KR20030035121A - Ｓｒｇ３ 유전자 결핍 생쥐 및 그의 제조방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 SRG3 유전자 결핍 생쥐 및 그의 제조방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 SRG3 유전자의 일부, 네오마이신 저항(Neomycin resistance) 유전자 및 디프테리아 독소 유전자로 이루어진 유전자 적중벡터(targeting vector), 상기 적중벡터를 포함하는 배아간세포(Embryonic Stem Cell, ES Cell), 상기 배아간세포를 이용하여 얻은 SRG3 유전자 결핍 생쥐 및 그의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명의 SRG3 유전자 결핍 생쥐는 SRG3 단백질의 기능을 억제시킴으로써 SRG3의 생체 내 역할에 대한 연구에 유용하게 이용될 수 있다.
Description
본 발명은 SRG3 유전자 결핍 생쥐 및 그의 제조방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 SRG3 유전자의 일부, 네오마이신 저항(Neomycin resistance) 유전자 및 디프테리아 독소 유전자로 이루어진 유전자 적중벡터(targeting vector), 상기 적중벡터를 포함하는 배아간세포(Embryonic Stem Cell, ES Cell), 상기 배아간세포를 이용하여 얻은 SRG3 유전자 결핍 생쥐 및 그의 제조방법에 관한 것이다.
진핵세포의 핵 안에 존재하는 DNA는 히스톤(histone) 또는 비히스톤 단백질과 복합체를 이루어 존재하는데, 이를 염색질(chromatin)이라 한다. 염색질에 DNA 분해효소(DNase)를 처리하면 200 염기쌍의 DNA와 히스톤 단백질(한 분자의 H1과 두 분자씩의 H2A, H2B, H3, H4)로 구성된 단위 복합체로 분리되고, 이를 DNase로 더 분해하면 염색질 구성의 기본 단위인 누클레오솜(nucleosome)이 분리된다. 히스톤은 염기성 아미노산인 리신과 아르기닌을 많이 함유하는 단백질로서 산성의 DNA와 결합할 수 있으며 진화적으로 상당히 보존되어 있다. 누클레오솜은 146 염기쌍의 핵심(core) DNA와 두 분자씩의 H2A, H2B, H3 및 H4 단백질이 결합된 히스톤 8량체(octamer)로 구성되어 있다. 이렇게 DNA가 히스톤 복합체에 감겨있는 구조는 다시 코일 형태로 감겨서 염색사 구조를 형성하게 된다. 염색체는 이 염색사가 세포분열이 일어날 때 더욱 작은 크기로 포개져서 만들어진 것이다. 이와 같이 DNA는 단백질들과 상호작용을 하면서 차곡차곡 채워져 있기 때문에 전사에 필요한 기구들이 쉽게 접근할 수 없도록 되어있다. 따라서 특정 유전자에 전사가 일어나기 위해서는 그 유전자가 있는 부위에 전사에 필요한 단백질들이 접근할 수 있도록 DNA가 느슨하게 풀어져야만 한다. 이처럼 염색질 구조의 변형은 유전자 발현에 기본적인 조절방식으로 기능을 한다.
지난 십수년간 생화학적, 유전학적 연구를 통해 밝혀진 다양한 염색질 재구성(remodeling) 인자들은 히스톤을 변형시키거나 염색질 구조를 변화시킴으로 유전자의 전사 조절에 관여한다. 이러한 인자들을 작용 기작에 따라 크게 두 그룹으로나눌 수 있는데, 첫째는 히스톤 아세틸트랜스퍼레이즈(histone acetyltransferase, 이하 "HAT"라 약칭한다)와 히스톤 디아세틸레이즈(histone deacetylase, 이하 "HDAC"라 약칭한다) 그룹으로서, 누클레오솜의 히스톤에 아세틸기를 붙이고 Ep는 과정을 통하여 염색질을 재구성한다. 일반적으로 히스톤에 아세틸기가 많아지면 그 부분의 유전자 전사가 원활해진다고 알려져 있다.
둘째는 ATP-의존 염색질 재구성 그룹으로서, ATP 에너지를 이용하여 염색질 구조를 변화시킨다. SWI/SNF 복합체는 ATP-의존 염색질 재구성 그룹에 속하며, 효모에서부터 인간에 이르기까지 진화적으로 잘 보존되어 있다. 포유동물의 SWI/SNF 복합체는 9-12 종류의 단백질로 구성되어 있는데, 조직에 따라 구성성분이 조금씩 다르다. 이는 SWI/SNF 복합체가 발생과 분화 과정에 조직 특이적으로 작용할 가능성을 시사한다. SWI/SNF 복합체의 ATPase는 BRG1 또는 hBRM 두가지인데, 각각 따로 복합체를 이룬다. 이들과 더불어 복합체의 핵심구성요소로 BAF155, BAF170 및 SNF5/INI1 가 존재한다. 최근 BRM, BRG1, SNF5/INI1 유전자결핍 생쥐들이 만들어져서 SWI/SNF 복합체의 생체 내 역할에 관한 이해에 많은 도움을 주었다. BRM 결핍 생쥐의 경우 세포증식에 약간의 이상이 관찰된 반면 BRG1 이나 SNF5/INI1 결핍 생쥐들은 초기 발생과정에서 죽고, 한쪽 유전자가 결핍된 경우 종양이 잘 형성된다고 보고되어 있다.
