JP2023127452A - 抗ｐｅｇ抗体結合材料および抗ｐｅｇ抗体の検出方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】メトキシ末端ＰＥＧ選択的抗ＰＥＧ抗体を検出可能な抗ＰＥＧ抗体結合材料を提供する。【解決手段】実施形態に係る抗ＰＥＧ抗体結合材料は、一般式（１）で表されるセルロースオリゴマーを含み、メトキシ末端ＰＥＧ選択的抗ＰＥＧ抗体に結合可能である。式（１）中、ｎは平均重合度であって６～１６の数を表し、ｍは１～１６の整数を表す。【化１】JPEG2023127452000010.jpg36165【選択図】図２
Description
本発明は、抗ＰＥＧ抗体結合材料、およびそれを用いた抗ＰＥＧ抗体の検出方法に関する。
タンパク質、リポソーム、ミセルなどの表面をＰＥＧ（ポリエチレングリコール）で修飾することにより、被修飾体の血中滞留性が向上し、免疫原性が低下する。そのため、現在、数多くのＰＥＧ修飾医薬品が臨床応用されている。
しかしながら、ＰＥＧ修飾によってＰＥＧに対する抗体（抗ＰＥＧ抗体）が分泌誘導されることが明らかになった。抗ＰＥＧ抗体が血中に存在している間にＰＥＧ修飾医薬品が投与されると、ＰＥＧ修飾医薬品が血中から除去される現象（ＡＢＣ現象）が起こり、血中滞留性が低下したり、副作用が生じたりすることがある。そのため、抗ＰＥＧ抗体の誘導やＰＥＧ修飾医薬品の治療効果に与える影響を評価するために、血中に存在する抗ＰＥＧ抗体を高感度に検出することが求められている。
抗ＰＥＧ抗体としては、ＰＥＧ構造のバックボーンであるオキシエチレンの繰り返し構造を認識し、該バックボーンのＰＥＧ鎖に選択性の高いバックボーン選択的抗ＰＥＧ抗体だけでなく、メトキシ末端ＰＥＧ選択的抗ＰＥＧ抗体がある。メトキシ末端ＰＥＧ選択的抗ＰＥＧ抗体は、メトキシ末端ＰＥＧに高い選択性を持つものであり、すなわち末端にメトキシ基を持つＰＥＧ鎖に特異的に結合する。メトキシ末端ＰＥＧ選択的抗ＰＥＧ抗体は、より疎水性度の高いエトキシ基やブトキシ基を末端に持つＰＥＧ鎖に対しても結合することが知られている。
ＰＥＧ鎖を含むバイオセンサに関する技術として、例えば特許文献１には、金属（酸化物）微粒子または半導体微粒子に２本以上のＰＥＧ鎖を介して官能基または機能性部分を設けたＰＥＧ修飾ナノ粒子を含むバイオセンサが開示されている。
また、特許文献２および３には、水不溶性粒子と、その表面上に配置されたポリシロキサンを含むプライマー層と、プライマー層上に配置された親水性ポリマー層を含み、該親水性ポリマー層を、抗体が結合されたＰＥＧ鎖と、不活性基が結合されたＰＥＧ鎖とで構成した親水性粒子を含むバイオセンサが開示されている。
Ｔ．Ｎｏｈａｒａら，"Enzymatic Synthesis of Oligo(ethylene glycol)-BearingCellulose Oligomers for in Situ Formation of Hydrogels with CrystallineNanoribbon Network Structures"，Ｌａｎｇｍｕｉｒ，２０１６年，３２，４７，１２５２０－１２５２６
本発明者らは、血中に存在する抗ＰＥＧ抗体を高感度に検出することを目指し、研究していくなかで、特定のオリゴエチレングリコール基を持つセルロースオリゴマーがメトキシ末端ＰＥＧ選択的抗ＰＥＧ抗体に特異的に結合することを見い出した。
本発明の実施形態は、以上の点に鑑みてなされたものであり、メトキシ末端ＰＥＧ選択的抗ＰＥＧ抗体に結合可能な抗ＰＥＧ抗体結合材料、および、それを用いた抗ＰＥＧ抗体の検出方法を提供することを目的とする。
本発明は以下に示される実施形態を含む。
［１］ 下記一般式（１）で表されるセルロースオリゴマーを含む、メトキシ末端ＰＥＧ選択的抗ＰＥＧ抗体に結合可能な抗ＰＥＧ抗体結合材料。
一般式（１）：
（式（１）中、ｎは平均重合度であって６～１６の数を表し、ｍは１～１６の整数を表す。）
［２］ 上記［１］に記載の抗ＰＥＧ抗体結合材料を含むバイオセンサ。
［３］ 上記［１］に記載の抗ＰＥＧ抗体結合材料を含む吸着剤。
［１］ 下記一般式（１）で表されるセルロースオリゴマーを含む、メトキシ末端ＰＥＧ選択的抗ＰＥＧ抗体に結合可能な抗ＰＥＧ抗体結合材料。
一般式（１）：
［２］ 上記［１］に記載の抗ＰＥＧ抗体結合材料を含むバイオセンサ。
［３］ 上記［１］に記載の抗ＰＥＧ抗体結合材料を含む吸着剤。
［４］ 下記一般式（１）：
（式（１）中のｎは平均重合度であって６～１６の数を表し、ｍは１～１６の整数を表す。）で表されるセルロースオリゴマーを、メトキシ末端ＰＥＧ選択的抗ＰＥＧ抗体との結合を可能にする条件下で、前記抗ＰＥＧ抗体を含むことが疑われる被検体とインキュベートすること、
前記被検体とのインキュベート後の前記セルロースオリゴマーを、前記抗ＰＥＧ抗体に対する二次抗体の結合を可能にする条件下で、前記二次抗体を含む試料とインキュベートすること、および、
前記試料とのインキュベート後の前記セルロースオリゴマーを用いて、プローブとしての前記二次抗体により、前記被検体に含まれる前記抗ＰＥＧ抗体を検出すること、
を含む、抗ＰＥＧ抗体の検出方法。
前記被検体とのインキュベート後の前記セルロースオリゴマーを、前記抗ＰＥＧ抗体に対する二次抗体の結合を可能にする条件下で、前記二次抗体を含む試料とインキュベートすること、および、
前記試料とのインキュベート後の前記セルロースオリゴマーを用いて、プローブとしての前記二次抗体により、前記被検体に含まれる前記抗ＰＥＧ抗体を検出すること、
を含む、抗ＰＥＧ抗体の検出方法。
本発明の実施形態によれば、メトキシ末端ＰＥＧ選択的抗ＰＥＧ抗体に結合可能な抗ＰＥＧ抗体結合材料が提供される。該抗ＰＥＧ抗体結合材料は、例えば、メトキシ末端ＰＥＧ選択的抗ＰＥＧ抗体を検出するためのバイオセンサや、メトキシ末端ＰＥＧ選択的抗ＰＥＧ抗体を吸着するための吸着剤に用いることができる。
本実施形態に係る抗ＰＥＧ抗体結合材料は、下記一般式（１）で表されるセルロースオリゴマー（以下、ＯＥＧ化セルロースオリゴマーともいう。）を含む。ＯＥＧ化セルロースオリゴマーは、グルコースがβ－１，４－グルコシド結合により連結された構造を持つセルロースオリゴマーにおいて、その還元末端のアノマー炭素にメトキシ基を持つオリゴエチレングリコール基が置換基として結合したものである。
式（１）中、ｎは６～１６の数を表し、ｍは１～１６の整数を表す。また、式（１）中の波線は還元末端のアノマー位の立体配位がα体、β体、または、α体とβ体の混合物であることを表す。
上記ｎは、セルロースオリゴマーの平均重合度（ＤＰ）を表し、６以上１６以下である。ｎは６．５以上でもよく、７以上でもよい。また、１４以下でもよく、１３以下でもよく、１２以下でもよい。セルロースオリゴマーの平均重合度は、セルロースオリゴマーの質量比に応じた重合度の加重平均値である。なお、個々のＯＥＧ化セルロースオリゴマーの重合度は、特に限定されないが、例えば４以上でもよく、５以上でもよく、６以上でもよく、また、例えば２０以下でもよく、１６以下でもよく、１３以下でもよい。
上記ｍは、オリゴエチレングリコール基におけるエチレンオキシド単位の付加モル数を表し、１以上１６以下である。ｍは３以上であることが好ましく、より好ましくは４以上である。ｍは１２以下であることが好ましく、より好ましくは１０以下であり、更に好ましくは８以下である。なお、ＯＥＧ化セルロースオリゴマーは、ｍが１～１６のうちのいずれか１つの値を持つものでもよく、ｍが複数の値を持つ混合物でもよい。
一実施形態において、ＯＥＧ化セルロースオリゴマーは下記一般式（２）で表されるものであってもよい。この場合、還元末端のアノマー位の立体配位はβ体である。なお、式（２）中のｍおよびｎは、式（１）中のｍおよびｎと同じである。
ＯＥＧ化セルロースオリゴマーは、セルロースＩＩ型の結晶構造を持つセルロースオリゴマー集合体でもよい。すなわち、一実施形態において、ＯＥＧ化セルロースオリゴマーは、式（１）で表される化合物を構成成分とする、セルロースＩＩ型の結晶構造を持つセルロースオリゴマー集合体であってもよい。該セルロースオリゴマー集合体は、シート状の構造（セルロースナノシート）を持つものでもよい。ここで、シート状の構造は、図１に示すようなリボン状の構造（セルロースナノリボン）を包含する概念である。
天然由来のセルロース鎖が平行に配列したセルロースＩ型の結晶構造を持つのに対し、人工合成されたセルロースオリゴマーは、熱力学的に安定であるセルロースＩＩ型の結晶構造を一般に形成する。その際、セルロース鎖末端の置換基である（ＯＣ２Ｈ４）ｍ－ＯＣＨ３は結晶形に影響を与えず、該置換基を持つセルロースオリゴマーはセルロースナノシートの膜厚方向に配列してラメラ結晶を形成し、置換基がシート表面に露出する。
