CN117568400A - 一种构建i型半乳糖血症基因点突变小鼠模型的方法及应用 - Google Patents

一种构建i型半乳糖血症基因点突变小鼠模型的方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种构建I型半乳糖血症(GAL I)基因点突变小鼠模型的方法及应用，涉及动物基因工程技术领域，包括如下步骤：利用CRISPR/Cas9系统对小鼠Galt基因c.847+1G位点进行点突变，进而使所述小鼠的Galt基因c.847+1G位点由碱基G突变为碱基T，得到I型半乳糖血症的基因点突变小鼠模型；所述CRISPR/Cas9系统包括Cas9mRNA、sgRNA和ssODN；所述sgRNA的序列如SEQ ID NO.1所示，所述ssODN的序列如SEQ ID NO.2所示。本发明针对经典半乳糖血症GALT基因的致病位点Galt c.847+1G>T(人类为GALT c.904+1G>T)设计了sgRNA、ssODN，成功构建了Galt c.847+1G>T点突变小鼠，其在转录的时候发生剪接错误，GALT蛋白无法正确翻译，为探索GAL I发生和发展机理、发现药物新靶点以及临床前药效学评价等生物医学研究奠定基础。

Description

一种构建I型半乳糖血症基因点突变小鼠模型的方法及应用
技术领域
本发明涉及动物基因工程技术领域，具体涉及一种构建I型半乳糖血症基因点突变小鼠模型的方法及应用。
背景技术
半乳糖血症(Galactosemia,GAL,OMIM#230440)是由于半乳糖Leloir代谢途径中关键酶失活或功能异常所引起的常染色体隐性遗传代谢病，包括I型、II型和III型。I型半乳糖血症，(Type I Galactosamia,GAL I,OMIM#230400)又称经典半乳糖血症(ClassicGalactosemia)，其患病率为1/30000—1/60000，在三种半乳糖血症中发病率最高。半乳糖对人体至关重要，具有广泛的功能，是婴儿断奶前的关键能量来源，对早期发育尤为重要，如果不及时治疗，可致新生儿死亡。
GAL I的临床症状可分为急性症状和慢性并发症。急性症状是由于胎儿出生后摄取乳汁中乳糖，乳糖代谢异常导致肝大、肝硬化等肝损伤，随后出现白内障及肾小管功能不全等症状，严重威胁生命。乳糖和半乳糖饮食限制治疗后，可有效缓解GAL I的急性症状，然而并不能解决GAL I的慢性并发症。慢性并发症主要为神经系统和生殖系统病变，表现为语言障碍、运动失调以及卵巢功能不全等。目前，限制病人饮食摄入乳糖和半乳糖是主要的治疗措施，尚无其他治疗办法。
目前，ARUP数据库(http://www.arup.utah.edu/database/GALT)收录了230种GALT变异类型，包括错义突变、插入突变、缺失突变、无义突变以及拼接位点突变等。GALT的变异特点具有明显的地域性，美国和北欧地区的高频突变位点为c.563A>G(p.Q188R)；东欧人群的高频位点为c.855G>T(p.K285N)；非洲人群的高频突变位点为c.404C>T(p.S135L)；其他地区并未发现热点突变位点。
我国也有一定数量的GAL I患者，但在医学方面的研究较少。2008年，黄晓春等回顾总结了深圳市GAL筛查工作，指出该地区的总体患病率约为1/50000。杨茹莱等的统计结果表明浙江省GAL的发病率约为1/200000，并鉴定了患者的GALT突变位点。其中一个案例的患者GALT的一个等位基因为同义突变，另外一个等位基因为9号外显子3'端c.904+1G>T拼接位点突变，虽然GAL为常染色体隐性遗传病，然而该患者仍表现出GAL I的临床症状。可见，c.904+1G位点对于维持GALT蛋白的酶活性非常重要，是强致病性突变位点。
CRISPR/Cas9技术效率高、成本低、设计和操作简单，是目前应用最广泛的基因编辑技术。鉴于此，本发明以强致病性的变异位点c.904+1G>T为参考，利用CRISPR-Cas9系统制备，提供一种构建I型半乳糖血症基因点突变小鼠模型的方法及应用。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种构建I型半乳糖血症基因点突变小鼠模型的方法及应用。目的是利用CRISPR-Cas9系统制备Galt c.847+1G>T(对应人类c.904+1G位点)精准突变小鼠，并深入分析小鼠的病理特征，旨在建立模拟人类GAL I疾病的小鼠模型，为探索GAL I发生和发展机理、发现药物新靶点以及临床前药效学评价等生物医学研究奠定基础。