SRG3는 생쥐에서 발현되는 단백질로 효모의 SWI3, 초파리의 MOIRA, 인간의 BAF155와 상동체이며 생쥐 SWI/SNF 복합체의 핵심구성요소이다(Jeon S.H.et al.,1997). 흥미롭게도 SRG3 안티-센스 RNA를 사이모마(thymoma) 세포주에 넣어주었더니 글루코코르티코이드에 의한 아폽토시스가 저해됨이 관찰되었다(Jeon S.H.et al., J. Exp. Med.,1997, 185(10):1827-1836). 이는 SRG3 가 이 과정에 중요한 역할을 한다는 것을 시사한다. 이러한 실험 결과들과 더불어 SRG3의 생체 내 기능에 대한 활발한 연구가 요구되고 있다.
이에, 본 발명자들은 SRG3의 생체 내 기능을 알아보기 위하여 노력하던 중, SRG3 유저자의 일부를 결손시켜 SRG3 단백질의 기능을 억제시킨 SRG3 유전자 결핍 생쥐를 제조하였으며, 상기 유전자결핍 생쥐를 이용한 실험에서 SRG3 단백질이 생쥐의 초기 발생단계에 필수적임을 확인하고, 두뇌 형성에 중요한 역할을 한다는 사실을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 SRG3 단백질의 기능을 억제시킨 SRG3 유전자 결핍 생쥐 및 그의 제조방법을 제공하는 것이다.
도 1은 본 발명의 유전자 적중벡터(gene targeting vector)를 나타낸 모식도이고,
SRG3 유전자좌(Locus) : 정상적인 SRG3 유전자의 배열을 나타낸 것,
적중벡터(Targeting vector) : SRG3 유전자의 네 번째 엑손을 네오마이신 저항 유전자로 대치시킬 수 있는 적중벡터,
적중 유전자좌(Targeted Locus) : 적중 벡터가 정상적인 SRG3 유전자와 상동재조합(homologous recombination)이 이루어졌을 경우를 나타낸 것,
Neo : 네오마이신 저항 유전자, D.Txn : 디프테리아 독소
프로브 : 써던 블러팅 분석에 쓰이는 프로브
3, 4, 5 : 엑손3, 엑손4, 엑손5를 나타냄,
P1, P2, P3 : PCR 분석에 쓰이는 프라이머들,
도 2는 본 발명의 적중벡터가 상동재조합을 통하여 정상 SRG3 유전자의 네 번째 엑손을 네오마이신 저항 유전자로 대치시킨 것을 써던 블럿으로 분석한 전기영동 사진이고,
+/+ : 정상 생쥐, +/- : SRG3 한쪽 유전자가 결핍,
도 3은 SRG3 유전자 한쪽 결핍 생쥐(SRG3 heterozygous mutant, +/-)들끼리 교배하여 낭배(blastocyst)를 추출한 후 PCR(polymerase chain reaction) 분석으로 유전자 타이핑(genotyping)을 수행한 사진이고,
+/+ : 정상 생쥐, +/- : SRG3 한쪽 유전자가 적중,
-/- : SRG3 양쪽 유전자가 적중, 레인 1: DNA 사이즈 마커
도 4는 본 발명의 SRG3 유전자 결핍 생쥐에서 SRG3 단백질의 발현 감소양상을 확인하기 위하여, 흉선 세포와 두뇌 세포의 파쇄액을 이용하여 웨스턴 블러팅(western blotting)으로 분석한 사진이고,
레인 1: 정상 생쥐(+/+)의 흉선 세포 파쇄액,
레인 2: SRG3 한쪽 유전자 결핍 생쥐(+/-)의 흉선 세포 파쇄액,
레인 3: 정상 생쥐(+/+)의 두뇌 세포 파쇄액 (배아발생 12.5일),
레인 4: SRG3 한쪽 유전자 결핍 생쥐(+/-)의 두뇌 세포 파쇄액 (배아발생 12.5일),
도 5는 본 발명의 SRG3 한쪽 유전자 결핍 생쥐(SRG3 heterozygous mutant)를 서로 교배시켜 얻어낸 낭배를 SRG3 항체와 mBRG1 항체를 사용하여 형광면역염색으로 분석한 사진이고,
SRG3의 발현 : 푸른색, mBRG1의 발현 : 붉은색,
합병(merged) :SRG3와 mBRG1의 발현을 합친 것,
A-C : 낭배를 추출한 후 바로 형광염색한 경우,
D-I : 낭배를 추출하여 체외에서 3일간 배양한 후 형광염색한 경우,
+/- : SRG3 유전자가 한쪽만 결핍된 낭배 (A-C 의 오른쪽, D-F)
-/- : SRG3 유전자가 양쪽 모두 결핍된 낭배 (A-C의 왼쪽, G-I)
ZP : 투명대(Zona pellucida), ICM : 세포속덩이(Inner cell mass),
TE : 트로펙토덤(Trophectoderm),
TG : 영양세포 거인세포(Trophoblast giant cell),