詳細には、ＯＥＧ化セルロースオリゴマーを、上記式（１）の下方に付記したように、セルロース鎖を還元末端から非還元末端に向かう矢印で示し、置換基を波線で示したとき、図１中に断面構造を示すように、ＯＥＧ化セルロースオリゴマーは上記矢印の向きが交互になるように膜厚方向に配列し、したがって置換基は互い違いにシート表面に露出した構造をとる。
ＯＥＧ化セルロースオリゴマーの合成方法は、特に限定されず、例えば、非特許文献１に記載された、セロデキストリンホスホリラーゼ（ＣＤＰ）の逆反応を利用した酵素合成反応を用いてもよい。すなわち、グルコースまたはセロビオースのアノマー位にβ結合を介して上記置換基を持つプライマーもしくはセロビオースのアノマー位にα結合を介して上記置換基を持つプライマーとα－グルコース－１－リン酸（αＧ１Ｐ）とを、ＣＤＰと反応させることにより、プライマーに対してαＧ１Ｐが逐次的に重合され、式（１）で表されるＯＥＧ化セルロースオリゴマーを合成することができる。
上記式（１）で表されるＯＥＧ化セルロースオリゴマーは、メトキシ末端ＰＥＧ選択的抗ＰＥＧ抗体に特異的に結合し、プローブとしての二次抗体や、ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）、リゾチームなどの他のタンパク質には結合しない。そのため、上記セルロースオリゴマー集合体は、タンパク質を非特異的に吸着しないバイオイナートな表面を持ち、メトキシ末端ＰＥＧ選択的抗ＰＥＧ抗体に特異的に結合する。ＯＥＧ化セルロースオリゴマーは、また、バックボーン選択的抗ＰＥＧ抗体にも結合しない。そのため、ＯＥＧ化セルロースオリゴマーは、メトキシ末端ＰＥＧ選択的抗ＰＥＧ抗体に対して選択的に結合可能であり、メトキシ末端ＰＥＧ選択的抗ＰＥＧ抗体を選択的に検出ないし吸着可能な抗ＰＥＧ抗体結合材料として用いることができる。
ＯＥＧ化セルロースオリゴマーが結合可能なメトキシ末端ＰＥＧ選択的抗ＰＥＧ抗体は、より詳細には、末端にメトキシ基を持つＰＥＧ（ポリエチレングリコール）に特異的に結合するモノクローナル抗体であり、メトキシ末端ＰＥＧ選択的モノクローナル抗ＰＥＧ抗体とも称される。メトキシ末端ＰＥＧ選択的抗ＰＥＧ抗体は、より疎水性度の高いエトキシ基やブトキシ基を末端に持つＰＥＧ鎖に対しても結合するものであってもよい。メトキシ末端ＰＥＧ選択的抗ＰＥＧ抗体のクラスは、特に限定されず、ＩｇＧでもよく、ＩｇＭでもよい。
本実施形態に係る抗ＰＥＧ抗体結合材料は、ＯＥＧ化セルロースオリゴマーを含むことから、メトキシ末端ＰＥＧ選択的抗ＰＥＧ抗体を認識し、これに結合可能なものである。そのため、例えば、メトキシ末端ＰＥＧ選択的抗ＰＥＧ抗体を検出するためのバイオセンサ、メトキシ末端ＰＥＧ選択的抗ＰＥＧ抗体を吸着するための吸着剤等に用いることができる。
該抗ＰＥＧ抗体結合材料は、ＯＥＧ化セルロースオリゴマー（例えば上記セルロースオリゴマー集合体）のみからなるものでもよく、また、その効果を損なわない範囲で他の成分、例えば、タンパク質、ペプチド、核酸、脂質、糖、細胞、アミノ酸、金属イオン、有機溶媒等を含んでもよい。
ＯＥＧ化セルロースオリゴマー、詳細にはその集合体であるセルロースオリゴマー集合体は、水に溶解しない物質であり、上記酵素合成反応により合成した場合、ＯＥＧ化セルロースオリゴマーは水分散液として得られる。一実施形態に係る抗ＰＥＧ抗体結合材料は、該水分散液から水を除去することにより得られる乾燥粉末であってもよく、該乾燥粉末をそのまま、またはタンパク質等の他の成分を粉体混合することで、粉末状の抗ＰＥＧ抗体結合材料を調製してもよい。粉末状の抗ＰＥＧ抗体結合材料は、その使用に際して、水を加えることで容易に水に分散させることができ、水分散液を調製することができる。
一実施形態に係る抗ＰＥＧ抗体結合材料は、ＯＥＧ化セルロースオリゴマーを水に分散させた水分散液でもよい。ＯＥＧ化セルロースオリゴマーの水分散液とする場合、水に緩衝剤を加えて緩衝液としてもよい。すなわち、ＯＥＧ化セルロースオリゴマーの水分散液は、ＯＥＧ化セルロースオリゴマーが緩衝液に分散したものであってもよい。
緩衝剤としては、特に限定されず、例えば、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、２－モルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）緩衝液、トリスヒドロキシメチルアミノメタン（Ｔｒｉｓ）緩衝液、３－モルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）緩衝液、４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）緩衝液等を構成する緩衝剤が挙げられる。
ＯＥＧ化セルロースオリゴマーの水分散液とする場合、ＯＥＧ化セルロースオリゴマーの含有量（濃度）は、特に限定されず、例えば０．０１～５％（ｗ／ｖ）でもよく、０．０３～０．３％（ｗ／ｖ）でもよい。
本明細書において、「％（ｗ／ｖ）」は、質量体積パーセント濃度であり、１００ｍＬの体積にしめる対象物質の質量（ｇ）である。
一実施形態に係る抗ＰＥＧ抗体結合材料は、ＯＥＧ化セルロースオリゴマー（例えば上記セルロースオリゴマー集合体）を、プラスチックやガラスなどの基材の表面に固定化したものであってもよい。
一実施形態において、上記抗ＰＥＧ抗体結合材料を含むバイオセンサは、メトキシ末端ＰＥＧ選択的抗ＰＥＧ抗体を検出し定量するバイオアッセイを行うために用いられるものである。該バイオセンサは、かかるバイオアッセイを行うのに用いられる各要素またはそれら要素の集成体もしくは組合せをいう。
従って、バイオセンサは、例えば、ＯＥＧ化セルロースオリゴマーからなる粉末のみで構成されてもよく、ＯＥＧ化セルロースオリゴマーの水分散液のみで構成されてもよい。あるいは、バイオセンサは、これらＯＥＧ化セルロースオリゴマーの粉末または水分散液とともに、プローブとしての二次抗体を組み合わせたキット（即ち、抗ＰＥＧ抗体検出キット）でもよく、さらに、例えば二次抗体が酵素標識抗体の場合、その酵素に対応する基質を組み合わせた抗ＰＥＧ抗体検出キットでもよい。
後述する実施例のとおり、ＯＥＧ化セルロースオリゴマーによるメトキシ末端ＰＥＧ選択的抗ＰＥＧ抗体の検出感度は、ＯＥＧ化セルロースオリゴマーを被検体とインキュベートする際に、ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）などのアルブミンを添加することによって向上する。
そのため、バイオセンサにはＢＳＡなどのアルブミンが含まれてもよく、ＯＥＧ化セルロースオリゴマーと被検体をインキュベートする際にアルブミンが添加されることが好ましい。その場合、アルブミンは、上記抗ＰＥＧ抗体結合材料に含まれてもよく、抗ＰＥＧ抗体結合材料とは別体として抗ＰＥＧ抗体検出キットに含まれてもよい。アルブミンが抗ＰＥＧ抗体結合材料に含まれる場合、ＯＥＧ化セルロースオリゴマーとともにアルブミンが混合された粉末状であってもよく、ＯＥＧ化セルロースオリゴマーの水分散液中にアルブミンが溶解されていてもよい。ＯＥＧ化セルロースオリゴマーとアルブミンの比率は、特に限定されず、例えばＯＥＧ化セルロースオリゴマー／アルブミンの質量比で、０．００３／１～０．３／１でもよく、０．０１／１～０．１／１でもよい。なお、被検体が血液のようにアルブミンを含むものである場合、追加的にアルブミンを添加してもよく、添加しなくてもよい。
一実施形態に係る抗ＰＥＧ抗体の検出方法は、以下の工程を含む。
（１） ＯＥＧ化セルロースオリゴマーを、メトキシ末端ＰＥＧ選択的抗ＰＥＧ抗体との結合を可能にするに条件下で、被検体とインキュベートする工程、
（２） 該被検体とのインキュベート後のＯＥＧ化セルロースオリゴマーを、二次抗体の結合を可能にする条件下で、二次抗体を含む試料とインキュベートする工程、および、
（３） 該試料とのインキュベート後のＯＥＧ化セルロースオリゴマーを用いて、プローブとしての二次抗体により、被検体に含まれるメトキシ末端ＰＥＧ選択的抗ＰＥＧ抗体を検出する工程。
（１） ＯＥＧ化セルロースオリゴマーを、メトキシ末端ＰＥＧ選択的抗ＰＥＧ抗体との結合を可能にするに条件下で、被検体とインキュベートする工程、
（２） 該被検体とのインキュベート後のＯＥＧ化セルロースオリゴマーを、二次抗体の結合を可能にする条件下で、二次抗体を含む試料とインキュベートする工程、および、
（３） 該試料とのインキュベート後のＯＥＧ化セルロースオリゴマーを用いて、プローブとしての二次抗体により、被検体に含まれるメトキシ末端ＰＥＧ選択的抗ＰＥＧ抗体を検出する工程。
工程（１）では、上記抗ＰＥＧ抗体結合材料としてのＯＥＧ化セルロースオリゴマーの水分散液とともに被検体を容器に添加し、混合分散させた後、インキュベートする。
被検体とは、メトキシ末端ＰＥＧ選択的抗ＰＥＧ抗体を含むことが疑われる検査対象物質である。例えば、抗ＰＥＧ抗体の誘導やＰＥＧ修飾医薬品の治療効果に与える影響を評価するために、血中に存在する抗ＰＥＧ抗体を検出する場合、血液またはそれを希釈したものを被検体としてもよい。