本发明为了解决上述技术问题，第一个方面提供了一种构建I型半乳糖血症基因点突变小鼠模型的方法，所述构建方法包括如下步骤：利用CRISPR/Cas9系统对小鼠Galt基因c.847+1G位点进行基因打靶，进而使所述小鼠的Galt基因c.847+1G位点由碱基G突变为碱基T，得到I型半乳糖血症的基因点突变小鼠模型；所述CRISPR/Cas9系统包括sgRNA、ssODN和Cas9mRNA；所述sgRNA的序列如SEQ ID NO.1所示，所述ssODN的序列如SEQ ID NO.2所示。
根据NCBI和Ensembl数据库中的人类GALT与小鼠Galt基因组和转录组信息的对比，分析其基因结构后选择小鼠Galt-201(ENSMUST00000084695.12)转录本中作为编辑转录本。Galt-201转录本(ENSMUST00000084695.12)全长3.47kb，其中包含11个外显子(Exons)，10个内含子(Introns)。上述的Galt c.847+1G>T突变位点位于小鼠Galt-201转录本第9个内含子的第一个碱基，由原来的G突变为T。
本发明的有益效果是：本发明针对经典半乳糖血症GALT基因的致病位点Galtc.847+1G(人类为GALT c.904+1G)设计了sgRNA、ssODN，并利用CRISPR-Cas9系统，将sgRNA、ssODN、Cas9mRNA共注射受精卵，成功构建了Galt c.847+1G>T点突变小鼠，即在Galt c.847+1G位点处精准的将碱基G突变为碱基T，导致在转录的时候发生剪接错误，GALT蛋白无法正确翻译。
在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。
进一步，所述方法包括使用所述sgRNA、所述ssODN和Cas9的混合物的步骤。
进一步，所述方法包括如下的具体的步骤：
1)将所述sgRNA、所述ssODN和所述Cas9混合，得到注射液；
2)采用显微注射的方法将所述注射液注射入小鼠受精卵的胞质中，得到注射后受精卵；
3)将所述注射后受精卵移植入代孕母鼠的输卵管内，发育完成后，得到F0代小鼠；
4)将所述F0代小鼠连续繁殖多代，并从后代中鉴定出Galt基因点突变的纯合子，作为Galt基因点突变小鼠模型。
上述4)中通过鉴定获得I型半乳糖血症的基因点突变小鼠模型具体的鉴定方法包括采用qPCR、WB等实验检测Galt基因敲除小鼠GALT基因的表达水平，同时对Galt基因敲除小鼠和野生型小鼠的体重进行记录，通过病理学切片实验进一步分析模型小鼠的相关表型，并得出以下结论：
(1)针对经典半乳糖血症GALT基因的致病位点Galt c.847+1G>T(人类为GALTc.904+1G>T)设计了sgRNA、ssODN，并利用CRISPR-Cas9系统，将sgRNA、ssODN、Cas9mRNA共注射受精卵，成功构建了Galt c.847+1G>T点突变小鼠。
(2)通过qPCR实验和WB实验检测Galt mRNA表达水平和GALT蛋白表达水平，实验结果表明Galt c.847+1G>T点突变小鼠的Galt mRNA、GALT蛋白质表达水平均明显低于野生型小鼠，并具有统计学差异。
(3)在小鼠生长前15周，野生型小鼠的体重略高于Galt c.847+1G>T点突变小鼠。
(4)通过石蜡切片HE染色对组织器官进行形态学和功能的分析，发现Galt c.847+1G>T点突变小鼠和野生型小鼠相比，在心脏、脾脏、肾脏组织上均无异常，但是肝脏出现损伤现象，肺脏出现严重的炎症反应。
(5)通过肝脏组织的PAS染色，发现Galt c.847+1G>T点突变小鼠着色较野生型小鼠浅，说明Galt c.847+1G>T点突变小鼠肝脏组织的糖原含量低于野生型小鼠。
总之，本发明成功构建了Galt mRNA、GALT蛋白表达水平低于野生型小鼠的Galtc.847+1G>T点突变纯合子小鼠，Galt c.847+1G>T点突变纯合子小鼠肝脏、肺脏都出现了严重的炎症，肝脏糖原的含量也低于野生型小鼠，可见Galt c.847+1G>T点突变纯合子可以模拟出人类半乳糖血症的一些症状。
进一步，所述sgRNA、所述ssODN和所述Cas9mRNA的质量比为1：1：1。
进一步，所述小鼠单受精卵的供体为C57BL/6J小鼠。
进一步，所述代孕母鼠为ICR小鼠。
第二个方面提供了一种构建I型半乳糖血症的基因点突变小鼠模型，所述构建I型半乳糖血症的基因点突变小鼠模型由上述任一项所述的制备方法制备得到。
第三个方面提供了一种用于构建I型半乳糖血症的基因点突变小鼠模型的试剂盒，所述试剂盒包括上述中所述sgRNA、所述ssODN和所述Cas9。
第四个方面提供了上述所述构建I型半乳糖血症的基因点突变小鼠模型或上述所述试剂盒在开发和/或筛选治疗I型半乳糖血症的物质中的应用。