도 6은 본 발명의 SRG3 한쪽 유전자 결핍 생쥐(+/-)들 중 두뇌 발달에 기형을 보이는 일부 생쥐들의 외형분석으로서, 배아발생 시기별로 구분하여 정상과 비교한 사진이고,
A와 B는 후두부 사진, C-H는 측면사진, E'와 F'는 정면사진,
왼편(A,C,E,G)은 정상 배아, 오른편(B,D,F,H)은 두뇌 기형 배아,
A,B : 배아발생 9.5일(E9.5), C,D : 배아발생 10.5일(E10.5),
E,E',F,F' : 배아발생 12.5일(E12.5), G,H : 배아발생 16.5일(E16.5),
스케일 바(Scale bar, mm) : 0.2(A,B), 0.4(C,D), 1(E,F), 2(G,H),
도 7은 본 발명의 SRG3 한쪽 유전자 결핍 생쥐(+/-)들 중 두뇌 발달에 기형을 보이는 일부 생쥐들의 탈뇌증을 배아발생 12.5일에 분석한 것으로, 두뇌 구조 이상을 형태학적 및 인시투 혼성화(in situ hybridization) 방법을 분석한 사진이고,
왼편(A,C) : 정상 배아, 오른편(B,D) : 두뇌 기형 배아,
A,B : 헤마톡실린/에오신 염색,
C,D : 대뇌피질에 특이적으로 발현되는BF-1유전자 인시투 혼성화,
스케일 바(mm) : 0.2,
도 8은 본 발명의 SRG3 한쪽 유전자 결핍 생쥐(+/-)들 중 두뇌 발달에 기형을 보이는 일부 생쥐들의 탈뇌증을 배아발생 13.5일에 분석한 것으로, 신경세포의 증식과 분화를 각각 BrdU 염색법과 MAP2 염색법으로 분석한 사진이고,
왼편(A,C, E, F)은 정상 배아, 오른편(B,D, G, H)은 두뇌 기형 배아,
A,B : 세포의 증식 여부를 알아볼 수 있는 BrdU 염색,
C,D : 신경세포의 분화 여부를 알아볼 수 있는 MAP2 염색,
E,F,G,H : 각각 A,C,B,D 의 해당 부분 고배율 사진,
스케일 바(mm) : 0.5(A-D), 0.1(E-H)
상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 SRG3 단백질의 기능을 억제시킨 SRG3 유전자 결핍 생쥐를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 SRG3 유전자 결핍 생쥐의 제조방법을 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 SRG3 단백질의 기능을 억제시킨 SRG3 유전자 결핍 생쥐를 제공한다.
이를 위하여, 먼저 본 발명은 네오마이신 저항(Neomycin resistance) 유전자와 디프테리아 독소 유전자가 SRG3 유전자의 일부에 삽입된 적중벡터(targeting vector)를 제공한다(도 1참조).
본 발명의 적중벡터는 SRG3 유전자 일부, 네오마이신 저항 유전자 및 디프테리아 독소 유전자를 포함하고 있으며, 상기 적중벡터는 SRG3 게놈 DNA와의 상동 재조합(homologous recombination)을 통해 SRG3 유전자의 네 번째 엑손이 네오마이신 저항 유전자로 대체되고, 디프테리아 독소는 상동 재조합이 일어날 경우 제거되어 세포가 죽지 않게 만드는 역할을 한다.
또한, 본 발명은 상기 적중벡터를 포함하는 배아간세포(Embryonic Stem Cell, ES Cell)를 제공한다.
본 발명의 배아간세포는 SRG3 유전자 일부, 네오마이신 저항 유전자 및 디프테리아 독소 유전자를 포함하는 상기 적중벡터를 생쥐 배아간세포주에 도입하여, 적중벡터를 SRG3 게놈 DNA와 상동재조합시켜 제조된다.
또한, 본 발명은 상기 배아간세포를 이용하여 제조한 SRG3 한쪽 유전자 결핍생쥐(SRG3 heterozygous mutant, +/-)를 제공한다.
본 발명의 SRG3 한쪽 유전자 결핍 생쥐는 상기 SRG3 유전자 일부가 결실된 적중벡터가 상동 재조합된 배아간세포를 정상 생쥐 낭배(blastocyst)의 세포속덩이(inner cell mass)에 섞어준 후 상기 낭배를 가임신된 대리모 생쥐에 착상시켜 키메라(chimera) 생쥐를 제조하고, 상기 키메라 생쥐를 정상 생쥐와 교배시켜 제조된다.
또한, 본 발명은 상기 SRG3 한쪽 유전자 결핍 생쥐(+/-)로부터 얻어진 SRG3 +/- 유전자형을 갖는 수정란을 제공한다.
본 발명자들은 SRG3 +/- 유전자형을 갖는 SRG3 유전자 결핍 생쥐의 수정란을 2001년 9월 6일부로 한국생명공학 연구원 유전자 은행에 기탁하였다(수탁번호 : KCTC 10069BP).
또한, 본 발명은 SRG3 -/- 유전자형을 갖는 SRG3 유전자 결핍 생쥐 배아를 제공한다.