工程（１）では、上記のように、メトキシ末端ＰＥＧ選択的抗ＰＥＧ抗体の検出感度を向上するために、ＢＳＡなどのアルブミンを添加してもよい。その場合、系中におけるアルブミンの濃度（被検体に元々含まれるアルブミンを除いたアルブミン濃度）は、特に限定されないが、例えば０．０５～１０％（ｗ／ｖ）であることが好ましく、より好ましくは０．５～５％（ｗ／ｖ）である。
工程（１）でのインキュベーション条件としては、ＯＥＧ化セルロースオリゴマーとメトキシ末端ＰＥＧ選択的抗ＰＥＧ抗体との結合が可能であれば特に限定されず、例えば４～６０℃、１分～２時間でもよい。系中におけるＯＥＧ化セルロースオリゴマーの濃度は特に限定されず、例えば０．０１～１％（ｗ／ｖ）でもよく、０．０１～０．１％（ｗ／ｖ）でもよい。
工程（１）では、このようにしてＯＥＧ化セルロースオリゴマーに対して、検出対象であるメトキシ末端ＰＥＧ選択的抗ＰＥＧ抗体を結合させる（図２参照）。その後、遠心分離および洗浄により、メトキシ末端ＰＥＧ選択的抗ＰＥＧ抗体を結合させたＯＥＧ化セルロースオリゴマーを、被検体から分離する。
工程（２）では、抗ＰＥＧ抗体を結合させたＯＥＧ化セルロースオリゴマーに、二次抗体を含む試料を添加し、混合分散させた後、インキュベートする。
二次抗体を含む試料としては、二次抗体の水溶液が挙げられる。二次抗体としては、メトキシ末端ＰＥＧ選択的抗ＰＥＧ抗体に特異的に結合することでプローブとなるものであれば特に限定されず、例えば、酵素、放射性同位体、ビオチン、蛍光色素などで標識された抗体が挙げられる。
工程（２）でのインキュベーション条件としては、メトキシ末端ＰＥＧ選択的抗ＰＥＧ抗体と二次抗体との結合が可能であれば、特に限定されず、例えば４～６０℃、１分～２時間でもよい。系中における二次抗体の濃度は特に限定されず、例えば１００～１０００ｎｇ／ｍＬでもよい。
工程（２）では、このようにしてＯＥＧ化セルロースオリゴマーに結合した抗ＰＥＧ抗体に対して、プローブとしての二次抗体を結合させる（図２参照）。その後、遠心分離および洗浄により、二次抗体を結合させたＯＥＧ化セルロースオリゴマーを、二次抗体を含む試料から分離する。
工程（３）では、二次抗体を結合させたＯＥＧ化セルロースオリゴマーを用いて、プローブとしての二次抗体により、被検体に含まれるメトキシ末端ＰＥＧ選択的抗ＰＥＧ抗体を検出し、その定量を行う。
例えば、二次抗体として酵素標識抗体を用いた場合、図２に示すように、上記二次抗体を結合させたＯＥＧ化セルロースオリゴマーに対し、当該酵素に対応する基質を加えて酵素反応を行う。これにより生成される生成物の色素を吸光（呈色）、蛍光または化学発光などで検出および定量を行う。
他の実施形態において、上記抗ＰＥＧ抗体結合材料を含む吸着剤は、メトキシ末端ＰＥＧ選択的抗ＰＥＧ抗体を吸着させることにより、当該抗ＰＥＧ抗体を除去または精製するために用いることができる。
該吸着剤は、ＯＥＧ化セルロースオリゴマーからなる粉末で構成されてもよく、ＯＥＧ化セルロースオリゴマーの水分散液で構成されてもよく、これらに他の任意成分が含まれてもよい。
吸着剤をメトキシ末端ＰＥＧ選択的抗ＰＥＧ抗体の除去に用いる場合、例えば、当該抗ＰＥＧ抗体を含む液体に該吸着剤を添加して、該抗ＰＥＧ抗体とＯＥＧ化セルロースオリゴマーとを接触させることにより、両者を結合させる。その後、該抗ＰＥＧ抗体が吸着した吸着剤を上記液体から遠心分離などにより取り除くことにより、液体から該抗ＰＥＧ抗体を除去することができる。
吸着剤をメトキシ末端ＰＥＧ選択的抗ＰＥＧ抗体の精製に用いる場合、例えば、当該抗ＰＥＧ抗体とともに夾雑物を含む液体に該吸着剤を添加して、該抗ＰＥＧ抗体とＯＥＧ化セルロースオリゴマーとを接触させることにより、両者を結合させる。その後、該抗ＰＥＧ抗体が吸着したＯＥＧ化セルロースオリゴマーを上記液体から遠心分離などにより分離して回収する。回収したＯＥＧ化セルロースオリゴマーに対して、例えば酸処理を施すことにより、該抗ＰＥＧ抗体とＯＥＧ化セルロースオリゴマーとの結合が解除されるので、ＯＥＧ化セルロースオリゴマーから該抗ＰＥＧ抗体を分離回収することができ、純度の高いメトキシ末端ＰＥＧ選択的抗ＰＥＧ抗体を得ることができる。
以下、実施例により更に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
［非修飾セルロースオリゴマー（Ｃｅｌｌ－Ｇｌｃ）の調製］
Ｔ．Ｓｅｒｉｚａｗａら，Ｐｏｌｙｍ．Ｊ．，２０１６年，４８，５３９－５４４に記載の方法に従い、プライマーとしてグルコースを用いて、下記式で表される、平均重合度が１０（ｎ＝１０）の非修飾セルロースオリゴマー（Ｃｅｌｌ－Ｇｌｃ）を合成した。
Ｔ．Ｓｅｒｉｚａｗａら，Ｐｏｌｙｍ．Ｊ．，２０１６年，４８，５３９－５４４に記載の方法に従い、プライマーとしてグルコースを用いて、下記式で表される、平均重合度が１０（ｎ＝１０）の非修飾セルロースオリゴマー（Ｃｅｌｌ－Ｇｌｃ）を合成した。
［ＯＥＧ化セルロースオリゴマー（Ｃｅｌｌ－ＯＥＧｍ）の調製］
上記非特許文献１（Ｔ.Ｎｏｈａｒａら,Ｌａｎｇｍｕｉｒ，２０１６年，３２，４７，１２５２０－１２５２６）に記載の方法に従い、プライマーとしてＯＥＧ化グルコースを用いて、上記式（２）で表されるＯＥＧ化セルロースオリゴマーを合成した。ＯＥＧ化セルロースオリゴマーとしては、式（２）において、ｎ＝１０，ｍ＝４のセルロースオリゴマー（Ｃｅｌｌ－ＯＥＧ４）と、ｎ＝１０，ｍ＝６のセルロースオリゴマー（Ｃｅｌｌ－ＯＥＧ６）と、ｎ＝１１，ｍ＝８のセルロースオリゴマー（Ｃｅｌｌ－ＯＥＧ８）とを合成した。
上記非特許文献１（Ｔ.Ｎｏｈａｒａら,Ｌａｎｇｍｕｉｒ，２０１６年，３２，４７，１２５２０－１２５２６）に記載の方法に従い、プライマーとしてＯＥＧ化グルコースを用いて、上記式（２）で表されるＯＥＧ化セルロースオリゴマーを合成した。ＯＥＧ化セルロースオリゴマーとしては、式（２）において、ｎ＝１０，ｍ＝４のセルロースオリゴマー（Ｃｅｌｌ－ＯＥＧ４）と、ｎ＝１０，ｍ＝６のセルロースオリゴマー（Ｃｅｌｌ－ＯＥＧ６）と、ｎ＝１１，ｍ＝８のセルロースオリゴマー（Ｃｅｌｌ－ＯＥＧ８）とを合成した。
平均重合度は、プロトン核磁気共鳴（ＮＭＲ）装置（ＡＶＡＮＣＥ ＩＩＩ ＨＤ５００（Ｂｒｕｋｅｒ Ｂｉｏｓｐｉｎ、磁場強度：５００ＭＨｚ、積算回数１６回））を用いて、ＯＥＧ化セルロースオリゴマーのセルロース部位における還元末端以外のアノマー位（δ４．２ｐｐｍ付近）と還元末端のアノマー位（δ４．３ｐｐｍ付近）のプロトンの積分値をもとに算出した。
［セルロースオリゴマー（Ｃｅｌｌ－Ｃｅｌｌｏ－ＢｉＰ）の調製］
Ｋ．Ｓｕｇｉｕｒａら，Ｐｏｌｙｍ．Ｊ．，２０２１年，５３．１１３３に記載の方法に従い、プライマーとして両末端にセロビオースを持つオリゴエチレングリコールを用いて、下記式で表される、ｐ＝５，ｑ＝５のセルロースオリゴマー（Ｃｅｌｌ－Ｃｅｌｌｏ－ＢｉＰ）を合成した。
Ｋ．Ｓｕｇｉｕｒａら，Ｐｏｌｙｍ．Ｊ．，２０２１年，５３．１１３３に記載の方法に従い、プライマーとして両末端にセロビオースを持つオリゴエチレングリコールを用いて、下記式で表される、ｐ＝５，ｑ＝５のセルロースオリゴマー（Ｃｅｌｌ－Ｃｅｌｌｏ－ＢｉＰ）を合成した。
［試薬］
試験例で使用した試薬ＢＳＡおよびＯＰＤは以下のとおりである。
・ＢＳＡ：ウシ血清アルブミン、富士フイルム和光純薬製、プロテアーゼ不含
・ＯＰＤ：ｏ－フェニレンジアミン二塩酸塩、ナカライテスク製、水質分析用
試験例で使用した試薬ＢＳＡおよびＯＰＤは以下のとおりである。
・ＢＳＡ：ウシ血清アルブミン、富士フイルム和光純薬製、プロテアーゼ不含
・ＯＰＤ：ｏ－フェニレンジアミン二塩酸塩、ナカライテスク製、水質分析用
［試験例１：二次抗体の結合評価］
抗ＰＥＧ抗体の結合を評価する際に使用する二次抗体の吸着を評価した。二次抗体としては、抗ウサギＩｇＧ，ＨＲＰ標識抗体（ＧｅｎｅＴｅｘ製）を用い、３．３％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ／ＰＢＳ溶液で１０００倍に希釈し、二次抗体の含有量が４１０ｎｇ／ｍＬである二次抗体溶液を調製した。ここで、３．３％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ／ＰＢＳ溶液は、３３０ｍｇのＢＳＡを１０ｍＬのＰＢＳ（ｐＨ７．４、以下同じ）に溶かして調製した。
抗ＰＥＧ抗体の結合を評価する際に使用する二次抗体の吸着を評価した。二次抗体としては、抗ウサギＩｇＧ，ＨＲＰ標識抗体（ＧｅｎｅＴｅｘ製）を用い、３．３％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ／ＰＢＳ溶液で１０００倍に希釈し、二次抗体の含有量が４１０ｎｇ／ｍＬである二次抗体溶液を調製した。ここで、３．３％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ／ＰＢＳ溶液は、３３０ｍｇのＢＳＡを１０ｍＬのＰＢＳ（ｐＨ７．４、以下同じ）に溶かして調製した。
