS显色法测定催化活力，结果见表1。结果显示：固定化酶每克蛋白的单位酶活力相对于游离酶每克蛋白的单位酶活力为29％，本发明中的固定化载体制得的固定化木聚糖酶与碳纳米管固定化的木聚糖酶，催化效率相差无几，同时在酶催化完成后，采用外加磁场方式实现固定化酶的快速分离，操作简便，分离彻底。而碳纳米管固定化酶由于颗粒尺寸较小，分离则需要抽滤、离心等能耗较高的方式，增加了固定化酶批次使用的成本。
将所获得的固定化酶载体应用于β-葡萄糖苷酶的固定化中，制备固定化的β-葡萄糖苷酶，并测定其固定化效率及催化活力。
取碳纳米管枝接的磁性纳米颗粒250mg，分散于10mL 5mg/mL的β-葡萄糖苷酶柠檬酸钠盐缓冲溶液(50mmol/L pH4.8～5.0)中，pH为5.0，5℃，摇床混合4h，摇床转速为200r/min。使碳纳米管枝接的磁性纳米颗粒与待固定化的β-葡萄糖苷酶通过非特异性吸附结合，即形成碳纳米管枝接的磁性纳米固定化β-葡萄糖苷酶。磁性分离并清洗颗粒，获得纯净的碳纳米管枝接的磁性纳米固定化β-葡萄糖苷酶。作为对照，取碳纳米管250mg，按照上述同样的固定化方法，获得碳纳米管固定化β-葡萄糖苷酶。
将制备的固定化β-葡萄糖苷酶通过pNPG显色法测定催化活力，结果见表1。结果显示：固定化酶每克蛋白的单位酶活力相对于游离酶每克蛋白的单位酶活力为76％，本发明中的固定化载体制得的固定化β-葡萄糖苷酶与碳纳米管固定化的β-葡萄糖苷酶，催化效率相差无几，同时在酶催化完成后，采用外加磁场方式实现固定化酶的快速分离，操作简便，分离彻底。而碳纳米管固定化酶由于颗粒尺寸较小，分离则需要抽滤、离心等能耗较高的方式，增加了固定化酶批次使用的成本。
表1 实验结果比较
实施例2
一种固定化酶载体的制备方法，包括以下步骤：
(1)制备磁性纳米颗粒：采用化学共沉淀法制备磁性Fe3O4纳米颗粒，控制平均粒径为200nm。
(2)制备富含碳纳米管的亲水性溶胶-凝胶型化合物：将1.0g琼脂糖溶于45mL水中，加热至沸腾形成溶胶。将4.5g碳纳米管(长度为250nm)加入至沸腾的琼脂糖溶液中，80℃220w超声分散30min，获得富含碳纳米管的亲水性溶胶-凝胶型化合物溶液。
(3)对步骤(1)中制备的磁性纳米颗粒进行碳纳米管枝接修饰：将2.25g磁性纳米颗粒加入到45mL富含碳纳米管的亲水性溶胶-凝胶型化合物溶液中，80℃220w超声分散30min，得到磁性Fe3O4、碳纳米管和琼脂糖的悬浊液。将悬浊液加入由216mL甲苯、84mL三氯甲烷和6mL司班80组成的有机溶剂和表面活性剂的混合溶液中，65℃，1000r/min，强力搅拌20min，得到均匀体系。对均匀体系持续搅拌，自然冷却后，用大量乙醚和双蒸水清洗。磁性分离得到枝接有碳纳米管的磁性纳米颗粒。将碳纳米管枝接磁性纳米颗粒低温旋转蒸干，研磨后筛选粒径200目以下颗粒，即制得固定化酶载体。
所获得的固定化酶载体，高胶熔点琼脂糖包裹在磁性纳米颗粒表面形成富羟基壳，其平均厚度为50nm。表面枝接的碳纳米管质量分数为100mg/g固定化酶载体。通过溶胶-凝胶方式枝接碳纳米管，碳纳米管与待固定化的酶通过非特异性吸附作用力结合。
将上述制备的固定化酶载体应用于碳酸酐酶的固定化中，制备固定化的碳酸酐酶，并测定其固定化效率及催化活力。