본 발명의 SRG3 유전자 결핍 생쥐 배아는 상기 SRG3 +/- 유전자형을 갖는 유전자 결핍 생쥐의 수정란으로부터 SRG3 +/- 유전자형을 갖는 유전자 결핍 생쥐를 얻고 상기 SRG3 +/- 유전자형을 갖는 유전자 결핍 생쥐를 교배시켜 얻을 수 있다.
상기 SRG3 -/- 유전자형을 갖는 유전자 결핍 생쥐 배아는 SRG3 유전자의 일부가 결실되어 SRG3 단백질의 기능이 상실된 유전자 결핍 생쥐 배아이다.
SRG3 한쪽 유전자 결핍 생쥐(+/-)들을 서로 교배하면 이론적으로는 멘델의 법칙에 의해 25%의 확률로 SRG3 유전자가 양쪽 모두 결핍된 자손을 기대할 수 있다. 하지만 태어난 새끼들 중에 SRG3 유전자가 양쪽 모두 결핍된 경우는 없는데, 이는 배아발생 과정에서 SRG3 양쪽 유전자가 결핍된 생쥐들은 태어나기 전에 이미 죽어있기 때문이다.
SRG3 한쪽 유전자 결핍 생쥐(+/-)들을 서로 교배시킨 후, 임신된 암컷으로부터 발생 시기별로 배아를 분리하여 SRG3 유전자가 양쪽 모두 결핍된 배아가 언제 죽는지를 알아보면, 이들은 낭배시기를 지나 착상과정을 거친 후 바로 죽어나가는데 이는 낭배의 세포속덩이가 에그실린더로 발달하지 못하여 더 이상의 발생이 진행되지 않기 때문이다(도 5참조). 또한, SRG3와 함께 SWI/SNF 복합체의 핵심 구성요소인 BRG1이 결핍된 배아는 착상 전에 죽는데 반해(Bultmanet al , Mol. Cell, 2000, 6(6):1287-1295) SRG3가 결핍된 배아는 착상을 마친 후에 죽는데, 상기의 차이점은 SRG3 결핍 배아의 경우 남아있는 BRG1이 기본적인 염색질 재구성 활성을 나타내기 때문이다(Phelanet al, .Mol. Cell., 1999, 3(2):247-253). 상기 결과로부터 SRG3 단백질이 착상 이후 낭배의 발생과정에 필수적인 역할을 담당하는 것을 알 수 있다.
SRG3 유전자가 양쪽 모두 결핍된 배아는 발생 초기에 죽는 반면, 한쪽만 결핍된 상황에서는 일부가 신경관 형성에 결함을 보이며, 탈뇌증(exencephaly)이 관찰된다. 생쥐의 신경관은 배아발생 8.5일에서 9.5일 사이에 형성이 되는데, 이는 신경판이 둥글게 말려 올라가며 관을 형성하여 생긴다. SRG3가 한쪽이 결핍된 생쥐의 일부는 신경관 형성이 제대로 이루어지지 않아 두뇌가 밖으로 나오는 탈뇌증을 보인다(도 6참조). 상기 신경관 형성 결함이 일어난 배아의 두뇌를 형태학적으로 분석해 보면, 탈뇌증 배아의 뇌는 세 번째 뇌실이 닫히지 않고 간뇌조직이 밖으로 뻗어나와 머리 윗부분을 차지하며, 이로 인해 양측 뇌실이 축소된 채로 대뇌의 스트리아툼은 상당히 부풀어져 있고, 대뇌 피질의 오리엔테이션이 거꾸로 되어 있음을 관찰할 수 있다(도 7참조). 또한, 간뇌가 머리 윗부분을 차지하며 과증식한 모습을 보이고 측뇌실 역시 상당히 축소되어 있으며 대뇌의 스트리아툼이 부풀려진 채 대뇌피질의 오리엔테이션이 아래로 향해있음을 볼 수 있다. 이러한 구조적인 이상은 중뇌, 연수 등에서도 관찰되어 정상에 비해 뒤로 짓눌려진 뇌 구조가 관찰된다(도 8참조). 또한, 탈뇌증 배아는 정상 배아에 비해 전반적으로 신경 분화가 다소 덜 되었고, 특히 스트리아툼 부분의 신경 분화가 미비한 것으로 나타났다. 상기와 같이 SRG3 단백질의 발현량이 줄어듦으로 인해 신경세포가 비정상적인 증식과 분화과정이 일어나는 것을 알 수 있고, SRG3 단백질이 신경세포의 증식과 분화에 중요한 역할을 한다는 것을 나타낸다.
또한, 본 발명은 상기 SRG3 유전자 결핍 생쥐의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 SRG3 유전자 결핍 생쥐의 제조방법은
1) SRG3 유전자에 대한 적중벡터를 제조하는 단계;
2) 상기 적중벡터를 배아간세포에 도입하여 상동재조합에 의해 SRG3 유전자의 일부가 결손된 배아간세포 클론을 얻는 단계;
3) 상기 SRG3 유전자 결핍 배아간세포를 정상 낭배(blastocyte)의 세포속덩이(inner cell mass)에 미세주입하여 키메라(chimera) 생쥐를 얻는 단계;
4) 상기 키메라 생쥐를 정상 생쥐와 교배시켜 SRG3 +/- 유전자형을 갖는 SRG3 한쪽 유전자 결핍 생쥐를 얻는 단계; 및
5) 상기 SRG3 한쪽 유전자 결핍 생쥐를 교배시켜 SRG3 -/- 유전자형을 갖는 SRG3 유전자 결핍 생쥐 배아를 얻는 단계로 구성된다.