进一步，所述物质为药物或蛋白。
附图说明
图1为本发明Ensembl数据库中Galt-201转录本结构图；
图2为本发明小鼠Galt c.847+1G>T打靶位点图；
图3为本发明F1代Galt c.847+1G>T小鼠的后代Sanger测序；
图4为本发明Galt基因点突变小鼠肝脏中的mRNA表达水平检测；
图5为本发明Galt基因点突变小鼠蛋白水平检测图，其中，A为Galt基因点突变小鼠GALT蛋白表达水平图，B为统计结果图；WT
图6为本发明WT小鼠和Galt基因点突变小鼠心脏、肝脏、脾脏、肺脏和肾脏病理切片HE染色；
图7为本发明WT小鼠和Galt基因点突变小鼠的PAS染色结果。
具体实施方式
以下对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购得的常规产品。
实施例
1、实验动物、主要试剂及常用溶液
1.1实验动物
实验所用实验动物为SPF(Specific pathogen Free)级C57BL/6J和ICR小鼠。本发明的设计与方案均得到了桂林医学院动物护理和使用委员会的批准，动物伦理审批号为GLMC201803033。下述中的WT小鼠为纯野生的C57BL/6J小鼠。
1.2主要试剂、耗材说明
表1主要试剂和耗材
1.3常用溶液配制
1)10×TBS溶液配制和1×TBST缓冲液的配制
表2 10×TBS溶液配制和1×TBST缓冲液的配制
其中10×TBS溶液配制需要用12N HCl将pH调节至7.6，加入蒸馏水至终体积为1L。
2)转模液的配制、5×SDS-PAGE电泳液的配制和50×TAE溶液的配制
表3转模液的配制、5×SDS-PAGE电泳液的配制和50×TAE溶液的配制
3)LB液体培养基的配制和LB固体培养基的配制
表4LB液体培养基的配制
序号 试剂名称 用量
1 酵母提取物 0.5g/100ml
2 胰蛋白 1g/100ml
3 NaCl 1g/100ml
4 ddH2O 定容至100ml
LB固体培养基的配制：与LB液体培养基相比，该LB固体培养基的配制还添加1.5g/100ml的琼脂粉，其余与LB液体培养基的配制相同。
2、实验方法
2.1靶向小鼠Galt基因sgRNA、ssODN序列的设计
根据NCBI和Ensembl数据库中的人类GALT与小鼠Galt基因组和转录组信息的对比，分析其基因结构后选择小鼠Galt-201(ENSMUST00000084695.12)转录本作为编辑转录本。Galt-201转录本(ENSMUST00000084695.12)全长3.47kb，其中包含11个外显子(Exons)和10个内含子(Introns)(图1)。本发明Galt c.847+1G>T突变位点位于小鼠Galt-201转录本第9个内含子的第一个碱基，由原来的G突变为T，导致蛋白翻译时发生剪接错误。
具体的本发明基于CRISPR/Cas9基因突变系统针对小鼠Galt基因设计了sgRNA序列和ssODN序列(序列信息见表5)，使小鼠Galt基因在Galt c.847+1G(如图2)发生突变，造成GALT蛋白翻译错误。采用Galt-sgRNA(SEQ ID NO.1)、所述ssODN(SEQ ID NO.2)和所述Cas9混合后，显微注射到小鼠受精卵中，然后将受精卵移植到代孕母鼠体内，产出F0代，对F0代进行PCR鉴定，将阳性F0代连续的繁殖至少2代，以产生Galt c.847+1G>T点突变纯合小鼠模型。
表5设计的sgRNA、ssODN序列信息
2.2Galt基因突变小鼠模型的制备
2.2.1小鼠受精卵的获取
(1)超数排卵。选取周龄3-3.5W的C57BL/6雌鼠，并于实验第一天下午5点给雌鼠注射孕马血清促性腺激素(PMSG)，5UI/只；第三天下午5点(与第一天同一时间)给已经注射PMSG的雌鼠注射人绒毛膜促性腺激素(HCG)，5UI/只。
(2)胚胎培养皿的准备。在第三天注射激素完毕后，在超净工作台中用35mm的培养皿制作TYH精子获能皿、HTF受精皿、KSOM胚胎培养皿。所有培养皿制作完毕后，置于37.5℃、5％ CO2培养箱中过夜平衡。
(3)体外受精。实验第四天早上9点左右，选取适配的3-6月的C57BL/6雄鼠，通过颈椎脱臼法处死，用手术器械对其进行解剖，打开腹腔，找到附睾并将其取下。用吸水纸去掉上面多余的血液和脂肪，将其放入TYH精子获能皿中的矿物油中，用眼科剪在附睾上开一个小口，在体视显微镜下使用显微操作镊将精液从小口中挤出，并将精液移至200μL的TYH液滴中。随后将TYH精子获能皿放入37.5℃，5％CO2培养箱获能50min。同样的方法处死雌鼠后，用眼科剪使背部皮肤暴露，剪下卵巢和输卵管段用吸水纸去掉上面多余的脂肪和血液，放入受精皿中，在体视显微镜下找到输卵管膨大部位，用1mL注射器将卵团划到HTF液滴中。待精子获能完毕后，沿着微滴边缘用加样枪吸取2.5μL精子加到每一个200μL的受精滴中，将HTF受精皿放入培养箱中继续培养。