取碳纳米管枝接的磁性纳米颗粒250mg，分散于10mL 5mg/mL的碳酸酐酶弱碱性磷酸钾盐缓冲溶液(50mmol/L pH 7.0～8.5)中，pH为8.0，28℃，摇床混合5h，摇床转速为200r/min。使碳纳米管枝接的磁性纳米颗粒与待固定化的碳酸酐酶通过非特异性吸附结合，即形成碳纳米管枝接的磁性纳米固定化碳酸酐酶。磁性分离并清洗颗粒，获得纯净的碳纳米管枝接的磁性纳米固定化碳酸酐酶。作为对照，取碳纳米管250mg，按照上述同样的固定化方法，获得碳纳米管固定化碳酸酐酶。
将制备的固定化碳酸酐酶通过pH电极法测定催化活力，固定化酶每克蛋白的单位酶活力相对于游离酶每克蛋白的单位酶活力定义为单位酶活回收率，结果见表2。结果显示：本发明中的固定化载体制得的固定化碳酸酐酶与碳纳米管固定化的碳酸酐酶，催化效率相差无几，同时在酶催化完成后，采用外加磁场方式实现固定化酶的快速分离，操作简便，分离彻底。而碳纳米管固定化酶由于颗粒尺寸较小，分离则需要抽滤、离心等能耗较高的方式，增加了固定化酶批次使用的成本。
将上述制备的固定化酶载体应用于木聚糖酶的固定化中，制备固定化的木聚糖酶，并测定其固定化效率及催化活力。
取碳纳米管枝接的磁性纳米颗粒250mg，分散于10mL 5mg/mL的木聚糖酶柠檬酸钠盐缓冲溶液(50mmol/L pH4.8～5.0)中，pH为4.8，28℃，摇床混合5h，摇床转速为200r/min。使碳纳米管枝接的磁性纳米颗粒与待固定化的木聚糖酶通过非特异性吸附结合，即形成碳纳米管枝接的磁性纳米固定化木聚糖酶。磁性分离并清洗颗粒，获得纯净的碳纳米管枝接的磁性纳米固定化木聚糖酶。作为对照，取碳纳米管250mg，按照上述同样的固定化方法，获得碳纳米管固定化木聚糖酶。
将制备的固定化木聚糖酶通过DNS显色法测定催化活力，结果见表2。结果显示：固定化酶每克蛋白的单位酶活力相对于游离酶每克蛋白的单位酶活力为22％，本发明中的固定化载体制得的固定化木聚糖酶与碳纳米管固定化的木聚糖酶，催化效率相差无几，在酶催化完成后，采用外加磁场方式实现固定化酶的快速分离，操作简便，分离彻底。而碳纳米管固定化酶由于颗粒尺寸较小，分离则需要抽滤、离心等能耗较高的方式，增加了固定化酶批次使用的成本。
将上述制备的固定化酶载体应用于β-葡萄糖苷酶的固定化中，制备固定化的β-葡萄糖苷酶，并测定其固定化效率及催化活力。
取碳纳米管枝接的磁性纳米颗粒250mg，分散于10mL 5mg/mL的β-葡萄糖苷酶柠檬酸钠盐缓冲溶液(50mmol/L pH4.8～5.0)中，pH为5.0，5℃，摇床混合4h，摇床转速为200r/min。使碳纳米管枝接的磁性纳米颗粒与待固定化的β-葡萄糖苷酶通过非特异性吸附结合，即形成碳纳米管枝接的磁性纳米固定化β-葡萄糖苷酶。磁性分离并清洗颗粒，获得纯净的碳纳米管枝接的磁性纳米固定化β-葡萄糖苷酶。作为对照，取碳纳米管250mg，按照上述同样的固定化方法，获得碳纳米管固定化β-葡萄糖苷酶。
将制备的固定化β-葡萄糖苷酶通过pNPG显色法测定催化活力，结果见表2。结果显示：固定化酶每克蛋白的单位酶活力相对于游离酶每克蛋白的单位酶活力为73％，本发明中的固定化载体制得的固定化β-葡萄糖苷酶与碳纳米管固定化的β-葡萄糖苷酶，催化效率相差无几，同时克服了碳纳米管固定化酶回收成本高的难题。
表2 对比试验结果
实施例3
一种固定化酶载体的制备方法，包括以下步骤：
(1)制备磁性纳米颗粒：采用化学共沉淀法制备磁性Fe3O4纳米颗粒，控制平均粒径为100nm。
(2)制备富含碳纳米管的亲水性溶胶-凝胶型化合物：将1.0g壳聚糖溶于45mL水中，加热至沸腾形成溶胶。将0.45g碳纳米管(长度为500nm)加入至沸腾的琼脂糖溶液中，80℃220w超声分散30min，获得富含碳纳米管的亲水性溶胶-凝胶型化合物溶液。