본 발명에서는 SRG3 게놈 DNA 절편과 네오마이신 저항 유전자 및 디프테리아 독소 유전자를 이용하여 SRG3 DNA의 네 번째 엑손을 네오마이신으로 대치시킬 수 있게 위치시키고 디프테리아 독소 유전자는 상기 적중벡터가 상동재조합이 일어날 경우 잘려질 수 있도록 적중벡터를 제조한다(도 1참조).
상기 적중벡터를 제한효소로 절단하여 선형화한 후, 이를 생쥐의 배아간세포에 도입시킨다. 이어 네오마이신 또는 G418을 사용하여 상기 적중벡터가 게놈에 삽입된 배아간세포들만을 선별한다. 한편, 디프테리아 독소 유전자는 상기 적중벡터가 상동재조합을 통하여 삽입되어야만 제거되므로, 결국 살아남은 배아간세포 클론들은 상기 적중벡터가 상동재조합에 의해 게놈에 들어간 경우에 한한다. 이러한 선별과정을 거친 후에 각각의 클론들에 대해 게놈 DNA내 상기 적중벡터가 상동재조합에 의해 삽입되었는지 확실히 검증하기 위하여 게노믹 DNA에 대한 서던 블러팅과3-프라이머 PCR 분석법을 실시한다(도 2및도 3참조)
상기에서 선별한 배아간세포 클론들을 증식시켜 발생중인 낭배의 안쪽세포덩어리에 섞어준 후, 가임신된 대리모에 착상시켜 이후 발생과정을 통해 키메라 생쥐를 만드는 세포혼합법을 이용하였다. 가임신된 대리모는 이용되는 세포혼합 낭배에 따라 선택되며 수정관이 절제된 수컷 포유동물과 교배하여 가임신시킨 암컷 생쥐이다. 이후 태어난 키메라 생쥐들의 SRG3 유전자결핍 여부를 선별하기 위한 분석은 서던 블러팅을 이용하였다.
상기에서 제조한 키메라 생쥐들을 정상 생쥐와 교배시켜 얻어낸 새끼들을 서던 블러팅을 통해 분석한 바, 상기 적중벡터가 전달된 새끼들을 얻어낼 수 있었으며, 이들을 다시 교배하여 한쪽 SRG3 유전자가 결핍된 SRG3 +/- 유전자형을 갖는 배아들 뿐 아니라, 양쪽 SRG3 유전자가 모두 결핍된 SRG3 -/- 유전자형을 갖는 배아도 제조한다.
상기의 SRG3 +/- 유전자형을 갖는 SRG3 한쪽 유전자 결핍 생쥐로부터 얻어진 SRG3 +/- 유전자형을 갖는 수정란을 2001년 9월 6일부로 한국생명공학 연구원 유전자 은행에 기탁하였다(수탁번호 : KCTC 10069BP).
본 발명에서는 상기 SRG3 +/- 유전자형을 갖는 유전자 결핍 생쥐의 수정란을 대리모에 이식하여 SRG3 +/- 유전자형을 갖는 유전자 결핍 생쥐를 얻고 상기 SRG3 +/- 유전자형을 갖는 유전자 결핍 생쥐를 교배시켜 SRG3 +/- 유전자형을 갖는 배아 및 SRG3 -/- 유전자형을 갖는 배아를 제조한다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> SRG3 유전자 결핍 적중벡터의 제조
SRG3 유전자결핍 적중벡터를 제조하기 위하여, 본 발명자들은 SRG3 게놈 DNA의 적당한 절편과 네오마이신 저항 유전자, 디프테리아 독소 유전자를 결합시켜 네 번째 엑손이 상동재조합에 의해 제거할 수 있도록 SRG3 적중벡터를 제조하였다.
구체적으로, 클로닝(cloning)되어 있는 생쥐의 SRG3 cDNA(Jeon S.H.et al., J. Exp. Med.,1997, 185(10):1827-1836)를 제한효소 XhoI/HindIII 로 절단하여 0.6 kb의 SRG3 cDNA를 얻고, 이를 엑소 클레나우(exo-Klenow) DNA 중합 효소와 랜덤 핵사머, dATP, dTTP, dGTP, P32-방사선 동위원소가 부착된 dCTP를 이용하여 랜덤 프라이밍 방법으로 프로브를 제작하여 생쥐 게노믹 DNA 라이브러리를 스크리닝하였다. 상기에서 얻어진 SRG3 게놈 DNA 클론들을 제한효소로 절단하여 제한효소 맵을 작성한 후, SRG3 cDNA의 5' 부분의 여러 가지 단편들을 프로브로 이용하여 써던 블러팅을 수행하여 대략적인 엑손의 위치를 파악하였다. 이어 서브클로닝과 시퀀싱을 통해 엑손과 인트론의 정확한 위치를 파악한 후, 엑손 중 네 번째 엑손이 유전자 조작을 통해 제거되기 쉬운 적중벡터를 만들 수 있으므로, 네오마이신 저항 유전자와 디프테리아 독소 유전자를 포함한 PGKneoloxDTA 벡터(Soriano로부터 얻음; Soriano,Development, 1997, 124(14):2691-2700)를 이용하여 적중벡터를 제작하였다(도 1).