2.2.2小鼠受精卵的显微注射
(1)受精卵的清洗和挑选。精卵细胞共孵育6h左右后，受精卵细胞从200μL的HTF液滴中转移至50μL的HTF液滴进行初次清洗，随后将这些胚胎转移至M2胚胎清洗皿中，再清洗6-10次，去除附着在受精卵外的卵丘细胞和其他杂质，将清洗好的胚胎放回培养箱中待用。
(2)显微注射液的配制。将sgRNA、ssODN、Cas9蛋白从-80℃冰箱中取出，置于冰上溶解。在超净台中用无酶枪头按一定比例分别吸取sgRNA、ssODN、Cas9蛋白于无酶1.5EP管中充分混匀，使得sgRNA、ssODN、Cas9蛋白在混合溶液中的终浓度均为200ng/ull，然后使用Microloader微量上样针吸取1ul的混合液移至显微注射针内。
(3)显微注射。调节固定针利用负压固定住受精卵，固定时要避开极体。通过显微注射针将混合物注射至受精卵胞质。注射完毕后，将注射后的受精卵用口吸管移到捡卵皿中进行清洗5-10次，再将清洗后的受精卵移到KOSM胚胎培养皿中，并将KOSM胚胎培养皿放到培养箱中继续培养。
2.2.3胚胎移植
(1)ICR雄性小鼠的结扎。选取3.5-4周龄的ICR雄性小鼠，待ICR雄性小鼠的结扎后放鼠笼饲养。
(2)ICR受体雌鼠的准备。在体外受精当日下午5点左右，挑选周龄6-12周，体重25-35g的发情期ICR雌鼠，将它们与ICR结扎雄鼠合笼，挑选见栓的ICR雌鼠作为受体。
(3)受精卵的挑选。将经显微注射后正常发育至2-cell细胞时期的受精卵挑选出来，并进行统计，将15枚作为一组放入KSOM胚胎培养皿的微滴中备用。
(4)胚胎移植。将见栓ICR受体雌鼠称重麻醉，在背部开口并找到输卵管壶腹部，在壶腹部前端的输卵管部位用显微剪剪口，口吸管用三段法将胚胎移入，以气泡进入输卵管膨大部为移植成功标志，缝合小鼠肌肉组织、皮肤，放于热台待其苏醒，术后护理，待其怀孕产仔。
2.2.4新生小鼠的基因型鉴定
(1)F0代小鼠拟突变位点区域的扩增。ICR受体雌鼠在进行胚胎移植后21天左右产仔，新生小鼠为F0代。待小鼠出生7天后，剪鼠尾，用天根血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒(DP304-02)提取小鼠鼠尾DNA，并对拟突变位点区域进行PCR扩增，并将PCR产物送测以分析基因型。PCR反应的引物序列Galt-M-ES-1、Galt-M-EA-1见表6，反应体系如表7所示，PCR扩增反应程序见表8。
(2)PCR产物胶回收。将确认发生基因突变的小鼠DNA再次进行PCR，其PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，120V，30min。电泳结束后，切下符合目标大小且单一条带至EP管中，按照天根普通DNA产物纯化试剂盒(DP204-02)操作说明进行胶回收，回收后的PCR产物浓度需达到40ng/μL方满足下一步实验的要求。。
(3)连接转化。取1μL胶回收产物、1μL pMD 19-T Vector于PCR管中混匀，ddH2O补足至5μL，加入2.5μL的Solution I酶，所有反应均在冰上配制。将混合液置于PCR仪中16℃，1h进行连接。连接结束后，从-80℃冰箱取出大肠杆菌置于于冰上溶解，取30μL大肠杆菌和7.5μL连接产物置于1.5mL的EP管混匀冰浴30min，金属浴42℃，90s；冰浴2min。在EP管中加入150μL不含抗生素的LB液体培养基，37℃摇床孵育，40min，使菌体复苏。摇菌结束后，将菌液均匀涂布于含氨苄青霉素的LB固体培养基中，并将培养基置于37℃恒温箱培养16-18h，待其长出单菌落。
(4)挑取单菌落。在超净工作台中用小枪头挑取单菌落至含有10μL ddH2O的PCR管中，每个LB固体培养基中挑取10-15个单菌落。
(5)菌液PCR。以挑取的单菌落为模板进行菌液PCR，菌液PCR体系见表9，PCR反应程序见10。PCR结束后，将PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳鉴定。
(6)测序。将符合目标大小且电泳条带单一的剩余菌液8ul移至2ml离心管中，并加入1.5mL含氨苄青霉素的LB液体培养基，置于摇床中37℃，150rpm，回旋，过夜摇菌，第二天将菌液进行测序。