ＰＢＳにセルロースオリゴマーを５ｍｇ／ｍＬ分散させたセルロース分散液を調製した。セルロースオリゴマーとしては、非修飾セルロースオリゴマー（Ｃｅｌｌ－Ｇｌｃ）、ＯＥＧ化セルロースオリゴマー（Ｃｅｌｌ－ＯＥＧ４，Ｃｅｌｌ－ＯＥＧ６，Ｃｅｌｌ－ＯＥＧ８）、およびセルロースオリゴマー（Ｃｅｌｌ－Ｃｅｌｌｏ－ＢｉＰ）を用いて、それぞれのセルロース分散液を調製した。
１．二次抗体の吸着
０．２ｍＬのＰＣＲチューブにセルロース分散液１０μＬを添加し、さらに二次抗体溶液１００μＬを添加して分散させた後、２５℃で１時間インキュベートした。次いで、遠心（１５０００ｒｐｍ、２５℃、５分）し、上清を除去した後、１００μＬのＰＢＳで再分散させ、この遠心と再分散の操作を３回実施することで洗浄した。
０．２ｍＬのＰＣＲチューブにセルロース分散液１０μＬを添加し、さらに二次抗体溶液１００μＬを添加して分散させた後、２５℃で１時間インキュベートした。次いで、遠心（１５０００ｒｐｍ、２５℃、５分）し、上清を除去した後、１００μＬのＰＢＳで再分散させ、この遠心と再分散の操作を３回実施することで洗浄した。
２．酵素反応
次いで、遠心し上清を除去した後、ＰＣＲチューブに基質溶液１００μＬを添加した。基質溶液としては、ＯＰＤを２ｍｇ／ｍＬおよび過酸化水素を０．１１ｖ／ｖ％含むクエン酸リン酸バッファー（ｐＨ４．０）を用いた。基質溶液を添加し、分散させた後、２５℃で３０分間インキュベートした。次いで、３Ｎ硫酸１００μＬを添加し、遠心（１５０００ｒｐｍ、２５℃、１０分）した後、９６穴プレートに上清１００μＬを添加し、プレートリーダー（ＢｉｏＴｅｋ製「Ｓｙｎｅｒｇｙ Ｈ１」）で４９０ｎｍの吸光度を測定した。
次いで、遠心し上清を除去した後、ＰＣＲチューブに基質溶液１００μＬを添加した。基質溶液としては、ＯＰＤを２ｍｇ／ｍＬおよび過酸化水素を０．１１ｖ／ｖ％含むクエン酸リン酸バッファー（ｐＨ４．０）を用いた。基質溶液を添加し、分散させた後、２５℃で３０分間インキュベートした。次いで、３Ｎ硫酸１００μＬを添加し、遠心（１５０００ｒｐｍ、２５℃、１０分）した後、９６穴プレートに上清１００μＬを添加し、プレートリーダー（ＢｉｏＴｅｋ製「Ｓｙｎｅｒｇｙ Ｈ１」）で４９０ｎｍの吸光度を測定した。
結果は、図３に示すとおりであり、非修飾セルロースオリゴマー（Ｃｅｌｌ－Ｇｌｃ）、ＯＥＧ化セルロースオリゴマー（Ｃｅｌｌ－ＯＥＧ４，Ｃｅｌｌ－ＯＥＧ６，Ｃｅｌｌ－ＯＥＧ８）、およびセルロースオリゴマー（Ｃｅｌｌ－Ｃｅｌｌｏ－ＢｉＰ）のいずれに対しても、ＨＲＰ標識抗体（二次抗体）は吸着しないことがわかった。
［試験例２：メトキシ末端ＰＥＧ選択的抗ＰＥＧ抗体の結合評価］
一次抗体であるメトキシ末端ＰＥＧ選択的抗ＰＥＧ抗体（ｍｅｔｈｏｘｙ－ｍＡｂ）としては、ＰＥＧ－Ｂ－４７（ａｂｃａｍ製）を用いた。ＰＥＧ－Ｂ－４７は、動物種：ウサギ、クラス：ＩｇＧ、免疫原：ＰＥＧ－ＫＬＨである、メトキシ末端ＰＥＧ選択的モノクローナル抗ＰＥＧ抗体である（Ｍｅｒｒｙ Ｒ.Ｓｈｅｒｍａｎら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２００８年，５７，２３６－２４６）。ＰＥＧ－Ｂ－４７を３．３％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ／ＰＢＳ溶液で６８５００倍に希釈し、ＰＥＧ－Ｂ－４７の含有量が１１ｎｇ／ｍＬである一次抗体溶液を調製した。
一次抗体であるメトキシ末端ＰＥＧ選択的抗ＰＥＧ抗体（ｍｅｔｈｏｘｙ－ｍＡｂ）としては、ＰＥＧ－Ｂ－４７（ａｂｃａｍ製）を用いた。ＰＥＧ－Ｂ－４７は、動物種：ウサギ、クラス：ＩｇＧ、免疫原：ＰＥＧ－ＫＬＨである、メトキシ末端ＰＥＧ選択的モノクローナル抗ＰＥＧ抗体である（Ｍｅｒｒｙ Ｒ.Ｓｈｅｒｍａｎら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２００８年，５７，２３６－２４６）。ＰＥＧ－Ｂ－４７を３．３％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ／ＰＢＳ溶液で６８５００倍に希釈し、ＰＥＧ－Ｂ－４７の含有量が１１ｎｇ／ｍＬである一次抗体溶液を調製した。
セルロース分散液、二次抗体溶液および基質溶液については、試験例１と同じものを用いた。
１．一次抗体の抗原抗体反応
０．２ｍＬのＰＣＲチューブにセルロース分散液（５ｍｇ／ｍＬ，ＰＢＳ）１０μＬを添加し、さらに一次抗体溶液１００μＬを添加し、分散させた後、２５℃で１時間インキュベートして抗原抗体反応を実施した。この抗原抗体反応の系は、セルロースオリゴマーの濃度が０．４５ｍｇ／ｍＬ、一次抗体の濃度が１０ｎｇ／ｍＬ、ＢＳＡの濃度が３％（ｗ／ｖ）である。
０．２ｍＬのＰＣＲチューブにセルロース分散液（５ｍｇ／ｍＬ，ＰＢＳ）１０μＬを添加し、さらに一次抗体溶液１００μＬを添加し、分散させた後、２５℃で１時間インキュベートして抗原抗体反応を実施した。この抗原抗体反応の系は、セルロースオリゴマーの濃度が０．４５ｍｇ／ｍＬ、一次抗体の濃度が１０ｎｇ／ｍＬ、ＢＳＡの濃度が３％（ｗ／ｖ）である。
インキュベート後、遠心（１５０００ｒｐｍ、２５℃、５分）し、上清を除去した後、１００μＬのＰＢＳで再分散させ、この遠心と再分散の操作を３回実施することで洗浄した。
２．二次抗体の抗原抗体反応
次いで、遠心（１５０００ｒｐｍ、２５℃、５分）し上清を除去した後、ＰＣＲチューブに二次抗体溶液（二次抗体含有量：４１０ｎｇ／ｍＬの３．３％ＢＳＡ／ＰＢＳ溶液）１００μＬを添加して分散させ、２５℃で１時間インキュベートした。その後、遠心（１５０００ｒｐｍ、２５℃、５分）し、上清を除去した後、１００μＬのＰＢＳで再分散させ、この遠心と再分散の操作を３回実施することで洗浄した。
次いで、遠心（１５０００ｒｐｍ、２５℃、５分）し上清を除去した後、ＰＣＲチューブに二次抗体溶液（二次抗体含有量：４１０ｎｇ／ｍＬの３．３％ＢＳＡ／ＰＢＳ溶液）１００μＬを添加して分散させ、２５℃で１時間インキュベートした。その後、遠心（１５０００ｒｐｍ、２５℃、５分）し、上清を除去した後、１００μＬのＰＢＳで再分散させ、この遠心と再分散の操作を３回実施することで洗浄した。
３．酵素反応
次いで、遠心（１５０００ｒｐｍ、２５℃、５分）し上清を除去した後、ＰＣＲチューブに基質溶液（ＯＰＤ：２ｍｇ／ｍＬ、Ｈ２Ｏ２：０．１１ｖ／ｖ％、ｐＨ４．０クエン酸リン酸バッファー）１００μＬを添加し、分散させ、２５℃で３０分間インキュベートした。その後、３Ｎ硫酸１００μＬを添加し、遠心（１５０００ｒｐｍ、２５℃、１０分）した。上清を分取し、超純水で２倍希釈した後、１００μＬを９６穴プレートに添加し、プレートリーダー（ＢｉｏＴｅｋ製「Ｓｙｎｅｒｇｙ Ｈ１」）で４９０ｎｍの吸光度を測定した。
次いで、遠心（１５０００ｒｐｍ、２５℃、５分）し上清を除去した後、ＰＣＲチューブに基質溶液（ＯＰＤ：２ｍｇ／ｍＬ、Ｈ２Ｏ２：０．１１ｖ／ｖ％、ｐＨ４．０クエン酸リン酸バッファー）１００μＬを添加し、分散させ、２５℃で３０分間インキュベートした。その後、３Ｎ硫酸１００μＬを添加し、遠心（１５０００ｒｐｍ、２５℃、１０分）した。上清を分取し、超純水で２倍希釈した後、１００μＬを９６穴プレートに添加し、プレートリーダー（ＢｉｏＴｅｋ製「Ｓｙｎｅｒｇｙ Ｈ１」）で４９０ｎｍの吸光度を測定した。
各セルロースオリゴマーについて測定した吸光度から、セルロースオリゴマー無しで同様に実験した場合の吸光度を減算することにより、評価を行う吸光度を算出した。実験は、各セルロースオリゴマーについて３回ずつ行い、その平均の吸光度を求めた。
結果は図４に示すとおりである。非修飾セルロースオリゴマー（Ｃｅｌｌ－Ｇｌｃ）およびセルロースオリゴマー（Ｃｅｌｌ－Ｃｅｌｌｏ－ＢｉＰ）では、メトキシ末端ＰＥＧ選択的抗ＰＥＧ抗体がほとんど結合していないことが分かる。
これに対し、ＯＥＧ化セルロースオリゴマー（Ｃｅｌｌ－ＯＥＧ４，Ｃｅｌｌ－ＯＥＧ６，Ｃｅｌｌ－ＯＥＧ８）では、メトキシ末端ＰＥＧ選択的抗ＰＥＧ抗体が結合していることが分かる。試験例１において、これらのセルロースオリゴマーにはＨＲＰ標識抗体（二次抗体）が吸着しないことからも、ＯＥＧ化セルロースオリゴマーに対するメトキシ末端ＰＥＧ選択的抗ＰＥＧ抗体の特異的な結合が裏付けられている。
また、ＯＥＧ化セルロースオリゴマーへの抗ＰＥＧ抗体の結合量は、Ｃｅｌｌ－ＯＥＧ４が最大であり、オリゴエチレングリコール基におけるエチレンオキシド単位の付加モル数が大きくなるほど、結合量が減少していた。
［試験例３：バックボーン選択的抗ＰＥＧ抗体の結合評価］