<실시예 2> SRG3 유전자 결핍 배아간세포의 제조
SRG3 유전자 결핍 배아간세포를 제조하기 위하여, 본 발명자들은 하기와 같은 방법으로 수행하였다. 구체적으로, 상기 실시예 1에서 제조한 적중벡터를 제한효소 NotI으로 절단하여 선형화한 후, 129 종(strain) 생쥐의 배아간세포에 전기충격법으로 도입한 후 G418을 처리하여 살아남은 배아간세포 클론을 확보하였다. 이는 적중벡터가 도입된 세포일 경우 적중벡터 내에 존재하는 네오마이신 저항 유전자에 의해 G418을 처리하여도 세포가 살아남을 수 있기 때문이다. 한편, 디프테리아 독소 유전자는 상동재조합이 되지 않을 경우 적중벡터에 그대로 남아있게 되어 그 세포는 죽게 된다. 따라서 적중벡터가 상동재조합으로 들어간 경우에만 G418에 의한 선별과정에서 살아남게 된다. 상기 배아간세포에 도입한 적중벡터의 상동재조합 여부를 확실히 검증하기 위하여도 1에 표시된 프로브(probe)를 이용하여 써던 블러팅을 수행하였다(도 2).
그 결과, 정상적인 SRG3 게놈 유전자는 SacI 제한효소에 의해 약 16kb 크기의 유전자 밴드가 나타났고, 적중벡터가 상동재조합에 의해 게놈 내에 도입된 경우에는 SacI 제한효소에 의해 약 9.8kb 크기의 유전자 밴드가 나타났다. 따라서 본 발명의 배아간세포는 적중벡터가 도입되어 상동재조합이 일어난 것을 알 수 있었다.
<실시예 3> 배아간세포를 이용한 SRG3 한쪽 유전자 결핍 생쥐(+/-)의 생산 및 수정란 확보
상기 실시예 2에서 얻은 SRG3 유전자 결핍 배아간세포를 C57BL/6 생쥐의 낭배(blastocyte) 세포속덩이(inner cell mass)에 미세주입하여 혼합한 뒤, 이를 가임신된 대리모 생쥐(C57BL/6 strain)의 자궁에 착상시켜 키메라 생쥐를 제조하였다.
본 발명자들은 상기 키메라 생쥐가 SRG3 유전자가 결핍된 생쥐인지 확인하기 위하여 써던 블러팅을 수행하였다. 상기에서 얻은 생후 3 주령의 키메라 생쥐의 꼬리를 약 1 ㎝ 절제한 후 이로부터 게놈 DNA를 분리하였다. 상기에서 분리한 게놈 DNA를 주형으로 하고서열번호 1로 기재되는 5' 공통 PCR 프라이머 P1,서열번호 2로 기재되는 SRG3 유전자의 네 번째 엑손 특이적 3' 프라이머 P2 및서열번호 3으로 기재되는 네오마이신 특이적인 3' 프라이머 P3를 이용하여 3-프라이머 PCR을 수행하였다.
그 결과, 정상적인 SRG3 게놈 유전자인 경우 프라이머 P1 및 프라이머 P2에 의해 PCR 증폭되어 450 bp 크기의 유전자 밴드가 검출되었고, 적중벡터가 삽입된 SRG3 유전자결핍 생쥐는 프라이머 P1 및 프라이머 P3에 의해 PCR 증폭되어 250 bp 크기의 PCR 산물이 검출되었다(도 3). 상기 3-프라이머 PCR 방법은 써던 블러팅 기법과 더불어 적중벡터가 전달된 카이머릭 생쥐를 선별할 수 있었으며, 이 후 이들 키메라 생쥐를 정상 생쥐와 교배하여 얻은 자손들을 써던 블러팅 및 3-프라이머 PCR 방법을 수행하여 모든 세포에 적중벡터가 상동재조합에 의해 삽입된 생쥐를 선별할 수 있었다.
본 발명자들은 상기 SRG3 한쪽 유전자 결핍 생쥐가 SRG3 단백질이 감소되어 발현되는지 확인하기 위하여 웨스턴 블럿 분석을 수행하였다.
그 결과, 상기 유전자 결핍 생쥐들은 한쪽 SRG3 유전자가 결핍되어 있으므로 SRG3 단백질의 발현량이 양쪽 SRG3 유전자가 모두 정상인 생쥐에 비해 반으로 줄어있음을 확인할 수 있었다(도 4).
본 발명자들은 상기와 같은 스크리닝 방법을 통해 확보한 SRG +/- 유전자형을 갖는 SRG3 한쪽 유전자 결핍 생쥐의 수정란을 한국생명공학연구원 유전자은행에 2001년 9월 6일자로 기탁하였다(수탁번호 : KCTC 10069BP).