表6拟突变位点区域PCR扩增引物序列
表7拟突变位点区域PCR扩增反应体系
表8拟突变位点区域PCR扩增反应程序1
表9菌液PCR扩增反应体系
序号 反应组分 体积(μL)
1 单菌落菌液 2
2 M13F(10pmol/μL) 0.5
3 M13R(10pmol/μL) 0.5
4 Premix TaqTM 5
5 ddH2O 2
表10菌液PCR扩增反应程序
2.2.5Galt基因突变小鼠的繁育
将F0代Galt基因突变与WT小鼠合笼进行繁育，产下的小鼠为F1代，并剪下F1代小鼠的鼠尾，提取DNA进行PCR扩增、sanger测序鉴定基因型。将鉴定为Galt基因突变小鼠的F1代进行组间交配繁育纯合子，并对它们产下的后代进行sanger测序，鉴定基因型。
2.3Galt基因突变小鼠分子水平的检测
2.3.1Galt基因突变小鼠mRNA表达水平检测
(1)总RNA的提取。将WT小鼠、Galt c.847+1G>T点突变小鼠安乐死后，取其肝脏，在冰上用Trizol法提取总RNA(每个组别的小鼠至少取3只)。将肝脏置于2mL EP管中进行称重，每100mg的组织加入1mL的预冷Trizol试剂，向EP管中加入2-3颗磁珠，用动物组织研磨机进行研磨，将磨碎的组织置于冰上静置10min，随后12000g，4℃，离心15min，将上清移至另一个EP管中。向EP管中加入1/5Trizol体积的氯仿，用力颠倒混匀(不可使用涡旋振荡器，避免RNA片段断裂)，室温中静置3min，可见分层，12000g，4℃，离心15min。离心后，溶液分为3层，上层为水相，中间层为蛋白质，下层为有机相，而RNA位于上层水相中，用移液枪小心吸取上层水相至新的EP管中。向EP管中加入1/2Trizol体积预冷的异丙醇，用移液枪轻轻混匀，室温静置10min，12000g，4℃，离心15min，小心弃去上清。向EP管中加入1倍Trizol体积的75％乙醇洗涤RNA，随后7500g，4℃，离心5min，弃去上清，室温静置5-15min，确保水和乙醇完全挥发。
(2)总RNA质量检测。RNA沉淀完全干燥后，向EP管中加入30μL无酶水溶解沉淀，测定浓度，纯净的RNA样品A260/A280比值为2.0左右，随后用1％琼脂糖凝胶电泳检测提取的RNA是否完整。
(3)基因组DNA的去除和逆转录。完整将提取的总RNA样品进行逆转录。按照TaKaRa公司的逆转录试剂盒(RR047A)说明书进行操作，于无酶的PCR管中配制去除总RNA中基因组DNA的反应体系，反应体系见表11，将PCR管置于PCR仪中，42℃反应2min。随后在冰上配制逆转录反应体系，反应体系见表12，反应程序为37℃15min；85℃5s；4℃∞。
(4)qPCR。按照TaKaRa公司TB Ex TaqTMⅡ试剂盒(RR820L，TaKaRa)说明书，配制qPCR反应体系(见表13)。本实验使用两步法PCR扩增程序：95℃30s；95℃5s，60℃30sfor40repeats；95℃15s，60℃30s，95℃15s(dissociation)。以小鼠GAPDH作为内参基因，采用2^-△△CT法计算Galt基因的相对表达水平，qPCR反应的引物见表14。
表11去除基因组DNA反应体系
反应组分 体积(μL)
5×gDNA Eraser Buffer 2.0
gDNA Eraser 1.0
Total RNA 1μg的Total RNA
RNase Free dH2O up to 10μL
表12反转录反应体系
反应组分 体积(μL)
去除基因组DNA反应液 10.0
PrimeScript RT Enzyme Mix I 1.0
RT Primer Mix 1.0
5×PrimeScript Buffer 2(for Real Time) 4.0
RNase Free dH2O 4.0
Total 20
表13 qPCR反应液配制
反应组分 体积(μL)
TB Green Premix Ex Taq II(2×) 12.5
PCR Forward Primer(10μM) 1.0
PCR Reverse Primer(10μM) 1.0
RT反应液(cDNA溶液) 2
灭菌水 8.5
Total 25
表14 Galt基因qPCR扩增引物序列
2.3.2Galt基因突变小鼠蛋白表达水平检测
(1)总蛋白的提取。将3只WT小鼠、3只Galt c.847+1G>T点突变小鼠安乐死后，取其肝脏置于2mL EP管中进行称重，每20mg组织中加入100-200μL细胞裂解液(碧云天，P0013)，裂解液使用前需加入PMSF(碧云天，ST506)，使PMSF的最终浓度为1mM。向EP管中加入2-3颗磁珠，用动物组织研磨机进行研磨，将磨碎充分的组织悬液置于冰上裂解30min，随后12000rpm，4℃，离心15min，将上清移至另一个新的EP管中，组织总蛋白存于上清液中。