一次抗体であるバックボーン選択的抗ＰＥＧ抗体（ｂａｃｋｂｏｎｅ－ｍＡｂ）としては、ｃｌｏｎｅ６．３（Ｍｅｒｃｋ製、動物種：マウス、クラス：ＩｇＧ１）を用いた。ｃｌｏｎｅ６．３は、これまでに７５０Ｄａ以上のＰＥＧに結合することが明らかになっている（Ｓａｍｕｅｌ Ｋ．Ｌａｉ，Ｃｏｍｍｕｎ．Ｃｈｅｍ．２０２０年，３，１２４）。ｃｌｏｎｅ６．３を３．３％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ／ＰＢＳ溶液で１４５５００倍に希釈し、ｃｌｏｎｅ６．３の含有量が１１ｎｇ／ｍＬである一次抗体溶液を調製した。
一次抗体であるバックボーン選択的抗ＰＥＧ抗体（ｂａｃｋｂｏｎｅ－ｍＡｂ）としては、ｃｌｏｎｅ６．３（Ｍｅｒｃｋ製、動物種：マウス、クラス：ＩｇＧ１）を用いた。ｃｌｏｎｅ６．３は、これまでに７５０Ｄａ以上のＰＥＧに結合することが明らかになっている（Ｓａｍｕｅｌ Ｋ．Ｌａｉ，Ｃｏｍｍｕｎ．Ｃｈｅｍ．２０２０年，３，１２４）。ｃｌｏｎｅ６．３を３．３％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ／ＰＢＳ溶液で１４５５００倍に希釈し、ｃｌｏｎｅ６．３の含有量が１１ｎｇ／ｍＬである一次抗体溶液を調製した。
二次抗体としては、抗マウスＩｇＧ１，ＨＲＰ標識抗体（ａｂｃａｍ製）を用い、３．３％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ／ＰＢＳ溶液で２２７３倍に希釈し、二次抗体の含有量が４４０ｎｇ／ｍＬである二次抗体溶液を調製した。セルロース分散液および基質溶液については、試験例１と同じものを用いた。
１．一次抗体の抗原抗体反応
０．２ｍＬのＰＣＲチューブにセルロース分散液１０μＬを添加し、さらに一次抗体溶液１００μＬを添加し、分散させた後、２５℃で１時間インキュベートして抗原抗体反応を実施した。この抗原抗体反応の系は、セルロースオリゴマーの濃度が０．４５ｍｇ／ｍＬ、一次抗体の濃度が１０ｎｇ／ｍＬ、ＢＳＡの濃度が３％（ｗ／ｖ）である。インキュベート後、遠心（１５０００ｒｐｍ、２５℃、５分）し、上清を除去した後、１００μＬのＰＢＳで再分散させ、この遠心と再分散の操作を３回実施することで洗浄した。
０．２ｍＬのＰＣＲチューブにセルロース分散液１０μＬを添加し、さらに一次抗体溶液１００μＬを添加し、分散させた後、２５℃で１時間インキュベートして抗原抗体反応を実施した。この抗原抗体反応の系は、セルロースオリゴマーの濃度が０．４５ｍｇ／ｍＬ、一次抗体の濃度が１０ｎｇ／ｍＬ、ＢＳＡの濃度が３％（ｗ／ｖ）である。インキュベート後、遠心（１５０００ｒｐｍ、２５℃、５分）し、上清を除去した後、１００μＬのＰＢＳで再分散させ、この遠心と再分散の操作を３回実施することで洗浄した。
２．二次抗体の抗原抗体反応
次いで、遠心（１５０００ｒｐｍ、２５℃、５分）し上清を除去した後、ＰＣＲチューブに二次抗体溶液１００μＬを添加して分散させ、２５℃で１時間インキュベートした。その後、遠心（１５０００ｒｐｍ、２５℃、５分）し、上清を除去した後、１００μＬのＰＢＳで再分散させ、この遠心と再分散の操作を３回実施することで洗浄した。
次いで、遠心（１５０００ｒｐｍ、２５℃、５分）し上清を除去した後、ＰＣＲチューブに二次抗体溶液１００μＬを添加して分散させ、２５℃で１時間インキュベートした。その後、遠心（１５０００ｒｐｍ、２５℃、５分）し、上清を除去した後、１００μＬのＰＢＳで再分散させ、この遠心と再分散の操作を３回実施することで洗浄した。
３．酵素反応
次いで、遠心（１５０００ｒｐｍ、２５℃、５分）し上清を除去した後、ＰＣＲチューブに基質溶液（ＯＰＤ：２ｍｇ／ｍＬ、Ｈ２Ｏ２：０．１１ｖ／ｖ％、ｐＨ４．０クエン酸リン酸バッファー）１００μＬを添加し、分散させ、２５℃で３０分間インキュベートした。その後、３Ｎ硫酸１００μＬを添加し、遠心（１５０００ｒｐｍ、２５℃、１０分）した。上清１００μＬを９６穴プレートに添加し、プレートリーダー（ＢｉｏＴｅｋ製「Ｓｙｎｅｒｇｙ Ｈ１」）で４９０ｎｍの吸光度を測定した。
次いで、遠心（１５０００ｒｐｍ、２５℃、５分）し上清を除去した後、ＰＣＲチューブに基質溶液（ＯＰＤ：２ｍｇ／ｍＬ、Ｈ２Ｏ２：０．１１ｖ／ｖ％、ｐＨ４．０クエン酸リン酸バッファー）１００μＬを添加し、分散させ、２５℃で３０分間インキュベートした。その後、３Ｎ硫酸１００μＬを添加し、遠心（１５０００ｒｐｍ、２５℃、１０分）した。上清１００μＬを９６穴プレートに添加し、プレートリーダー（ＢｉｏＴｅｋ製「Ｓｙｎｅｒｇｙ Ｈ１」）で４９０ｎｍの吸光度を測定した。
セルロースオリゴマーについて測定した吸光度から、セルロースオリゴマー無しで同様に実験した場合（コントロール）の吸光度を減算することにより、評価を行う吸光度を算出した。実験は、３回の実験を３セット行い、各セットの平均値のさらなる平均の吸光度を求めた。
結果は、図５に示すとおりである。コントロールの吸光度を差し引いて求めた吸光度はほぼ０であり、ＯＥＧ化セルロースオリゴマー（Ｃｅｌｌ－ＯＥＧ４，Ｃｅｌｌ－ＯＥＧ６，Ｃｅｌｌ－ＯＥＧ８）には、バックボーン選択的抗ＰＥＧ抗体が結合しないことが分かった。そのため、本実施形態に係るセルロースオリゴマーであると、メトキシ末端ＰＥＧ選択的抗ＰＥＧ抗体を選択的に検出できると考えられる。
［試験例４：ブランク測定におけるＢＳＡ濃度依存性］
二次抗体が容器に対して非特異的に吸着すると、検出感度が低下する要因となる。そこで、容器に対する二次抗体の非特異的吸着を抑制するために、抗原抗体反応に対して不活性なタンパク質であるＢＳＡを反応系に共存させて、その影響を調べた。
二次抗体が容器に対して非特異的に吸着すると、検出感度が低下する要因となる。そこで、容器に対する二次抗体の非特異的吸着を抑制するために、抗原抗体反応に対して不活性なタンパク質であるＢＳＡを反応系に共存させて、その影響を調べた。
１．ＢＳＡの吸着
０．２ｍＬのＰＣＲチューブにＰＢＳを１０μＬ添加し、さらにＢＳＡ溶液１００μＬを添加し、分散させた。ＢＳＡ溶液としては、１．１ｍｇのＢＳＡを１ｍＬのＰＢＳに溶かして調製した０．１１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ／ＰＢＳ溶液、３．３ｍｇのＢＳＡを１ｍＬのＰＢＳに溶かして調製した０．３３％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ／ＰＢＳ溶液、１１ｍｇのＢＳＡを１ｍＬのＰＢＳに溶かして調製した１．１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ／ＰＢＳ溶液、３３ｍｇのＢＳＡを１ｍＬのＰＢＳに溶かして調製した３．３％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ／ＰＢＳ溶液、および、ＢＳＡ無添加の０％（ｗ／ｖ）ＰＢＳを用いた。
０．２ｍＬのＰＣＲチューブにＰＢＳを１０μＬ添加し、さらにＢＳＡ溶液１００μＬを添加し、分散させた。ＢＳＡ溶液としては、１．１ｍｇのＢＳＡを１ｍＬのＰＢＳに溶かして調製した０．１１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ／ＰＢＳ溶液、３．３ｍｇのＢＳＡを１ｍＬのＰＢＳに溶かして調製した０．３３％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ／ＰＢＳ溶液、１１ｍｇのＢＳＡを１ｍＬのＰＢＳに溶かして調製した１．１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ／ＰＢＳ溶液、３３ｍｇのＢＳＡを１ｍＬのＰＢＳに溶かして調製した３．３％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ／ＰＢＳ溶液、および、ＢＳＡ無添加の０％（ｗ／ｖ）ＰＢＳを用いた。
ＢＳＡ溶液を添加、分散後、２５℃で１時間インキュベートした後、１００μＬのＰＢＳで内容物を３回置換することにより、ＰＣＲチューブを洗浄した。
２．二次抗体の吸着
次いで、洗浄後のＰＣＲチューブに二次抗体溶液（二次抗体含有量：４１０ｎｇ／ｍＬの３．３％ＢＳＡ／ＰＢＳ溶液）１００μＬを添加し、２５℃で１時間インキュベートした。二次抗体溶液としては試験例１と同じものを用いた。
次いで、洗浄後のＰＣＲチューブに二次抗体溶液（二次抗体含有量：４１０ｎｇ／ｍＬの３．３％ＢＳＡ／ＰＢＳ溶液）１００μＬを添加し、２５℃で１時間インキュベートした。二次抗体溶液としては試験例１と同じものを用いた。
インキュベート後、１００μＬのＰＢＳで内容物を３回置換することにより、ＰＣＲチューブを洗浄した。
３．酵素反応
次いで、ＰＢＳを除去した後、ＰＣＲチューブに基質溶液（ＯＰＤ：２ｍｇ／ｍＬ、Ｈ２Ｏ２：０．１１ｖ／ｖ％、ｐＨ４．０クエン酸リン酸バッファー）１００μＬを添加し、２５℃で３０分間インキュベートした。基質溶液としては試験例１と同じものを用いた。その後、３Ｎ硫酸１００μＬを添加した。