<실험예 1> SRG3 양쪽 유전자가 모두 결핍된 배아(-/-) 분석
SRG3 단백질의 생체 내 역할을 알아보기 위하여, 본 발명자들은 상기 실시예 3에서 선별된 SRG3 한쪽 유전자 결핍 생쥐(+/-)들을 서로 교배하여 SRG3 단백질이 완전히 발현되지 않는 SRG3 양쪽 유전자 결핍 생쥐(-/-)를 생산하려 하였다. 이론적으로 SRG3 유전자가 한쪽이 결핍된 생쥐들을 서로 교배시킬 경우 멘델리안 법칙에 의해 25%의 확률로 SRG3 유전자가 양쪽 모두 결핍된 자손을 기대할 수 있기 때문이다. 하지만 그 결과, 태어난 새끼들 중에 SRG3 유전자가 양쪽 모두 결핍된 경우는 없었다. 이는 곧 배아발생과정에서 SRG3 양쪽 유전자가 결핍된 생쥐들은 태어나기 전에 죽어 있다는 것을 나타내었다.
본 발명자들은 SRG3 유전자 한쪽이 결핍된 생쥐들을 서로 교배시킨 후, 임신된 암컷으로부터 발생 시기별로 배아를 분리하여 SRG3 유전자가 양쪽 모두 결핍된 배아가 언제 죽는지를 알아보았다. 실험 결과에 따르면 이들은 낭배시기를 지나 착상과정을 거친 후 바로 죽어나감을 관찰하였다. 죽음의 원인을 규명하기 위하여 본 발명자들은 수정 후 3.5일이 지난 낭배를 자궁으로부터 추출한 뒤 이를 15% FBS 가 포함된 DMEM 배양액으로 배양하여 이후의 발생과정을 살펴보았다.
그 결과, 정상 또는 SRG3 유전자 한쪽이 결핍된 배아는 배양 3일 후 정상적인 에그실린더 형태를 갖추는 반면, SRG3 유전자가 양쪽 모두 결핍된 배아는 낭배의 세포속덩이가 에그실린더로 발달하지 못하여 더 이상의 발생이 진행되지 않음을 알아내었다(도 5).
또한 상기 실험과정에서 SRG3와 함께 SWI/SNF 복합체의 핵심 구성요소인 BRG1에 대한 각각의 특이적인 항체를 이용하여 발현여부를 형광염색법에 의해 알아본 바, SRG3가 완전히 결핍된 경우 BRG1의 발현이 약간 감소함을 관찰하였다. BRG1이 결핍된 배아는 착상 전에 죽는데 반해(Bultmanet al , Mol. Cell, 2000, 6(6):1287-1295) SRG3가 결핍된 배아는 착상을 마친 후에 죽는 차이점은 아마도 SRG3 결핍 배아의 경우 남아있는 BRG1이 기본적인 염색질 재구성 활성을 나타내기 때문으로 생각된다(Phelanet al,Mol. Cell., 1999, 3(2):247-253). 상기와 같은 결과는 SRG3 단백질이 착상 이후 낭배의 발생과정에 필수적임을 의미하는 것이다.
<실험예 2> SRG3 한쪽 유전자 결핍 생쥐(+/-)의 분석
SRG3 유전자가 양쪽 모두 결핍된 배아의 경우 발생 초기에 죽는 반면, 한쪽만 결핍된 상황에서는 일부가 신경관 형성에 결함을 보였으며, 탈뇌증(exencephaly)이 관찰되었다. 생쥐의 신경관은 배아발생 8.5일에서 9.5일 사이에 형성이 되는데, 이는 신경판이 둥글게 말려 올라가며 관을 형성한다. SRG3가 한쪽이 결핍된 생쥐의 약 15-20%는 상기 신경관 형성이 제대로 이루어지지 않아 두뇌가 밖으로 나오는 탈뇌증을 보이는데, 그 형태를 각각 배아시기 9.5일, 10.5일, 12.5일, 16.5일에 걸쳐 나타내었다(도 6).
상기 신경관 형성 결함이 일어난 배아의 두뇌를 형태학적으로 분석하기 위해 배아시기 12.5일에 해당하는 탈뇌증 배아의 뇌를 코로날 섹션하여 헤마톡실린-에오신 염색법으로 정상적인 배아의 뇌와 비교해보았다.
그 결과,도 7에서 관찰되는 것과 같이 탈뇌증 배아의 뇌(B)는 세 번째 뇌실이 닫히지 않고 간뇌조직이 밖으로 뻗어나와 머리 윗부분을 차지하며, 이로 인해 양측 뇌실이 축소된 채로 대뇌의 스트리아툼은 상당히 부풀어져 있고, 대뇌 피질의 오리엔테이션이 거꾸로 되어 있음을 관찰할 수 있었다(도 7의A,B). 더불어 본 발명자들은 BF-1 이라는 대뇌피질에 특이적인 분자마커를 이용하여 인시투혼성화(in situhybridization) 방법을 사용해서 상기한 대뇌 피질의 오리엔테이션 이상을 명확히 보여주었다(도 7의C,D).