(2)BCA法测定总蛋白浓度：根据碧云天生物技术公司的BCA蛋白浓度测定试剂盒(P0012S)说明书对提取的组织总蛋白进行浓度测定。最后，根据酶标仪测出的数值，绘制标准曲线，根据标准曲线计算出总蛋白浓度。
(3)蛋白变性。根据BCA法测定的浓度，取出一部分蛋白样品，使样品与5×SDS-PAGE loading buffer混合后定量为5ug/μl，将混合好的样品置于金属浴中，100℃加热10min，加热过程中时不时颠倒混匀，使其均匀受热，降至室温后，12000rpm，4℃离心10min，置于-20℃保存备用。
(4)SDS-PAGE凝胶的配胶。按照碧云天生物技术公司的SDS-PAGE凝胶配制试剂盒(P0012A)说明书配制10％的分离胶，将分离胶加入玻璃板中并用ddH2O进行压胶，室温静置，待分离胶凝固后，去除ddH2O，配制浓缩胶并加满玻璃板，将梳子插入浓缩胶中，室温静置，待浓缩胶凝固。
(5)SDS-PAGE电泳。将制好的胶组装好后，放入电泳槽中。电泳槽内槽倒满新的1×SDS-PAGE电泳缓冲液。上样时，第一个孔是2μL蛋白Marker(Thermo Fisher，26616)，随后按顺序对蛋白样品进行上样，每孔6μL蛋白样品，即蛋白样品泳道中每个泳道的蛋白总量为30μg。点样完毕后，开始SDS-PAGE电泳。
(6)转膜。电泳结束后，将转膜液倒入白色托盘中，将胶从玻璃板中分离出来浸入转膜液中，根据胶上的Marker条带，用切胶板分别切下包含目的蛋白、内参蛋白的胶块，将切割好的胶浸入转膜液中待用。随后裁剪两片大小与胶相似的PVDF膜，放入无水甲醇中浸泡1min左右。按照黑板、海绵垫、滤纸、胶、PVDF膜、滤纸、海绵垫、白板的顺序组装好“三明治”，注意每一层之间都不能有气泡。将“三明治”放入转膜仪中，250mA恒流转膜90min。
(7)封闭。转膜结束后，将PVDF膜取出，用1×TBST缓冲液洗涤1次，摇床脱色5min。随后用1×TBST缓冲液配制5％的脱脂牛奶封闭2h。
(8)一抗孵育。封闭结束后，用1×TBST缓冲液洗涤4次，每次10min。重组Anti-GALT抗体(Abcom,ab178406)、GAPDH Polyclonal antibody(Proteintech，10494-1-AP)分别按照1:2000、1:5000的比例用Western一抗稀释液(碧云天，P0023A)进行稀释。用稀释好的一抗对PVDF膜进行孵育，4℃冰箱过夜。
(9)二抗孵育。将过夜孵育的PVDF膜从冰箱中拿出来，回收一抗，用1×TBST缓冲液洗涤PVDF膜4次，每次10min。用5％的脱脂牛奶按1:5000比例稀释的辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗室温孵育2h。二抗孵育完毕后，用1×TBST缓冲液洗涤PVDF膜4次，每次10min。
(10)发光。将碧云天生物技术公司的超敏ECL化学发光试剂盒(P0018S)中的试剂A、试剂B按1:1比例混匀，在PVDF膜上均匀滴加发光混合液，在Tanon凝胶成像系统观察结果。
2.4Galt基因突变小鼠表型分析
2.4.1Galt基因突变小鼠生长情况观察
对Galt基因突变小鼠和野生型小鼠的体重进行记录，进行统计学分析。
2.4.2Galt基因突变小鼠病理切片分析
(1)取材及固定。将周龄一致的WT小鼠、Galt c.847+1G>T点突变小鼠处死后，取其肝脏、肾脏、卵巢等组织放入4％的多聚甲醛溶液中固定48h后，自来水冲洗30min。
(2)脱水和透明。将固定好的组织过梯度酒精进行脱水：75％乙醇1h，85％乙醇1h，95％乙醇(Ⅰ)1h，95％乙醇(Ⅱ)1h，无水乙醇(Ⅰ)1h；无水乙醇(Ⅱ)1h。脱水结束后，用二甲苯溶液进行两次透明处理，每次30min。
(3)浸蜡、包埋和切片。将经透明处理的组织在50-52℃石蜡(软蜡)中浸泡1h，58-60℃石蜡(Ⅰ，硬腊)浸泡1h；58-60℃石蜡(Ⅱ)浸泡1h。浸蜡结束后，用58-60℃石蜡(硬腊)对组织进行包埋。用美国Thermo Fisher公司的切片机进行切片，切片完成后放置65℃烤片3-4h。
(5)HE染色：按照北京索莱宝科技有限公司的苏木素伊红(HE)染色试剂盒(G1120)说明书对切片进行染色。二甲苯中脱蜡两次，每次5min。梯度酒精复水(顺序为：100％、95％、85％、75％)，每梯度3min。蒸馏水浸泡2min。苏木素染色液染色2-5min(具体时间视情况而定)，蒸馏水洗去浮色，分化液分化10-60s，自来水浸洗两次，每次3-5min。伊红染色液30s-2min，倾去多余染色液后快速脱水(过梯度酒精：75％、85％、95％和无水乙醇(Ⅰ)各浸洗2-3s，无水乙醇(Ⅱ)浸洗1min)。二甲苯透明两次，每次1min，中性树胶封固，镜下观察。