次いで、ＰＢＳを除去した後、ＰＣＲチューブに基質溶液（ＯＰＤ：２ｍｇ／ｍＬ、Ｈ２Ｏ２：０．１１ｖ／ｖ％、ｐＨ４．０クエン酸リン酸バッファー）１００μＬを添加し、２５℃で３０分間インキュベートした。基質溶液としては試験例１と同じものを用いた。その後、３Ｎ硫酸１００μＬを添加した。
次いで、９６穴プレートに、酵素反応後の溶液１００μＬを添加し、プレートリーダー（ＢｉｏＴｅｋ製「Ｓｙｎｅｒｇｙ Ｈ１」）で４９０ｎｍの吸光度を測定した。実験は３回行い、その平均の吸光度を求めた。
結果は図６に示すとおりである。ＢＳＡの濃度が増大するにしたがって吸光度が低下しており、バックグラウンドが低下した。ＢＳＡが容器（チューブ）に吸着し、二次抗体の非特異的吸着を抑制できたためと考えられる。
［試験例５：ブランク測定におけるＢＳＡ濃度依存性（セルロースオリゴマー有り）］
セルロースオリゴマーを添加した場合における、ＢＳＡの濃度による二次抗体の非特異的吸着への影響を調べた。
セルロースオリゴマーを添加した場合における、ＢＳＡの濃度による二次抗体の非特異的吸着への影響を調べた。
１．ＢＳＡの吸着
０．２ｍＬのＰＣＲチューブにセルロース分散液１０μＬを添加し、さらにＢＳＡ溶液１００μＬを添加し、分散させた。セルロース分散液としては、ＰＢＳにＯＥＧ化セルロースオリゴマー（Ｃｅｌｌ－ＯＥＧ４）を５ｍｇ／ｍＬ分散させたものを用いた。ＢＳＡ溶液としては、試験例４と同じ５種類の溶液を用いた。
０．２ｍＬのＰＣＲチューブにセルロース分散液１０μＬを添加し、さらにＢＳＡ溶液１００μＬを添加し、分散させた。セルロース分散液としては、ＰＢＳにＯＥＧ化セルロースオリゴマー（Ｃｅｌｌ－ＯＥＧ４）を５ｍｇ／ｍＬ分散させたものを用いた。ＢＳＡ溶液としては、試験例４と同じ５種類の溶液を用いた。
ＢＳＡ溶液を添加、分散後、２５℃で１時間インキュベートした後、遠心（１５０００ｒｐｍ、２５℃、５分）し、上清を除去した後、１００μＬのＰＢＳで再分散させ、この遠心と再分散の操作を３回実施することで洗浄した。
２．二次抗体の吸着
次いで、遠心（１５０００ｒｐｍ、２５℃、５分）し上清を除去した後、ＰＣＲチューブに二次抗体溶液（二次抗体含有量：４１０ｎｇ／ｍＬの３．３％ＢＳＡ／ＰＢＳ溶液）１００μＬを添加して分散させ、２５℃で１時間インキュベートした。二次抗体溶液としては試験例４と同じものを用いた。
次いで、遠心（１５０００ｒｐｍ、２５℃、５分）し上清を除去した後、ＰＣＲチューブに二次抗体溶液（二次抗体含有量：４１０ｎｇ／ｍＬの３．３％ＢＳＡ／ＰＢＳ溶液）１００μＬを添加して分散させ、２５℃で１時間インキュベートした。二次抗体溶液としては試験例４と同じものを用いた。
インキュベート後、遠心（１５０００ｒｐｍ、２５℃、５分）し、上清を除去した後、１００μＬのＰＢＳで再分散させ、この遠心と再分散の操作を３回実施することで洗浄した。
３．酵素反応
次いで、遠心（１５０００ｒｐｍ、２５℃、５分）し上清を除去した後、ＰＣＲチューブに基質溶液（ＯＰＤ：２ｍｇ／ｍＬ、Ｈ２Ｏ２：０．１１ｖ／ｖ％、ｐＨ４．０クエン酸リン酸バッファー）１００μＬを添加し、分散させ、２５℃で３０分間インキュベートした。基質溶液としては試験例４と同じものを用いた。その後、３Ｎ硫酸１００μＬを添加し、遠心（１５０００ｒｐｍ、２５℃、１０分）した。
次いで、遠心（１５０００ｒｐｍ、２５℃、５分）し上清を除去した後、ＰＣＲチューブに基質溶液（ＯＰＤ：２ｍｇ／ｍＬ、Ｈ２Ｏ２：０．１１ｖ／ｖ％、ｐＨ４．０クエン酸リン酸バッファー）１００μＬを添加し、分散させ、２５℃で３０分間インキュベートした。基質溶液としては試験例４と同じものを用いた。その後、３Ｎ硫酸１００μＬを添加し、遠心（１５０００ｒｐｍ、２５℃、１０分）した。
次いで、上清１００μＬを９６穴プレートに添加し、プレートリーダー（ＢｉｏＴｅｋ製「Ｓｙｎｅｒｇｙ Ｈ１」）で４９０ｎｍの吸光度を測定した。実験は３回行い、その平均の吸光度を求めた。
結果は図７に示すとおりである。ＢＳＡの濃度が増大するにしたがって吸光度が低下しており、バックグラウンドが低下した。二次抗体での処理に先立ち、高濃度のＢＳＡを添加してインキュベートすることにより、次に添加する二次抗体の容器への非特異的吸着を抑制することができ、検出感度（Ｓ／Ｎ比）を向上できることが分かった。
［試験例６：セルロースオリゴマーに対するＢＳＡの吸着評価］
０．２ｍＬのＰＣＲチューブにセルロース分散液４８μＬを添加し、さらにＢＳＡ溶液７２μＬを添加し、分散させた。セルロース分散液としては、ＰＢＳにＯＥＧ化セルロースオリゴマー（Ｃｅｌｌ－ＯＥＧ４）を５ｍｇ／ｍＬ分散させたものを用いた。ＢＳＡ溶液としては、５０ｍｇのＢＳＡを１ｍＬのＰＢＳに溶かして調製した５％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ／ＰＢＳ溶液を用いた。両者を混合後の液中では、セルロースオリゴマーの濃度が２ｍｇ／ｍＬであり、ＢＳＡの濃度が３％（ｗ／ｖ）である。
０．２ｍＬのＰＣＲチューブにセルロース分散液４８μＬを添加し、さらにＢＳＡ溶液７２μＬを添加し、分散させた。セルロース分散液としては、ＰＢＳにＯＥＧ化セルロースオリゴマー（Ｃｅｌｌ－ＯＥＧ４）を５ｍｇ／ｍＬ分散させたものを用いた。ＢＳＡ溶液としては、５０ｍｇのＢＳＡを１ｍＬのＰＢＳに溶かして調製した５％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ／ＰＢＳ溶液を用いた。両者を混合後の液中では、セルロースオリゴマーの濃度が２ｍｇ／ｍＬであり、ＢＳＡの濃度が３％（ｗ／ｖ）である。
上記混合後、２５℃で１時間インキュベートし、次いで、遠心（１５０００ｒｐｍ、２５℃、５分）した後、上清２５μＬを分取して、超純水で２０倍希釈した後、５０μＬをマイクロセルに添加した。
そして、波長２００～８００ｎｍでＵＶ－ｖｉｓ（紫外可視分光法）分析を行い、２８０ｎｍの吸光度を求めた。測定は３回実施し、その平均値を求めた。
また、ブランクとして、セルロース分散液の代わりにセルロースオリゴマー（Ｃｅｌｌ－ＯＥＧ４）を含まないＰＢＳを４８μＬ添加し、その他は同様にして吸光度の平均値を求めた。
結果は図８に示すとおりである。図８において、「セルロース（＋）」はセルロース分散液を用いた例、「セルロース（－）」はブランクとしてセルロースオリゴマー（Ｃｅｌｌ－ＯＥＧ４）を含まないＰＢＳを用いた例である。
図８に示すように、セルロースオリゴマー（Ｃｅｌｌ－ＯＥＧ４）を添加した場合も未添加の場合もほぼ同じ吸光度を示した。このことから、ＢＳＡはセルロースオリゴマー（Ｃｅｌｌ－ＯＥＧ４）にほとんど吸着しないことがわかった。
［試験例７：ＢＳＡ存在下でのメトキシ末端ＰＥＧ選択的抗ＰＥＧ抗体の検出］
セルロース分散液としては、ＰＢＳにＯＥＧ化セルロースオリゴマー（Ｃｅｌｌ－ＯＥＧ４）を５ｍｇ／ｍＬ分散させたものを用いた。
一次抗体溶液としては、上記ＰＥＧ－Ｂ－４７を３．３％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ／ＰＢＳ溶液で希釈し、一次抗体の濃度が１．１ｎｇ／ｍＬ、２．２ｎｇ／ｍＬ、５．５ｎｇ／ｍＬ、１１ｎｇ／ｍＬ、２２ｎｇ／ｍＬ、５５ｎｇ／ｍＬ、１１０ｎｇ／ｍＬ（６８５０倍希釈）となるようにそれぞれ調製したものを用いた。
二次抗体溶液および基質溶液については、試験例１と同じものを用いた。
１．一次抗体の抗原抗体反応
０．２ｍＬのＰＣＲチューブにセルロース分散液（Ｃｅｌｌ－ＯＥＧ４，５ｍｇ／ｍＬ，ＰＢＳ）１０μＬを添加し、一次抗体溶液１００μＬを添加し、分散させた後、２５℃で１時間インキュベートして抗原抗体反応を実施した。この抗原抗体反応の系は、セルロースオリゴマーの濃度が０．４５ｍｇ／ｍＬ、一次抗体の濃度が１～１００ｎｇ／ｍＬ、ＢＳＡの濃度が３％（ｗ／ｖ）である。また、ブランクとして、一次抗体を含まない３．３％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ／ＰＢＳ溶液を１００μＬ添加して１時間インキュベートした。
０．２ｍＬのＰＣＲチューブにセルロース分散液（Ｃｅｌｌ－ＯＥＧ４，５ｍｇ／ｍＬ，ＰＢＳ）１０μＬを添加し、一次抗体溶液１００μＬを添加し、分散させた後、２５℃で１時間インキュベートして抗原抗体反応を実施した。この抗原抗体反応の系は、セルロースオリゴマーの濃度が０．４５ｍｇ／ｍＬ、一次抗体の濃度が１～１００ｎｇ／ｍＬ、ＢＳＡの濃度が３％（ｗ／ｖ）である。また、ブランクとして、一次抗体を含まない３．３％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ／ＰＢＳ溶液を１００μＬ添加して１時間インキュベートした。
インキュベート後、遠心（１５０００ｒｐｍ、２５℃、５分）し、上清を除去した後、１００μＬのＰＢＳで再分散させ、この遠心と再分散の操作を３回実施することで洗浄した。
２．二次抗体の抗原抗体反応