상기 탈뇌증을 세포 수준에서 분석하고자 본 발명자들은 신경 세포의 증식과 분화 정도를 알아보기 위해 각각 BrdU 투여실험과 MAP2 염색을 실시하였다.
그 결과,도 8을 보면 앞서도 7에서 관찰한 바와 같이, 간뇌가 머리 윗부분을 차지하며 과증식한 모습을 보이고 측뇌실 역시 앞서 기술한대로 상당히 축소되어 있으며 대뇌의 스트리아툼이 부풀려진 채 대뇌피질의 오리엔테이션이 아래로 향해있음을 볼 수 있었다. 이러한 구조적인 이상은 중뇌, 연수 등에서도 관찰되어 정상에 비해 뒤로 짓눌려진 뇌 구조가 관찰되었다.
한편, 본 발명자들은 신경세포의 증식 정도를 알아보기 위해 임신 13.5일에 해당하는 암컷 생쥐의 복강에 60 ㎍/g 의 농도로 BrdU를 복강투여 한 후, 1시간이 지난 뒤 배아를 분리하여 부앙(Bouin) 고정액으로 고정시키고 탈수 및 침투 과정을 거친 후 파라핀 블록을 만들었다. 이 후 10-15 ㎛의 사지탈 섹션을 준비하여 안티-BrdU 항체로 염색해 보았다.
그 결과, 탈뇌증을 보이는 배아의 경우 후두부 위쪽 방면에 간뇌를 활발히 생산하는 신경 모세포로 생각되는 세포들이 관찰됨을 알 수 있다. 탈뇌증이 이 세포들의 과증식에 의해 유도되는지, 아니면 탈뇌증으로 인해 이러한 세포들의 과증식이 유도되는것인지 원인 결과 관계가 분명하지는 않지만, 과증식하는 세포와 탈뇌증과 관계가 있는 것을 나타낸다.
또한, 신경세포의 분화 정도를 알아보기 위해 본 발명자들은 신경세포 분화 마커인 MAP2 항체로 염색을 하였다.
그 결과,도 8의C,D에서 관찰된 것과 같이 탈뇌증 배아는 정상 배아에 비해 전반적으로 신경 분화가 다소 덜 되었고, 특히 스트리아툼 부분의 신경 분화가 미비한 것으로 나타났다. 이에, 본 발명자들은 SRG3 단백질의 발현량이 줄어듦으로 인해 신경세포가 비정상적인 증식과 분화과정을 겪음을 확인하였다.
상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 SRG3 유전자 결핍 생쥐로부터 SRG3 단백질이 초기 발생에 필수적이며 두뇌의 형성에 중요한 역할을 한다는 것을 알아낼 수 있었고, SRG3 단백질의 정확한 생체내 역할을 규명하는 동물 모델로서 유용하게 사용될 수 있다.
Claims (10)
- SRG3 게놈 유전자의 일부, 네오마이신 저항 유전자 및 디프테리아 독소 유전자로 이루어진 SRG3 유전자 적중벡터(targeting vector).
- 제 1항에 있어서, 상기 네오마이신 저항 유전자는 상동재조합시 SRG3 유전자의 네 번째 엑손을 대체시키는 것을 특징으로 하는 적중 벡터.
- 제 1항의 적중 벡터가 도입되어 상동재조합된 배아간세포.
- 제 3항의 배아간세포를 대리모에 착상시켜 제조한 SRG3 유전자 결핍 키메라(chimera) 생쥐.
- 제 4항의 키메라 생쥐를 정상 생쥐와 교배시켜 제조한 SRG3 +/- 유전자형을 갖는 SRG3 한쪽 유전자 결핍 생쥐.
- 제 5항의 SRG3 +/- 유전자형을 갖는 SRG3 유전자 결핍 생쥐로부터 얻어진 수정란(수탁번호 : KCTC 10069BP).
- 제 6항의 수정란을 대리모에 착상시켜 얻은 SRG3 +/- 유전자형을 갖는 SRG3 유전자 결핍 생쥐.
- 제 7항에 있어서, 대리모는 가임신된 암컷 생쥐인 것을 특징으로 하는 유전자 결핍 생쥐.
- 제 7항의 SRG+/- 유전자형을 갖는 SRG3 유전자 결핍 생쥐를 교배시켜 제조되는 SRG3 -/- 유전자형을 갖는 SRG3 유전자 결핍 생쥐 배아.
- 1) SRG3 유전자에 대한 적중벡터를 제조하는 단계;2) 상기 적중벡터를 배아간세포에 도입하여 상동재조합에 의해 SRG3 유전자의 일부가 결손된 배아간세포 클론을 얻는 단계;3) 상기 SRG3 유전자 결핍 배아간세포를 정상 낭배(blastocyte)의 세포속덩이(inner cell mass)에 미세주입하여 키메라(chimera) 생쥐를 얻는 단계; 및4) 상기 키메라 생쥐를 정상 생쥐와 교배시켜 SRG3 +/- 유전자형을 갖는 SRG3 한쪽 유전자 결핍 생쥐를 얻는 단계로 구성되는 SRG3 유전자 결핍 생쥐의 제조방법.
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