2.5统计学分析
本发明所有数据结果分析都是使用GraphPad Prism 9软件进行统计分析，用t检验(Student’s t-test)进行两组数据之间的比较，用单因素方差分析(One-way Anova)进行三组及三组以上数据之间的比较，采用平均值±标准差(X±SD)形式处理本论文的所有实验结果，，用*表示P<0.05。
3、结果
3.1基于CRISPR/Cas9技术构建Galt基因突变小鼠
3.1.1F0代小鼠的产生
使用上述2.1合成的sgRNA、ssODN和Cas9mRNA进行显微注射，根据上述2.2的记载Galt基因c.847+1G>T点突变小鼠模型的制备。得到4只Galt c.847+1G>T点突变杂合小鼠，为两只雌鼠、两只雄鼠，这4只小鼠则作为F0代进行繁育。
3.1.2F1代小鼠的产生
将Galt c.847+1G>T点突变杂合小鼠的F0代小鼠分别与WT小鼠合笼繁育F1代小鼠。剪下Galt c.847+1G>T点突变杂合小鼠产下的F1代小鼠的鼠尾，提取DNA，通过Sanger测序和TA克隆检测F1代基因型，得到杂合子小鼠。
3.1.3纯合子小鼠的繁育
分别将F1代Galt c.847+1G>T点突变杂合小鼠进行组内合笼繁育纯合子，待它们产下幼鼠后，取幼鼠DNA样品进行PCR扩增、Sanger测序测定基因型。WTF1代Galt c.847+1G>T点突变杂合小鼠组间合笼产下的小鼠中，通过PCR扩增、Sanger测序鉴定出两个Galtc.847+1G>T纯合子(C26、C30皆为雌性)，测序结果如图3所示，其中图3灰色字母表示Galt-sgRNA序列，具有下划线的字母“G”表示Galt c.847+1G目的突变位点，“-”表示碱基缺失，红色字母表示碱基置换。这两只Galt c.847+1G>T纯合子编号为C26、C30。
3.2Galt基因突变小鼠分子水平的检测
分别取WT小鼠、Galt c.847+1G>T点突变杂合小鼠的肝脏，用Trizol法提取总RNA，通过qPCR实验对Galt c.847+1G>T点突变杂合小鼠mRNA表达情况进行分析。总RNA提取完毕后测浓度，并用1％琼脂糖凝胶电泳检测纯度和完整性，提取的总RNA浓度见表15。
选取质量较好的RNA进行qPCR，将得到的数据进行统计学分析，结果如图4所示。Galt c.847+1G>T点突变小鼠中Galt mRNA表达水平明显低于WT小鼠，并具有统计学差异WB实验检测发现在肝脏组织中，与WT小鼠相比，Galt c.847+1G>T点突变小鼠中GALT蛋白表达水平显著降低，且具有统计学差异，(情况如图5所示)。
表15小鼠肝脏中总RNA浓度(ng/μL)
3.3Galt基因突变小鼠表型分析
3.3.1Galt基因突变小鼠的生长情况
为了探究Galt c.847+1G>T点突变杂合小鼠是否会出现GAL I出生长发育迟缓的特征。在正常饲养的条件下，对WT小鼠、Galt c.847+1G>T点突变杂合小鼠进行体重称量，并进行统计学分析。在小鼠生长前15周，在雄性小鼠中，野生型小鼠的体重略高于Galt基因突变小鼠，而在雌性小鼠中，Galt基因突变小鼠和野生型小鼠的体重相比，并无明显差异。
3.3.2Galt基因突变小鼠病理切片分析
在WT小鼠中，GALT蛋白在主要脏器：心脏、肝脏、脾脏、肾脏、大脑中均有表达，而经典半乳糖血症患者往往会出现生长发育迟缓，故取Galt c.847+1G>T点突变小鼠和WT小鼠的以上器官进行病理切片，HE和PAS染色。。WT如图6所示，WTWTWTWTWTWT在WT小鼠和Galtc.847+1G>T点突变纯合子小鼠的肺组织病理切片中，可以明显看到点突变小鼠的肺组织出现了肺泡腔内及肺间质有大量的炎性细胞浸润，肺泡间隔变宽，肺泡形状发生改变，部分肺泡断裂或融合。在点突变小鼠的肝脏组织病理切片中，肝细胞大片状坏死、溶解，仅存少数肝细胞索,伴有大量炎症细胞浸润。从肝脏、肺组织病理切片的结果可以看出点突变小鼠肝脏、肺均有较严重的炎症反应，其他组织未见异常。如图7所示，PAS染色发现Galt c.847+1G>T点突变小鼠肝脏着色较野生型小鼠浅，说明Galt c.847+1G>T点突变小鼠的肝脏组织的糖原含量低于野生型小鼠。
4结论