次いで、遠心（１５０００ｒｐｍ、２５℃、５分）し上清を除去した後、ＰＣＲチューブに二次抗体溶液（二次抗体含有量：４１０ｎｇ／ｍＬの３．３％ＢＳＡ／ＰＢＳ溶液）１００μＬを添加して分散させ、２５℃で１時間インキュベートした。その後、遠心（１５０００ｒｐｍ、２５℃、５分）し、上清を除去した後、１００μＬのＰＢＳで再分散させ、この遠心と再分散の操作を３回実施することで洗浄した。
次いで、遠心（１５０００ｒｐｍ、２５℃、５分）し上清を除去した後、ＰＣＲチューブに二次抗体溶液（二次抗体含有量：４１０ｎｇ／ｍＬの３．３％ＢＳＡ／ＰＢＳ溶液）１００μＬを添加して分散させ、２５℃で１時間インキュベートした。その後、遠心（１５０００ｒｐｍ、２５℃、５分）し、上清を除去した後、１００μＬのＰＢＳで再分散させ、この遠心と再分散の操作を３回実施することで洗浄した。
３．酵素反応
次いで、遠心（１５０００ｒｐｍ、２５℃、５分）し上清を除去した後、ＰＣＲチューブに基質溶液（ＯＰＤ：２ｍｇ／ｍＬ、Ｈ２Ｏ２：０．１１ｖ／ｖ％、ｐＨ４．０クエン酸リン酸バッファー）１００μＬを添加し、分散させ、２５℃で３０分間インキュベートした。その後、３Ｎ硫酸１００μＬを添加し、遠心（１５０００ｒｐｍ、２５℃、１０分）した。上清を分取し、超純水で５倍希釈した後、１００μＬを９６穴プレートに添加し、プレートリーダー（ＢｉｏＴｅｋ製「Ｓｙｎｅｒｇｙ Ｈ１」）で４９０ｎｍの吸光度を測定した。
次いで、遠心（１５０００ｒｐｍ、２５℃、５分）し上清を除去した後、ＰＣＲチューブに基質溶液（ＯＰＤ：２ｍｇ／ｍＬ、Ｈ２Ｏ２：０．１１ｖ／ｖ％、ｐＨ４．０クエン酸リン酸バッファー）１００μＬを添加し、分散させ、２５℃で３０分間インキュベートした。その後、３Ｎ硫酸１００μＬを添加し、遠心（１５０００ｒｐｍ、２５℃、１０分）した。上清を分取し、超純水で５倍希釈した後、１００μＬを９６穴プレートに添加し、プレートリーダー（ＢｉｏＴｅｋ製「Ｓｙｎｅｒｇｙ Ｈ１」）で４９０ｎｍの吸光度を測定した。
一次抗体の各濃度について測定した吸光度を求めた。実験は、３回の実験を３セット行い、各セットの平均値のさらなる平均の吸光度を求めた。
結果は図９および図１０に示すとおりである。横軸は、一次抗体の抗原抗体反応における反応系での一次抗体（ｍｅｔｈｏｘｙ－ｍＡｂ）の濃度を示し、縦軸は、４９０ｎｍでの吸光度を示す。図１０は、低濃度域（０～１０ｎｇ／ｍＬ）での結果を拡大して示すグラフである。
図９および図１０に示すように、３％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ存在下で、メトキシ末端ＰＥＧ選択的抗ＰＥＧ抗体を定量検出できることが分かった。図１０に示すように、低濃度域における傾き（ｓｌｏｐｅ）は０．０６１２であり、標準偏差σは０．００１３３であり、決定係数Ｒ２は０．９９７であった。検出下限（＝３σ／ｓｌｏｐｅ）は０．０６５ｎｇ／ｍＬであり、極めて高い感度を示した。
［試験例８：１０％ＦＢＳ共存下での検出下限］
アルブミンは血清中に最も多く含まれるタンパク質ではあるものの、血清にはアルブミンの他にグロブリン、糖、アミノ酸、尿素、および金属イオンなどのさまざまな夾雑物質が含まれている。ここでは実際の血液中に存在するメトキシ末端ＰＥＧ選択的抗ＰＥＧ抗体の検出を目指し、モデル血清としてウシ胎児血清（ＦＢＳ）共存下でのメトキシ末端ＰＥＧ選択的抗ＰＥＧ抗体の検出ならびに定量を検討した。
アルブミンは血清中に最も多く含まれるタンパク質ではあるものの、血清にはアルブミンの他にグロブリン、糖、アミノ酸、尿素、および金属イオンなどのさまざまな夾雑物質が含まれている。ここでは実際の血液中に存在するメトキシ末端ＰＥＧ選択的抗ＰＥＧ抗体の検出を目指し、モデル血清としてウシ胎児血清（ＦＢＳ）共存下でのメトキシ末端ＰＥＧ選択的抗ＰＥＧ抗体の検出ならびに定量を検討した。
試験例８において、セルロース分散液としては、ＰＢＳにＯＥＧ化セルロースオリゴマー（Ｃｅｌｌ－ＯＥＧ４）を５ｍｇ／ｍＬ分散させたものを用いた。ＦＢＳとしては、ＢｉｏＷｅｓｔ製、細胞培養用の１００％ＦＢＳを超純水で希釈して２２ｖ／ｖ％としたもの（２２％ＦＢＳ）を用いた。なお、ＦＢＳにはγ－グロブリン（抗体）は含まれていない。
一次抗体溶液としては、上記ＰＥＧ－Ｂ－４７を６．６％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ／２×ＰＢＳ溶液で希釈し、一次抗体の濃度が２．２ｎｇ／ｍＬ、４．４ｎｇ／ｍＬ、１１ｎｇ／ｍＬ、２２ｎｇ／ｍＬ、４４ｎｇ／ｍＬ、１１０ｎｇ／ｍＬ、２２０ｎｇ／ｍＬとなるようにそれぞれ調製した７種類の溶液を用いた。ここで、６．６％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ／２×ＰＢＳ溶液は、６６０ｍｇのＢＳＡを１０ｍＬの２×ＰＢＳ（ＰＢＳの２倍濃度溶液、以下同じ）に溶かして調製した。
二次抗体溶液および基質溶液については、試験例１と同じものを用いた。
１．一次抗体の抗原抗体反応
０．２ｍＬのＰＣＲチューブにセルロース分散液（Ｃｅｌｌ－ＯＥＧ４，５ｍｇ／ｍＬ，ＰＢＳ）１０μＬを添加し、２２％ＦＢＳを５０μＬ添加し、さらに一次抗体溶液５０μＬを添加し、分散させた後、２５℃で１時間インキュベートして抗原抗体反応を実施した。この抗原抗体反応の系は、セルロースオリゴマーの濃度が０．４５ｍｇ／ｍＬ、一次抗体の濃度が１～１００ｎｇ／ｍＬ、ＦＢＳの濃度が１０ｖ／ｖ％、ＢＳＡの濃度が３％（ｗ／ｖ）である。また、ブランクとして、一次抗体を含まない６．６％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ／２×ＰＢＳ溶液を５０μＬ添加して１時間インキュベートした。
０．２ｍＬのＰＣＲチューブにセルロース分散液（Ｃｅｌｌ－ＯＥＧ４，５ｍｇ／ｍＬ，ＰＢＳ）１０μＬを添加し、２２％ＦＢＳを５０μＬ添加し、さらに一次抗体溶液５０μＬを添加し、分散させた後、２５℃で１時間インキュベートして抗原抗体反応を実施した。この抗原抗体反応の系は、セルロースオリゴマーの濃度が０．４５ｍｇ／ｍＬ、一次抗体の濃度が１～１００ｎｇ／ｍＬ、ＦＢＳの濃度が１０ｖ／ｖ％、ＢＳＡの濃度が３％（ｗ／ｖ）である。また、ブランクとして、一次抗体を含まない６．６％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ／２×ＰＢＳ溶液を５０μＬ添加して１時間インキュベートした。
インキュベート後、遠心（１５０００ｒｐｍ、２５℃、５分）し、上清を除去した後、１００μＬのＰＢＳで再分散させ、この遠心と再分散の操作を３回実施することで洗浄した。
２．二次抗体の抗原抗体反応
次いで、遠心（１５０００ｒｐｍ、２５℃、５分）し上清を除去した後、ＰＣＲチューブに二次抗体溶液（二次抗体含有量：４１０ｎｇ／ｍＬの３．３％ＢＳＡ／ＰＢＳ溶液）１００μＬを添加して分散させ、２５℃で１時間インキュベートした。その後、遠心（１５０００ｒｐｍ、２５℃、５分）し、上清を除去した後、１００μＬのＰＢＳで再分散させ、この遠心と再分散の操作を３回実施することで洗浄した。
次いで、遠心（１５０００ｒｐｍ、２５℃、５分）し上清を除去した後、ＰＣＲチューブに二次抗体溶液（二次抗体含有量：４１０ｎｇ／ｍＬの３．３％ＢＳＡ／ＰＢＳ溶液）１００μＬを添加して分散させ、２５℃で１時間インキュベートした。その後、遠心（１５０００ｒｐｍ、２５℃、５分）し、上清を除去した後、１００μＬのＰＢＳで再分散させ、この遠心と再分散の操作を３回実施することで洗浄した。
３．酵素反応
次いで、遠心（１５０００ｒｐｍ、２５℃、５分）し上清を除去した後、ＰＣＲチューブに基質溶液（ＯＰＤ：２ｍｇ／ｍＬ、Ｈ２Ｏ２：０．１１ｖ／ｖ％、ｐＨ４．０クエン酸リン酸バッファー）１００μＬを添加し、分散させ、２５℃で３０分間インキュベートした。その後、３Ｎ硫酸１００μＬを添加し、遠心（１５０００ｒｐｍ、２５℃、１０分）した。上清を分取し、超純水で５倍希釈した後、１００μＬを９６穴プレートに添加し、次いで、９６穴プレートに、遠心後の上清１００μＬを添加し、プレートリーダー（ＢｉｏＴｅｋ製「Ｓｙｎｅｒｇｙ Ｈ１」）で４９０ｎｍの吸光度を測定した。
次いで、遠心（１５０００ｒｐｍ、２５℃、５分）し上清を除去した後、ＰＣＲチューブに基質溶液（ＯＰＤ：２ｍｇ／ｍＬ、Ｈ２Ｏ２：０．１１ｖ／ｖ％、ｐＨ４．０クエン酸リン酸バッファー）１００μＬを添加し、分散させ、２５℃で３０分間インキュベートした。その後、３Ｎ硫酸１００μＬを添加し、遠心（１５０００ｒｐｍ、２５℃、１０分）した。上清を分取し、超純水で５倍希釈した後、１００μＬを９６穴プレートに添加し、次いで、９６穴プレートに、遠心後の上清１００μＬを添加し、プレートリーダー（ＢｉｏＴｅｋ製「Ｓｙｎｅｒｇｙ Ｈ１」）で４９０ｎｍの吸光度を測定した。
一次抗体の各濃度について測定した吸光度を求めた。実験は、３回の実験を３セット行い、各セットの平均値のさらなる平均の吸光度を求めた。