(3)对步骤(1)中制备的磁性纳米颗粒进行碳纳米管枝接修饰：将0.45g磁性纳米颗粒加入到45mL富含碳纳米管的亲水性溶胶-凝胶型化合物溶液中，80℃220w超声分散30min，得到磁性Fe3O4、碳纳米管和琼脂糖的悬浊液。将悬浊液加入由216mL甲苯、84mL三氯甲烷和3mL司班80组成的有机溶剂和表面活性剂的混合溶液中，65℃，1000r/min，强力搅拌20min，得到均匀体系。对均匀体系持续搅拌，自然冷却后，用大量乙醚和双蒸水清洗。磁性分离得到枝接有碳纳米管的磁性纳米颗粒。将碳纳米管枝接磁性纳米颗粒低温旋转蒸干，研磨后筛选粒径200目以下颗粒，即制得固定化酶载体。
所获得的固定化酶载体表面枝接的碳纳米管质量分数为500mg/g固定化酶载体。壳聚糖包裹在磁性纳米颗粒表面形成富羟基壳，其平均厚度为100nm，通过溶胶-凝胶方式枝接碳纳米管，碳纳米管与待固定化的酶通过非特异性吸附作用力结合。
将上述制备的固定化酶载体应用于碳酸酐酶的固定化中，制备固定化的碳酸酐酶，并测定其固定化效率及催化活力。
取碳纳米管枝接的磁性纳米颗粒250mg，分散于10mL 5mg/mL的碳酸酐酶弱碱性磷酸钾盐缓冲溶液(50mmol/L pH 7.0～8.5)中，pH为8.5，28℃，摇床混合5h，摇床转速为200r/min。使碳纳米管枝接的磁性纳米颗粒与待固定化的碳酸酐酶通过非特异性吸附结合，即形成碳纳米管枝接的磁性纳米固定化碳酸酐酶。磁性分离并清洗颗粒，获得纯净的碳纳米管枝接的磁性纳米固定化碳酸酐酶。作为对照，取碳纳米管250mg，按照上述同样的固定化方法，获得碳纳米管固定化碳酸酐酶。
将制备的固定化碳酸酐酶通过pH电极法测定催化活力，固定化酶每克蛋白的单位酶活力相对于游离酶每克蛋白的单位酶活力定义为单位酶活回收率，结果见表3。结果显示：本发明中的固定化载体制得的固定化碳酸酐酶与碳纳米管固定化的碳酸酐酶，催化效率相差无几，在酶催化完成后，采用外加磁场方式实现固定化酶的快速分离，操作简便，分离彻底。而碳纳米管固定化酶由于颗粒尺寸较小，分离则需要抽滤、离心等能耗较高的方式，增加了固定化酶批次使用的成本。
将上述制备的固定化酶载体应用于木聚糖酶的固定化中，制备固定化的木聚糖酶，并测定其固定化效率及催化活力。
取碳纳米管枝接的磁性纳米颗粒250mg，分散于10mL 5mg/mL的木聚糖酶柠檬酸钠盐缓冲溶液(50mmol/L pH4.8～5.0)中，pH为4.8，28℃，摇床混合5h，摇床转速为200r/min。使碳纳米管枝接的磁性纳米颗粒与待固定化的木聚糖酶通过非特异性吸附结合，即形成碳纳米管枝接的磁性纳米固定化木聚糖酶。磁性分离并清洗颗粒，获得纯净的碳纳米管枝接的磁性纳米固定化木聚糖酶。作为对照，取碳纳米管250mg，按照上述同样的固定化方法，获得碳纳米管固定化木聚糖酶。
将制备的固定化木聚糖酶通过DNS显色法测定催化活力，结果见表3。结果显示：固定化酶每克蛋白的单位酶活力相对于游离酶每克蛋白的单位酶活力为30％，本发明中的固定化载体制得的固定化木聚糖酶与碳纳米管固定化的木聚糖酶，催化效率相差无几，在酶催化完成后，采用外加磁场方式实现固定化酶的快速分离，操作简便，分离彻底。而碳纳米管固定化酶由于颗粒尺寸较小，分离则需要抽滤、离心等能耗较高的方式，增加了固定化酶批次使用的成本。
将上述制备的固定化酶载体应用于β-葡萄糖苷酶的固定化中，制备固定化的β-葡萄糖苷酶，并测定其固定化效率及催化活力。