本发明针对经典半乳糖血症GALT基因的致病位点Galt c.847+1G>T(人类为GALTc.904+1G>T)，成功构建了Galt c.847+1G>T点突变小鼠。Galt c.847+1G>T点突变小鼠在第9个内含子的第一个碱基由G置换成T，导致在转录的时候发生剪接错误，GALT蛋白无法正确翻译，因此Galt基因突变的杂合子小鼠的GALT mRNA、GALT蛋白的表达水平都远低于WT小鼠。但在利用ELISA实验进行血清中GALT含量检测时，Galt c.847+1G>T点突变小鼠和WT小鼠相比并无明显差异。
本发明利用qPCR、WB实验分别检测了Galt c.847+1G>T点突变小鼠的mRNA表达水平、GALT蛋白表达水平，通过记录小鼠生长体重来分析其生长情况，通过ELISA实验、病理学切片实验进一步分析模型小鼠的相关表型，并得出以下结论：
(1)针对经典半乳糖血症GALT基因的致病位点Galt c.847+1G>T(人类为GALTc.904+1G>T)设计了sgRNA、ssODN，并利用CRISPR-Cas9系统，将sgRNA、ssODN、Cas9mRNA共注射受精卵，成功构建了Galt c.847+1G>T点突变小鼠。
(2)通过qPCR实验和WB实验检测了Galt的mRNA表达水平和GALT蛋白表达水平，实验结果表明Galt c.847+1G>T点突变小鼠的Galt mRNA、GALT蛋白质表达水平均明显低于WT小鼠。WT
(3)与WT小鼠相比，Galt c.847+1G>T点突变雄性小鼠的体重略低于WT小鼠，而Galt c.847+1G>T点突变雌性小鼠的体重与WT小鼠无明显差异WT。
(4)通过病理切片HE染色对组织器官进行形态学和功能的分析，发现Galt c.847+1G>T点突变小鼠和WT小鼠相比，在心脏、脾脏和肾脏组织上均无异常。但是肝脏和肺脏大部分细胞破裂坏死，有大量炎细胞浸润。
(5)通过肝脏组织的PAS染色，发现Galt c.847+1G>T点突变小鼠着色较野生型小鼠浅，说明Galt c.847+1G>T点突变小鼠的肝脏组织的糖原含量低于野生型小鼠。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (10)

1.一种构建I型半乳糖血症基因点突变小鼠模型的方法，其特征在于，所述构建方法包括如下步骤：利用CRISPR/Cas9系统对小鼠Galt基因c.847+1G位点进行点突变，进而使所述小鼠的Galt基因c.847+1G位点由碱基G突变为碱基T，得到I型半乳糖血症的基因点突变小鼠模型；
所述CRISPR/Cas9系统包括sgRNA和ssODN；所述sgRNA的序列如SEQ ID NO.1所示，所述ssODN的序列如SEQ ID NO.2所示。
2.根据权利要求1所述一种构建I型半乳糖血症基因点突变小鼠模型的方法，其特征在于，所述方法包括使用所述sgRNA、所述ssODN和Cas9 mRNA的混合物的步骤。
3.根据权利要求1或2所述一种构建I型半乳糖血症基因点突变小鼠模型的方法，其特征在于，所述方法包括如下的具体的步骤：
1)将所述sgRNA、所述ssODN和所述Cas9 mRNA混合，得到注射液；
2)采用显微注射的方法将所述注射液注射入小鼠受精卵的胞质中，得到注射后受精卵；
3)将所述注射后受精卵移植入代孕母鼠的输卵管内，发育完成后，得到F0代小鼠；
4)将所述F0代小鼠连续繁殖多代，并从后代中鉴定出Galt基因点突变的纯合子，作为Galt基因点突变小鼠模型。
4.根据权利要求3所述一种构建I型半乳糖血症基因点突变小鼠模型的方法，其特征在于，所述sgRNA、所述ssODN和所述Cas9 mRNA的质量比为1：1：1。
5.根据权利要求3所述一种构建I型半乳糖血症基因点突变小鼠模型的方法，其特征在于，所述小鼠单受精卵的供体为C57BL/6J小鼠。
6.根据权利要求3所述一种构建I型半乳糖血症基因点突变小鼠模型的方法，其特征在于，所述代孕母鼠为ICR小鼠。
7.一种构建I型半乳糖血症的基因点突变小鼠模型，其特征在于，所述引发I型半乳糖血症的基因点突变小鼠模型由如权利要求1至6任一项所述的制备方法制备得到。
8.一种用于如权利要求7所述构建I型半乳糖血症的基因点突变小鼠模型的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括sgRNA、ssODN和Cas9 mRNA。
9.一种如权利要求7所述构建I型半乳糖血症的基因点突变小鼠模型或权利要求8所述试剂盒的应用，其特征在于，用于开发和/或筛选治疗I型半乳糖血症的物质。
10.根据权利要求9所述应用，其特征在于，所述物质为药物。
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