結果は図１１および図１２に示すとおりである。横軸は、一次抗体の抗原抗体反応における反応系での一次抗体（ｍｅｔｈｏｘｙ－ｍＡｂ）の濃度を示し、縦軸は、４９０ｎｍでの吸光度を示す。図１２は、低濃度域（０～１０ｎｇ／ｍＬ）での結果を拡大して示すグラフである。
図１１および図１２に示すように、１０ｖ／ｖ％のＦＢＳと３％（ｗ／ｖ）のＢＳＡの共存下で、メトキシ末端ＰＥＧ選択的抗ＰＥＧ抗体を定量検出できることが分かった。図１２に示すように、低濃度域における傾き（ｓｌｏｐｅ）は０．０５５４であり、標準偏差σは０．００５３４であり、決定係数Ｒ２は０．９９４であった。検出下限（＝３σ／ｓｌｏｐｅ）は０．２９ｎｇ／ｍＬであり、既報の血清存在下（２０倍希釈）でのセンシング系（Ｓｈａｏｙｉ Ｊ．ら，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．２０１７年，８９，１６，８２１７－８２２２）の検出限界１０ｎｇ／ｍＬ程度と比較して、極めて高い感度を示した。
［試験例９：１０％ＦＢＳ存在下での検出下限］
ＢＳＡの添加効果を確認するために、試験例８に対してＢＳＡを添加せずに同様の試験を行った。
ＢＳＡの添加効果を確認するために、試験例８に対してＢＳＡを添加せずに同様の試験を行った。
試験例９において、一次抗体溶液としては、上記ＰＥＧ－Ｂ－４７を２×ＰＢＳで希釈し、一次抗体の濃度が２．２ｎｇ／ｍＬ、４．４ｎｇ／ｍＬ、１１ｎｇ／ｍＬ、２２ｎｇ／ｍＬ、４４ｎｇ／ｍＬ、１１０ｎｇ／ｍＬ、２２０ｎｇ／ｍＬとなるようにそれぞれ調製した７種類の溶液を用いた。セルロース分散液、２２％ＦＢＳ、二次抗体溶液および基質溶液については、試験例８と同じものを用いた。
１．一次抗体の抗原抗体反応
０．２ｍＬのＰＣＲチューブにセルロース分散液（Ｃｅｌｌ－ＯＥＧ４，５ｍｇ／ｍＬ，ＰＢＳ）１０μＬを添加し、２２％ＦＢＳを５０μＬ添加し、さらに一次抗体溶液５０μＬを添加し、分散させた後、２５℃で１時間インキュベートして抗原抗体反応を実施した。この抗原抗体反応の系は、セルロースオリゴマーの濃度が０．４５ｍｇ／ｍＬ、一次抗体の濃度が１～１００ｎｇ／ｍＬ、ＦＢＳの濃度が１０ｖ／ｖ％である。また、ブランクとして、一次抗体を含まない２×ＰＢＳを５０μＬ添加して１時間インキュベートした。
０．２ｍＬのＰＣＲチューブにセルロース分散液（Ｃｅｌｌ－ＯＥＧ４，５ｍｇ／ｍＬ，ＰＢＳ）１０μＬを添加し、２２％ＦＢＳを５０μＬ添加し、さらに一次抗体溶液５０μＬを添加し、分散させた後、２５℃で１時間インキュベートして抗原抗体反応を実施した。この抗原抗体反応の系は、セルロースオリゴマーの濃度が０．４５ｍｇ／ｍＬ、一次抗体の濃度が１～１００ｎｇ／ｍＬ、ＦＢＳの濃度が１０ｖ／ｖ％である。また、ブランクとして、一次抗体を含まない２×ＰＢＳを５０μＬ添加して１時間インキュベートした。
インキュベート後、遠心（１５０００ｒｐｍ、２５℃、５分）し、上清を除去した後、１００μＬのＰＢＳで再分散させ、この遠心と再分散の操作を３回実施することで洗浄した。
２．二次抗体の抗原抗体反応
次いで、遠心（１５０００ｒｐｍ、２５℃、５分）し上清を除去した後、ＰＣＲチューブに二次抗体溶液（二次抗体含有量：４１０ｎｇ／ｍＬの３．３％ＢＳＡ／ＰＢＳ溶液）１００μＬを添加して分散させ、２５℃で１時間インキュベートした。その後、遠心（１５０００ｒｐｍ、２５℃、５分）し、上清を除去した後、１００μＬのＰＢＳで再分散させ、この遠心と再分散の操作を３回実施することで洗浄した。
次いで、遠心（１５０００ｒｐｍ、２５℃、５分）し上清を除去した後、ＰＣＲチューブに二次抗体溶液（二次抗体含有量：４１０ｎｇ／ｍＬの３．３％ＢＳＡ／ＰＢＳ溶液）１００μＬを添加して分散させ、２５℃で１時間インキュベートした。その後、遠心（１５０００ｒｐｍ、２５℃、５分）し、上清を除去した後、１００μＬのＰＢＳで再分散させ、この遠心と再分散の操作を３回実施することで洗浄した。
３．酵素反応
次いで、遠心（１５０００ｒｐｍ、２５℃、５分）し上清を除去した後、ＰＣＲチューブに基質溶液（ＯＰＤ：２ｍｇ／ｍＬ、Ｈ２Ｏ２：０．１１ｖ／ｖ％、ｐＨ４．０クエン酸リン酸バッファー）１００μＬを添加し、分散させ、２５℃で３０分間インキュベートした。その後、３Ｎ硫酸１００μＬを添加し、遠心（１５０００ｒｐｍ、２５℃、１０分）した。次いで、上清を分取し、超純水で５倍希釈した後、１００μＬを９６穴プレートに添加し、次いで、プレートリーダー（ＢｉｏＴｅｋ製「Ｓｙｎｅｒｇｙ Ｈ１」）で４９０ｎｍの吸光度を測定した。
次いで、遠心（１５０００ｒｐｍ、２５℃、５分）し上清を除去した後、ＰＣＲチューブに基質溶液（ＯＰＤ：２ｍｇ／ｍＬ、Ｈ２Ｏ２：０．１１ｖ／ｖ％、ｐＨ４．０クエン酸リン酸バッファー）１００μＬを添加し、分散させ、２５℃で３０分間インキュベートした。その後、３Ｎ硫酸１００μＬを添加し、遠心（１５０００ｒｐｍ、２５℃、１０分）した。次いで、上清を分取し、超純水で５倍希釈した後、１００μＬを９６穴プレートに添加し、次いで、プレートリーダー（ＢｉｏＴｅｋ製「Ｓｙｎｅｒｇｙ Ｈ１」）で４９０ｎｍの吸光度を測定した。
一次抗体の各濃度について測定した吸光度を求めた。実験は、３回の実験を３セット行い、各セットの平均値のさらなる平均の吸光度を求めた。
結果は図１３および図１４に示すとおりである。横軸は、一次抗体の抗原抗体反応における反応系での一次抗体（ｍｅｔｈｏｘｙ－ｍＡｂ）の濃度を示し、縦軸は、４９０ｎｍでの吸光度を示す。図１４は、低濃度域（０～１０ｎｇ／ｍＬ）での結果を拡大して示すグラフである。
図１３および図１４に示すように、ＢＳＡを添加しなかった場合でも、１０ｖ／ｖ％のＦＢＳの存在下で、メトキシ末端ＰＥＧ選択的抗ＰＥＧ抗体を定量検出できることが分かった。図１４に示すように、低濃度域における傾き（ｓｌｏｐｅ）は０．０２１７であり、標準偏差σは０．００２１９であり、決定係数Ｒ２は０．９９７９であった。検出下限（＝３σ／ｓｌｏｐｅ）は０．３０ｎｇ／ｍＬであり、３％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ存在下の場合と同等の値であった。そのため、ＦＢＳの存在下では、ＢＳＡの添加効果は観察されなかった。但し、上記既報の血清存在下（２０倍希釈）でのセンシング系の検出限界１０ｎｇ／ｍＬ程度と比較して、極めて高い感度を示していた。
なお、明細書に記載の種々の数値範囲は、それぞれそれらの上限値と下限値を任意に組み合わせることができ、それら全ての組み合わせが好ましい数値範囲として本明細書に記載されているものとする。また、「Ｘ～Ｙ」との数値範囲の記載は、Ｘ以上Ｙ以下を意味する。
以上、本発明のいくつかの実施形態を説明したが、これら実施形態は、例として提示したものであり、発明の範囲を限定することは意図していない。これら実施形態は、その他の様々な形態で実施されることが可能であり、発明の要旨を逸脱しない範囲で、種々の省略、置き換え、変更を行うことができる。これら実施形態やその省略、置き換え、変更などは、発明の範囲や要旨に含まれると同様に、特許請求の範囲に記載された発明とその均等の範囲に含まれるものである。
Claims (4)
- 下記一般式（１）：
メトキシ末端ＰＥＧ選択的抗ＰＥＧ抗体に結合可能な抗ＰＥＧ抗体結合材料。 - 請求項１に記載の抗ＰＥＧ抗体結合材料を含むバイオセンサ。
- 請求項１に記載の抗ＰＥＧ抗体結合材料を含む吸着剤。
- 下記一般式（１）：
前記被検体とのインキュベート後の前記セルロースオリゴマーを、前記抗ＰＥＧ抗体に対する二次抗体の結合を可能にする条件下で、前記二次抗体を含む試料とインキュベートすること、および、
前記試料とのインキュベート後の前記セルロースオリゴマーを用いて、プローブとしての前記二次抗体により、前記被検体に含まれる前記抗ＰＥＧ抗体を検出すること、
を含む、抗ＰＥＧ抗体の検出方法。
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| JP2022031256A JP2023127452A (ja) | 2022-03-01 | 2022-03-01 | 抗ｐｅｇ抗体結合材料および抗ｐｅｇ抗体の検出方法 |
| TW112102820A TW202336439A (zh) | 2022-03-01 | 2023-01-19 | 抗ｐｅｇ抗體結合材料及抗ｐｅｇ抗體的檢測方法 |
| PCT/JP2023/004480 WO2023166944A1 (ja) | 2022-03-01 | 2023-02-10 | 抗ｐｅｇ抗体結合材料および抗ｐｅｇ抗体の検出方法 |
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|---|---|---|---|
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