取碳纳米管枝接的磁性纳米颗粒250mg，分散于10mL 5mg/mL的β-葡萄糖苷酶柠檬酸钠盐缓冲溶液(50mmol/L pH4.8～5.0)中，pH为5.0，5℃，摇床混合4h，摇床转速为200r/min。使碳纳米管枝接的磁性纳米颗粒与待固定化的β-葡萄糖苷酶通过非特异性吸附结合，即形成碳纳米管枝接的磁性纳米固定化β-葡萄糖苷酶。磁性分离并清洗颗粒，获得纯净的碳纳米管枝接的磁性纳米固定化β-葡萄糖苷酶。作为对照，取碳纳米管250mg，按照上述同样的固定化方法，获得碳纳米管固定化β-葡萄糖苷酶。
将制备的固定化β-葡萄糖苷酶通过pNPG显色法测定催化活力，结果见表3。结果显示：固定化酶每克蛋白的单位酶活力相对于游离酶每克蛋白的单位酶活力为72％，本发明中的固定化载体制得的固定化β-葡萄糖苷酶与碳纳米管固定化的β-葡萄糖苷酶，催化效率相差无几，同时克服了碳纳米管固定化酶回收成本高的难题。
表3 对比实验数据
Claims (10)
1.一种固定化酶载体，其特征在于，包括磁性纳米颗粒、亲水性溶胶-凝胶型化合物以及碳纳米管，亲水性溶胶-凝胶型化合物包裹在磁性纳米颗粒表面形成富羟基壳，富羟基壳包裹碳纳米管的一端，将碳纳米管枝接在磁性纳米颗粒表面。
2.根据权利要求1所述的固定化酶载体，其特征在于，所述磁性纳米颗粒为纳米铁氧化物、纳米钛氧化物或纳米硅氧化物；磁性纳米颗粒粒径为50~200 nm。
3.根据权利要求1所述的固定化酶载体，其特征在于，所述亲水性溶胶-凝胶型化合物为高熔点琼脂糖或壳聚糖，其溶胶温度为40~80℃。
4.根据权利要求1所述的固定化酶载体，其特征在于，所述碳纳米管为多壁碳纳米管或单壁碳纳米管，其长度为50~500nm，每克固定化酶载体枝接有50~500mg碳纳米管。
5.根据权利要求1所述的固定化酶载体，其特征在于，所述富羟基壳的平均厚度为20~100nm。
6.一种制备权利要求1~5任意一项所述固定化酶载体的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）制备磁性纳米颗粒；
2）将亲水性溶胶-凝胶型化合物溶于水中，加热至沸腾形成浓度为10~50g/L溶胶；将碳纳米管加入至沸腾的溶胶中，70~100℃ 220w超声分散30min，获得富含碳纳米管的亲水性溶胶-凝胶型化合物溶液；
3）将磁性纳米颗粒加入到富含碳纳米管的亲水性溶胶-凝胶型化合物溶液中，70~100℃ 220w超声分散30min，得到磁性Fe3O4、碳纳米管和琼脂糖的悬浊液；将悬浊液加入积比为50~100:1的甲苯-三氯甲烷溶液、司班80组成的混合溶液中，65℃，1000r/min，强力搅拌20~30min，得到均匀体系；
4）对均匀体系持续搅拌，自然冷却后，用乙醚和双蒸水清洗；磁性分离得到枝接有碳纳米管的磁性纳米颗粒；将碳纳米管枝接磁性纳米颗粒低温旋转蒸干，研磨后筛选粒径200目以下颗粒，即制得固定化酶载体。
7.根据权利要求6所述的固定化酶载体制备方法，其特征在于，步骤2）中，所述的碳纳米管在溶胶凝胶型化合物溶液中的质量浓度为10~100g/L。
8.根据权利要求6所述的固定化酶载体制备方法，其特征在于，步骤3）中，所述的磁性纳米颗粒在富含碳纳米管的亲水性溶胶-凝胶化合物溶液中的质量浓度为5~50g/L。
9.权利要求1~5任意一项所述固定化酶载体在制备固定化酶中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，所述的酶包括碳酸酐酶、木聚糖酶和β-葡萄糖苷酶。
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